PT2251419E - Vacina contra a síndrome reprodutiva e respiratória porcina com base no isolado ja-142 - Google Patents
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DESCRIÇÃO "VACINA CONTRA A SÍNDROME REPRODUTIVA E RESPIRATÓRIA PORCINA COM BASE NO ISOLADO JA-142" ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção A presente invenção diz respeito, em termos gerais, a vírus atenuados e avirulentos (PRRSV) da síndrome reprodutiva e respiratória porcina atípica (PRRS) e às correspondentes vacinas de vírus vivos para administração a suínos, com o intuito de lhes conferir uma imunidade eficaz contra os PRRSV.
Descrição da Técnica anterior A PRRS surgiu no final dos anos de 1980 como patologia virai importante dos suínos. Os PRRSV provocam insuficiências reprodutivas graves em porcas prenhas, traduzidas por ninhadas de porquinhos prematuros, um número maior de nados-mortos, leitões muito magros e débeis à nascença, menor número de animais por ninhada e atraso no regresso à época do cio. Além disso, o sistema respiratório dos suínos infectados com os PRRSV fica gravemente afectado, o que é demonstrado por lesões que aparecem nos pulmões dos suínos infectados. Para combater os problemas associados à infecção com os PRRSV, foram desenvolvidas vacinas que conferiam imunidade às estirpes de PRRSV existentes. 2 A epidemia de uma forma grave invulgar de PRRS, doravante aqui designada por "PRRS atípica", foi identificada pela primeira vez na América do Norte no final de 1996. Diferia da epidemia de "PRRS típica" pelos factos seguintes: 1) os sinais clínicos eram mais prolongados e também mais graves; 2) a incidência de abortos era maior, especialmente durante os períodos de gestação iniciais e médios; 3) havia uma maior incidência de mortalidade de leitões e porcas; 4) os PRRSV eram isolados menos frequentemente a partir de fetos de abortos, animais nados-mortos e animais recém-nascidos - talvez porque os abortos eram mais frequentemente o resultado de uma doença aguda materna, em vez de uma infecção transplacentária; 5) as lesões pulmonares dos leitões afectados eram mais extensas; e 6) as vacinas disponíveis nos circuitos comerciais conferiam pouca ou nenhuma protecção. No seu conjunto, esta observação indicou o aparecimento de estirpes de PRRSV mais virulentas e antigenicamente distintas e determinou a necessidade de se dispor de uma nova geração de vacinas para a PRRS. 0 processo mais frequentemente utilizado para a preparação de vacinas atenuadas de vírus vivos consiste em fazer uma sequência de passagens do vírus por um substrato (normalmente uma cultura de células) diferente do hospedeiro natural (S) até o vírus ficar suficientemente atenuado (isto é, com uma virulência reduzida ou com uma menor aptidão para provocar doenças) para poder ser utilizado como vacina. Para a primeira passagem, infecta-se uma cultura de células com o inoculo seleccionado. Depois de se obter uma prova nítida da replicação do vírus (v.g., efeitos citopáticos induzidos pelo vírus [CPE] nas células 3 infectadas), utiliza-se uma aliquota do meio de cultura de células, ou células infectadas, ou de ambos, da primeira passagem para infectar uma segunda cultura de células. Repete-se o processo até que uma ou várias mutações criticas no genoma virai causem uma atenuação suficiente para que o virus possa ser utilizado em segurança como vacina. 0 grau de atenuação é determinado, normalmente, de forma empírica, expondo-se o hospedeiro natural (S) a níveis de passagem progressivamente maiores do vírus. 0 procedimento descrito supra é bastante fiável e tem sido utilizado com êxito para o desenvolvimento de diversas vacinas para utilização humana e veterinária. No entanto, é relativamente ineficiente, uma vez que a fase logarítmica da replicação virai, durante a qual é mais provável que ocorram as mutações, fica normalmente completa muito antes da evidência da replicação do vírus se tornar visivelmente manifesta.
Murtaugh et al. (1995) Archives Virol. 140, 1451-1460 comparam as sequências que codificam as proteínas estruturais das estirpes virais VR-2332 e de Lelystad do vírus da PRRS. A análise sequencial comparativa indicou que havia graus de identidade de aminoácidos nas grelhas de leitura aberta para o vírus de Lelystad compreendidos entre 55 % na ORF5 e 79 % na ORF6.
Mengelin et al. (1999) A. J. V. 60(3), 334-340, descrevem a identificação e a avaliação clínica de estirpes suspeitas de terem derivado de vacinas de vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina. Concluiu-se que a estirpe de vacina, em varas de suínos, pode ter persistido e sofrido mutações para uma forma menos atenuada. 4 0 documento ΕΡ 0 835 929 AI descreve uma nova estirpe atenuada (CNCM Institut Pasteur 1-1642) do vírus da PRRS, em conjunto com um procedimento de atenuação da replicação do mesmo, mediante a utilização de um clone obtido a partir de células MA-104 do rim de macaco (CNCM Institut Pasteur 1-1643). 0 documento US 5 476 778 descreve um processo para atenuar o vírus da síndrome da infertilidade e respiratória dos suínos, o qual consiste em fazer passar o vírus por uma linhagem de células de símios, em condições perfeitamente definidas. 0 documento US 5 587 164 descreve um processo para a produção de vírus da PRRS numa cultura de tecidos que pode ser infectada para a replicação do vírus, até haver uma quantidade suficiente para proteger os animais contra a PRRS ou para a sua utilização no diagnóstico da PRRS ou para a identificação da estrutura molecular do vírus da PRRS para o desenvolvimento de produtos recombinantes, consistindo tal processo em inocular com o vírus a cultura de tecidos e em colher os vírus replicados.
Assim sendo, existe na especialidade uma necessidade inegável de se dispor de uma vacina que confira uma imunidade eficaz contra as estirpes de PRRSV, incluindo as estirpes atípicas de PRRSV recentemente descobertas. Também há a necessidade de se dispor de um processo para a preparação de uma vacina deste tipo. Finalmente, o que é necessário é que haja um processo de passagem de vírus que atenue os vírus mais eficientemente do que aquilo que até agora se pensava ser possível, daí resultando vírus atenuados que induzam anticorpos específicos dos PRRSV, na 5 terapêutica de suínos, que confiram uma imunidade eficaz contra a subsequente infecção por PRRSV.
DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito às seguintes formas de realização (1) a (21): (1) um vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina (PRRS) com uma sequência representada pela SEQ ID N0:1 ou por uma sequência que tenha pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N0:1, (2) o vírus da forma de realização (1), em que tal vírus compreende a sequência representada pela SEQ ID N0:1, (3) um vírus da PRRS com o número VR-2638 de Admissão na ATCC , (4) o vírus da forma de realização (1), em que o vírus compreende a sequência representada pela SEQ ID NO:2, (5) o vírus de uma qualquer das formas de realização (1) a (3), atenuado por um processo de atenuação de vírus que compreende os passos que consistem em atenuar com êxito os referidos vírus, mediante inoculação e replicação dos vírus em culturas celulares individuais respectivas, até se conseguir a atenuação, remover amostras que contenham os vírus, pelo menos a partir de determinadas dessas culturas celulares enquanto o vírus se está a replicar a uma velocidade logarítmica e antes da indução de efeitos citopáticos nessas determinadas culturas celulares, e inocular com as referidas amostras as passagens de culturas celulares respectivas subsequentes, 6 (6) o vírus da forma de realização (5), em que o referido passo de remoção tem lugar aproximadamente 24 horas após a inoculação das referidas culturas celulares, (7) o vírus da forma de realização (5), em que a referida cultura celular compreende uma monocamada de células que é superior a cerca de 70% da confluência, (8) o vírus da forma de realização (5), o qual compreende também o passo que consiste em testar periodicamente o referido vírus da progenia para se pesquisar a atenuação, (9) o vírus da forma de realização (5) , o qual compreende também os passos que consistem em conservar essas determinadas culturas celulares após o referido passo de remoção e em observar se ocorre a indução de efeitos citopáticos nessas culturas celulares conservadas, (10) o vírus da forma de realização (5), em que a inoculação é feita com o mais pequeno número de vírus que em última instância tem como resultado o CPE, (11) o vírus de acordo com uma qualquer das formas de realização anteriores, tendo o referido vírus sido submetido a um mínimo de 200 vezes de passagem em cultura celular, (12) o vírus de acordo com uma das formas de realização anteriores, sendo o referido vírus atenuado, (13) o vírus de acordo com uma qualquer das formas de realização anteriores, sendo o referido vírus avirulento, (14) o vírus de acordo com uma qualquer das formas de realização anteriores, sendo o referido vírus capaz de desencadear uma resposta de anticorpos nos suínos, 7 (15) o vírus da forma de realização (14), sendo a referida resposta de anticorpos específica para as estirpes de vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina, (16) o vírus atenuado da PRRS de acordo com uma qualquer das formas de realização (5) a (10), obtido mediante atenuação de um vírus que possui uma sequência de ácidos nucleicos representado pela SEQ ID NO: 2, (17) uma vacina que compreende o vírus de acordo com uma qualquer das formas de realização anteriores, (18) a vacina da forma de realização (17), a qual compreende também um veiculo farmacologicamente compatível, (19) uma sequência de ácido nucleico isolado que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1, (20) uma sequência de ácido nucleico isolado que compreende a sequência ilustrada na SEQ ID NO:l. (21) a vacina tal como definida nas formas de realização (17) ou (18) para utilização na imunização de suínos contra a síndrome reprodutiva e respiratória porcina, em que a referida imunização consiste em administrar a referida vacina aos referidos suínos. A presente invenção resolve os problemas enunciados supra e proporciona estirpes atenuadas e atípicas de PRRSV e as correspondentes vacinas aperfeiçoadas de vírus vivos modificados, as quais conferem uma imunidade eficaz contra as estirpes atípicas de PRRSV. O termo "imunidade eficaz" designa a aptidão de uma vacina para prevenir infecções de PRRSV em suínos, incluindo as infecções com os PRRSV atípicos, de que resultam substanciais sinais clínicos da doença. Significa isto que o suíno imunizado pode ou não ser serologicamente positivo aos PRRSV, mas não manifesta nenhuns sintomas clínicos substanciais. 0 termo "PRRSV atípicos" designa estas novas estirpes de PRRSV que são substancialmente mais virulentas do que as estirpes típicas dos PRRSV.
Em formas preferenciais, a vacina da invenção compreende vírus vivos cuja virulência tenha sido atenuada. Demonstrou-se que o vírus atenuado resultante é avirulento e confere uma imunidade eficaz. Escolheu-se uma estirpe particularmente virulenta da PRRS atípica (denominada JA-142) que provocou sintomas especialmente graves da PRRS e que representa a estirpe dominante dos PRRSV atípicos, para a atenuação subsequente por meio de diversas passagens. 0 vírus atenuado resultante foi depositado na Colecção Americana de Culturas Tipo (ATCC), Rockville, MD em 2 de Fevereiro de 1999 e foi-lhe atribuído o n° VR-2638 de Admissão na ATCC. Este vírus atenuado é um vírus inoculador principal, Master Seed Virus (MSV), que foi submetido depois a diversas passagens e desenvolvido como vacina eficaz de PRRSV. 0 nome atribuído ao vírus não atenuado, JA-142, provém do padrão das enzimas de restrição. 0 número 1 representa a incapacidade da enzima MLU I para clivar o vírus na grelha de leitura aberta 5 (ORF 5) . 0 número 4 representa a clivagem por Hinc II nas posições 118 e 249 do par de bases da ORF 5 e sequências contíguas curtas. 0 número 2 representa a clivagem por Sac II na posição 54 do par de bases da ORF 5 e sequências contíguas curtas. A execução das passagens do vírus até à atenuação foi efectuada utilizando um processo novo que teve como resultado uma maior eficiência. Dito de forma concreta, o vírus foi mantido na fase de replicação logarítmica através 9 de múltiplas passagens por culturas celulares, com a finalidade de se encurtar materialmente o tempo até à atenuação. Isto foi conseguido garantindo que em cada cultura celular havia um excesso substancial de células inicialmente não infectadas, comparativamente com o número de vírus presentes. Assim sendo, transferindo apenas um pequeno número de vírus de passagem para passagem, garante-se uma replicação logarítmica.
