CN111149922B - 一种具有免疫、生长促进功能的脾脏源饲料添加剂及其制备方法与应用 - Google Patents
一种具有免疫、生长促进功能的脾脏源饲料添加剂及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有免疫、生长促进功能的脾脏源饲料添加剂及其制备方法与应用。本发明的饲料添加剂提取自动物脾脏，包括转移因子和细胞因子；所述的细胞因子的分子量在25KDa以下。本发明的制备方法中包括包被剂的使用。本发明的脾脏源饲料添加剂可应用于猪、鸡、鱼虾、毛皮动物的养殖。本发明有效保持了饲料脾脏制品中各种功效因子的活性，且结合应用方法的改进，兼顾了免疫效果与增重，提高了脾脏制品在禽畜养殖业中的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有免疫、生长促进功能的脾脏源饲料添加剂及其制备方法与应用。
背景技术
新世纪以来，我国的畜牧业得到了飞速发展，从传统庭院式家庭散养发展为规模化、产业化、集约化饲养。现在，畜牧业已经成为我国农业中最具活力的产业之一。在享受畜牧业发展带给人们的福利时，人们也承受着畜牧业发展带来的不利影响：比如抗生素的滥用，使畜禽体内药残超标，严重危害食品安全；畜牧行业死淘率过高，降低养殖户经济收益；滞后处理的农业污染成为新的农业发展制约因素，生态环境被破环。开发安全、高效、稳定、可控的绿色饲料添加剂一直是学科领域研究热点。除此之外，蛋白质饲料资源短缺一直是困扰我国饲料工业发展的瓶颈问题。我国蛋白质饲料资源自给严重不足，对进口依赖度高，大豆进口数量需求大。随着我国经济发展，可耕种土地不断减少，蛋白质资源供需矛盾突出，急需技术创新，深挖现有资源潜在价值。因此，动物性蛋白饲料原料资源的需求仍将维持较高水平，寻找替代品，确保畜禽健康，保护食品安全，将是一项长期而艰巨的任务。
在国家目录中，脾脏粉属于蛋白质饲料，可以弥补动物性蛋白质原料的不足。脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的淋巴细胞、巨噬细胞及免疫物质（细胞因子、转移因子、促吞噬素、免疫球蛋白、补体等），是机体细胞免疫和体液免疫的中心。将脾脏细胞破壁，释放活性细胞因子，用于生产不但可以促进动物机体生长，还可代替部分抗生素，减少畜产品生产中抗生素的使用。
然而，现有技术中饲料行业对脾脏原料的利用并不充分。究其原因，脾脏中的多种活性成分极易在加工中失活，现有技术尚未攻克这一难题；脾脏中的活性成分如细胞因子丰富，作用机理复杂，彼此之间存在复杂的级联式协同与制约关系，其作用机理尚不完全清楚。如果脾脏制品加工、使用不当，在养殖业中反而会起到反效果。现有技术中的脾脏制品尚无法兼顾免疫与禽畜的增重，影响了禽畜养殖业的收益。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种具有免疫生长促进功能的脾脏源饲料添加剂及其制备方法与应用，解决了现有技术中存在的技术问题，有效保持了饲料脾脏制品中各种功效因子的活性，且结合应用方法的改进，兼顾了免疫效果与增重，提高了脾脏制品在禽畜养殖业中的应用价值。
具体技术方案如下：
本发明的目的之一是提供一种具有免疫生长促进功能的脾脏源饲料添加剂，提取自动物脾脏，包括转移因子和细胞因子；所述的细胞因子的分子量在25KDa以下。
其中，所述细胞因子包括胰岛素样生长因子、白细胞介素和干扰素。
所述的白细胞介素包括IL-1型和IL-2型，所述的干扰素包括干扰素γ，所述的胰岛素样生长因子包括IGF-1。
上述活性成分均经过外委机构检测，如有需求可提供检测报告作为证据。
转移因子（TF因子）为又称传输因子，分子量3～5KDa，由具有白细胞免疫功能的淋巴细胞产生。TF因子带有致敏淋巴细胞特异性疫信息，在机体内能将T细胞受体致敏激活，特异地将供体的免疫力被动地转移到细胞受体，引起免疫应答反应。
白细胞介素（LI）分子量为15～17.5KDa，为免疫应答过程中白细胞间相互作用的细胞因子。
