ES2348159T3 - Vacuna contra el sindrome respiratorio y reproductivo porcino basada en el aislado ja-142. - Google Patents
Vacuna contra el sindrome respiratorio y reproductivo porcino basada en el aislado ja-142. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento de pases múltiples para atenuar un virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (SRRP) capaz de inducir un efecto citopático, que incluye las etapas de replicar sucesivamente dicho virus por inoculación y replicación del virus en cultivos celulares individuales hasta que se consiga su atenuación, caracterizado porque cada etapa sucesiva de inoculación y replicación comprende (1) retirar una muestra que contiene virus del cultivo celular mientras que el virus se está replicando a una velocidad logarítmica y antes de la inducción de efectos citopáticos en el cultivo celular, (2) inocular el cultivo celular siguiente con una alícuota de dicha muestra, de modo que se usa la alícuota más pequeña que mantiene la infección y la replicación logarítmica, y de modo que sólo se transfieren pequeñas cantidades de virus de un pase a otro, (3) conservar cada cultivo celular del que se ha retirado una muestra (de acuerdo con la etapa 1)) después de la etapa de retirada, y (4) observar si se produce inducción de un efecto citopático en cada uno de dichos cultivos celulares conservados.
Description
Vacuna contra el síndrome respiratorio y
reproductivo porcino basada en el aislado
JA-142.
La presente invención se refiere en líneas
generales al virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino
(SRRP) atípico avirulento atenuado (VSRRP) y a las vacunas de virus
vivo correspondientes para su administración a ganado porcino para
conferir una inmunidad eficaz en el ganado porcino frente a VSRRP.
La invención se refiere a un nuevo procedimiento altamente eficaz
para pasar virus SRRP hasta su atenuación.
El SRRP surgió a finales de los años 80 como una
enfermedad vírica importante del ganado porcino. El VSRRP causa
insuficiencia reproductiva grave en cerdas gestantes, manifestada en
forma de partos prematuros, aumento del número de mortinatos,
cerdos momificados y nacidos débiles, tasa de partos disminuida y
retraso en la vuelta al estro. Además, el sistema respiratorio del
ganado porcino infectado con VSRRP se ve afectado desfavorablemente,
lo que se demuestra por lesiones que aparecen en los pulmones del
ganado porcino infectado. Para combatir los problemas asociados con
la infección por VSRRP, se han desarrollado vacunas que conferían
inmunidad a las cepas de SRRP existentes entonces.
Las epidemias de una forma excepcionalmente
grave de SRRP, denominado en lo sucesivo en el presente documento
"SRRP atípico", se reconoció por primera vez en Norteamérica en
la última parte de 1996. Se diferenciaban de las epidemias de
"SRRP típico" en que: 1) los signos clínicos eran más
prolongados así como más graves; 2) la incidencia de abortos era
superior, especialmente durante la primera parte y la mitad de la
gestación; 3) existía una mayor incidencia de mortalidad de cerdas
nulíparas y mutíparas; 4) el VSRRP se aislaba menos frecuentemente
de fetos abortados, cerdos mortinatos y cerdos nacidos vivos -quizá
porque los abortos eran más frecuentemente el resultado de una
enfermedad maternal aguda más que de una infección transplacentaria;
5) las lesiones pulmonares de los cerdos jóvenes afectados eran más
amplias; y 6) las vacunas disponibles en el mercado proporcionaban
escasa o ninguna protección. En su conjunto, estas observaciones
indicaban la emergencia de cepas más virulentas y antigénicamente
diferentes de SRRP y la necesidad de una nueva generación de vacunas
contra SRRP.
El procedimiento usado más frecuentemente para
producir vacunas de virus vivo atenuado es realizar pases en serie
del virus en un sustrato (habitualmente un cultivo celular) distinto
del huésped natural (S) hasta que se atenúe lo suficiente (es
decir, se reduzca su virulencia o capacidad para producir
enfermedades) para usarlo como vacuna. Para el primer pase, se
infecta un cultivo celular con el inóculo seleccionado. Después de
obtener pruebas claras de replicación de virus (por ejemplo,
efectos citopáticos inducidos por virus [ECP] en las células
infectadas), se usa una alícuota del medio de cultivo celular, o
células infectadas, o ambas, del primer pase para infectar un
segundo cultivo celular. El procedimiento se repite hasta que una o
más mutaciones críticas en el genoma viral causan una atenuación
suficiente de modo que el virus pueda usarse con seguridad como
vacuna. El grado de atenuación se determina habitualmente
empíricamente exponiendo al huésped natural (S) a niveles de pase
progresivamente mayores del virus.
El procedimiento anterior es básicamente válido
y se ha usado con éxito para el desarrollo de numerosas vacunas
para uso humano y veterinario. Sin embargo, es relativamente
ineficaz porque la fase logarítmica de la replicación de virus,
durante la que es más probable que se produzcan mutaciones, se
completa con frecuencia mucho antes de que se hagan visiblemente
evidentes pruebas de la replicación viral.
El documento US 5.840.563 desvela un
procedimiento para los virus del síndrome respiratorio y de
infertilidad porcino en aumento, por el que el virus se inocula en
células de simio y las células de simio inoculadas se incuban.
El documento US 5.846.805 describía un virus del
síndrome respiratorio y de infertilidad porcino atenuado que se
produce por un procedimiento que comprende pasar el virus del
síndrome respiratorio y de infertilidad porcino por células de
simio.
El documento US 5.476.778 desvela un
procedimiento de atenuación de virus del síndrome respiratorio y de
infertilidad porcino que comprende pasar el virus por una línea
celular de simio en condiciones bien definidas.
El documento US 4.211.843 desvela un
procedimiento para la producción de una cepa atenuada de virus del
sarampión, eficaz para la producción de vacuna de virus del
sarampión atenuado.
El documento US 4.224.412 desvela una vacuna de
cultivo de virus vivo contra el moquillo canino y procedimientos de
preparación de dicha vacuna.
Ciaccio, G. (1970) [Biology of attenuated, mumps
rubella, measles and rabies viruses. Comparative considerations on
the methods of attenuation of their virulence] Rivista di biologia
63 (1), 87-129 describe la biología de diferentes
virus atenuados.
Kawai y Masumoto (1977) Virology 76,
60-71 describen partículas interferentes y no
interferentes generadas por un virus variante de placas pequeñas de
rabia.
Por lo tanto, existe una necesidad indudable en
la técnica de una vacuna que confiera una inmunidad eficaz contra
cepas de VSRRP, incluyendo cepas de VSRRP atípicas recientemente
descubiertas. También existe la necesidad en la técnica de un
procedimiento de preparación de dicha vacuna. Por último, lo que se
necesita es un procedimiento de pase de un virus que atenúe el
virus más eficazmente de lo que hasta ahora se creía posible, con el
virus atenuado resultante generando anticuerpos específicos de
VSRRP en ganado porcino, confiriendo de este modo una inmunidad
eficaz frente a una infección posterior por VSRRP.
La presente invención se define como sigue: Un
procedimiento de pases múltiples para atenuar un virus SRRP capaz
de inducir un efecto citopático, que incluye las etapas de replicar
sucesivamente dicho virus por inoculación y replicación del virus
en cultivos celulares individuales hasta que se consiga su
atenuación, caracterizado porque cada etapa de inoculación y
replicación sucesiva comprende
- 1)
- retirar una muestra que contiene virus del cultivo celular mientras que el virus se está replicando a una velocidad logarítmica y antes de la inducción de efectos citopáticos en el cultivo celular,
- 2)
- inocular el siguiente cultivo celular con una alícuota de dicha muestra de modo que se usa la alícuota más pequeña que mantiene la infección y la replicación logarítmica, y de modo que sólo se transfieren cantidades pequeñas de virus de un pase a otro,
- 3)
- conservar cada cultivo celular del que se retiró una muestra (de acuerdo con la etapa 1) después de la etapa de retirada y
- 4)
- observar si se produce inducción de un efecto citopático en cada uno de dichos cultivos celulares conservados.
\vskip1.000000\baselineskip
La etapa de retirada 1) se lleva a cabo
aproximadamente 24 horas después de la inoculación de dichos
cultivos celulares y los cultivos celulares empleados comprenden una
monocapa de células que tienen una confluencia superior a
aproximadamente el 70%.
El procedimiento comprende además la etapa de
ensayar periódicamente dicho virus progenie para determinar su
atenuación y también incluye la etapa de proporcionar un exceso de
células inicialmente no infectadas para asegurar que dicho virus
pueda replicarse a una velocidad logarítmica.
Además, cada una de las inoculaciones sucesivas
que implican el pase antes de que se observe un efecto citopático
se lleva a cabo después de que se observe un efecto citopático en un
cultivo celular previamente inoculado, siendo dicho cultivo celular
previamente inoculado un cultivo parental de las células de las que
se retira una alícuota para el pase.
La presente invención supera los problemas
resumidos anteriormente. Se describen cepas de VSRRP atípico
atenuado y las vacunas vivas modificas mejoradas correspondientes
que confieren una inmunidad eficaz contra cepas de VSRRP atípicas
recientemente descubiertas. La expresión "inmunidad eficaz" se
refiere a la capacidad de una vacuna para prevenir infecciones por
VSRRP en ganado porcino, incluyendo infecciones por VSRRP atípico
que dan como resultado signos clínicos importantes de la
enfermedad. Es decir, el ganado porcino inmunizado puede o no ser
serológicamente positivo para VSRRP, pero no presenta ningún síntoma
clínico importante. La expresión "VSRRP atípico" se refiere a
estas nuevas cepas de SRRP que son sustancialmente más virulentas
que las cepas de VSRRP
típicas.
típicas.