Na prática, o processo é iniciado, normalmente, inoculando várias culturas celulares separadas com aliquotas virais progressivamente mais pequenas (isto é, números mais pequenos de vírus em cada cultura) . Por exemplo, as culturas iniciais podem conter aliquotas de 200 pL, 20 pL e 2 pL. Após um curto período inicial de incubação (v.g., aproximadamente 24 horas), as mesmas aliquotas virais (no exemplo, 200 pL, 20 pL e 2 pL) de cada cultura celular são transferidas para culturas individuais renovadas (não infectadas previamente) , ao passo que as culturas iniciais são monitorizadas até se observar ou não o efeito citopático (CPE). Este processo prossegue por ordem sequencial para passagens múltiplas, utilizando-se as mesmas aliquotas virais em cada caso e mantendo as culturas para observação do CPE. Se em todas as passagens sequenciais das culturas for observado o CPE após o número seleccionado de passagens completas, é possível determinar a maior sequência de aliquotas virais (no exemplo, 200 pL e 20 pL) , após o que se ensaia uma outra série de aliquotas virais progressivamente mais pequenas (v.g., 2 pL, 0,2 pL e 0,02 pL), sendo o processo repetido outra vez, conservando-se mais uma vez as culturas celulares após a transferência para observação do CPE. 10
Em algum momento, neste processo de inoculação com aliquotas virais sucessivamente mais pequenas, o CPE deixará de ser observado numa dada cultura celular. Quando isto ocorrer, na passagem, em que o CPE não foi observado, faz-se uma substituição pelo nível subsequente da aliquota virai mais elevada, após o que as passagens subsequentes irão ser inoculadas utilizando as aliquotas virais anteriormente utilizadas.
Na medida em que um vírus irá ter tendência para se tornar mais eficiente para infectar células e também para se replicar com uma titulação de infecciosidade mais elevada para culturas de células ao longo do tempo (o que é especialmente verdadeiro com vírus de ARN, tais como os PRRSV), verificar-se-á que são necessárias aliquotas virais cada vez mais pequenas para manter a infecção durante a transferência sequencial. A utilização da aliquota mais pequena que mantém a infecção ajuda a garantir que a replicação virai permanece numa fase logarítmica ao longo do processo.
Determinou-se depois a sequência do ADN do vírus atenuado pelas passagens, a partir da 201a passagem, recorrendo a métodos convencionais. A sequência deste vírus atenuado recebeu a designação de MSV JA-142, cuja sequência está representada pela SEQ ID NO:l. A sequência do vírus virulento, JA-142, é dada pela SEQ ID NO:2.
Na terminologia aqui utilizada devem ser consideradas as definições seguintes: o termo "identidade de sequência", tal como é conhecido na especialidade, refere-se a uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas ou duas ou mais sequências polinucleotídicas, designadamente uma sequência de referência e uma dada sequência que irá 11 ser comparada com a sequência de referência. Determina-se a identidade de sequência comparando a sequência dada com a sequência de referência depois de as sequências terem sido alinhadas de forma óptima para se obter o grau mais elevado de similaridade entre sequências, conforme determinado pelo ajustamento entre cadeias de tais sequências. A seguir a cada alinhamento, avalia-se e determina-se a identidade de sequência numa base de posição por posição, v.g., considera-se que as sequências são "idênticas" numa posição particular se, nessa posição, os nucleótidos ou os resíduos aminoácidos forem idênticos. 0 número total de tais identidades posicionais é depois dividido pelo número total de nucleótidos ou de resíduos na sequência de referência para se obter a identidade de sequência percentual (%) . A identidade de sequência pode ser calculada facilmente por meio de métodos conhecidos, incluindo, mas sem nenhuma limitação, os descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis em Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); e Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Os métodos preferenciais para a determinação da identidade entre sequências são concebidos para permitirem a máxima coincidência entre as sequências testadas. Os métodos para a determinação da identidade entre sequências são codificados em programas informáticos acessíveis ao 12 público, os quais permitem determinar a identidade de sequência entre sequências dadas. Como exemplos de tais programas refere-se, mas sem nenhuma limitação, o conjunto de programas informáticos GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). O programa BLASTX está acessível ao público em geral a partir da NCBI e de outras fontes (BLAST Manual,
Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda , MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec Biol., 215:403-410 (1990)). Estes programas alinham, de forma óptima, as sequências , utilizando ponderadores de lacunas por defeito, com a finalidade de se obter o nível mais elevado de identidade de sequência entre a sequência dada e a sequência de referência. A título ilustrativo, ao dizer-se que um polinucleótido possui uma sequência de nucleótidos que possui, por exemplo, pelo menos 95% de "identidade de sequência" com uma sequência de nucleótidos de referência, estamos a afirmar que a sequência de nucleótidos do polinucleótido dado é idêntica à sequência de referência com a excepção de a sequência de polinucleótidos dada poder conter até 5 mutações pontuais por cada 100 nucleótidos da sequência de nucleótidos de referência. Dito por outras palavras, num polinucleótido que possua uma sequência de nucleótidos que tenha pelo menos 95% de identidade com a sequência de nucleótidos de referência, até 5% dos nucleótidos da sequência de referência podem ser suprimidos ou substituídos por um outro nucleótido, ou pode ser inserido na sequência de referência um número de nucleótidos até 5% do total de nucleótidos da sequência de 13 referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições dos terminais 5' ou 3' da sequência de nucleótidos de referência ou em qualquer outro local entre estas posições terminais, podem ser intercaladas quer individualmente entre nucleótidos da sequência de referência quer em um ou vários grupos contíguos no interior da sequência de referência. De forma análoga, o termo 'polipeptido que possui uma dada sequência de aminoácidos que tem, por exemplo, 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos de referência', pretende significar que a sequência dada de aminoácidos do polipeptido é idêntica à sequência de referência com a excepção de uma dada sequência de polipeptidos poder conter até 5 alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de referência. Dito por outras palavras, para se obter uma dada sequência de polipeptidos que possua pelo menos 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos de referência, é possível suprimir ou substituir até 5% dos resíduos aminoácidos na sequência de referência por um outro aminoácido ou é possível inserir na sequência de referência um número de aminoácidos até 5% do número total de aminoácidos na sequência de referência. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições dos terminais amino ou carboxi da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer outro local entre estas posições terminais, podem estar intercaladas quer individualmente entre resíduos na sequência de referência quer em um ou vários grupos contíguos no interior da sequência de referência. De preferência, as posições dos resíduos que não são idênticos diferem por substituições conservativas de aminoácidos. No 14 entanto, as substituições conservativas não são consideradas como uma correspondência coincidente quando se faz a determinação da identidade de sequência.
De igual modo, o termo "homologia sequencial", tal como aqui utilizado, designa também um método para a determinação da relação entre duas sequências. Para a determinação da homologia sequencial faz-se um alinhamento óptimo de duas ou mais sequências, conforme descrito supra, sendo introduzidas lacunas, se necessário. No entanto, contrariamente ao termo "identidade de sequência", as substituições conservativas de aminoácidos são levadas em linha de conta como correspondências coincidentes quando se faz a determinação da homologia sequencial. Dito por outras palavras, para se obter um polipeptido ou um polinucleótido que possua 95% de homologia sequencial com uma sequência de referência, 95% dos resíduos aminoácidos ou dos nucleótidos na sequência de referência têm de coincidir correspondentemente ou compreender uma substituição conservativa com um outro aminoácido ou nucleótido ou é possível inserir na sequência de referência um número de aminoácidos ou de nucleótidos até 5% do total dos resíduos aminoácidos ou dos nucleótidos, sem incluir as substituições conservativas, da sequência de referência.
Uma "substituição conservativa" designa a substituição de um resíduo aminoácido ou de um nucleótido com um outro resíduo aminoácido ou com um outro nucleótido que possua características ou propriedades semelhantes, incluindo o tamanho, a hidrofobicidade, etc., de tal modo que a funcionalidade global não mude significativamente. 0 termo "isolado" significa alterado "por um ser humano" a partir do seu estado natural, isto é, se ocorrer na natureza, terá sido alterado ou removido a partir do seu 15 ambiente original, ou ambos os casos. Por exemplo, considera-se que um polinucleótido ou um polipeptido naturalmente presentes num organismo vivo não estão "isolados", mas se o mesmo polinucleótido ou o mesmo polipeptido forem separados dos materiais coexistentes do seu estado natural, consideram-se "isolados" no sentido do termo aqui utilizado.
De preferência, as sequências que partilhem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID N0:1 são eficazes para conferirem imunidade a animais depois de vacinados com vírus atenuados que contenham tais sequências homólogas.
DESCRIÇÃO MINUCIOSA DA FORMA DE REALIZAÇÃO PREFERENCIAL
Os exemplos seguintes descrevem formas de realização preferenciais da presente invenção. No entanto, faz-se observar que estes exemplos são apresentados apenas a título de ilustração.
Exemplo 1
Materiais e métodos
Este exemplo descreve o processo de passagem de vírus para atenuação, o qual maximiza a eficiência de atenuação ao garantir que o vírus se encontra, preferencialmente, numa fase logarítmica de replicação. As passagens dos vírus (isto é, acrescentou-se ao meio nutriente de uma cultura não infectada uma aliquota de meio nutriente contendo os vírus, células desligadas e resíduos de células provenientes de uma 16 cultura de células infectadas com os vírus) foram feitas em intervalos diários. Foram acrescentadas quantidades diferentes de vírus em cada intervalo, utilizando culturas múltiplas. Por exemplo, no início, fez-se a transferência de 200 pL para uma cultura não infectada, acrescentou-se 20 pL a uma segunda cultura não infectada e acrescentou-se 2 pL a uma terceira cultura não infectada. O objectivo consistiu em ter uma quantidade suficiente de células sensíveis, de modo a que os ciclos de replicação pudessem continuar até à transferência subsequente. Considerou-se que o procedimento era bem sucedido se as células eventualmente revelassem o CPE. No entanto, uma vez que o CPE induzido pelos PRRSV só aparece algum tempo após a fase de crescimento logarítmica, foram feitas passagens antes de se saber se, em última instância, estas teriam ou não tido êxito ("passagens cegas"). As passagens que originaram um CPE induzido pelos vírus foram consideradas como um "resultado positivo". Nos casos em que uma passagem não originou um resultado positivo, repetiu-se a passagem utilizando a diluição mais elevada obtida a partir da última passagem que não originou um resultado positivo. À medida que vão sendo feitas cada vez mais passagens, o vírus vai ficando adaptado para se replicar na linhagem de células e menos apto para produzir sintomas da doença no hospedeiro original. Estas modificações ocorrem através das mutações aleatórias que têm lugar durante a replicação.
Utilizando este processo, foram executados os procedimentos a seguir descritos para efectuar as passagens de um vírus exemplificativo, em conformidade com a presente invenção, designado por MSV, JA-142. As passagens deste vírus foram efectuadas em culturas de células MARC-145, com 17 intervalos diários. No processo foram utilizadas placas de 24 cavidades para minimizar a quantidade de células e meio nutriente necessários e para simplificar a técnica de passagem de aliquotas múltiplas. Acrescentou-se a cada cavidade as células e o meio nutriente e esperou-se que as células formassem ou quase formassem uma monocamada confluente (superior a cerca de 70%) . O meio nutriente era constituído aproximadamente por 90% de meio essencial mínimo em solução salina equilibrada de Eagle (MEM), 10% de soro de vitelo fetal e sulfato de gentamicina na concentração de 0,05 mg/mL. O volume de meio nutriente utilizado foi aproximadamente de 1 mL. Normalmente, foram utilizadas três cavidades de uma coluna para cada quantidade de vírus que foi transferida. Transferiu-se uma aliquota do meio nutriente proveniente da passagem anterior para a primeira cavidade da coluna às 48 ou às 72 horas. Depois de as culturas de células terem sido preparadas, transferiu-se meio nutriente da primeira cavidade para a segunda cavidade da mesma coluna às 72 ou às 96 horas e para a terceira cavidade da mesma coluna às 96 ou às 120 horas. Normalmente, as placas foram montadas e iniciadas duas vezes por semana, pelo que a quarta cavidade da coluna foi utilizada umas vezes sim e outras vezes não. As condições de passagem foram mantidas as 37°C numa atmosfera húmida contendo 5% de CO2.