干扰素是一类糖蛋白，其中TFN-γ具有种属特异性，在本发明中分子量为19～25KDa，主要由T细胞和NK细胞产生，具有抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫及抗肿瘤作用。
胰岛素样生长因子(IGF)是一类多功能细胞增殖调控因子，分子量为7.4～7.6KDa，在细胞分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用。
转移因子、细胞因子是一类具有刺激细胞免疫及促生长活性，通过与特异的、高亲和力的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽或糖蛋白类物质。
需要注意的是，脾脏提取物中的各种细胞因子在体内既相互促进又相互制约，具有多效、重迭、协同、拮抗、网络性等特点。彼此间进行级联反应，诱导细胞发生自分泌、旁分泌和内分泌作用。添加量少，在体内不起作用，添加量过多，则起相反作用，而且必须具有活性，通过试验得到既能增强机体免疫又能促进生长的适当用量非常困难。其一在于免疫与促生长二者在某种状态下呈负相关关系。其二，添加量小，不足以激活免疫系统的免疫功能。添加量过多，易造成免疫抑制，不能提高机体的免疫功能，反而致其免疫功能下降，疾病增加。其三，免疫细胞受体必须被致敏激活，且受体与配体结合，形成二倍体或多倍体，才能发挥作用。现实运用酶进行水解、冻干法等提取脾脏内容物的方法，尽管已有专利申请，但从脾脏中提取细胞因子运用到实际生产中，尚未见报道。
本发明将脾脏水提物尤其是细胞因子的分子量控制在25KDa之下，运用多种细胞因子，在不同动物不同阶段的添加比例区间为0.5～6wt%，获得了功效稳定可控的脾脏源饲料添加剂。
优选的，所述脾脏源饲料添加剂的原料为猪、牛、羊或鸡的脾脏。
进一步优选，本发明中使用的猪、牛、羊的脾脏连接处的脂肪＜10g；鸡的脾脏连接处的脂肪＜1g；挥发性盐基氮≤10mg/100g。
优选的，所述脾脏源饲料添加剂经过包被处理；所述包被处理使用的包被剂包括海藻酸钠、精氨酸和海藻糖。本发明特殊的包被处理对脾脏源饲料添加剂的效果有显著的保护和促进作用。
转移因子、细胞因子等功效因子，其物化特性大部分不耐高温。在60℃～70℃条件下15min～30min灭活，对蛋白酶、DNA、RNA酶敏感。实验结果证明，本发明特殊的包被处理能有效防止功效因子失活。
本发明的包被剂既是功效保护剂又起到缓释剂的作用。本发明特殊的包被处理能防止脾脏活性成分高温失活，有利于喷雾干燥产品常温保藏和高温制粒工艺生产。本发明特殊的包被处理除了防止功效成分失活外，还有利于其在动物机体内的吸收，防止活性成分被胃酸及蛋白酶破坏，同时使包被外层在小肠内45分钟迅速崩解，快速完全吸收。常温下3个月，4℃可达6～12个月不失活。
本发明的目的之二是提供一种具有免疫生长促进功能和促生长功能的脾脏源饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）原料的挑选与处置；
（2）机械细胞破碎并超滤分离；
（3）包被处理；
（4）干燥。
其中，步骤（1）的工作条件优选为：
选择猪、牛、羊或鸡的脾脏作为原料，于-18～-20℃条件下冷冻贮藏，使用前0～4℃条件下解冻2h。
进一步优选，解冻失水≤6%，贮藏过程中脾脏Ph值在5.8-6.2。
冷冻的贮藏方式与低温解冻是必要的，有助于活性的保持和细胞破碎的进行。
其中，步骤（2）中机械细胞破碎（匀浆）后获得的体系的粒径20μm以下的累计率超过60%。
优选的，步骤（2）的工作条件为：
脾脏原料与水的质量比为1:1～1:4，10～15℃条件下使用研磨分散机进行匀浆,转速12000～20000rpm匀浆10～25min。匀浆后的物料进行超滤分离，得细胞破碎液。匀浆后，破壁率达到80%以上。
匀浆之前，可在10～15℃条件下使用胶体磨进行预处理。
超滤之前，可对匀浆液进行离心处理。