La vacuna descrita en el presente documento
incluye virus vivo cuya virulencia se ha atenuado. Se ha demostrado
que el virus atenuado resultante es avirulento y confiere una
inmunidad eficaz. Se seleccionó una cepa particularmente virulenta
de SRRP atípico (denominada JA-142) que causaba
síntomas especialmente graves de SRRP y representa la cepa
dominante de VSRRP atípico para su atenuación posterior por pase. El
virus atenuado resultante se ha depositado en la Colección
Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, MD el 2 de febrero de
1999 y concordaba con el Nº de Acceso de la ATCC
VR-2638. Este virus atenuado es un Virus de Semilla
Maestra (VSM) preferido que se ha pasado y desarrollado
posteriormente como una vacuna de VSRRP eficaz.
El nombre dado al virus no atenuado,
JA-142, surge del patrón enzimático de restricción.
El 1 representa la incapacidad de la enzima MLU I para escindir el
virus en el marco de lectura abierta 5 (ORF 5). El 4 representa la
escisión por Hinc II en las posiciones de pares de bases 118 y 249
de la ORF 5 y secuencias contiguas cortas. El 2 representa la
escisión por Sac II en la posición del par de bases 54 de la ORF 5 y
secuencias contiguas cortas.
El pase del virus hasta su atenuación se efectuó
usando un nuevo procedimiento que daba como resultado una eficacia
aumentada. En concreto, el virus se mantuvo en la fase de
replicación logarítmica durante todos los múltiples pases de
cultivo celular para acortar sustancialmente el tiempo hasta la
atenuación. Esto se consigue asegurándose de que en cada cultivo
celular exista un exceso sustancial de células inicialmente no
infectadas respecto al número de virus presente. Así, transfiriendo
sólo pequeñas cantidades de virus de un pase a otro, se asegura una
replicación logarítmica.
En la práctica, el procedimiento se inicia
normalmente por inoculación de varios cultivos celulares distintos
con alícuotas virales progresivamente más pequeñas (es decir, menor
cantidad de virus en cada cultivo). Por ejemplo, los cultivos de
partida podrían contener alícuotas virales de 200 \mul, 20 \mul
y 2 \mul. Después de un periodo de incubación corto inicial (por
ejemplo, \sim24 horas), las mismas alícuotas virales (en el
ejemplo, de 200 \mul, 20 \mul y 2 \mul) de cada cultivo
celular se transfieren a cultivos individuales recién preparados
(previamente no infectados), mientras que los cultivos de partida se
controlan hasta que se observa o no un efecto citopático (ECP).
Este procedimiento se continúa en un orden en serie durante
múltiples pases, usando las mismas alícuotas virales en cada caso y
conservando los cultivos para la observación del ECP. Si todos los
pases de cultivo en serie presentan ECP después de que se completen
un número seleccionado de pases, puede terminarse la serie de mayor
alícuota viral (en el ejemplo, de 200 \mul y 20 \mul), después
de lo cual se emplea otra serie de alícuotas virales
progresivamente más pequeñas (por ejemplo, de 2 \mul, 0,2 \mul
y 0,02 \mul) y el procedimiento se repite de nuevo, manteniendo de
nuevo los cultivos celulares después de la transferencia para la
observación del ECP.
En algún punto en este procedimiento de
inoculación de alícuotas virales sucesivamente más pequeñas no se
observará ECP en un cultivo celular dado. Cuando esto ocurre, el
siguiente mayor nivel de alícuota viral que muestra ECP sustituye
al pase en el que no se observó ECP, después de lo cual se
inocularán pases posteriores usando las alícuotas virales
previamente empleadas.
En vista de que un virus tenderá a volverse más
eficaz en la infección de células y también a replicarse hasta un
mayor título de infectividad para cultivos celulares con el tiempo
(lo que es especialmente cierto con virus de ARN tales como el
VSRRP), se observará que son necesarias alícuotas virales cada vez
más pequeñas para mantener la infección durante la transferencia en
serie. El uso de la alícuota más pequeña que mantiene la infección
contribuye a asegurar que la replicación viral permanece en una fase
logarítmica durante todo el procedimiento.
La secuencia de ADN del virus pasado atenuado
del pase 201 se determinó después usando procedimientos
convencionales. La secuencia de este virus atenuado se designó como
VSM JA-142 Pase Nº 201, y cuya secuencia se
proporciona como SEC ID Nº: 1. La secuencia del virus virulento,
JA-142, se proporciona como SEC ID Nº: 2.
Como se usan en el presente documento, serán
aplicables las definiciones siguientes: La "identidad de
secuencia", como se conoce en la técnica, se refiere a una
relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más
secuencias polinucleotídicas, en concreto una secuencia de
referencia y una secuencia dada que se comparará con la secuencia
de referencia. La identidad de secuencia se determina por
comparación de la secuencia dada con la secuencia de referencia
después de que las secuencias se hayan alineado óptimamente para
producir el mayor grado de similitud de secuencia, según se
determina por el emparejamiento entre hebras de dichas secuencias.
Tras dicho alineamiento, se determina la identidad de secuencia en
base a posición por posición, por ejemplo, las secuencias son
"idénticas" en una posición particular si, en esa posición, los
nucleótidos o restos aminoacídicos son idénticos. El número total
de dichas identidades de posición se divide después entre el número
total de nucleótidos o restos en la secuencia de referencia para
dar el % de identidad de secuencia. La identidad de secuencia puede
calcularse fácilmente por procedimientos conocidos, incluyendo, pero
sin limitación, los descritos en Computational Molecular Biology,
Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, Nueva York (1988),
Biocomputing: Informatics y Genome Projects, Smith, D. W., ed.,
Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence
Data, Parte I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press,
Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von
Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer,
Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York
(1991); y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073
(1988).
Los procedimientos preferidos para determinar la
identidad de secuencia están diseñados para dar el mayor
emparejamiento entre las secuencias ensayadas. Los procedimientos
para determinar la identidad de secuencia están codificados en
programas informáticos disponibles públicamente que determinan la
identidad de secuencia entre secuencias dadas. Los ejemplos de
dichos programas incluyen, pero sin limitación, el paquete de
programas GCG (Devereux, J. y col., Nucleic Acids Research, 12 (1):
387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. y col., J.
Molec. Biol., 215: 403-410 (1990). El programa
BLASTX está disponible públicamente en el NCBI y otras fuentes
(BLAST Manual, Altschul, S. y col., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894,
Altschul, S. F. y col., J. Molec. Biol., 215:
403-410 (1990)). Estos programas alinean óptimamente
secuencias usando pesos de huecos por defecto para producir el
mayor nivel de identidad de secuencia entre las secuencias dada y de
referencia. Como ilustración, por un polinucleótido que tiene una
secuencia de nucleótidos que tiene una "identidad de
secuencia" de al menos, por ejemplo, el 95% con una secuencia de
nucleótidos de referencia se entiende que la secuencia de
nucleótidos del polinucleótido dado es idéntica a la secuencia de
referencia excepto por que la secuencia polinucleotídica dada puede
incluir hasta 5 mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la
secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, en un
polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una
identidad de al menos el 95% respecto a la secuencia de nucleótidos
de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de
referencia pueden delecionarse o sustituirse con otro nucleótido, o
un número de nucleótidos de hasta el 5% de los nucleótidos totales
en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de
referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden
aparecer en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de
nucleótidos de referencia, o en cualquier parte entre esas
posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los
nucleótidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos
contiguos dentro de la secuencia de referencia. De forma análoga,
por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos dada que
tiene, por ejemplo, una identidad de secuencia de al menos el 95%
con una secuencia de aminoácidos de referencia, se entiende que la
secuencia de aminoácidos dada del polipéptido es idéntica a la
secuencia de referencia excepto por que la secuencia polipeptídica
dada puede incluir hasta 5 modificaciones de aminoácidos por cada
100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En
otras palabras, para obtener una secuencia polipeptídica dada que
tenga una identidad de secuencia de al menos el 95% con una
secuencia de aminoácidos de referencia, hasta el 5% de los restos
aminoacídicos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o
sustituirse con otro aminoácido, o un número de aminoácidos de
hasta el 5% del número total de restos aminoacídicos en la secuencia
de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia.
Estas modificaciones de la secuencia de referencia pueden aparecer
en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de
aminoácidos de referencia, o en cualquier parte entre esas
posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los
restos de la secuencia de referencia o en el uno o más grupos
contiguos dentro de la secuencia de referencia. Preferentemente, las
posiciones de restos que no son idénticos difieren en sustituciones
de aminoácidos conservativas. Sin embargo, las sustituciones
conservativas no se incluyen como un emparejamiento cuando se
determina la identidad de
secuencia.
secuencia.