Foram analisadas aliquotas de volumes diferentes (contendo quantidades diferentes de vírus) para cada passagem para se determinar se a quantidade de vírus era suficiente para induzir o CPE. Por exemplo, utilizou-se uma outras sequência de transferências de aliquotas (passagens) de 200 pL, 20 pL e 2 pL, respectivamente, até as aliquotas 18 mais pequenas exibirem consistentemente o CPE, com o objectivo de se transferir a aliquota mais pequena que produziu o CPE. Quando a aliquota mais pequena (v.g., 2 pL) do grupo de aliquotas analisadas provocou consistentemente o CPE, foram analisadas quantidades mais pequenas (v.g., 0,2 pL e 0,02 pL) . Quando uma determinada diluição não induziu o CPE, tal sequência de culturas foi reiniciada com a quantidade mais pequena seguinte que não induziu o CPE nessa passagem (isto é, no caso de uma transferência de 2 pL não ter tido êxito na produção de CPE na 25a passagem, mas se a transferência de 20 pL nessa 25a passagem tivesse tido êxito, então repetiu-se a transferência de 2 pL utilizando 20 pL, recomeçando com transferências de 2 pL para a 26a passagem).
Utilizando este processo, determinou-se a quantidade mais pequena de vírus que é necessário transferir para se obter o CPE. Os vírus foram sujeitos a passagens, com êxito, em intervalos diários, utilizando as seguintes quantidades de meio nutriente infectado com vírus (o que reflecte a diluição mais elevada [i.e., a aliquota mais pequena] que originou o CPE, tendo presente que as outras diluições também poderiam servir para o efeito): N° da passagem Quantidade transferida 3-21 22, 23 24-41 42-83 84-90 91-112
200 pL 2 0 pL 200 pL 20/200 pL (alternando) 2 0 pL 2 pL 0,2 pL 113 19 19 N° da passagem 114-116 117 118-120 121 122-124 125-167 168 169-171 172 173-175 176 177-179 180 181-183 184 185-187 188 189-191 192 193-195 196 197 (continuação)
Quantidade transferi
2 pL
0,2 pL
2 pL
0,2 pL
2 pL
0,2 pL
0,02 pL
0,2 pL
0,02 pL
0,2 pL
0,02 pL
0,2 pL
0,02 pL
0,2 pL
0,02 pL
0,2 pL
0,02 pL
0,2 pL
0,02 pL
0,2 pL
0,02 pL
0,2 pL
Resultados e discussão processo JA-142
As sucessivas passagens do vírus, utilizando o descrito supra, tiveram como resultado um PRRSV atenuado. Como é evidente o vírus fica cada vez mais 20 adaptado para se replicar na cultura de células e consequentemente é necessário transferir uma quantidade cada vez mais pequena de meio nutriente infectado com o virus, à medida que as passagens prosseguem. No caso das transferências em que se utiliza uma quantidade muito pequena de meio nutriente infectado com os virus (v.g., 0,2 pL ou 0,02 pL), foi necessária uma outras diluição separada. Esta diluição foi obtida adicionando uma pequena quantidade de meio nutriente, infectado com os virus, a uma quantidade maior de meio nutriente. Por exemplo, para se obter uma transferência de 0,2 pL, acrescentou-se 2 pL de meio nutriente, infectado com os virus, a 20 pL de meio nutriente e acrescentou-se 2 pL desta diluição à cultura subsequente da série. Utilizando esta metodologia, utilizou-se a diluição mais elevada que produziu o CPE e minimizou-se o tempo necessário para a transferência dos virus. As transferências feitas com intervalos diários garantiram que o virus se encontrava sempre numa fase logarítmica de replicação. As transferências diárias garantiram também que houve um número adequado de células para replicação dos vírus.
Devido ao facto de as mutações (que são provavelmente cumulativas) , que tenham provavelmente como resultado uma atenuação, apenas ocorrerem durante a replicação, não há nenhuma vantagem em ter praticamente todas as células infectadas, deixando-se decorrer a replicação a um ritmo mais lento ou interrompendo-a antes da transferência subsequente. Com base em estudos anteriores sobre os PRRSV, sabe-se que o seu ciclo de replicação é de cerca de 8 horas, pelo que a transferência de uma quantidade mínima de vírus do meio nutriente infectado com vírus para meio nutriente não infectado, em intervalos diários, tem como resultado a 21 possibilidade de os virus disporem sempre de uma quantidade suficiente de células nas quais irão replicar-se.
Conforme se pode concluir facilmente, as transferências em que se utiliza este processo têm como resultado uma redução do tempo necessário, o que até agora era considerado impossível (isto é, cada transferência necessitou de menos tempo). Isto é especialmente importante quando é necessário um número elevado de passagens para adequar a atenuação do vírus. Se cada passagem fosse efectuada com um intervalo de 3 dias, utilizando os processos antigos, um procedimento que necessitasse de 200 passagens levaria menos 400 dias, utilizando o processo da presente invenção.
Exemplo 2
Materiais e métodos
Este exemplo serviu para determinar se a 200a passagem do vírus PRRS, JA-142, poderia fazer com que este regressasse à sua virulência depois de ter passado pelo animal hospedeiro seis vezes. Este estudo incidiu sobre seis grupos. Foram inoculados intranasalmente 5 suínos do grupo 1 (grupo inicial) , com o vírus PRRS MSV, JA-142, passagem 200, ao passo que foram inoculados três suínos do grupo IA, (grupo de contraprova) intranasalmente com diluente estéril. Os animais foram alimentados com ração existente nos circuitos comerciais e água ad libitum durante todo o estudo. Os suínos dos dois grupos de tratamento foram monitorizados diariamente para a pesquisa de sinais clínicos (aspecto, sinais respiratórios, fezes, etc.). Decorridos 6 dias, os animais foram pesados, foram-lhes retiradas amostras de sangue e 22 depois foram sacrificados. Após uma avaliação dos pulmões à procura de lesões, recolheu-se, a partir de cada animal os fluidos de lavagem pulmonar. Os fluidos de lavagem pulmonar foram congelados e descongelados uma vez e preparou-se uma mistura utilizando 2,0 mL de soro e 2,0 mL de fluido de lavagem pulmonar proveniente de cada animal pertencente a um grupo, respectivamente para a preparação das retropassagens 1 e IA. Utilizou-se esta mistura para contagiar (intranasalmente) os animais do grupo 2 e do grupo 2A, respectivamente. Repetiu-se este processo para os grupos 3 e 3A até 6 e 6A. Os animais de cada grupo ficaram alojados em condições idênticas, mas separados.
Após a inoculação efectuou-se a colheita de amostras de sangue e fez-se a monitorização das temperaturas corporais. Foram medidas as temperaturas rectais de cada animal periodicamente desde o momento -1 DPE (número de dias pós-exposição) até ao momento 6 DPE e calculou-se um valor médio conjuntamente com as temperaturas de outros animais do mesmo grupo. Monitorizou-se o estado e saúde de cada animal diariamente durante todo o período do estudo. Os resultados foram compilados e ordenados com base numa observação diária. Os parâmetros de avaliação são os seguintes: 1. Aspecto normal = 0; deprimido = 1; excitado = 2; comatoso/morto = 30. 2. Respiração normal = 0; espirros = 1; tosse = 1; rápida/curta = 2; difícil = 3. 23 3. Fezes normais =0; secas =1; soltas = 2; fluidas = 3. 4. Olhos normais = 0; lacrimosos = 1; baços = 2; mortiços = 3. 5. Narinas normais = 0; corrimento aquoso = 1; vermelhas/ inflamadas = 2; úlceras com crosta = 3. 6 . Boca normal = 0; baba = 2; úlceras = 3.
7. Actividade NA 8. Apetite normal = 0; reduzido = 1; anoréxico (nenhum) = 3. 9. Outros
Os animais também foram pesados antes da inoculação e na autópsia. Calculou-se o ganho médio de peso para cada grupo para efeitos de comparação. Foram efectuados ensaios experimentais com os vírus de PRRS, tendo sido feitas análises imunoenzimáticas (ELISA) e de neutralização do soro (SN) após as exposições dos animais às composições experimentais em análise e de contraprova. As experiências para o isolamento dos PRRSV a partir das amostras de soro foram efectuadas com células MA-104. Antes da vacinação e a seguir à vacinação efectuou-se uma contagem do número de leucócitos, utilizando um 24 contador de COULTER, modelo Zl, Coulter Corp., Miami, FL. Na autópsia fez-se uma avaliação e classificação dos pulmões de cada animal. A classificação dos pulmões foi feita separando cada pulmão em 7 secções e determinando a percentagem de envolvimento pulmonar (a percentagem da área pulmonar afectada, conforme comprovado pelas lesões e pela vermelhidão de cada secção e multiplicando esse valor pela área aproximada de todo o pulmão), que é a percentagem da área pulmonar total que a secção abrange. Os parâmetros para avaliação e classificação são os seguintes: X 0,10 X 0,10 X 0,25 X 0,10 X 0,10 X 0,25 X 0,10 % de envolvimento do Lobo Apical Esquerdo % de envolvimento do Lobo Cardíaco Esquerdo % de envolvimento do Lobo Diafragmático Esquerdo % de envolvimento do Lobo Apical Direito % de envolvimento do Lobo Cardíaco Direito % de envolvimento do Lobo Diafragmático Direito % de envolvimento do Lobo Intermédio do Pulmão Direito Total (soma de todos os valores na coluna mais à direita)
Resultados e discussão
Efectuou-se a monitorização de cada grupo de suínos durante 6 dias após a vacinação. Os resultados clínicos foram fracos em todos os grupos. Os resultados dos registos clínicos estão agrupados no quadro 1. QUADRO 1
Registos Clínicos Diários Trata- Grupo 1 Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Média mento Suíno # -1 0 1 2 3 4 5 6 JA-142 psg 200 545 0 0 2 0 0 0 0 0 0,25 551 0 0 0 0 0 0 0 0 0 561 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25
Trata- Grupo 1 Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Média mento Suíno # -1 0 1 2 3 4 5 6 565 0 0 0 0 0 0 0 0 0 806 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0, 4 0 0 0 0 0 0, 05 Soluto 550 0 0 0 0 0 0 0 0 0 salino 568 0 0 0 0 0 0 0 0 0 801 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Trata- Grupo 2 Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Média mento Suíno # -1 0 1 2 3 4 5 6 Retropas- 546 0 0 0 0 0 0 0 0 0 sagem 1 553 0 0 0 0 0 0 0 0 0 562 0 0 0 0 0 1 0 0 0, 125 572 0 0 0 0 0 0 0 0 0 573 0 0 0 0 2 0 0 0 0,25 Média 0 0 0 0 0,4 0,2 0 0 0, 075 Retropas- 556 0 0 0 0 0 0 0 0 0 sagem 1 566 0 0 0 0 0 0 0 0 0 802 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Retropas- 548 0 0 0 0 0 0 0 0 0 sagem 2 567 0 0 0 0 0 0 0 0 0 569 0 0 0 0 1 1 0 0 0,25 574 0 0 0 0 0 0 0 0 0 804 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0, 2 0, 2 0 0 0, 05 26 (continuação)
Trata- Grupo 3 Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Média mento Suíno # -1 0 1 2 3 4 5 6 Retropas- 547 0 0 0 0 0 0 0 0 0 sagem 2A 5564 0 0 0 0 0 0 0 0 0 805 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Trata- Grupo 4 Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Média mento Suíno # -1 0 1 2 3 4 5 6 Retropas- 549 0 0 0 0 0 0 0 0 0 sagem 3 554 0 0 0 0 0 0 0 0 0 563 0 0 0 0 0 0 0 0 0 570 0 0 0 0 0 0 0 0 0 803 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Retropas- 560 0 0 0 0 0 0 0 0 0 sagem 3A 571 0 0 0 0 0 0 0 0 0 575 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Trata- Grupo 5 Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Média mento Suíno # -1 0 1 2 3 4 5 6 Retropas- 1 0 2 0 0 2 0 2 2 1 sagem 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 2 0 2 2 2 2 2 20 1, 75 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0, 4 0, 4 0, 4 0, 4 00 o 0, 4 00 o 00 o 0,55 Retropas- 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 27 sagem 4a 28 (continuação)
Trata- Grupo 5 Dia -1 Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Média mento Suíno # 0 1 2 3 4 5 6 7 0 0 2 2 2 2 2 2 1,5 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0, 08 0,48 0, 48 0,56 0,48 0,56 0,56 0,4 Trata- Grupo 6 Dia -1 Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Média mento Suíno # 0 1 2 3 4 5 6 Retro- 10 0 0 0 0 2 0 0 2 0,5 passagem 5 12 0 0 0 2 2 0 0 2 0, 75 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 2 2 2 0 0 0 0 2 1 16 2 2 2 0 0 1 1 2 1,25 Média 0, 8 0, 8 0, 8 0,4 0, 8 0,2 0, 2 1,6 0,7 Retro- 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 passagem 5A 11 2 2 0 0 0 0 0 0 0,5 13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0,666667 0,56 0,16 0,08 0,16 0,04 0,04 0,32 0,253333 Não houve diferenças significativas entre grupos no que diz respeito a temperaturas rectais ou ganhos de peso diário. Todos os resultados clínicos pulmonares foram negativos.