匀浆工艺获得的粒径的限定是重要的。现有技术中对粒径的限定通常为平均粒径，在本发明的研发过程中发现，平均粒径与功效成分的溶出量并不存在直接的同步关系，换言之平均粒径并不能作为脾脏功效因子溶出量的量度；而某一粒径粒子的累计量与功效成分的溶出量具有明显的同步关系，以此为量度来设计匀浆工艺，可稳定获得高产率的脾脏功效因子。此外，破壁率也与功效因子溶出量正相关。
匀浆中维持低温是必要的，脾脏中的活性因子极易高温失活。
所述的超滤分离包括离心后进行超滤，可通过超滤获得所需的转移因子、细胞因子分子量范围，超滤滤膜的截留分子量优选为22～25KDa，最优选为25KDa。保留适当的细胞因子分子量范围对本发明而言是必要的，是本发明功效稳定可控的关键之一。
其中，步骤（3）的工作条件为：
a、用柠檬酸调整步骤（2）获得的细胞破碎液pH值为4.5～5.3；
b、配置浓度为0.8wt%～3wt%的海藻酸钠水溶液；
c、配置浓度为1wt%～3.5wt%的精氨酸水溶液;
d、配置浓度为1wt%～5wt%的海藻糖水溶液;
e、将步骤（3b）获得的海藻酸钠溶液加入步骤（3a）获得的细胞破碎液，300～600rpm搅拌10～25min；海藻酸钠溶液与步骤（3a）获得的细胞破碎液的质量比为1:15～1:40，海藻酸钠溶液的温度在40℃之下;
f、将步骤（3c）获得的精氨酸溶液加入步骤（3e）获得的反应体系，100～250rpm搅拌10～25min；精氨酸溶液与步骤（3a）获得的细胞破碎液的质量比为1:15～1:40，精氨酸溶液的温度在40℃之下;
g、将步骤（3d）获得的海藻糖溶液加入步骤（3f）获得的反应体系， 100～250rpm搅拌10～25min；海藻糖溶液与步骤（3a）获得的细胞破碎液的质量比为1:15～1:40，海藻糖溶液的温度在40℃之下。
经过上述工艺，本发明包被率达到90%以上。本发明包被剂的添加顺序是重要的，包被过程中pH值的调整也是必要的。如顺序、pH值、用量不当，达不到包被效果，且影响喷雾干燥工艺的进行，影响消化率，进而引起动物腹泻。
其中，步骤（4）的工作条件为：
对步骤（3）获得的包被液进行喷雾干燥，进口温度为200～260℃，出口温度65～120℃。
本发明的第三个目的是提供如上所述的具有免疫生长促进功能和促生长功能的脾脏源饲料添加剂在禽畜养殖中的应用。
优选的，应用于猪、鸡、鱼虾、毛皮动物的养殖。
进一步优选，所述的具有免疫生长促进功能的脾脏源饲料添加剂在禽畜饲料中的质量占比如下：
仔猪2wt%～6wt%，母猪0.5wt%～1.5wt%，肉小鸡1wt%～1.3wt%，肉中大鸡1.2wt%～2wt%，种禽0.8wt%～1.2wt%，鱼虾0.5wt%～1wt%，毛皮动物0.5wt%～1.5wt%。
通过本发明制备的脾脏源饲料添加剂配合上述应用方法，能有效兼顾免疫效果与增重效果，在降低患病率、死亡率的前提下实现理想经济效益。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种具有免疫生长促进功能的脾脏源饲料添加剂，解决了现有技术中脾脏源饲料添加剂活性、功效不稳定的问题，通过截取细胞因子的有效分子量，获得了功效稳定可控的脾脏源饲料添加剂，兼顾了免疫效果与增重，科学地从根本上解决了少用或不用抗生素的问题。提高了脾脏制品在禽畜养殖业中的应用价值。
本发明还提供了上述脾脏源饲料添加剂的制备方法，通过粒径、温度的控制和特有的包被方法，有效保持了饲料脾脏制品中各种功效因子的活性。本发明的包被剂既是功效保护剂又起到缓释剂的作用，不仅防止功效成分失活，还有利于其在动物机体内的吸收，防止活性成分被胃酸及蛋白酶破坏，同时使包被外层在小肠内45分钟迅速崩解，快速完全吸收。
本发明还提供了上述脾脏源饲料添加剂的使用方法，能有效兼顾免疫效果与增重效果，在降低患病率、死亡率的前提下实现理想经济效益。
附图说明
图1为实施例1匀浆后获得的细胞匀浆液的粒径分布图；