De forma similar, la "homología de
secuencia", como se usa en el presente documento, también se
refiere a un procedimiento para determinar el grado de relación de
dos secuencias. Para determinar la homología de secuencia, dos o
más secuencias se alinean óptimamente como se ha descrito
anteriormente y se introducen huecos si es necesario. Sin embargo,
al contrario que la "identidad de secuencia", se cuentan las
sustituciones de aminoácidos conservativas como emparejamiento
cuando se determina la homología de secuencia. En otras palabras,
para obtener un polipéptido o polinucleótido que tenga una
homología de secuencia del 95% con una secuencia de referencia, el
95% de los restos aminoacídicos o nucleótidos en la secuencia de
referencia deben coincidir, o comprender una sustitución
conservativa, con otro aminoácido o nucleótido, o un número de
aminoácidos o nucleótidos de hasta el 5% de los restos
aminoacídicos o nucleótidos totales, sin incluir sustituciones
conservativas, en la secuencia de referencia pueden insertarse en la
secuencia de referencia.
Una "sustitución conservativa" se refiere a
la sustitución de un resto aminoacídico o nucleótido con otro resto
aminoacídico o nucleótido que tiene características similares o
propiedades que incluyen tamaño, hidrofobicidad, etc., de modo que
la funcionalidad global no cambia significativamente.
El término "aislado" significa alterado
"por la mano del hombre" de su estado natural, es decir, si
aparece en la naturaleza, se ha modificado o retirado de su entorno
original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido
presente de forma natural en un organismo vivo no está
"aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado
de los materiales coexistentes de su estado natural está
"aislado", según se emplea el término en el presente
documento.
documento.
Preferentemente, las secuencias que comparten
una homología de secuencia de al menos aproximadamente el 75%, más
preferentemente de al menos aproximadamente el 85%, aún más
preferentemente de al menos aproximadamente el 90% y, más
preferentemente, de al menos aproximadamente el 95% con la SEC ID
Nº: 1, son eficaces para conferir inmunidad a animales vacunados
con virus atenuados que contienen dichas secuencias homólogas. Como
alternativa, las secuencias que comparten una identidad de
secuencia de al menos aproximadamente el 65%, más preferentemente
de al menos aproximadamente el 75%, aún más preferentemente de al
menos aproximadamente el 85% y, más preferentemente, de al menos
aproximadamente el 95% con la SEC ID Nº: 1, también son eficaces
para conferir inmunidad a animales vacunados con virus atenuados que
contienen dichas secuencias idénticas.
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Los ejemplos siguientes exponen realizaciones
preferidas de la presente invención. Sin embargo, debe entenderse
que estos ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y que nada
en los mismos debe tomarse como una limitación del ámbito global de
la invención.
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Este ejemplo describe un procedimiento de pase
para atenuar virus que maximiza la eficacia de atenuación asegurando
que el virus esté preferentemente en una fase de replicación
logarítmica. El virus se pasó (es decir, una alícuota de medio
nutritivo que incluía el virus, células no unidas y residuos
celulares de un cultivo celular infectado por virus se añadió al
medio nutritivo de un cultivo no infectado) a intervalos diarios. Se
añadieron diferentes cantidades de virus a cada intervalo usando
múltiples cultivos. Por ejemplo, al principio, se transfirieron 200
\mul a un cultivo no infectado, se añadieron 20 \mul a un
segundo cultivo no infectado y 2 \mul a un tercer cultivo no
infectado. El objetivo era tener una cantidad suficiente de células
susceptibles de modo que los ciclos de replicación pudieran
continuar hasta la transferencia siguiente. El procedimiento se
consideraba exitoso si las células mostraban finalmente ECP. Sin
embargo, debido a que el ECP inducido por VSRRP no aparece hasta
cierto tiempo después de la fase de crecimiento logarítmica, los
pases se realizaron antes de que se supiera si serían o no
finalmente exitosos ("pases a ciegas"). Se decía que los pases
que daban como resultado ECP inducido por virus habían dado como
resultado una "toma". Si un pase no daba como resultado una
toma, el pase se reiniciaba la mayor dilución del último pase que
daba como resultado una toma. A medida que se realizaban más y más
pases, el virus se adaptaba más a replicarse en la línea celular y
era menos capaz de producir síntomas de enfermedad en su huésped
original. Estos cambios se producen por mutaciones aleatorias que se
producen durante la replicación.
Usando este procedimiento, se usaron los
procedimientos siguientes para pasar un virus ejemplar de acuerdo
con la presente invención, VSM, JA-142. Esta cepa se
pasó en cultivos celulares MARC-145 a intervalos
diarios. Se usaron placas de veinticuatro pocillos para el
procedimiento para minimizar la cantidad de células y de medio
nutritivo necesaria y para simplificar la técnica de pase de
múltiples alícuotas. Se añadieron células y medio nutritivo a cada
pocillo y se dejó que las células formaran o casi formaran (más de
aproximadamente el 70%) una monocapa confluente. El medio nutritivo
comprendía medio esencial mínimo (MEM) de solución salina
equilibrada de Earle a aproximadamente el 90%, suero fetal de
ternera al 10% y 0,05 mg/ml de sulfato de gentamicina. El volumen
de medio nutritivo usado era de aproximadamente 1 ml. Habitualmente
se usaron tres pocillos de una columna para cada cantidad de virus
que se transfirió. Una alícuota de medio nutritivo del pase anterior
se transfirió al primer pocillo de la columna a las 48 ó 72 horas,
después de que se hubieran preparado los cultivos celulares, medio
nutritivo del primer pocillo se transfirió al segundo pocillo de la
misma columna a las 72 ó 96 horas y al tercer pocillo de la misma
columna a las 96 ó 120 horas. Las placas se preparaban
habitualmente dos veces por semana, de modo que a veces se usaba el
cuarto pocillo de la columna y a veces no se usaba. Las condiciones
de pase se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera húmeda que contenía
CO_{2} al 5%.
Se ensayaron alícuotas de diferentes tamaños
(que tenían diferentes cantidades de virus) para cada pase para
determinar si la cantidad de virus era suficiente para inducir el
ECP. Por ejemplo, se usó una serie distinta de transferencias de
alícuotas (pases) de 200 \mul, 20 \mul y 2 \mul,
respectivamente, hasta que las alícuotas más pequeñas presentaban
sistemáticamente ECP, siendo el objetivo transferir la alícuota más
pequeña que producía ECP. Cuando la alícuota más pequeña (por
ejemplo, de 2 \mul) del grupo de alícuotas que se estaba
ensayando daba como resultado sistemáticamente ECP, se ensayaban
cantidades menores (por ejemplo, de 0,2 \mul y 0,02 \mul).
Cuando una dilución determinada no presentaba ECP, esa serie de
cultivos se reiniciaba con la siguiente menor cantidad que daba
como resultado ECP a ese pase (es decir, si la transferencia de 2
\mul no tenía éxito produciendo ECP en el pase 25 pero la
transferencia de 20 \mul en el pase 25 tenía éxito, la
transferencia de 2 \mul se repetía usando 20 \mul, reanudando
las transferencias de 2 \mul para el pase 26).
Usando este procedimiento, se determinaba la
menor cantidad de virus que era necesario transferir para obtener
ECP. El virus se pasaba con éxito a intervalos diarios usando las
cantidades siguientes de medio nutritivo infectado por virus (que
reflejan la mayor dilución [es decir, la alícuota más pequeña] que
daba como resultado ECP, teniendo presente que también funcionarían
otras diluciones):
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
El pase de los virus usando el procedimiento
anterior daba como resultado un VSRRP atenuado,
JA-142. Como es evidente, el virus se adaptaba más
a replicarse en el cultivo celular y por lo tanto requería que se
transfiriera una menor cantidad de medio nutritivo infectado por
virus a medida que continuaban los pases. Para transferencias
usando una cantidad muy pequeña de medio nutritivo infectado por
virus (por ejemplo, de 0,2 \mul o 0,02 \mul) era necesaria una
dilución distinta. Esta dilución se efectuaba añadiendo una pequeña
cantidad de medio nutritivo infectado por virus a una mayor
cantidad de medio nutritivo. Por ejemplo, para obtener una
transferencia de 0,2 \mul, se añadían 2 \mul de medio nutritivo
infectado por virus a 20 \mul a medio nutritivo y se añadían 2
\mul de esta dilución al siguiente cultivo en la serie. Usando
esta estrategia, se usaba la mayor dilución que daba como resultado
un ECP y se minimizaba el tiempo necesario para pasar el virus. El
pase a intervalos diarios aseguraba que el virus estaba siempre en
una fase de replicación logarítmica. La transferencia diaria
también aseguraba que hubiera un número adecuado de células para la
replicación del virus.
Debido a que las mutaciones (que probablemente
son acumulativas) que probablemente dan como resultado la atenuación
sólo se producen durante la replicación, no supone una ventaja
tener sustancialmente todas las células infectadas ni que la
replicación se desarrolle a una velocidad más lenta o se detenga
antes de la siguiente transferencia. Basándose en estudios previos
del VSRRP, se sabía que el ciclo de replicación es de
aproximadamente 8 horas, por lo tanto, transferir una cantidad
mínima de virus de medio nutritivo infectado por virus a medio
nutritivo no infectado a intervalos diarios da como resultado que
el virus tenga siempre muchas células en las que replicarse.