Em termos serológicos, os quocientes S/P nos protocolos ELISA e as titulações de SN foram negativos para cada grupo durante todo o período experimental. Foram feitas experiências para isolamento dos vírus em todas as amostras de soro e em todos os fluidos de lavagem pulmonar. Por volta do 6o dia, eram positivas entre 60-100% das 29 amostras de soro provenientes dos grupos inoculados com JA-142, na passagem 200a e subsequentes retropassagens. Os grupos aos quais havia sido administrado o soluto salino foram negativos. Nas primeiras três passagens efectuou-se a recuperação dos virus nos fluidos de lavagem pulmonar provenientes apenas de 20-40% dos suínos, mas para as últimas três passagens efectuou-se a recuperação dos vírus a partir de 50-80% dos suínos.
Com base nestes valores, conclui-se que a passagem 200a de JA-142 não levou ao regresso ao estado de virulência depois de ter passado pelos suínos 6 vezes.
Exemplo 3
Materiais e métodos
Este exemplo demonstrou que o nível de atenuação de segurança do MSV, JA-142, passagem 200a, não se alterou significativamente durante seis retropassagens no animal hospedeiro. Efectuou-se a avaliação do nível de atenuação ou segurança, utilizando o modelo de porca prenhe e monitorizando o efeito sobre os resultados reprodutivos. Este modelo é o sistema de teste mais sensível e não assenta em factores subjectivos para o estudo da virulência. Neste exemplo foram constituídos 4 grupos (A, B, C & D) em que havia 7 porcas por cada grupo. O grupo A foi inoculado intranasalmente com PRRS MSV, JA-142 passagem 200. O grupo B foi inoculado intranasalmente com JA-142, passagem 200, 6 retropassagens. O grupo C foi inoculado intranasalmente com diluente estéril par servir de contraprova normal. O grupo D foi inoculado intranasalmente 30 com PRRSV JA-142, passagem 4. As composições experimentais estudadas (estimulo com JA-142, passagem 4) foram administradas aproximadamente ao fim de 93 dias de gestação. Efectuou-se a monitorização das temperaturas corporais das porcas durante os primeiros 7 dias após a vacinação. Foram colhidas amostras de sangue das porcas uma vez por semana e no momento em que pariram. Foram retiradas amostras de sangue e determinados e registados os pesos dos leitões no momento do nascimento e com 7 e 14 dias de idade. Monitorizou-se o estado de saúde de cada animal diariamente durante o estudo que prosseguiu até 14 dias após o nacimento dos animais. Fez-se uma avaliação da qualidade da ninhada observando o estado de saúde dos leitões nascidos.
As análises de PRRS pelo protocolo ELISA foram efectuadas a seguir às exposições das porcas às composições experimentais testadas. Também foram realizadas análises de PRRS pelo protocolo ELISA com os soros dos leitões, semanalmente a seguir ao nascimento da ninhada. A seguir à exposição às composições experimentais estudadas foram feitas experiências com células MA-104 para isolar os PRRSV existentes nas amostras de soro. Efectuou-se periodicamente a medição das temperaturas rectais desde o dia 0 pós-vacinação (DPV) até ao 7o DPV e determinou-se a temperatura média de cada grupo. Antes e após a inoculação efectuou-se uma contagem do número total de leucócitos, tal como no exemplo 1. Foram efectuadas observações clinicas das porcas, tal como no exemplo 2, desde o momento -1 DPV até ao nascimento da ninhada. Foram efectuadas observações clinicas dos leitões desde o momento do nascimento da ninhada até aos 14 dias de idade. Finalmente, na autópsia, 31 efectuou-se uma avaliação e um registo dos pulmões de cada leitão para se avaliar o envolvimento pulmonar percentual.
Resultados
Os resultados obtidos pelo protocolo ELISA indicam que os animais utilizados no estudo ainda não tinham sido afectados pelos PRRSV. Os animais que receberam inóculos virais, grupos A, B e D, ficaram seroconvertidos ao fim de 14 dias após o tratamento. Houve três porcas do grupo B que continuaram negativas ao fim de 14 dias após o tratamento. No momento do nascimento da ninhada verificou-se que as porcas negativas do grupo B revelaram ser analiticamente positivas em anticorpos contra os PRRSV.
Os resultados obtidos pelo protocolo ELISA com os animais indicaram que a maior parte dos leitões nascidos de porcas do grupo A e do grupo B tinham sido contagiados depois de terem mamado. Os leitões para os quais haviam sido obtidos resultados negativos zero dias pós-nascimento (0 DPF) revelaram ser analiticamente positivos ao 7° DPF. Todos os animais nascidos de porcas do grupo C revelaram ser analiticamente seronegativos durante o estudo. Houve apenas alguns leitões do grupo D que foram objecto de análises experimentais, uma vez que a maior parte foram animais nado-mortos ou raquíticos. Metade dos animais estudados eram seropositivos. Isto indicou que os animais seronegativos haviam sido contagiados antes de terem mamado, pelo que não foram capazes de mamar. Todos os leitões nascidos de porcas do grupo D morreram antes do 7o DPF. Os isolamentos de PRRSV a partir de porcas dos grupos A e B foram esporádicos. Embora os resultados obtidos pelo 32 protocolo ELISA tivessem indicado que estas porcas haviam sido inoculadas com êxito com as composições experimentais virais estudadas, muitas continuaram a ser negativas para isolamento de vírus a partir do soro. A maior parte dois leitões nascidos de porcas dos grupos A e B revelaram resultados analíticos positivos para isolamento de vírus durante o decurso do estudo. A ninhada nascida de uma porca do grupo A nunca apresentou resultados positivos e a ninhada nascida de uma porca do grupo B tinha apenas 2 de 8 leitões que apresentaram resultados positivos em termos de isolamento de vírus. Não foi recuperado nenhum vírus dos leitões nascidos de porcas do grupo C. Os vírus foram recuperados a partir da maior parte (71%) dos leitões nascidos de porcas do grupo D.
As temperaturas rectais pós-tratamento foram irrelevantes. Os grupos que foram tratados com MSV, retropassagem 6, ou com diluente estéril, apresentaram medições que não excederam 101,7°F. O grupo D, tratado com JA-142, passagem 4, apresentou 4 (4 em 7) porcas que revelaram temperaturas que não excederam 102°F, com uma porca chegando aos 103,4°F durante um dos dias. Os resultados respeitantes aos ganhos de peso dos leitões nascidos de porcas do grupo A (tratados com MSV) e do grupo B (tratado com MSV, retropassagem 6) foram superiores aos dos leitões nascidos das porcas de contraprova do grupo C. O ganho de peso médio durante o período de 14 dias de observação foi de 7,9 libras. Para o grupo A foi de 7,7 libras; para o grupo B e para o grupo C foi de 6,9 libras. As diferenças nos ganhos de peso não estavam relacionadas com o tamanho da ninhada ainda existente ao fim de 14 dias. Os tamanhos médios das ninhadas ao fim de 14 dias após o 33 nascimento (DPF) foram de 9 para o grupo A, 7 para o grupo B e 10 para o grupo C. Nenhum leitão nascido das porcas do grupo D sobreviveu para além do 3o DPF. A contagem de leucócitos (WBC) para as porcas dos grupos A, B e C permaneceu relativamente constante. As percentagens médias dos valores pré-estimulação foram iguais ou superiores a 92% durante o período de observação. Em três porcas do grupo D foram determinados valores de WBC inferiores aos esperados no intervalo de domínio normal (7-20 x 106/mL) .