图2为实施例1喷雾干燥后获得的包浆干粉的粒径分布图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例中使用的动物脾脏由河南双汇和临沂金锣提供。
研磨分散机型号：上海依肯CMSD2000/10。
实施例中使用的其他物料均为市售普通物料。
实施例1
以猪脾脏为原料生产脾脏源饲料添加剂，包括如下步骤：
（1）原料的挑选与处置：脾脏-18～-20℃条件下冷冻贮藏，使用前0～4℃条件下解冻4h；
（2）机械细胞破碎：脾脏原料与水的质量比为1:2，10～15℃条件下使用研磨分散机进行匀浆，转速15000rpm匀浆15min；对匀浆后的物料离心后取上清进行超滤，滤膜的截留分子量为25KDa；保留25KDa以下的超滤流出物。
（3）包被处理:
a、用柠檬酸调整步骤（2）获得的细胞破碎液pH值为4.8；
b、使用20℃的水配置浓度为2wt%的海藻酸钠水溶液；
c、使用20℃的水配置浓度为2.5wt%的精氨酸水溶液;
d、使用20℃的水配置浓度为3wt%的海藻糖水溶液;
e、将步骤（3b）获得的海藻酸钠溶液加入步骤（3a）获得的细胞破碎液，400rpm搅拌15min；海藻酸钠溶液与步骤（3a）获得的细胞破碎液的质量比为1:20;
f、将步骤（3c）获得的精氨酸水溶液加入步骤（3e）获得的反应体系，200rpm搅拌15min；精氨酸溶液与步骤（3a）获得的细胞破碎液的质量比为1：20；
g、将步骤（3d）获得的海藻糖溶液加入步骤（3f）获得的反应体系，200rpm搅拌15min；海藻糖溶液与步骤（3a）获得的细胞破碎液的质量比为1：20。
（4）干燥：对步骤（3）获得的包被液进行喷雾干燥，干燥温度为进口温度245℃，出口温度85℃。
实验1：利用Winner2308C激光粒度测定仪对实施例1步骤（2）中匀浆后获得的料液进行粒径测定。
取均一的匀浆液一滴，滴入智能型干湿一体激光粒度分析仪，选择湿法检测，读取相关颗粒累计分布粒径数值。粒径小于20μm的累积率为66.986%。粒径分布的具体信息见图1。
实验2：利用Winner2308C激光粒度测定仪对实施例1最终获得的喷雾干燥粉进行粒径测定。
将实施例1最终得到的喷雾干燥包浆粉过40目振动筛后取样品进行粒度检测，使用智能型干湿一体激光粒度分析仪，选择干法检测，读取相关颗粒累计分布粒径数值。实施例1获得的包被干粉的粒径分布的具体信息见图2。
实验3：包被率的测定
将实施例1最终得到的喷雾干燥包浆粉过40目振动筛后，将5g包浆粉分散于150ml水中（室温），以蛋白质含量为检测指标（包被粉的主要成分为多肽），使用离心法(10000rpm离心15min)测定包浆粉的包被率。
包被率=（A-B）/A×100%;
A:包浆粉中蛋白质含量（g）;
B:离心获得的上清液中蛋白质含量（g）
测得包被率为93.2%。
实验4：实施例1获得的产品的活性成分的检测。
对实施例1获得的产品中的转移因子、白细胞介素、干扰素、胰岛素样生长因子进行委托检测，检测结果见表1。
表1 实施例1活性成分检测表
上述检测结果有检测报告为证，如需要提供证据，可后续提供。
实施例2
以鸡脾脏为原料生产脾脏源饲料添加剂，包括如下步骤：
（1）原料的挑选与处置：脾脏-18～-20℃条件下冷冻贮藏，使用前0～4℃条件下解冻6h；
（2）机械细胞破碎：脾脏原料与水的质量比为1:1，10～15℃条件下使用细胞破碎机进行匀浆，转速12000rpm匀浆25min；；对匀浆后的物料离心后取上清进行超滤，滤膜的截留分子量为22KDa；保留22KDa以下的超滤流出物。
（3）包被处理:
a、用柠檬酸调整步骤（2）获得的细胞破碎液pH值为5；
b、使用25℃的水配置浓度为0.8wt%的海藻酸钠水溶液；
c、使用25℃的水配置浓度为2.5wt%的精氨酸水溶液;
d、使用25℃的水配置浓度为3wt%的海藻糖水溶液;
e、将步骤（3b）获得的海藻酸钠溶液加入步骤（3a）获得的细胞破碎液，海藻酸钠溶液与步骤（3a）获得的细胞破碎液的质量比为1:15；600rpm搅拌10min；