Como puede apreciarse fácilmente, el pase usando
este procedimiento da como resultado ahorros de tiempo que hasta
ahora se creían imposibles (es decir, cada pase requería menos
tiempo). Esto es especialmente importante cuando son necesarios un
alto número de pases para una atenuación viral adecuada. Si cada
pase, usando los procedimientos antiguos, se realizaba a un
intervalo de 3 días, un procedimiento que requiera 200 pases
llevaría 400 días menos usando el procedimiento de la presente
invención.
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Este ejemplo determinaba si el pase 200 del
virus SRRP, JA-142, revertiría a virulento cuando se
pasase en el animal huésped seis veces. Este estudio estaba
constituido por seis grupos. Cinco cerdos del grupo 1 (grupo
principal) se inocularon por vía intranasal con VSM de SRRP,
JA-142 pase 200, mientras que tres cerdos del
grupos 1A (grupo de control) se inocularon por vía intranasal con
diluyente estéril. A los animales se les suministró pienso
comercial y agua ad libitum durante todo el estudio. Los
cerdos de ambos grupos de tratamiento se controlaron diariamente
para determinar los signos clínicos (aspecto, signos respiratorios,
heces, etc.). Después de seis días, los animales se pesaron, se les
extrajo sangre y se sacrificaron. Después de puntuar los pulmones
para las lesiones, se recogieron lavados pulmonares de cada animal.
Los lavados pulmonares se congelaron y se descongelaron una vez, y
se preparó una combinación usando 2,0 ml de suero y 2,0 ml de lavado
pulmonar de cada animal dentro de un grupo para preparar los
Retropases 1 y 1A, respectivamente. Esta combinación se usó para
exponer (por vía intranasal) a los animales del grupo 2 y del grupo
2A, respectivamente. Este procedimiento se repitió para los grupos
3 y 3A a 6 y 6A. Los animales de cada grupo se alojaron por separado
pero en condiciones idénticas.
Después de la inoculación, se recogieron
muestras de sangre y se controlaron las temperaturas corporales. Se
midieron las temperaturas rectales para cada animal periódicamente
desde -1 DPE (días post-exposición) a 6 DPE y se
calculó el promedio junto con las temperaturas de otros animales del
mismo grupo. El estado de salud de cada animal se controló
diariamente durante la duración del estudio. Los resultados se
recopilaron y se puntuaron en forma de observación diaria. Los
parámetros de puntuación son los siguientes:
- 1.
- Aspecto
- \quad
- normal = 0; deprimido = 1; excitado = 2; comatoso/muerto = 30.
- 2.
- Respiración
- \quad
- normal = 0; estornudos = 1; tos = 1; rápida/lenta = 2; con dificultad = 3.
- 3.
- Heces
- \quad
- normales = 0; secas = 1; sueltas = 2; líquidas = 3.
- 4.
- Ojos
- \quad
- normales = 0; llorosos = 1; apagados = 2; hundidos = 3.
- 5.
- Orificios nasales
- \quad
- normales = 0; exudado seroso = 1; enrojecidos/inflamados = 2; úlceras con costras = 3.
- 6.
- Boca
- \quad
- normal = 0; balas = 2; úlceras = 3.
- 7.
- Actividad
- \quad
- NA
- 8.
- Apetito
- \quad
- normal = 0; disminuido = 1; anoréxicos (ninguno= = 3.
- 9.
- Otros
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales también se pesaron antes de la
inoculación y en la necropsia. Se calculó el promedio del aumento
de peso para cada grupo para su comparación. Se realizaron ensayos
inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) y ensayos de
neutralización de suero (NS) de SRRP después de las exposiciones de
los animales a artículos de ensayo y de control. Se realizaron
intentos para aislar VSRRP de muestras de suero en células
MA-104. Antes y después de la vacunación, se
determinaron los recuentos de leucocitos totales usando un COULTER
COUNTER MODEL Z1, Coulter Corp., Miami, FL. En la necropsia, se
puntuaron los pulmones de cada animal. La puntuación del pulmón se
realizó separando el pulmón en 7 secciones y determinando el
porcentaje de implicación pulmonar (el porcentaje del área pulmonar
afectada como se muestra por lesiones o enrojecimiento para cada
sección y multiplicando por el área aproximada de pulmón total) del
porcentaje de área pulmonar total que abarca la sección. Los
parámetros para la puntuación pulmonar son los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Cada grupo de cerdos se controló durante seis
días después de la vacunación. Las puntuaciones clínicas eran bajas
en todos los grupos. Los resultados de las puntuaciones clínicas se
proporcionan en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
No había diferencias significativas entre grupos
para las temperaturas rectales o los aumentos de peso diarios. Todas
las puntuaciones pulmonares eran negativas.
Serológicamente, las proporciones de S/P de
ELISA y títulos de NS eran negativos durante todo el periodo de
ensayo de cada grupo. Se intentó el aislamiento de virus en todas
las muestras de suero y lavados pulmonares. El día 6, el
60-100% de las muestras de suero de los grupos a los
que se les administró JA-142, pase 200, y retropases
posteriores eran positivos. Los grupos a los que se les administró
solución salina eran negativos. En los tres primeros pases se
recuperó virus en los lavados pulmonares de sólo el
20-40% de los cerdos, pero en los últimos tres
pases, el virus se recuperó del 50-80% de los
cerdos.
Basándose en estos datos, el
JA-142 pase 200 no revertía a virulento cuando se
pasaba por cerdos seis veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demostraba que el nivel de
atenuación de seguridad de VSM, JA-142, pase 200 no
cambiaba significativamente durante seis retropases en el animal
huésped. La evaluación del nivel de atenuación o seguridad se
realizó usando el modelo de cerda gestante y controlando el efecto
sobre el rendimiento reproductivo. Este modelo es el sistema de
ensayo más sensible y no depende de factores subjetivos para el
ensayo de la virulencia. Este ejemplo estaba constituido por cuatro
grupos (A, B, C y D) que tenían siete cerdas por grupo. El grupo A
se inoculó por vía intranasal con VSM de SRRP,
JA-142 pase 200. El grupo B se inoculó por vía
intranasal con JA-142 pase 200, retropase 6. El
grupo C se inoculó por vía intranasal con diluyente estéril, para
que actuaran como controles normales. El grupo D se inoculó por vía
intranasal con VSRRP JA-142 pase 4. Los artículos
de ensayo (exposición a JA-142, pase 4) se
administraron a aproximadamente 93 días de gestación. Se controlaron
las temperaturas corporales de las cerdas durante los siete
primeros días después de la vacunación. Se recogieron muestras de
sangre de las cerdas una vez por semana y en el momento del parto.
Se recogieron muestras de sangre y se registraron los pesos de los
lechones al nacimiento, a los 7 y 14 días de edad. El estado de
salud de cada animal se controló diariamente durante la duración
del estudio hasta y después del parto durante 14 días. El
rendimiento del parto se evaluó observando el estado de salud de los
lechones nacidos.
Se realizaron ensayos de ELISA de SRRP después
de las exposiciones de las cerdas al artículo de ensayo. También se
realizaron ensayos de ELISA de SRRP en los sueros de lechones
semanalmente después del parto. Después de la exposición al
artículo de ensayo, se realizaron intentos para aislar VSRRP de
muestras de suero en células MA-104. Se midieron
las temperaturas rectales periódicamente desde 0 días
post-vacunación (DPV) a 7 DPV, y se determinó la
temperatura promedia de cada grupo. Antes y después de la
inoculación, se determinaron los recuentos de leucocitos totales
como en el Ejemplo 1. Se realizaron observaciones clínicas de las
cerdas como en el Ejemplo 2, desde -1 DPV hasta el parto. Se
realizaron observaciones clínicas de los lechones desde el parto
hasta los 14 días de edad. Por último, en la necropsia se puntuaron
los pulmones de cada lechón para determinar el porcentaje de
implicación pulmonar.
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Los resultados de ELISA indican que los animales
usados en el presente estudio no habían recibido una exposición
previa a VSRRP. Los animales que recibieron inóculos de virus, los
grupos A, B y D, presentaban seroconversión a los 14 días
post-tratamiento. Tres cerdas del grupo B
permanecían negativas a los 14 días
post-tratamiento. En el momento del parto, las
cerdas negativas del grupo B daban positivo en el ensayo para
anticuerpos contra VSRRP.
Los resultados de ELISA de los cerdos indicaban
que la mayoría de las muestras de lechones nacidos de las cerdas
del grupo A y del grupo B se tomaron después de que hubieran mamado.
Esos cerdos que eran negativos a cero días
post-parto (0 DPP) daban positivo en el ensayo a 7
DPP. Todos los cerdos nacidos de cerdas del grupo C eran
seronegativos en el ensayo durante todo el estudio. Sólo se
ensayaron unos pocos cerdos del grupo D, puesto que la mayoría eran
mortinatos o estaban momificados. La mitad de esos cerdos que se
ensayaron eran seropositivos. Esto indicaba que se tomaron muestras
de los cerdos seronegativos antes de que mamaran, o que no fueron
capaces de mamar. Todos los lechones nacidos de cerdas del grupo D
murieron antes de 7 DPP. Los aislamientos de VSRRP de las cerdas de
los grupos A y B eran esporádicos. Aunque los resultados del ensayo
de ELISA indicaban que estas cerdas se inocularon con éxito con los
artículos de ensayo virales, muchas permanecían negativas para
aislamiento de virus a partir de suero.