Os resultados clínicos pós-inoculação foram irrelevantes para as porcas dos grupos A e B. Houve várias porcas do grupo C em que foram observados sinais clínicos experimentais ao longo de um período de vários dias. A maioria dos sintomas clínicos observados foram a diminuição do apetite, sintomas respiratórios e depressão. Uma porca do grupo C morreu de pneumonia bacteriana crónica ao 31° dia da experiência. Verificou-se que 6 das 7 porcas do grupo D apresentavam sinais clínicos, essencialmente em graus variáveis de gravidade, de perda de apetite, variando entre apetite reduzido e anorexia. Os resultados de avaliação clínica das porcas estão agrupados no quadro 2. QUADRO 2
Resultados clínicos das porcas Trata mento Porca # -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Grupo A 98 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 JA—142 MSV 133 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Passagem 200 147 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 178 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 34 215 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 243 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Grupo A 98 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 JA-142 MSV 133 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pas sagem 200 147 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 178 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 215 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 243 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 o, 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 Grupo A 98 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 JA-142 MSV 133 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Passagem 200 147 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 178 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 215 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 243 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Trata mento Porca # -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Grupo B 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Retro- passagem 6 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 135 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 149 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 209 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 212 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 226 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0, 1 0, 1 0, 1 0, 1 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Grupo B 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Retro- 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 35 passagem 6 135 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 149 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 209 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 212 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 226 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 Grupo B 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Retropas 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -sagem 6 135 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 149 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 209 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 212 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 226 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 o, o, o, o, o, o, 3 3 3 3 3 3 Trata- Porca -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 mento # Grupo C 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Estéril 113 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 3 3 5 3 3 Diluente 117 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 144 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 156 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 166 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 o, o, o, o, o, o, 2 5 5 8 7 7 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Grupo C 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Estéril 113 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 6 6 2 4 2 2 Diluente 117 0 0 0 0 0 0 1 5 5 5 5 5 2 4 1 1 144 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 156 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 166 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Média o, o, o, o, o, o, o, 1, 1, 1, 1, 1, 0, 1, 0, 0, 8 5 5 5 5 5 8 5 5 5 8 8 7 3 5 5 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 Grupo C 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Estéril 113 2 2 30 Diluente 117 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 144 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 156 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 36 166 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média o, o, 6 0 0 0 0 0 0 0 o, 0, 0, o, 0, o, 7 7 2 2 2 2 2 2 Trata- Porca -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 mento # Grupo D 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 JA-142 106 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 Pass 4 159 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 1 1 1 1 1 1 190 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 206 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 232 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 234 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 0 o, o, 0, 0, o, 0, o, 6 6 6 6 7 7 7 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Grupo D 2 1 1 3 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 JA-142 106 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pass 4 159 1 1 1 1 3 4 2 3 3 3 2 0 0 2 0 0 190 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 206 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 232 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 234 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0, 0, 0, o, 0, 0, 0, o, o, o, o, 0 0 o, 0 0 4 3 6 6 6 6 3 4 4 4 3 3 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 Grupo D 2 0 0 0 1 1 1 3 3 1 1 JA-142 106 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pass 4 159 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 190 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 206 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 232 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 234 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0, 0, o, 0, 0, 0, 0, 1 1 1 4 4 1 1
As observações clínicas dos leitões incidiram sobre duas categorias principais, morte e apetite reduzido. Não houve nenhumas diferenças significativas entre os grupos A, B e C no que diz respeito ao número médio de mortes por cada ninhada (DPL). 0 grupo A revelou um valor médio de 1,3 DPL, o grupo B revelou um valor médio de 2,4 DPL, o grupo C 37 revelou um valor médio de 2,0 DPL e não houve nenhum leitão do grupo D que tivesse sobrevivido para além de 3 dias após o nascimento. Os resultados clínicos para os leitões estão agrupados no quadro 3 QUADRO 3
Trata mento Porca # Suíno # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Srupo A 98 813 0 0 1 30 JA-142 814 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pass 200 815 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 816 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 817 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 818 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 819 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 820 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 821 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 822 1 30 Média 0,3 3 0,2 3,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 133 720 30 721 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 722 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 723 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 724 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 725 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 798 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 799 30 800 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 807 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 809 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 810 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 812 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 4,6 0,2 0 0,1 0 0,1 0 0 0 0 0 0,1 0 0 147 823 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 824 0 0 0 0 0 0 0 3 1 1 1 1 1 1 825 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 845 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 846 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 847 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 848 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Trata- Por- Suíno 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 38 mento ca # # 849 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 850 30 976 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 977 0 0 0 0 1 1 3 30 978 30 Média 5 0 0 0 0,1 0,1 0,4 3,3 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,3 178 486 30 487 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 488 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 489 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 490 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 491 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 492 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 493 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 494 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 3,3 0,1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,1 0 0 Grupo A 215 495 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 JA-142 496 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pass 200 497 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 498 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 499 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 808 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233 476 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 477 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 478 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 478 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 480 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 481 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 482 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 483 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 484 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 485 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 243 707 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 708 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 709 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 710 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 711 t 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 712 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 713 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 30 714 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 715 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 39 716 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 717 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 718 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 719 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,1 2,3 0,2 0 0 Grupo B Retropas-sagem 6 49 430 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 431 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40
Trata mento Porca # Suíno # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 432 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 433 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 434 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 435 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 436 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 437 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 438 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 3,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 459 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 460 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 461 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 462 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 463 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 464 0 0 1 1 1 1 30 465 0 30 Média 0 4,3 0,2 0,2 0,3 0,3 5,3 0, 4 0, 4 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 135 439 0 0 0 0 0 0 0 30 440 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 441 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 442 0 0 0 1 1 i 1 1 1 1 3 3 3 30 443 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 444 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 445 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 446 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 447 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,2 3,6 0,1 0,1 0,4 0, 4 0,4 3,8 149 231 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 232 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233 0 0 0 0 0 0 30 234 0 0 0 0 0 0 3 1 1 3 1 1 1 1 235 0 0 0 0 0 0 3 2 3 3 0 0 0 0 236 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 237 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 238 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 239 0 0 30 240 30 241 3 30 242 0 0 0 0 0 2 3 3 30 Média 2, 8 2, 7 3 0 0 0, 4 4,4 0, 9 4, 4 1 0,3 0,3 0,3 0,3 Srupo B 209 448 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Retropas- 449 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 41 sagem 6 450 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 451 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 452 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 453 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 454 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 455 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 456 30 457 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 1 1 1 1 458 30 Média 5,5 0 0 0 0 0 0 0 0, 4 0,4 0,4 0, 4 0, 4 0,4 212 243 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Trata mento Porca # Suino # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 244 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 245 0 0 0 0 3 1 30 246 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 247 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 0 0 248 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 249 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 250 0 0 0 3 30 426 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 427 0 0 0 1 3 1 1 30 428 0 0 0 1 3 3 30 429 0 0 0 0 2 3 3 3 3 3 3 1 30 Média 0 0 0 0,4 3,6 0,9 6,2 3,9 0,4 0,4 0,6 0,1 co co 0 226 Não Gráv. Grupo C Estéril 58 24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diluente 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 46 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 47 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 48 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 51 0 0 0 2 2 1 1 1 30 Mádia 0 0 0 0.3 0.3 0.1 0.1 0.1 3.8 0 0 0 0 0 113 17 30 18 30 19 30 20 30 21 0 30 22 30 23 30 42
Media 25,7 30 117 52 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 53 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 54 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 55 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 56 1 0 0 0 30 57 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 59 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 61 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 62 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0,5 0 0 0 2, 7 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0 0 144 146 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 147 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 148 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 149 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 150 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 221 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 0 0 222 0 0 0 0 0 2 2 1 1 1 1 1 0 1 223 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 224 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 225 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 Trata mento Porca # Suino # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 970 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 971 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 Média 0 0 0 0 0 0,3 0,3 0,1 0,2 0,1 0,2 0,2 0,1 0,1 Grupo C 156 63 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Estéril 64 0 0 1 0 30 Diluente 65 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 66 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 67 0 0 0 0 1 0 1 1 30 68 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 69 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 70 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 71 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 1 0 72 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 73 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 74 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 75 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0,1 0 2,5 0,2 0,3 0,3 2,6 0,1 0,1 0,1 0,1 0 166 76 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 77 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 78 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 43
79 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 80 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 81 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 141 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 142 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 143 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 144 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 145 1 30 Mádia 0,2 2,7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Srupo D JA-142 2 891 1 3 30 Passagem 4 892 1 30 Média 1 16,5 30 106 Abortou NA 159 883 30 884 30 Média 30 190 Abortou NA 206 890 30 Média 30 232 888 30 889 30 Média 30 234 Abortou NA
Os resultados obtidos em termos de ninhadas proporcionaram as diferenças e semelhanças mais extraordinárias entre os diversos grupos de tratamento. Uma vez que os tratamentos não tiveram nenhum efeito sobre o tamanho das ninhadas, as forma mais adequada para comparar os resultados respeitantes às ninhadas consiste em utilizar valores percentuais. 0 grupo A apresentou um valor percentual médio entre vivos/nascidos igual a 85% (DP ± 9,6%). 0 grupo B apresentou um valor percentual médio entre 44 vivos / nascidos igual a 89% (DP ± 11,6%) . 0 grupo de contraprova (grupo C) apresentou um valor percentual médio entre vivos/nascidos igual a 83,4% (DP ± 7,9%). Os valores percentuais médios para os nados-mortos dos grupos A, B e C foram de 8,8% (DP ± 9,66%), 6,6% (DP ± 9,7%) e 14% (DP ± 11,39%), respectivamente. Os valores percentuais médios de animais raquíticos nascidos de porcas dos grupos A, B e C foram de 6,1% (DP ± 6,01%), 3,9% (DP ± 4,45%) e 2,6% (DP ± 4,01%), respectivamente. Os valores percentuais médios entre vivos/nascidos, nados-mortos e raquíticos nascidos das porcas do grupo D foram respectivamente de 8,7% (DP ± 8,92%), 10,7% (DP ± 11,39%) e 81,9% (DP ± 17,18%), respectivamente.
Os resultados deste exemplo demonstram a estabilidade do MSV, JA-142, passagem 200, depois de ter passado pelo animal hospedeiro 6 vezes. Não houve nenhumas diferenças significativas entre o grupo de porcas tratadas com o MSV (grupo A) e as porcas que tinham sido expostas ao vírus na retropassagem 6 (grupo B) nas categorias de resultados em termos de ninhadas, leucopenia, temperaturas rectais e observações clínicas quer das porcas quer dos leitões. Além disso, os resultados nestas mesmas categorias para os grupos A e B foram comparáveis com os obtidos com o grupo C que havia sido tratado apenas com diluente estéril. Finalmente, os resultados obtidos com as porcas que haviam sido expostas ao vírus virulento da estirpe original de MSV, JA-142, passagem 4, ilustraram claramente o nível de atenuação do MSV e a inexistência de retorno aos estado de virulência pelo vírus JA-142, retropassagem 6.
Exemplo 4 45
Materiais e métodos
Este exemplo serviu para avaliar a segurança e o nível de atenuação ao administrar-se uma concentração 10X de MSV, JA-142, passagem 201. O estudo foi efectuado com um modelo de porcas prenhes, tendo sido monitorizado o efeito desta dosagem sobre o desempenho reprodutivo. O estudo abrangeu três grupos, A, C e D. O grupo A foi inoculado intranasalmente com PRRS MSV, JA-142, passagem 200. O grupo C foi inoculado intranasalmente com diluente estéril para servir de grupo de contraprova normal. O grupo D foi inoculado intranasalmente com 10X JA-142, passagem 201.
Todas as inoculações foram aplicadas ao fim de cerca de 93 dias de gestação. Efectuou-se a monitorização das temperaturas corporais das porcas durante os primeiros 7 dias, após a inoculação (vacinação). Foram feitas colheitas de sangue das porcas uma vez por semana e no momento do nascimento das ninhadas. Antes e após a inoculação efectuou-se uma determinação do número de leucócitos, tal como no exemplo 2. Monitorizou-se o estado de saúde de cada animal diariamente durante o estudo e ainda durante 14 dias após o nascimento das ninhadas. Foram feitas observações clinicas das porcas desde o momento -1 DPV até ao nascimento das ninhadas. Efectuou-se uma avaliação de resultados respeitantes às ninhadas, observando o estado de saúde dos leitões nascidos. Foram praticados protocolos de ensaio ELISA com os PRRSV a seguir às exposições das porcas às composições experimentais em estudo. Foram efectuadas experiências para isolar em células MA-104 os PRRSV provenientes de amostras de soro, após a exposição à 46 composição experimental estudada. Foram realizadas observações clinicas dos leitões desde o momento do nascimento da ninhada até aos 14 dias de idade. Efectuou-se a colheita de amostras de sangue dos leitões no momento do nascimento e ao 7o e 14° dias de idade. Foram praticados protocolos ELISA com os PRRSV em soros de leitões, semanalmente após o nascimento da ninhada. Os leitões foram também pesados no momento do nascimento, ao 7o dia pós-nascimento e na autópsia. Na autópsia efectuou-se uma avaliação e classificação dos pulmões de cada leitão para se determinar o envolvimento pulmonar percentual.
Resultados e discussão Não houve diferenças significativas entre grupos tratados com uma dose 10X de MSV, JA-142, passagem 201, grupos tratados com uma dose regular de MSV, JA-142, passagem 200 e grupos tratados com diluente estéril. Assim sendo, com base na segurança e atenuação do MSV, JA-142, passagem 200 e tendo em conta a inexistência de quaisguer diferenças significativas nos resultados quando se faz a comparação destes grupos, foi comprovado que uma dose de 10X de MSV, JA-142, passagem 201 é segura, atenuada e eficaz para induzir anticorpos contra os PRRSV.