f、将步骤（3c）获得的精氨酸溶液加入步骤（3e）获得的反应体系，250rpm搅拌10min; 精氨酸溶液与步骤（3a）获得的细胞破碎液的质量比为1：15；
g、将步骤（3d）获得的海藻糖溶液加入步骤（3f）获得的反应体系，250rpm搅拌10min；海藻糖溶液与步骤（3a）获得的细胞破碎液的质量比为1：15。
（4）干燥：对步骤（3）获得的包被液进行喷雾干燥，干燥温度为进口温度200℃，出口温度65℃。
实施例3
以牛脾脏为原料生产脾脏源饲料添加剂，包括如下步骤：
（1）原料的挑选与处置：脾脏-18～-20℃条件下冷冻贮藏，使用前0～4℃条件下解冻2h；
（2）机械细胞破碎：脾脏原料与水的质量比为1:4，10～15℃条件下使用研磨分散机进行匀浆，转速20000rpm匀浆10min；；对匀浆后的物料离心后取上清进行超滤，滤膜的截留分子量为25KDa；保留25KDa以下的超滤流出物。
（3）包被处理:
a、用柠檬酸调整步骤（2）获得的细胞破碎液pH值为4.5；
b、使用35℃的水配置浓度为3wt%的海藻酸钠水溶液；
c、使用35℃的水配置浓度为3.5wt%的精氨酸水溶液;
d、使用35℃的水配置浓度为5wt%的海藻糖水溶液;
e、将步骤（3b）获得的海藻酸钠溶液加入步骤（3a）获得的细胞破碎液，海藻酸钠溶液与步骤（3a）获得的细胞破碎液的质量比为1:40；300rpm搅拌25min；
f、将步骤（3c）获得的精氨酸溶液加入步骤（3e）获得的反应体系，100rpm搅拌25min；精氨酸溶液与步骤（3a）获得的细胞破碎液的质量比为1：40；
g、将步骤（3d）获得的海藻糖溶液加入步骤（3f）获得的反应体系，100rpm搅拌25min；海藻糖溶液与步骤（3a）获得的细胞破碎液的质量比为1：40。
（4）干燥：对步骤（3）获得的包被液进行喷雾干燥，干燥温度为进口温度260℃，出口温度120℃。
实施例4
原料为羊脾脏，其余工作条件与实施例1相同。
验证案例1
试验动物：选择体重相近的无猪瘟抗体28日龄断奶仔猪120头。
试验样品：实施例1获得的产品。对照品：血浆蛋白。
试验方法：随机分为4个处理，每个处理3个重复，每个重复10头。处理1（对照组）按照NRC（2012）仔猪饲养标准配制商品饲料，试验组分别在商品饲料的基础上添加20、40和60g/kg的本发明实施例1产品替代同样添加量的血浆蛋白。试验期20d。试验结束后进行个体称重，并每天记录采食情况、精神状态、粪便、腹泻及死亡情况。于48日龄采血供检测用。
结果:在提高仔猪生产性能方面，仔猪日粮中添加本发明产品对日采食量、日增重、料重比和期末体重有显著影响。与不添加本发明产品相比，仔猪采食添加40 g/kg的核糖蛋白日粮，试验全期日采食量、日增重和期末体重分别相对增加了6.09%、13.40%和5.71%，料重比下降了6.29%。
在提高仔猪机体免疫力方面，仔猪饲喂添加本发明产品的日粮，显著提高了外周血T淋巴细胞E玫瑰花环比例和血清IgG含量。以日粮中不添加本发明产品为100%，仔猪日粮中本发明产品添加量从20 g/kg增加到60 g/kg，外周血T淋巴细胞E玫瑰花环比例相对增加了6.88%、33.75%和0.64%，血清IgG含量相对提高了0.48%、18.39%和19.78%。
说明本发明产品具有促进免疫功能，可以非特异性的增强机体的细胞免疫和体液免疫，产生较高滴度的抗体，延长抗体高峰期。同时，具有促生长抗腹泻功能，堪比血浆蛋白产品，但比血浆蛋白调节机体免疫功能能力更强，成本低廉。其最适添加水平为40 g/kg。
验证案例2
试验动物：1日龄健康肉仔鸡1500只。
试验样品：饲料中添加本发明实施例1获得的产品。对照品：不添加。
试验方法：随机分成2个处理。试验期共40 d，分2个阶段饲养（0～3周龄，4～6周龄）。对照组饲喂商品饲料，试验组根据不同饲养阶段，在对照组饲粮基础上分别添加10 g/kg（0～3周龄）和13 g/kg（4～6周龄）本发明产品。将商品饲料制成粉料后与本发明产品混匀。每日记录各组采食量，每周统计一次料槽内的剩料量以及各组的平均体重，计算平均日采食量，日增重，料重比等。在试验第1d、7d、14d、21d、28d、35d和40d，每个处理组均取10只鸡，翅静脉采血，分离血清，测定血清抗体效价。试验第28d每个处理组取10只鸡称重，解剖取胸腺、脾脏、法氏囊称重记录，计算免疫器官指数。