La mayoría de los cerdos nacidos de cerdas de
los grupos A y B daban positivo en el ensayo para aislamiento de
virus durante la realización del estudio. La camada nacida de una
cerda del grupo A nunca dio positivo en el ensayo y en la camada
nacida de una cerda del grupo B sólo dos de ocho lechones dieron
positivo en el ensayo para aislamiento de virus. No se recuperó
virus de los lechones nacidos de cerdas del grupo C. Se recuperó
virus de la mayoría (71%) de los lechones nacidos de cerdas del
grupo D.
Las temperaturas rectales
post-tratamiento eran corrientes. Los grupos que se
trataron con VSM, retropase 6 o diluyente estéril no tuvieron
mediciones que superasen los 38,72ºC (101,7ºF). El grupo D, tratado
con JA-142, pase 4, tenía cuatro (de siete) cerdas
que sufrieron temperaturas que superaban los 38,89ºC (102ºF),
alcanzando una cerda 39,67ºC (103,4ºF) durante uno de los días. El
comportamiento de aumento de peso de los lechones nacidos de cerdas
de los grupos A (tratado con VSM) y B (tratados con VSM, retropase
6) era superior que el de los cerdos nacidos de cerdas de control
del grupo C. El promedio de aumento de peso para el periodo de
observación de 14 días era de 3,58 kg (7,9 lb). Para el grupo A era
de 3,49 kg (7,7 lb); para el grupo B y el grupo C era de 3,13 kg
(6,9 lb). La diferencia en el aumento de peso no estaba relacionada
con el tamaño de la camada restante a los 14 días. Los tamaños de
camada promedios a los 14 días post-parto (DPP) eran
de 9 para el grupo A, 7 para el grupo B y 10 para el grupo C.
Ningún cerdo nacido de las cerdas del grupo D sobrevivió más allá de
3 DPP.
Los recuentos de leucocitos (WBC) para las
cerdas de los grupos A, B y C permanecían relativamente constantes.
Los porcentajes promedios de los valores
pre-exposición eran equivalentes a o superiores al
92% durante la duración del periodo de observación. Tres cerdas del
grupo D tenían recuentos de WBC que eran inferiores al intervalo
normal esperado (7-20 x 10^{6}/ml).
Las puntuaciones clínicas
post-inoculación eran corrientes para las cerdas de
los grupos A y B. Se observó que varias cerdas del grupo C
experimentaban signos clínicos durante un periodo de varios días. La
mayoría de los síntomas clínicos observados estaban en la categoría
de apetito disminuido, síntomas respiratorios y depresión. Una
cerda del grupo C murió el día 31 del ensayo de neumonía bacteriana
crónica. Se observó que seis de las siete cerdas del grupo D tenían
signos clínicos, principalmente de grados variables de gravedad, de
pérdida de apetito, que variaban desde disminuido hasta anoréxico.
Los resultados de la puntuación clínica se proporcionan en la Tabla
2.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Las observaciones clínicas de los lechones se
incluían en dos categorías principales, muerte y apetito reducido.
No había diferencias significativas entre los grupos A, B y C en el
área del promedio de muertes por camada (MPC). El grupo A tenía un
promedio de 1,3 MPC, el grupo B tenía un promedio de 2,4 MPC, el
grupo C tenía un promedio de 2,0 MPC y ningún cerdo del grupo D
sobrevivió más allá de tres días post-parto. Las
puntuaciones clínicas para los lechones se proporcionan en la Tabla
3.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los resultados de rendimiento de parto
proporcionaban las diferencias y similitudes más espectaculares
entre los diversos grupos de tratamiento. Puesto que los
tratamientos no tendrían un efecto sobre el tamaño de las camadas,
la forma más apropiada de comparar los resultados de partos sería
usando valores de porcentaje. El grupo A tenía un porcentaje
promedio de vivos/nacidos del 85% (DT +/- 9,6). El grupo B tenía un
porcentaje promedio de vivos/nacidos del 89% (DT +/- 11,6). El
grupo de control (grupo C) tenía un porcentaje promedio de
vivos/nacidos del 83,4% (DT +/- 7,9). Los porcentajes promedios para
mortinatos para los grupos A, B y C eran del 8,8 (DT +/- 9,66), 6,6
(DT +/- 9,7) y 14 (DT +/- 11,39), respectivamente. Los porcentajes
promedios de momificados nacidos de cerdas de los grupos A, B y C
eran del 6,1 (DT +/- 6,01), 3,9 (DT +/- 4,45) y 2,6 (DT +/- 4,01),
respectivamente. Los porcentajes promedios de vivos/nacidos,
mortinatos y momificados nacidos de las cerdas del grupo D eran del
8,7 (DT +/- 8,92), 10,7 (DT +/- 11,39) y 81,9 (DT +/- 17,18),
respectivamente.
Los resultados de este ejemplo demostraban la
estabilidad del VSM, JA-142, pase 200, después de
pasarse en el animal huésped seis veces. No había diferencias
significativas entre el grupo de cerdas tratadas con el VSM (grupo
A) y las cerdas que se expusieron al virus del retropase 6 (grupo B)
en las categorías de rendimiento de parto, leucopenia, temperaturas
rectales y observaciones clínicas de las cerdas o de los lechones.
Además, los resultados en estas mismas categorías para los grupos A
y B eran comparables a los conseguidos por el grupo C, que se había
tratado con diluyente estéril. Por último, el rendimiento de las
cerdas que se habían expuesto al virus parental virulento de VSM,
JA-142, pase 4, ilustraba claramente el nivel de
atenuación del VSM y la ausencia de reversión a virulencia por el
virus JA-142 retropase 6.
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Este ejemplo evaluaba la seguridad y el nivel de
atenuación de administrar una concentración 10X de VSM,
JA-142, pase 201. El estudio se realizó en el
modelo de cerda gestante y se controló el efecto de esta
dosificación sobre el rendimiento reproductivo. El estudio estaba
constituido por tres grupos, A, C y D. El grupo A se inoculó por
vía intranasal con VSM de SRRP, JA-142, pase 200. El
grupo C se inoculó por vía intranasal con diluyente estéril para
que actuara como grupo de control normal. El grupo D se inoculó por
vía intranasal con JA-142 pase 201 10X. Todas las
inoculaciones se administraron a aproximadamente 93 días de
gestación. Se controlaron las temperaturas corporales de las cerdas
durante los primeros siete días después de la inoculación
(vacunación). Se recogieron muestras de sangre de las cerdas una vez
por semana y en el momento del parto. Antes y después de la
inoculación, se determinaron los recuentos de leucocitos totales
como en el Ejemplo 2. El estado de salud de cada animal se controló
diariamente durante la duración del estudio hasta y después del
parto durante 14 días. Se realizaron observaciones clínicas de las
cerdas desde -1 DPV hasta el parto. El rendimiento del parto se
evaluó por observación del estado de salud de los lechones nacidos.
Se realizaron ensayos de ELISA de VSRRP después de las exposiciones
de las cerdas al artículo de ensayo. Se realizaron intentos para
aislar VSRRP de muestras de suero en células MA-104
después de la exposición al artículo de ensayo. Se realizaron
observaciones clínicas de los lechones desde el parto hasta los 14
días de edad. Se recogieron muestras de sangre de los lechones al
nacimiento, a los 7 y 14 días de edad. Se realizaron ensayos de
ELISA de VSRRP en los sueros de lechones semanalmente después del
parto. Los lechones también se pesaron al nacimiento, el día 7
post-parto y en la necropsia. En la necropsia, los
pulmones de cada lechón se puntuaron para determinar el porcentaje
de implicación pulmonar.
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No había diferencias significativas entre los
grupos a los que se les administró una dosis 10X de VSM,
JA-142, pase 201, los grupos a los que se les
administró una dosis normal de VSM, JA-142, pase
200, y los grupos a los que se les administró diluyente estéril.
Por lo tanto, basándose en la seguridad y la atenuación de VSM,
JA-142, pase 200 y en la ausencia de cualquier
diferencia significativa en los resultados que comparan estos
grupos, se demostró que una dosis 10X de VSM ,
JA-142, pase 201 era segura, estaba atenuada y era
eficaz para inducir anticuerpos contra VSRRP.
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Este ejemplo demostró que una dosis de vacuna
mínima de VSRRP, JA-142, pase 205 que representa
VSM+5 es eficaz en un modelo de exposición respiratoria
experimental en cerdos de engorde. Se dividieron los cerdos en tres
grupos. El grupo 1 se inoculó por vía intramuscular con VSM de SRRP,
JA-142 pase 205 a un título de 2,0 log/dosis. El
grupo 2 se inoculó por vía intramuscular con diluyente estéril. El
grupo 3 actuó como control normal. Los cerdos de los grupos 1 y 2
se expusieron a un aislado de VSRRP con un patrón de RFLP de 144 a
día 28 post-vacunación. Se controlaron las
temperaturas corporales de los cerdos durante los siete primeros
días después de la vacunación y diariamente después de la
exposición. Cada animal se pesó en la vacunación, en la exposición,
semanalmente durante todo el estudio y en la necropsia. Se
recogieron muestras de sangre semanalmente después de la vacunación
y cada dos días después de la exposición. Se controló el estado de
salud de cada animal diariamente durante la duración del estudio.