Exemplo 5
Materiais e métodos
Este exemplo demonstrou que uma dose minima de vacina de PRRSV, JA-142, passagem 205, representando o MSV+5, é eficaz num modelo experimental de contágio respiratório em 47 suínos de criação. Os suínos foram divididos em 3 grupos. 0 grupo 1 foi inoculado intramuscularmente com PRRS MSV, JA-142, passagem 205 com uma concentração de 2,0 logs/dose. O grupo 2 foi inoculado intramuscularmente com diluente estéril. 0 grupo 3 serviu de contraprova normal. Os suínos dos grupos 1 e 2 foram estimulados com um isolado de PRRSV com um padrão de RFLP de 144 ao 28° dia após a vacinação. Efectuou-se a monitorização das temperaturas corporais dos suínos durante os primeiros 7 dias após a vacinação e diariamente durante o contágio. Os animais foram pesados nos momentos da vacinação, contágio, semanalmente durante o estudo e durante a autópsia. Foram efectuadas colheitas de sangue semanalmente após a vacinação e de dois em dois dias após a estimulação. Efectuou-se a monitorização do estado de saúde de cada animal diariamente durante o estudo. Depois de os animais terem sido sacrificados foram submetidos a autópsia e fez-se uma avaliação dos pulmões para se determinar o valor percentual do envolvimento pulmonar, tal como no exemplo 2. Foram executados protocolos ELISA com PRRSV a seguir às exposições dos suínos às composições e contágios experimentais estudados. Após a exposição às composições experimentais estudadas, foram realizadas em células MA-104 experiências para isolar os PRRSV a partir das amostras de soro. Os resultados de isolamento dos vírus e dos protocolos ELISA foram analisados estatisticamente pelo teste do χ2 que permite avaliar se a percentagem de animais positivos é a mesma em cada grupo. Efectuou-se uma contagem de leucócitos, tal como no exemplo 2.
Resultados e discussão 48
Os suínos do grupo 1 (suínos vacinados) alimentaram-se melhor, em todos os aspectos deste exemplo, do que os suínos do grupo 2 (suínos aos quais se administrou diluente estéril). As avaliações clínicas, temperaturas rectais e envolvimentos pulmonares percentuais foram todos superiores nos suínos aos quais se administrou diluente estéril. Os ganhos de peso e os números de leucócitos foram inferiores nos suínos que receberam o diluente estéril. Houve também uma redução significativa na viremia, começando ao 4o dia após o contágio no grupo que recebeu a vacina. Nos 10° e 11° dias após o contágio, o número de animais positivos à viremia diminuiu ainda mais no grupo vacinado, mas permaneceu igual no grupo que recebeu o diluente estéril.
Utilizou-se um protocolo ELISA para monitorizar o estado serológico anti-PRRSV antes e após a vacinação e o contágio. Todos os suínos eram negativos (razão S/P <0,4) no momento da vacinação. Todos os suínos, incluindo os vacinados, eram negativos ao 7o DPV (Dias pós-vacinação). Decorridos mais sete dias, 21 dos 22 suínos vacinados revelaram ser positivos na análise de anticorpos contra os PRRSV. Houve dois suínos do grupo 1 que continuaram a ser negativos durante o período de pré-contágio e nos quais ocorreu uma conversão serológica ao 8o dia pós-contágio (8 DPC). Todos os suínos do grupo 2 eram negativos no dia 0 da experiência e continuaram a ser negativos durante o período de pré-contágio. Ao 39° dia da experiência (8 DPC), houve 17 dos 22 suínos contagiados e não vacinados (grupo 2) que revelaram ser seropositivos nas análises efectuadas. Todos os suínos do grupo 3 (animais de contraprova normais) continuaram a ser seronegativos ao longo do estudo. 49
Foram efectuados isolamentos de vírus a partir dos soros antes e após a vacinação. Entre os 22 suínos vacinados, houve 17 positivos ao 2 DPV, 18 eram positivos ao 4 DPV e 19 eram positivos ao 7 DPV. Após a vacinação, não foi possível recuperar, de forma alguma, o vírus de vacina de um suíno, o mesmo acontecendo com um outro até ao 0 DPC. Estes resultados correspondem ao estado seronegativo destes suínos durante o período de observação pós-vacinação. No momento do contágio, 55% dos suínos vacinados eram virémicos positivos. Após o contágio, esta percentagem aumentou para 82% (ao 2 DPC) e diminuiu gradualmente até 9% ao 11 DPC. Todos os suínos do grupos 2 eram negativos no momento 0 DPC, tendo havido um aumento para 82% de positivos ao 2 DPC e para 91% ao 4 DPC. No 6 DPC e no 10 DPC, o grupo 2 continha aproximadamente 82% de positivos aos vírus, havendo 73% deste grupo positivo ao 11 DPC. Os animais de contraprova normais do grupo 3 continuaram a ser negativos durante o período do estudo. A monitorização da temperatura rectal revelou um aumento geral em todos os animais pertencentes ao grupo 2. Em metade dos suínos deste grupo houve um aumento de 1°F acima do valor médio pré-contágio durante 2 ou mais dias ao longo do período de observação de 11 dias. Em comparação, houve apenas 4 dos 22 suínos do grupo vacinado em que foram observadas temperaturas de 1°F acima da sua média pré-contágio. A duração média destes valores nos animais em que houve temperaturas elevadas durante 2 ou mais dias foi de 2,2 dias para o grupo 1 e de 4 dias para o grupo 2. Em nenhum dos suínos do grupo 3 foram observados aumentos de 1 °F acima da sua média pré-contágio durante 2 dias ou por um período mais longo 50
Monitorizou-se o ganho de peso ao longo do período de observação de 11 dias. Os suínos do grupo 3 ganharam uma média de 1,6 libras/dia, os suínos do grupo 2 ganharam uma média de 0,94 libras/dia e os suínos do grupo 1 ganharam uma média de 0,53 libras/dia. Assim sendo, os suínos contagiados e não vacinados ganharam apenas cerca de 57% do peso que foi ganho pelos suínos contagiados e vacinados e apenas 50% do peso ganho pelo grupo de animais de contraprova.
Monitorizou-se a leucopenia (número de leucócitos) durante o período de observação pós-contágio. No grupo 3 observou-se uma redução de 5%, na média do grupo, ao 33° dia da experiência (2 DPC), comparativamente com a média pré-contágio. No grupo 2, o número de leucócitos caiu uma média de 41% e não regressou aos níveis pré-contágio até ao 11 DPC. No grupo vacinado houve uma queda, da média do grupo, de 12% ao 34° dia da experiência (3 DPC) . O número de leucócitos regressou ao nível pré-contágio no dia seguinte e manteve-se igual ao nível pré-contágio durante o período de observação.
Foram efectuadas observações clínicas diárias desde o 28° dia da experiência (-4 DPC) até ao 42° dia da experiência (11 DPC). Todos os suínos revelaram estar isentos de quaisquer sinais clínicos observáveis durante o período de pré-contágio. O grupo 3 permaneceu isento de quaisquer sinais clínicos durante o período de pós-contágio. Houve 5 dos suínos do grupo 2 em que foram observados sinais clínicos pós-contágio. Estes sinais tornaram-se evidentes ao 6 DPC e não foram considerados graves. Os suínos vacinados manifestaram apenas um sinal 51 clínico observado durante o 11° dia do período de observação pós-contágio.
No final do estudo efectuou-se uma avaliação dos pulmões para pesquisa de lesões pulmonares observáveis. 0 grupo 3 tinha pulmões normais e uma avaliação média do grupo igual a 0,02. As avaliações individuais dos suínos do grupo 2 variaram, entre um limite à esquerda igual a 33 e um limite à direita igual a 98 para uma média do grupo igual a 78,33. Os valores de avaliação do grupo vacinado variaram entre um valor à esquerda igual a 30 e um valor à direita igual a 90 com uma média de grupo igual a 53,20.
Os resultados obtidos neste exemplo demonstram a eficácia de uma vacina de vírus vivos modificados de PRRS atípica. A vacina foi administrada com uma dose mínima de 2,0 logs por dose, contendo a 5a passagem além do MSV (JA-142, passagem 205). A eficácia da vacina ficou demonstrada ao reduzir significativamente a extensão das lesões pulmonares, a gravidade da leucopenia pós-contágio e a febre pós-contágio. Além disso, verificou-se a existência de uma taxa de crescimento normal nos suínos vacinados / contagiados, comparativamente com a que foi observada nos suínos de contraprova normais e significativamente melhor do que a que foi observada nos suínos não vacinados / contagiados.
Exemplo 6
Materiais e métodos
Neste exemplo fez-se a comparação de 4 grupos, os grupos 1, 2 e 3 com 2 0 suínos cada um e o grupo 4 com 10 52 suínos. 0 grupo 1 foi inoculado intramuscularmente (IM) com PRRS MSV, JA-142, passagem 205, com uma concentração de cerca de 2,5 logs/dose. O grupo 2 foi inoculado intranasalmente com PRRS MSV, JA-142, passagem 205, com uma concentração de cerca de 5,0 logs/dose. O grupo 3 foi inoculado IM com diluente estéril. O grupo 4 serviu apenas de contraprova. Os suínos foram contagiados com um isolado de PRRSV proveniente da Universidade do Estado do Dakota do Sul (SDSU) com um padrão de RFLP igual a 144 ao 28° dia pós-vacinação. Efectuou-se a monitorização das temperaturas corporais dos suínos diariamente após o contágio. Cada animal foi pesado nos momentos de vacinação, contágio, semanalmente durante o estudo e na autópsia. Foram colhidas amostras de sangue semanalmente após a vacinação e de dois em dois dias após o contágio. Efectuou-se a monitorização do estado de saúde de cada animal diariamente durante o estudo. No final do estudo os animais foram sacrificados e fez-se uma avaliação dos seus pulmões para determinação do envolvimento pulmonar percentual.
Foram efectuados protocolos ELISA com PRRSV a seguir às exposições dos suínos às composições experimentais estudadas e aos contágios. Foram também feitas experiências em células MA-104 para isolar os PRRSV das amostras de soro, após a exposição às composições experimentais estudadas. Foram feitas contagens do número de leucócitos (WBC) e observações clínicas pós-inoculação, tal como no exemplo 2.
Resultados e discussão 53
Aos zero dias pós-vacinação (DPV), todos os suínos deste exemplo eram serologicamente negativos aos PRRSV, conforme indicado por uma razão S/P < 0,4. Ao 14 DPV, 70% dos suínos do grupo 1 e 95% dos suínos do grupo 2 eram positivos em termos da presença de anticorpos anti-PRRSV. Apenas um suíno vacinado no grupo 1 continuou a ser seronegativo durante o período de pré-contágio. Este suíno passou a ser seropositivo ao fim de 7 dias pós-contágio (DPC) . Todos os suínos dos grupos 3 e 4 continuaram a ser negativos durante o período de pré-contágio. Ao 9o dia pós-contágio (DPC), todos os suínos do grupo 3, que é o grupo tratado com diluente estéril, revelaram, num protocolo ELISA, ser positivos aos anticorpos contra PRRSV. Os animais de contraprova normais, do grupo 4, continuaram a ser negativos durante o estudo.
Os resultados de isolamento dos vírus estão bem correlacionados com os resultados serológicos. Houve apenas um suíno que continuou a ser negativo em termos de isolamento de vírus a partir do soro e isso correspondeu ao estado seronegativo durante o período pós-vacinação. Estes resultados indicam a existência de uma relação entre a viremia pós-vacinação e a conversão serológica com a dosagem de vacina. Os animais do grupo 2 foram 100% seropositivos ao 14 DPV, comparativamente com 70% de animais do grupo 1. Os animais do grupo da dose elevada (grupo 2) foram 85% e 90% positivos à viremia respectivamente aos 14 DPV e ao 21 DPV. Em comparação, os animais do gruo da dose baixa (grupo 1) foram 55% e 85% positivos nos mesmos dias da experiência. A seguir ao contágio, em 89% dos animais do grupo 3 foram observadas temperaturas que estavam 1°F ou mais acima 54 dos valores observados pré-contágio, durante 2 ou mais dias. No grupo 1, houve 75% dos animais em que foram observadas temperaturas de 1°F ou mais durante 2 ou mais dias. Todavia, apenas em 45% dos animais do grupo 2 foram observadas temperaturas elevadas. Em comparação, em 30% dos animais do grupo de contraprova normal (grupo 4) foram observadas temperaturas elevadas durante 2 ou mais dias durante o período de observação de 11 dias.
Presume-se que o tratamento com a dose de vacina elevada ou com a dose de vacina baixa não teve nenhum efeito detrimental sobre a evolução do crescimento durante o período pós-vacinação (-3 DPV ao 28 DPV). O ganho de peso médio diário para os grupos 1 e 2, foi respectivamente de 0,77 libras/dia e 0,76 libras/dia. A seguir ao contágio, os grupos vacinados superaram o grupo tratado com diluente estéril em 0,05 libras/dia (grupo 1) e em 0,15 libras/dia (grupo 2) . Os animais de contraprova normais superaram os animais vacinados durante o mesmo intervalo de tempo, por um valor médio de 0,4 a 0,5 libras/dia.