En la necropsia, se sacrificó cada animal y los pulmones se
puntuaron para determinar el porcentaje de implicación pulmonar
como en el Ejemplo 2. Se realizaron ensayos de ELISA de VSRRP
después de las exposiciones de los cerdos a los artículos de ensayo
y exposición. Después de la exposición a los artículos de ensayo,
se realizaron intentos para aislar VSRRP de muestras de suero en
células MA-104. Se analizaron los resultados de
aislamiento de virus y ELISA usando un análisis de \chi^{2} que
ensaya si el porcentaje de animales positivos es el mismo en cada
grupo. Se realizaron recuentos de leucocitos como en el Ejemplo
2.
\vskip1.000000\baselineskip
A los cerdos del grupo 1 (cerdos vacunados) les
fue mejor en todos los aspectos de este ejemplo de lo que les fue a
los cerdos del grupo 2 (cerdos a los que se administró diluyente
estéril). Las puntuaciones clínicas, temperaturas rectales y
porcentaje de implicación pulmonar eran todos superiores para los
cerdos a los que se administró diluyente estéril. Los recuentos de
leucocitos y el aumento de peso eran inferiores para los cerdos que
recibieron el diluyente estéril. También había una reducción
significativa de la viremia, que comenzaba el día 4
post-exposición en el grupo al que se administró
vacuna. Los días 10 y 11 post-exposición, el número
de animales positivos para viremia disminuyó adicionalmente en el
grupo vacunado, pero continuaba siendo el mismo en el grupo que
recibió diluyente estéril.
Se usó un ELISA para controlar el estado
serológico anti-VSRRP antes de y después de la
vacunación y de la exposición. Todos los cerdos eran negativos
(proporción S/P <0,4) en el momento de la vacunación. Todos los
cerdos, incluyendo los vacunados, eran negativos a 7 DPV (días
post-vacunación). Siete días después, 21 de 22
cerdos vacunados dieron positivo en el ensayo para anticuerpo contra
VSRRP. Dos cerdos del grupo 1 continuaron siendo negativos durante
el periodo pre-exposición y presentaron
seroconversión a los 8 días post-exposición (8
DPE). Todos los cerdos del grupo 2 eran negativos a día de ensayo 0
y continuaron siendo negativos durante todo el periodo de
pre-exposición. El día de ensayo 39 (8 DPE), 17 de
los 22 cerdos expuestos no vacunados (Grupo 2) fueron seropositivos
en el ensayo.
Todos los cerdos del grupo 3 (controles normales) continuaron siendo seronegativos durante todo el estudio.
Todos los cerdos del grupo 3 (controles normales) continuaron siendo seronegativos durante todo el estudio.
Se realizaron aislamientos de virus a partir de
sueros antes y después de la vacunación. De los 22 cerdos
vacunados, 17 eran positivos a 2 DPV, 18 eran positivos a 4 DPV y 19
eran positivos a 7 DPV. Después de la vacunación, no se recuperó en
absoluto virus de la vacuna de un cerdo, y no hasta 0 DPE de otro.
Estos resultados se corresponden con el estado seronegativo de
estos cerdos durante el periodo de observación
post-vacunación. En el momento de la exposición, el
55% de los cerdos vacunados eran positivos para viremia. Después de
la exposición, este porcentaje aumentó hasta el 82% (a 2 DPE) y
disminuyó gradualmente hasta el 9% a 11 DPE. Todos los cerdos del
grupo 2 eran negativos a 0 DPE y aumentaban hasta un 82% de
positivos a 2 DPE y 91% a 4 DPE. A 6 y 10 DPE, el grupo 2 era
aproximadamente el 82% positivo a virus y el 73% de este grupo era
positivo a 11 DPE. Los controles normales, el grupo 3, continuaron
siendo negativos durante la duración del estudio.
El control de la temperatura rectal mostraba un
aumento de grupo global experimentado por el grupo 2. La mitad de
los cerdos de este grupo experimentaban un aumento de \sim0,55ºC
(1ºF) sobre el promedio pre-exposición durante 2 o
más días durante el periodo de observación de 11 días. En
comparación, sólo cuatro de los 22 cerdos en el grupo vacunado
experimentaron temperaturas de \sim0,55ºC (1ºF) sobre su promedio
pre-exposición. La duración promedia del periodo
durante el que esos animales experimentaban temperaturas elevadas
durante dos o más días era de 2,2 días para el grupo 1 y de 4 días
para el grupo 2. Ninguno de los cerdos del grupo 3 experimentó
aumentos de \sim0,55ºC (1ºF) sobre su promedio
pre-exposición durante dos días o más tiempo.
Se controló el aumento de peso durante el
periodo de observación de 11 días. Los cerdos del grupo 3 aumentaron
un promedio de 0,48 kg/día (1,06 libras/día), los cerdos del grupo
2 aumentaron un promedio de 0,43 kg/día (0,94 libras/día) y los
cerdos del grupo 1 aumentaron un promedio de 0,24 kg/día (0,53
libras/día). Por lo tanto, los cerdos expuestos no vacunados
aumentaron sólo aproximadamente el 57% tanto peso como lo hicieron
los cerdos expuestos vacunados y sólo el 50% tanto peso como el
grupo de control.
Se controló la leucopenia (recuentos de
leucocitos) durante el periodo de observación
post-exposición. El grupo 3 experimentó una
reducción del 5% en el promedio de grupo el día de ensayo 33 (2 DPE)
en comparación con el promedio pre-exposición. Para
el grupo 2, los recuentos de leucocitos disminuyeron un promedio del
41% y no volvieron a los niveles pre-exposición
hasta DPE. El grupo vacunado experimentó una disminución promedia
de grupo del 12% el día de ensayo 34 (3 DPE). Los recuentos
volvieron al nivel pre-exposición al día siguiente
y continuaron igual al nivel pre-exposición durante
la duración del periodo de observación.
Se realizaron observaciones clínicas diarias
desde el día de ensayo 28 (-4 DPE) al día de ensayo 42 (11 DPE).
Todos los cerdos carecían de cualquier signo clínico observable
durante el periodo pre-exposición. El grupo 3
permanecía sin ningún signo clínico durante la duración del periodo
post-exposición. Se observó que cinco de los cerdos
del grupo 2 tenían signos clínicos post-exposición.
Estos signos se hicieron evidentes 6 DPE y no se consideró que
fueran graves. Los cerdos vacunados tenían 1 sólo signo clínico
observado durante el periodo de observación
post-exposición de 11 días.
A la finalización del estudio, los pulmones se
evaluaron para las lesiones pulmonares observables. El grupo 3 tenía
pulmones normales y una puntuación promedia de grupo de 0,02. Las
puntuaciones de cerdos individuales para el grupo 2 variaban desde
un mínimo de 33 hasta un máximo de 98 para un promedio de grupo de
78,33. Las puntuaciones del grupo vacunado variaban desde 30 hasta
un máximo de 90 con un promedio de grupo de 53,20.
Los datos de este ejemplo demostraron la
eficacia de una vacuna viral de SRRP atípico vivo modificado. La
vacuna se administró a una dosis mínima de 2,0 log por dosis que
contenía el quinto pase más allá del VSM (JA-142,
pase 205). La eficacia de la vacuna se demostró reduciendo
significativamente el alcance de las lesiones pulmonares, la
gravedad de la leucopenia post-exposición y la
fiebre post-exposición. Además, se mantuvo una tasa
de crecimiento normal en cerdos vacunados/expuestos en comparación
con la conseguida por los cerdos de control normales, y
significativamente mejor que la conseguida por cerdos expuestos/no
vacunados.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo comparaba cuatro grupos, los grupos
1, 2 y 3, que tenían veinte cerdos cada uno, y el grupo 4, que
tenía 10 cerdos. El grupo 1 se inoculó por vía intramuscular (IM)
con VSM de SRRP, JA-142, pase 205, a un título de
aproximadamente 2,5 log/dosis. El grupo 2 se inoculó por vía
intranasal con VSM de SRRP, JA-142, pase 205, a un
título de aproximadamente 5,0 log/dosis. El grupo 3 se inoculó IM
con diluyente estéril. El grupo 4 actuaban como controles
estrictos. Los cerdos se expusieron a un aislado de VSRRP de la
South Dakota State University (SDSU) con un patrón de RFLP de 144
el día 28 post-vacunación. Se controlaron las
temperaturas corporales de los cerdos diariamente después de la
exposición. Cada animal se pesó en la vacunación, en la exposición,
semanalmente durante la duración del estudio y en la necropsia. Se
recogieron muestras de sangre semanalmente después de la vacunación
y cada dos días después de la exposición. El estado de salud de cada
animal se controló diariamente durante la duración del estudio. A
la finalización del estudio, los animales se sacrificaron y sus
pulmones se puntuaron para determinar el porcentaje de implicación
pulmonar.
Se realizaron ensayos de ELISA de VSRRP después
de las exposiciones de los cerdos a los artículos de ensayo y
exposición. También se realizaron intentos para aislar VSRRP a
partir de muestras de suero en células MA-104
después de la exposición a los artículos de ensayo. Se determinaron
los recuentos de WBC y las observaciones clínicas
post-inoculación como en el Ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
A cero días post-vacunación
(DPV), todos los cerdos de este ejemplo eran serológicamente
negativos para VSRRP, como se indica por que tenían una proporción
de S/P <0,4. A 14 DPV, el 70% de los cerdos del grupo 1 y el 95%
de los cerdos del grupo 2 dieron positivo en el ensayo para la
presencia de anticuerpo anti-VSRRP. Sólo un cerdo
vacunado del grupo 1 continuaba siendo seronegativo durante todo el
periodo de pre-exposición. Este cerdo se volvió
seropositivo a los siete días post-exposición (DPE).