Houve 84% (16 entre 19) dos animais do grupo 3, que é o grupo de tratamento com o diluente estéril, em que se observou uma queda de 25% ou mais no número de leucócitos (WBC) durante um ou mais dias após o contágio. Entre os animais de contraprova normais houve 3 em 10 (30%) em que foram observadas diminuições semelhantes. A seguir ao contágio, entre os grupos vacinados, quer o grupo da dose baixa (grupo 1) quer o grupo da dose elevada (grupo 2), houve 11 de 20 animais (55%) e 3 de 20 animais (15%) em que foi observada uma leucopenia de 25% durante um ou mais dias. 55
As observações clínicas efectuadas antes do contágio indicaram que os suínos estavam em bom estado de saúde. A seguir ao contágio, o nível do estado de saúde não se alterou significativamente para o conjunto dos suínos que haviam sido contagiados (grupos 1, 2 e 3) . A letargia, os sinais respiratórios e a perda de apetite foram os sinais clínicos observados e foram considerados e descritos como sinais de uma gravidade ligeira. Os sinais clínicos observados com um suíno do grupo 2 podem ser atribuídos a uma pneumonia bacteriana (ver o texto subsequente respeitante a lesões pulmonares) de que estava a padecer. No grupo de contraprova normal (grupo 4) não foram notados nenhuns sinais clínicos observáveis durante o período de observação de 11 dias.
No final do estudo, os suínos foram sacrificados e os seus pulmões foram observados para detectar lesões semelhantes às de PRRS para se qualificar e quantificar a amplitude do envolvimento pulmonar. Quantificou-se o valor percentual do envolvimento para cada lobo e depois multiplicou-se pelo valor percentual do pulmão para assim se obter o valor que representa a capacidade pulmonar total. Por exemplo, o valor de 50% de envolvimento pulmonar para o lobo diafragmático foi depois multiplicado pelo valor de 25% para se obter um resultado a 12,5% da capacidade pulmonar total. A quantificação máxima que foi possível obter foi de 100%. A quantificação pulmonar média do grupo correspondente aos animais de contraprova (grupo 4) foi zero. A quantificação média do grupo dos animais tratados com diluente estéril (grupo 3) foi de 70,08. Nos grupos de tratamento vacinados, as quantificações médias foram de 48,83 para o grupo da dose baixa (grupo 1) e de 56 17,76 para o da dose elevada (grupo 2). Para um suíno obteve-se uma quantificação pulmonar igual a 62,5 que foi a quantificação mais elevada no grupo 2. A descrição das lesões observadas nos pulmões destes suínos indica que estavam associadas a pneumonia bacteriana. A partir dos resultados deste estudo, conclui-se que os níveis de dosagem de vacina de PRRS MSV atípicos reduziu a gravidade dos sinais clínicos associados à doença respiratória causada pelos PRRSV. Uma dose prática completa superou a dose mínima, conforme indicado pela redução significativa dos valores de quantificação das lesões pulmonares.
Exemplo 7
Materiais e métodos
Este exemplo permitiu determinar a sequência do MSV atenuado, o JA-142 da 201a passagem, e também a sequência da passagem 3 do vírus isolado na natureza, o JA-142. Obteve-se o isolado de vírus atenuado a partir do lote do inoculo principal que representa a 201a passagem, em células MA-104 de símios, de um isolado de PRRSV proveniente de suínos afectados com PRRS. O desenvolvimento dos vírus foi feito em células 2621 pertencentes a uma linhagem de células do rim de macaco, também designadas por MA-104 e por USU-104 (Gravell et al., 181 Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 112-119 (1986), Collins et al., Isolation of Swine Infertility and Respiratory Syndrome Virus (Isolate ATCC VR-2332) em 'North America and Experimental Reproduction of the Disease in Gnotobiotic 57
Pigs', 4 J. Vet. Diagn. Invest. 117-126 (1992)). As células foram criadas em cultura em 50 mL de Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) , enriquecido com 10% de soro de vitelo fetal e com gentamicina na concentração de 50 pg/mL (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em atmosfera húmida contendo 5% de C02 e a 37°C em balões de plástico de cultura de tecidos de 75 cm2. Para as passagens pelas células foram mantidos intervalos de 5-7 dias. As células foram removidas da superfície com tripsina-verseno e divididas (1:4). Para infectar as células efectuou-se a decantação dos meios e acrescentou-se, durante 30 minutos, 1 mL do sobrenadante das células que continha os vírus com uma concentração de aproximadamente 105-106 doses infecciosas de culturas de tecidos (TCID50). Acrescentou-se 30 mL de meios recentes que continham 4% de soro de vitelo fetal. Manteve-se as células a incubar, conforme descrito supra, durante 5 dias, sendo evidente na cultura o efeito citopático ao fim deste tempo. O meio de cultura que continha os vírus foi centrifugado a 2000 r.p.m numa centrífuga Beckman TJ6 para juntar os resíduos celulares
Purificou-se o ARN genómico virai, acrescentando 1120 pL de tampão AVL preparado (QIAamp Virai RNA Isolation Kit, Qiagen) (QIAGEN, Inc. Valência, CA)/ARN portador, a uma amostra de 280 pL de meio de cultura que continha os vírus. Agitou-se a mistura e manteve-se a incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos. Acrescentou-se 1120 pL de etanol e inverteu-se a posição da mistura várias vezes. O ARN foi absorvido pela matriz de uma coluna de centrifugação QIAamp, fazendo centrifugações repetidas de aliquotas de 630 pL, a 6 000 x g, durante 1 minuto. Lavou- 58 se a coluna com 500 pL de tampão AW e centrifugou-se para remover todos os vestígios da solução de lavagem. Efectuou-se a eluição do ARN para fora da coluna com 60 pL de água tratada com pirocarbonato de dietilo, à temperatura ambiente. O ARN purificado foi guardado a -70°C ou utilizado imediatamente para síntese de ADNc.
Para a síntese de ADNc aqueceu-se o ARN virai a 6 7°C durante 7 minutos, fez-se o tratamento preparatório com hexâmeros aleatórios ou com iniciadores específicos de PRRSV e efectuou-se a transcrição inversa com transcriptase inversa (RT) de Superscript II RNase H (Life Technologies, Inc.) . As misturas de reacção continham MgCl2 5 mM, tampão II convencional IX (Perkin Elmer Corp. Wellesley, MA), 1 mM de cada um dos dATP, dCTP, dGTP e dTTP, inibidor da RNase na concentração de 1 unidade/pL, 2 unidades de RT e 1 pL de ARN em 40 pL de mistura de reacção. Manteve-se as misturas de reacção a incubar durante 15 minutos a 42°C, durante 5 minutos a 99°C e durante 5 minutos a 5°C.
Efectuou-se uma reacção em cadeia com polimerase (PCR) para se obter fragmentos de ADN para sequenciação, do modo seguinte: combinou-se 10 pL de porções da mistura de reacção de ADNc, com os reagentes a seguir indicados, daí resultando 25 pL de uma mistura de reacção contendo MgCl2 2 mM, tampão II convencional IX (Perkin Elmer), 0,2 mM de cada um dos dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 0,3 pM de iniciadores de 5'- e de 3'-, específicos do PRRSV, e 0,375 unidade de polimerase de Taq (AmpliTaq) (Perkin Elmer). As reacções foram preparadas por aquecimento durante 4 minutos a 93°C num equipamento de execução dos ciclos térmicos e depois foram executados 35 ciclos traduzidos por 50-59°C durante 30 segundos, 72°C durante 30-60 segundos e 94°C durante 30 59 segundos. Os tempos exactos e as temperaturas utilizadas variaram em função da temperatura de recombinação dos iniciadores em cada reacção e em função do comprimento previsto para o produto da amplificação. Efectuou-se uma incubação final durante 10 minutos a 72°C e depois manteve-se as misturas de reacção a 4°C. Os produtos obtidos por PCR foram purificados utilizando um estojo Microcon 100 (Amicon, Bedford, MA).
Efectuou-se uma PCR para a amplificação rápida das extremidades de ADNc (RACE) para se obter a sequência extrema do terminal 5'- do ARN genómico, com base no processo de Frohman, ΜΑ.,Οη Beyond Classic RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), 4 PCR Methods and Applications S40-S58 (1994). Isolou-se o ARN virai e converteu-se em ADNc, conforme descrito supra, utilizando como iniciadores hexâmeros aleatórios. Os produtos de reacção foram purificados numa coluna Microcon 100 (Amicon). Acrescentou-se uma cauda poli(dA) ao terminal 3', fazendo a incubação de 10 pL de ADNc num volume de 20 pL que continha tampão 4 IX (New England Biolabs, Beverly, MA), C0CI2 2,5 mM, dATP 0,5 mM e 2 unidades de transferase terminal (New England Biolabs), durante 15 minutos a 37°C. Interrompeu-se a reacção por aquecimento durante 5 minutos a 65°C e depois diluiu-se com água até perfazer 200 pL.
Efectuou-se a PCR utilizando o sistema de PCR 'Expanda Long Template' (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha) num volume de reacção de 50 pL que continha 10 pL de ADNc com cauda de poli(dA) diluido, tampão 3 IX, 0,35 mM de cada um dos dATP, dCTP, dGTP e dTTP, MgCl2 0,625 mM, iniciador Qt 0,04 pM (Frohman, 1994), iniciador Q0 0,3 pM (Frohman, 1994),0,3 pM de 5'-CGCCCTAATTGAATAGGTGAC-3' e 0,75 pL de mistura 60 enzimática. As misturas de reacção foram aquecidas a 93°C durante 2 minutos num aparelho de execução de ciclos térmicos que foram repetidos 25 vezes, sendo cada ciclo constituído por aquecimento a 93°C durante 10 sequndos, 63°C durante 30 segundos e 68°C durante 12 minutos. Ao fim de 25 ciclos, manteve-se a mistura de reacção a incubar a 68°C durante 7 minutos e a seguir manteve-se a temperatura a 4°C. Diluiu-se 100 vezes uma aliquota da mistura de reacção e acrescentou-se 45 pL do produto diluído a uma segunda mistura de PCR que continha, em 150 pL tampão 1 IX, 0,35 mM de cada um dos dATP, dCTP, dGTP e dTTP, iniciador Q± 0,3 pM (Frohman, 1994), 0,3 pM de 5'-CCTTCGGCAGGCGGGGAGTAGTGTTTGAGGTGCTCAGC-3' e 0,75 pL de mistura enzimática. As misturas de reacção foram aquecidas a 93°C durante 2 minutos num aparelho de execução de ciclos térmicos e foram sujeitas a 25 ciclos, em que cada ciclo consistiu num aquecimento a 93°C durante 10 segundos, 63°C durante 30 segundos e 68°C durante 4 minutos. Ao fim de 25 ciclos, manteve-se a mistura de reacção a incubar a 68°C durante 7 minutos e depois manteve-se a 4°C. Submeteu-se os produtos de reacção em electroforese sobre gel de agarose a 1% e purificou-se a banda que tinha aproximadamente 1500 pb, utilizando o estojo de purificação em gel QXII da QIAgen. O ADN resultante da eluição foi clonado no vector pGEM-T (Promega, Madison, WI), praticando procedimentos convencionais. Efectuou-se o isolamento dos clones individuais que ficaram a desenvolver-se para isolamento do ADN plasmídico, utilizando para tal os estojos de isolamento plasmídico da QIAgen.