Todos los cerdos de los grupos 3 y 4 continuaron siendo negativos
durante todo el periodo pre-exposición. A nueve DPE,
todos los cerdos del grupo 3, el grupo tratado con diluyente
estéril, dieron positivo en el ensayo por ELISA para anticuerpo
contra VSRRP. Los controles normales, el grupo 4, continuaron siendo
negativos durante la duración del estudio.
Los resultados de aislamiento de virus estaban
bien correlacionados con los resultados serológicos. Sólo un cerdo
continuaba siendo negativo para el aislamiento de virus a partir de
suero y esto correspondía al estado seronegativo durante el periodo
post-vacunación. Estos resultados indican una
relación entre la viremia post-vacunación y la
conversión serológica con la dosificación de vacuna. El grupo 2 era
el 100% seropositivo a 14 DPV en comparación con el 70% para el
grupo 1. El grupo de alta dosis (grupo 2) era el 85% y el 90%
positivo a viremia a 14 y 21 DPV, respectivamente. En comparación,
el grupo de baja dosis (grupo 1) era el 55% y el 85% positivo para
los mismos días de ensayo.
Después de la exposición, el 89% de los animales
del grupo 3 experimentaron temperaturas que eran \sim0,55ºC (1ºF)
o más superiores a los valores pre-exposición
durante dos o más días. En el grupo 1, el 75% de los animales
experimentaron temperaturas de un grado o más superiores durante dos
o más días. Mientras que sólo el 45% de los animales del grupo 2
experimentó temperaturas elevadas. En comparación, el 30% de los
animales del grupo de control normal (grupo 4) experimentó
temperaturas elevadas durante dos o más días durante el periodo de
observación de 11 días.
El tratamiento con la alta dosis de vacuna o la
baja dosis de vacuna parecía no tener un efecto perjudicial sobre
el rendimiento del crecimiento durante el periodo
post-vacunación (-3 DPV a 28 DPV). El aumento de
peso diario promedio para los grupos 1 y 2 era de 0,35 kg/día (0,77
lb/día) y de 0,34 kg/día (0,76 lb/día), respectivamente. Para una
comparación, los grupos 3 y 4 tenían aumentos de peso diarios
promedio de 0,35 kg (0,77 lb) y 0,354 kg (0,78 lb),
respectivamente. Después de la exposición, los grupos vacunados
tenían un aumento de peso diario promedio de 0,02 kg/día (0,05
lb/día) (grupo 1) y 0,07 kg/día (0,15 lb/día) (grupo 2) más que el
grupo tratado con diluyente estéril. Los controles normales tenían
un promedio de 0,18 a 0,23 kg/día (0,4 a 0,5 lb/día) más de aumento
de peso diario que los vacunados durante el mismo periodo de
tiempo.
El ochenta y cuatro por ciento (16 de 19) del
grupo 3, el grupo de tratamiento con diluyente estéril, experimentó
una disminución del 25% o superior en su recuento de WBC durante uno
o más días después de la exposición. En los controles normales, 3
de 10 (el 30%) habían experimentado disminuciones similares. Después
de la exposición, en los grupos vacunados, el de baja dosis (grupo
1) y el de alta dosis (grupo 2), 11 de 20 (55%) y 3 de 20 (15%)
habían experimentado una leucopenia del 25% durante uno o más
días.
Las observaciones clínicas realizadas antes de
la exposición indicaban que los cerdos estaban en buen estado de
salud. Después de la exposición, el nivel de estado de salud no
cambiaba significativamente para aquellos cerdos que se expusieron
(grupos 1, 2 y 3). La letargia, los signos respiratorios y la
pérdida de apetito eran los signos clínicos observados y estos se
describieron como de gravedad leve. Los signos clínicos descritos
para un cerdo del grupo 2 podían atribuirse a la neumonía bacteriana
(véase la discusión a continuación sobre lesiones pulmonares) que
estaba experimentando. El grupo de control normal (grupo 4), no
tenía ningún signo clínico observable durante el periodo de
observación de 11 días.
A la finalización del estudio, los cerdos se
sacrificaron y los pulmones se observaron para lesiones tipo SRRP
para puntuar el grado de implicación pulmonar. El porcentaje de
implicación se puntuó para cada lóbulo, y después se multiplicó por
el porcentaje de pulmón representado por la capacidad pulmonar
total. Por ejemplo, un 50% de implicación pulmonar para un lóbulo
diafragmático se multiplicaba después por 25% para que equivalga al
12,5% de la capacidad pulmonar total. La puntuación máxima que podía
obtenerse era de 100. La puntuación pulmonar promedia de grupo para
los controles normales (grupo 4) era de cero. La puntuación promedia
de grupo para el grupo de tratamiento con diluyente estéril (grupo
3) era de 70,08. Las puntuaciones promedias de grupos de
tratamiento vacunados eran de 48,83 para el grupo de baja dosis
(grupo 1) y de 17,76 para el grupo de alta dosis (grupo 2). Se
observó que un cerdo tenía una puntuación pulmonar de 62,5, la mayor
puntuación dentro del grupo 2. Se describió que las lesiones
observadas en los pulmones de este cerdo estaban asociadas con
neumonía bacteriana.
A partir de los resultados de este estudio,
ambos niveles de dosificación de la vacuna de VSM de SRRP atípico
reducían la gravedad de los signos clínicos asociados con la
enfermedad respiratoria causada por el VSRRP. Una dosis de campo
completa se comportaba mejor que la dosis mínima según se indicó por
la reducción significativa de las puntuaciones de lesiones
pulmonares.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo determinó la secuencia del VSM,
JA-142, del pase 201 atenuado, así como la secuencia
del pase 3 del virus del aislado de campo, JA-142.
El aislado de virus atenuado se obtuvo de la reserva de semilla
maestra que representa el pase 201 en células de simio
MA-104 de un aislado de VSRRP de cerdos afectados
con SRRP.
El virus se cultivó en células 2621, una línea
celular de riñón de mono, también denominada MA-104
y USU-104 (Gravell y col., 181 Proc. Soc. Exp.
Biol. Med. 112-1-19 (1986), Collins
y col., Isolation of Swine Infertility and Respiratory Syndrome
Virus (Isolate ATCC VR-2332) in North America and
Experimental Reproduction of the Disease in Gnotobiotic Pigs, 4 J.
Vet. Diagn. Invest. 117-126 (1992)) (cuyos
contenidos se incorporan por la presente por referencia). Las
células se cultivaron en 50 ml de medio MEM de Eagle modificado por
Dulbecco (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), complementado
con suero fetal de ternera al 10% y gentamicina 50 \mug/ml (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO) en una atmósfera de CO_{2} al 5%
humidificada a 37ºC en matraces de cultivo de tejidos de plástico
de 75 cm^{2}. Las células se mantuvieron por pase a intervalos de
5-7 días. Las células se desprendieron de la
superficie con tripsina-verseno y se dividieron 1:4.
Para infectar las células, se decantaron los medios y se añadió 1
ml de sobrenadante de células que contenía virus a un título de
aproximadamente 10^{5}-10^{6} dosis infecciosas
en cultivo de tejidos (DICT_{50}) durante 30 min. Se añadieron
treinta ml de medio recién preparado que contenía suero fetal de
ternera al 4%. Las células se incubaron como se ha descrito
anteriormente durante 5 días, momento en el que era evidente un
efecto citopático en el cultivo. Se centrifugó el medio de cultivo
que contenía virus a 2000 rpm en una centrífuga Beckman TJ6 para
sedimentar el residuo celular.
Se purificó ARN genómico viral añadiendo 1120
\mul de tampón AVL preparado (kit de aislamiento de ARN Viral
QIAamp) (QIAGEN, Inc. Valencia, CA)/ARN transportador a una muestra
de 280 \mul de medio de cultivo que contenía virus. La mezcla se
agitó vorticialmente y se incubó a temperatura ambiente durante 10
min. Se añadieron 1120 \mul de etanol y la mezcla se invirtió
varias veces. Se absorbió ARN a la matriz de una columna de
centrifugación QIAamp por centrifugación repetida de alícuotas de
630 \mul a 6.000 x g durante 1 min. La columna se lavó con 500
\mul de tampón AW y se centrifugó para eliminar todo rastro de
solución de lavado. El ARN se eluyó de la columna con 60 \mul de
agua tratada con dietilpirocarbonato a temperatura ambiente. El ARN
purificado se almacenó a -70ºC o se usó inmediatamente para la
síntesis de ADNc.
Para la síntesis de ADNc, se calentó ARN viral a
67ºC durante 7 min, se cebó con hexámeros aleatorios o cebadores
específicos de VSRRP y se realizó una transcripción inversa con la
transcriptasa inversa Superscript II RNasa H- (RT) (Life
Technologies, Inc.). Las reacciones contenían MgCl_{2} 5 mM,
tampón convencional II 1X (Perkin Elmer Corp. Wellesley, MA), 1 mM
de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 1 unidad/\mul de inhibidor
de ARNasa, 2 unidades de RT y 1 \mul de ARN en una reacción de 40
\mul. Las mezclas de reacción se incubaron durante 15 min a 42ºC,
durante 5 min a 99ºC y durante 5 min a 5ºC.