Combinou-se os produtos da PCR e o ADN plasmídico com iniciadores adequados, com base nas sequências dos PRRSV, obtidas no Genbank ou construídas a partir de sequências conhecidas, e submeteu-se o produto obtido a reacções de 61 sequenciação automática com estojos de sequenciação dos ciclos terminadores 'Taq DyeDeoxy' (Applied Biosystems, Foster City, CA) e um amplificador de ADN 'PR 2400 Thermocycler' (Perkin Elmer) no Centro de Análise Genética Avançada da Universidade do Minnesota. Os produtos das reacções foram submetidos a electroforese num sequenciador de ADN 'Applied Biosystems 3700'. As actividades de chamada e de correcção das bases das sequências foram executadas essencialmente com o programa informático 'Phred' (University of Washington Genome Center) e a montagem dos fragmentos foi feita fundamentalmente com o programa 'Phrap' (University of Washington Genome Center). Foram utilizadas outras aplicações informáticas, incluindo 'Lasergene Package' (DNASTAR Inc., Madison, WI), 'Wisconsin Package' versão 9.1 (Genetics Computer Group, Madison, WI), e 'EuGene' (Molecular Biology Information Resource, Houston, TX) para analisar as sequências. A sequência genómica virai final foi montada a partir de aproximadamente 100 reacções em cadeia com polimerase (PCR) e 428 reacções de sequenciação de ADN.
Resultados
Os resultados do exemplo 7 estão explicitados pelas SEQ ID NO:1 e 2 em que a SEQ ID NO:l representa a sequência da 201a passagem do vírus de inoculo principal, JA 142, e a SEQ ID NO: 2 representa a sequência do vírus virulento isolado na natureza, JA 142, ao fim de três passagens.
Também se descreve aqui: 62
Item 1: num processo de passagens múltiplas para atenuar o vírus, o qual compreende os passos que consistem em replicar sucessivamente o referido vírus mediante inoculação e replicação do vírus nas respectivas culturas de células individuais até se conseguir obter a atenuação, a melhoria que consiste em remover as amostras que contêm os vírus para fora de pelo menos algumas dessas culturas de células, enquanto o vírus se vai replicando a um ritmo logarítmico e antes da indução de efeitos citopáticos nessas determinadas culturas de células, e em inocular com as referidas amostras as passagens subsequentes das respectivas culturas de células.
Item 2: processo do item 1, em que o referido passo de remoção ocorre aproximadamente 24 horas após a inoculação das referidas culturas de células.
Item 3: processo do item 1, em que a referida cultura de células é constituída por uma monocamada de células que são mais do que cerca de 70% confluentes.
Item 4: processo do item 1, o qual compreende também o passo que consiste em testar periodicamente a referida progenia virai para pesquisar a atenuação.
Item 5: processo do item 1, o qual compreende também os passos que consistem em conservar as referidas determinadas culturas de células após o referido passo de remoção e em observar se a indução de efeitos citopáticos ocorre nas referidas culturas de células conservadas. 63
Item 6: processo do item 1, em que a referida inoculação compreende o mais pequeno número de virus que em última instância, provoca o CPE.
Item 7: um virus de PRRS que possui o Número VR-2638 de Admissão na ATCC.
Item 8: um virus atenuado pelo processo do item 1.
Item 9: o virus do item 8, tendo o referido vírus passado um mínimo de 200 vezes em cultura celular.
Item 10: o vírus do item 9, sendo o referido vírus substancialmente avirulento.
Item 11: o vírus do item 10, sendo o referido vírus capaz de suscitar uma resposta de anticorpos nos suínos.
Item 12: o vírus do item 11, em que a referida resposta de anticorpos é específica para as estirpes de vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina.
Item 13: a vacina que compreende o vírus do item 7.
Item 14: a vacina do item 13 que compreende também um veículo farmacologicamente compatível.
Item 15: a vacina do item 13, em que a referida vacina é capaz de suscitar uma resposta de anticorpos num animal hospedeiro. 64
Item 16: a vacina do item 15, em que o referido animal hospedeiro é um suino.
Item 17: a vacina do item 15, em que a referida resposta de anticorpos é especifica para as estirpes de vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina.
Item 18: a vacina do item 17, em que as referidas estirpes compreendem as estirpes da síndrome reprodutiva e respiratória porcina atípica.
Item 19: um vírus que possui o padrão de clivaqem por enzimas de restrição igual a 1-4-2, respectivamente pelas enzimas MLU 1, Hinc II e Sac II, na grelha de leitura aberta 5.
Item 20: o vírus do item 19 que não é clivável por MLU 1 na grelha de leitura aberta 5.
Item 21: uma vacina que compreende o vírus do item 19.
Item 22: a vacina do item 21, a qual compreende também um veículo farmacologicamente compatível.
Item 23: a vacina do item 21, em que a referida vacina é capaz de suscitar uma resposta de anticorpos num animal hospedeiro.
Item 24: a vacina do item 23, em que o referido animal hospedeiro é um suíno. 65
Item 25: a vacina do item 23, em que a referida resposta de anticorpos é especifica para as estirpes de vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina.
Item 26: a vacina do item 25, em que as referidas estirpes compreendem as estirpes da síndrome reprodutiva e respiratória porcina atípicas.
Item 27: processo para imunizar suínos contra as estirpes de vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina, compreendendo o referido processo o passo que consiste em administrar aos suínos a vacina do item 21.
Item 28: uma sequência isolada de ADN que possui pelo menos cerca de 65% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.
Item 29: uma sequência isolada de ADN que possui pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.
Item 30: uma sequência isolada de ADN que possui pelo menos cerca de 65% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 .
Item 31: uma sequência isolada de ADN que possui pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 .
Item 32: um vírus de PRRS que possui a sequência do item 28 66
Item 33: um vírus de PRRS que possui a sequência do item 29.
Item 34: o vírus do item 33, em que o referido vírus é atenuado pelo processo do item 1.
Item 35: o vírus do item 33, tendo o referido vírus passado um mínimo de 200 vezes em cultura celular.
Item 36: o vírus do item 33, em que o referido vírus é atenuado.
Item 37: o vírus do item 33, sendo o referido vírus substancialmente avirulento.
Item 38: o vírus do item 33, sendo o referido vírus capaz de suscitar uma resposta de anticorpos nos suínos.
Item 39: o vírus do item 38, em que a referida resposta de anticorpos é específica para as estirpes de vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina.
Item 40: uma vacina que compreende a sequência de ADN do item 29.
Item 41: a vacina do item 40, que compreende também um veículo farmacologicamente compatível. 67
Item 42: a vacina do item 40, em que a referida vacina é capaz de suscitar uma resposta de anticorpos num animal hospedeiro.
Item 43: a vacina do item 42, em que o referido animal hospedeiro é um suíno.
Item 44: a vacina do item 43, em que a referida resposta de anticorpos é especifica para as estirpes de vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina.
Item 45: a vacina do item 44, em que a referidas estirpes compreendem as estirpes de virus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina atípica.
Item 46: a sequência de ADN do item 29, e que a administração da referida sequência a um animal hospedeiro lhe confere uma imunidade eficaz. 68
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> MENGELING, WILLIAMS L.
VORWALD, ANN LAGER, KELLY ROOF, MIKE BURKHART, KELLY GORCYCA, DAVID E <120> VACINA CONTRA A SÍNDROME REPRODUTIVA E RESPIRFATÓRIA PORCINA COM BASE NO ISOLADO JA-142 <130> 27093a <140> <141> <150> 09/298,110 <151> 1999-04-22 <160> 2 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 15424 <212> ADN <213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina <400> 1 69 tcgcccgggc aggtgttgge cctatgcctt ggcafcttgts ttgtcaggag otgcgaccat fô tggcacagcc caaaacfcagc tgcacagaaa acgcccfctct gtigacagoce çcttcagggg 120 agcttagggg tctgteccta fcaccttgct tccggagttg cactgefcfcta eggtefeeecc ISO àaeeefcstaa ecatgtetgg gatacttgat cggtgeacgt geacecccaa tgecâfggtg 240 tttatggcgg agggccaagt ctactgeaca cgacgtctca gtgeaeggtc tctccfcfeecfc 300 ctgaatctcc aagçtcccga gcfcfcggagfcg ctgggcctat tttaeaggcc egaagagcea 360 etceggfegga cgttgcçacg tgcafcteecse actgfctgsgt gctcceccgc oggggectgíí 420 tggeEttctg egatíctttcc a&ttgcacga açgaccagtg gaaacctgaa ettteaacaa 4fi0 agaacggtgc gggtegcagc cgagaíCtac agagecggce agctcaçccc tgcagtcttg 540 aaggcfectac aagtttatga acggggttgc egctggtaee çeaOag&egg acctgeccct SOO ggagfeggccg «tfettgccaa ctcectaeat gtgagfcgata macctetccc gggagcaact 660 caegcgctaa ceaacctgce actcccagag aggcctaagc ctgaageccs ttgeccttct 720 gagtgtgcça tggctgacgt cfcategataot 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REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.
Patentes de invenção citadas na descrição • EP 0835929 AI [0008] • US 5476778 A [0009] • US 5587164 A [0010] • US 09298110 B [0085]
Literatura citada na descrição, para além das patentes de invenção • Murtaugh et al. Archives Virol., 1995, vol. 140, 1451-1460 [0006] • Mengelin et al. A. J. V., 1999, vol. 60 (3), 334-340 [0007] • Devereux, J. et al. Nucleic Acids Research, 1984, vol. 12 (1), 387 [0021] • Altschul, S. F. et al. J. Molec. Biol., 1990, vol. 215, 403-410 [0021] • NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894. BLAST Manual [0021]
Claims (21)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina (PRRS) que compreende uma sequência representada pela SEQ ID N0:1 ou por uma sequência que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.
2. Vírus da reivindicação 1, em que o referido vírus compreende a sequência representada por SEQ ID N0:1.
3. Um vírus de PRRS que possui o Número VR-2638 de Admissão na ATCC.
4. Vírus da reivindicação 1, em que o vírus compreende a sequência representada pela SEQ ID NO:2.
5. Vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, atenuado por um método próprio para atenuar um vírus, o qual compreende os passos de replicar sucessivamente o referido vírus, mediante inoculação e replicação do vírus nas respectivas culturas de células individuais, até se obter a atenuação, remover as amostras que contêm o vírus de pelo menos algumas dessas culturas de células, enquanto o vírus se replica a um ritmo logarítmico e antes da indução dos efeitos citopáticos nessas determinadas culturas de células, e inocular com as referidas amostras as subsequentes passagens das respectivas culturas de células.
6. Vírus da reivindicação 5, em que o referido passo de remoção ocorre aproximadamente 24 horas após a inoculação das referidas culturas de células. 2
7. Vírus da reivindicação 5, em que a referida cultura de células compreende uma monocamada de células que são mais do que cerca de 70% confluentes.
8. Vírus da reivindicação 5, o qual compreende também o passo que consiste em testar periodicamente a referida progenia virai para se determinar a atenuação.
9. Vírus da reivindicação 5, o qual compreende também os passos de conservar as referidas determinadas culturas de células após o referido passo de remoção e em observar se a indução de efeitos citopáticos ocorre nas referidas culturas de células conservadas.
10. Vírus da reivindicação 5, em que a referida inoculação compreende o número mais pequeno de vírus, que em última instância, origina um CPE.
11. Vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido vírus foi obrigado a passar um mínimo de 200 vezes em cultura celular.
12. Vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido vírus é atenuado.
13. Vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido vírus é avirulento.
14. Vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido vírus é capaz de suscitar uma resposta de anticorpos nos suínos. 3
15. Vírus da reivindicação 14, em que a referida resposta de anticorpos é específica para as estirpes de vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina.
16. Vírus de PRRS atenuado de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, obtido mediante a atenuação de um vírus que possui uma sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO:2.
17. Vacina que compreende o vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
18. Vacina da reivindicação 17, a qual compreende também um veículo farmacologicamente compatível.
19. Sequência de ácido nucleico isolada que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:l.
20. Sequência de ácido nucleico isolada que possui a sequência ilustrada por SEQ ID NO:l.
21. Vacina tal como definida nas reivindicações 17 ou 18, para utilização na imunização de um suíno contra a síndrome reprodutiva e respiratória porcina, em que a referida imunização consiste em administrar a referida vacina ao referido suíno.
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