\newpage
Se realizó una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) a los fragmentos de ADN obtenidos para
secuenciación de la forma siguiente: porciones de 10 \mul de una
mezcla de reacción de ADNc se combinaron con los reactivos
siguientes, dando como resultado una reacción de 25 \mul que
contenía MgCl_{2} 2 mM, tampón convencional II 1X (Perkin Elmer),
0,2 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 0,3 \muM de cebador
específico de VSRRP 5' y 3' y 0,375 unidades de Taq polimerasa
AmpliTaq (Perkin Elmer). Se prepararon las reacciones por
calentamiento durante 4 min a 93ºC en un termociclador, después 35
ciclos constituidos por 50-59ºC durante 30 s, 72ºC
durante 30-60 s y 94ºC durante 30 s. Los tiempos y
temperaturas específicos variaban dependiendo de las temperaturas
de hibridación de los cebadores en cada reacción, y de la longitud
esperada del producto amplificado. Se realizó una incubación final
durante 10 min a 72ºC y las reacciones se pusieron a 4ºC. Se
purificaron los productos de PCR con un kit Microcon 100 (Amicon,
Bedford, MA).
Se realizó una PCR de amplificación rápida de
extremos de ADNc (RACE) para obtener la secuencia terminal del
extremo 5' del ARN genómico, basándose en el procedimiento de
Frohman, MA., On Beyond Classic RACE (Rapid Amplification of cDNA
Ends), 4 PCR Methods and Applications S40-S58 (1994)
(cuyo contenido se incorpora por la presente por referencia). Se
aisló el ARN viral y se convirtió en ADNc como se ha descrito
anteriormente, con hexámeros aleatorios como cebadores. Se
purificaron los productos de reacción en una columna Microcon 100
(Amicon). Se añadió una cola poli(dA) al extremo 3' por
incubación de 10 \mul de ADNc en un volumen de 20 \mul que
contenía tampón 4 1X (New England Biolabs, Beverly, MA), CoCl_{2}
2,5 mM, dATP 0,5 mM y 2 unidades de transferasa terminal (New
England Biolabs), durante 15 min a 37ºC. La reacción se interrumpió
por calentamiento durante 5 min a 65ºC y después se diluyó hasta 200
\mul con agua.
Se realizó una PCR usando el Sistema de PCR de
Moldes de Gran Tamaño Expand^{a} (Boehringer Mannheim, Mannheim,
Alemania) en un volumen de reacción de 50 \mul que contenía 10
\mul de ADNc con cola poli(dA) diluido, tampón 3 1X, 0,35
mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, MgCl_{2} 0,625 mM,
cebador Q_{t} 0,04 \muM (Frohman, 1994), cebador Q_{o} 0,3
\muM (Frohman, 1994),
5'-CGCCCTAATTGAATAGGTGAC-3' 0,3
\muM y 0,75 \mul de mezcla enzimática. Las reacciones se
calentaron a 93ºC durante 2 min en un termociclador y se sometieron
a 25 ciclos, estando cada ciclo constituido por 93ºC durante 10 s,
63ºC durante 30 s y 68ºC durante 12 min. Después de 25 ciclos, la
reacción se incubó a 68ºC durante 7 min y se mantuvo a 4ºC. Se
diluyó una alícuota de la reacción 100 veces y se añadieron 5
\mul de producto diluido a una segunda reacción de PCR que
contenía, en 50 \mul, tampón 1 1X, 0,35 mM de cada uno de dATP,
dCTP, dGTP y dTTP, cebador Qi 0,3 \muM (Frohman, 1994),
5'-CCTTCGGCAGGCGGGGAGTAGTGTTT
GAGGTGCTCAGC-3' 0,63 \muM y 0,75 \mul de mezcla enzimática. Las reacciones se calentaron a 93ºC durante 2 min en un termociclador y se sometieron a 25 ciclos, estando cada ciclo constituido por 93ºC durante 10 s, 63ºC durante 30 s y 68ºC durante 4 min. Después de 25 ciclos, la reacción se incubó a 68ºC durante 7 min y se mantuvo a 4ºC. Los productos de reacción se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1% y la banda de aproximadamente 1500 pb se purificó usando el kit de purificación en gel QIAgen QXII. El ADN eluido se clonó en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI) usando procedimientos convencionales. Se aislaron clones individuales y se cultivaron para el aislamiento del ADN plasmídico usando kits de aislamiento de plásmidos de QIAgen.
GAGGTGCTCAGC-3' 0,63 \muM y 0,75 \mul de mezcla enzimática. Las reacciones se calentaron a 93ºC durante 2 min en un termociclador y se sometieron a 25 ciclos, estando cada ciclo constituido por 93ºC durante 10 s, 63ºC durante 30 s y 68ºC durante 4 min. Después de 25 ciclos, la reacción se incubó a 68ºC durante 7 min y se mantuvo a 4ºC. Los productos de reacción se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1% y la banda de aproximadamente 1500 pb se purificó usando el kit de purificación en gel QIAgen QXII. El ADN eluido se clonó en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI) usando procedimientos convencionales. Se aislaron clones individuales y se cultivaron para el aislamiento del ADN plasmídico usando kits de aislamiento de plásmidos de QIAgen.
Se combinaron productos de PCR y ADN plasmídico
con cebadores apropiados basados en secuencias de VSRRP relacionadas
en Genbank o derivados de secuencias conocidas, y se sometieron a
reacciones de secuenciación automáticas con kits de secuenciación
cíclica con terminadores Taq DyeDeoxy (Applied Biosystems, Foster
City, CA) y un Termociclador PR 2400 (Perkin Elmer) en el
University of Minnesota Advanced Genetic Analysis Center. Las
reacciones se sometieron a electroforesis en un secuenciador de ADN
Applied Biosystems 3700. La lectura automática de nucleótidos y la
corrección de errores de secuencias se realizaron principalmente con
el programa Phred (University of Washington Genome Center) y el
ensamblaje de fragmentos se realizó principalmente con el programa
Phrap (University of Washington Genome Center). Se usó un programa
informático adicional que incluía el paquete Lasergene (DNASTAR
Inc., Madison, WI), el paquete Wisconsin versión 9.1 (Genetics
Computer Group, Madison, WI) y EuGene (Molecular Biology
Information Resource, Houston, TX) para analizar la secuencia. La
secuencia genómica viral final se ensambló a partir de
aproximadamente 100 reacciones de PCR y 428 reacciones de
secuenciación de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados del Ejemplo 7 se proporcionan
como SEC ID Nº: 1 y 2 en las que la SEC ID Nº: 1 representa la
secuencia del pase 201 del Virus de Semilla Maestra, JA 142, y la
SEC ID Nº: 2 representa la secuencia del virus virulento aislado de
campo, JA 142, después de tres pases.
<110> MENGELING, WILLIAMS L.
\hskip1cmVORWALD, ANN
\hskip1cmLAGER, KELLY
\hskip1cmROOF, MIKE
\hskip1cmBURKHART, KELLY GORCYCA, DAVID E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VACUNA CONTRA EL SÍNDROME
RESPIRATORIO Y REPRODUCTIVO PORCINO BASADA EN EL AISLADO
JA-142
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 27093a
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/298.110
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
22-04-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15424
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15424
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (6)
1. Un procedimiento de pases múltiples para
atenuar un virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino
(SRRP) capaz de inducir un efecto citopático, que incluye las etapas
de replicar sucesivamente dicho virus por inoculación y replicación
del virus en cultivos celulares individuales hasta que se consiga su
atenuación,
caracterizado porque cada etapa sucesiva
de inoculación y replicación comprende
- (1)
- retirar una muestra que contiene virus del cultivo celular mientras que el virus se está replicando a una velocidad logarítmica y antes de la inducción de efectos citopáticos en el cultivo celular,
- (2)
- inocular el cultivo celular siguiente con una alícuota de dicha muestra, de modo que se usa la alícuota más pequeña que mantiene la infección y la replicación logarítmica, y de modo que sólo se transfieren pequeñas cantidades de virus de un pase a otro,
- (3)
- conservar cada cultivo celular del que se ha retirado una muestra (de acuerdo con la etapa 1)) después de la etapa de retirada, y
- (4)
- observar si se produce inducción de un efecto citopático en cada uno de dichos cultivos celulares conservados.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de la reivindicación 1,
produciéndose dicha etapa de retirada aproximadamente 24 horas
después de la inoculación de dichos cultivos celulares.
3. El procedimiento de la reivindicación 1,
comprendiendo dicho cultivo celular una monocapa de células que
tienen una confluencia superior a aproximadamente el 70%.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende además la etapa de ensayar periódicamente dicho virus
progenie para determinar su atenuación.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, que
incluye además la etapa de proporcionar un exceso de células
inicialmente no infectadas para asegurar que dicho virus pueda
replicarse a una velocidad logarítmica.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que cada una de las inoculaciones sucesivas que implican el pase
antes de que se observe un efecto citopático se lleva a cabo después
de que se observe el efecto citopático en un cultivo celular
previamente inoculado, siendo dicho cultivo celular previamente
inoculado un cultivo parental de las células de las que se retira
una alícuota para su pase.
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