结果:在改善肉鸡生产性能方面，以不添加本发明产品为100%，日粮中添加本发明产品，全期采食量和期末体重分别相对增加了2.68%和3.43%，料重比相对降低了0.60%。说明肉鸡饲喂添加本发明产品的日粮每周日增重明显高于对照组。
在增强肉鸡机体免疫力方面，以肉鸡日粮中不添加本发明产品为100%，日粮添加本发明产品，试验第8d、15d、21d、28d和35d血清相对抗体效价分别为114.11%、104.32%、104.74%、110.56%和110.97%。说明肉鸡饲喂添加本发明产品的日粮显著提高了血清抗体效价。另外，本发明产品对肉鸡胸腺指数和法氏囊指数影响差异显著，对脾脏指数没有显著影响。与肉鸡日粮不添加本发明产品相比，日粮中添加本发明产品，胸腺指数和法氏囊指数相对分别增加了7.42%和13.61%。
验证案例3
试验动物：水产养殖体质健康、规格整齐的大菱鲆幼鱼540尾。
试验样品：根据大菱鲆的营养需求及代谢特点，以鱼粉和大豆浓缩蛋白为主要蛋白源，鱼油为主要脂肪源，梯度添加0、0.5%、1%、2%、3%，4%的本发明实施例1获得的产品，配制成6组等氮等能的配合饲料，分别命名为D0、D1、D2、D3、D4、D5组，D0组为对照组。
试验方法：实验鱼用对照组饲料暂养2周，循环水养殖，连续充气。共分6组，每组本发明产品水平设置3个平行，每天投喂两次(08:00、17:00)，日投喂量为鱼体重量的1.2%～1.5%，据摄食情况调整投喂量。养殖实验周期为8周，养殖期间控制水温（17±1）℃，溶氧>6mg/L，盐度28~32，NO2--N<0.1mg/L，NH4+-N<0.1mg/L。养殖实验结束时，禁食24h，以桶为单位称重量，记录每桶实验鱼的尾数和质量，计算成活率、增重率和饲料系数。每桶随机选择15尾幼鱼，丁香酚麻醉，尾静脉采血，之后取内脏团称重，然后分离肝脏称重，计算脏体比和肝体比。血样4℃静置4h，4000r/min离心10min，取血清。将所有样品保存于-20℃，待测。
攻毒实验：实验结束后，每桶取10尾鱼进行攻毒实验。将纯化的鳗弧菌种于28℃,200r/min震荡培养箱中培养10h，至OD600约0.5,4℃,8000r/min离心10min，收集菌体沉淀，用无菌PBS稀释，至OD600为1左右，每尾注射100μL的鳗弧菌（1×107）进行攻毒，分别放入室内塑料桶内，保证充足供氧，每2小时观察一次，捞出死鱼，于48小时统计累计死亡率。
结果:在提高生产性能方面，D2组添加1%的本发明产品，在增重率方面要明显高于其他各组，而饲料系数要明显低于其他各组。
在提高免疫性能方面，血清总蛋白和球蛋白在1%组出现最高值，与对照组差异显著（P<0.05）。碱性磷酸酶在0.5%组出现最高值，显著高于对照组（P<0.05），与1%组无显著差异（P>0.05）。另外，各实验组白介素-β1（IL-β1）含量均显著高于对照组（P<0.05），各实验组肿瘤坏死因子（TNF-α）浓度均显著高于对照组（P<0.05），其中在0.5%组达到最高值。鳗弧菌攻毒48小时，结果显示，累积死亡率在0.5%组最低，显著低于对照组和其他各实验组。结果表明在D1组添加0.5%的本发明产品幼鱼抗病力最强。说明本发明产品在适当的添加比例下，对大菱鲆幼鱼的促生长、提高免疫力、增加抗病力等方面均有显著的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种具有免疫、生长促进功能的脾脏源饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述脾脏源饲料添加剂提取自动物脾脏，包括转移因子和细胞因子；所述的细胞因子的分子量在25KDa以下；
包括如下步骤：
(1)原料的挑选与处置；
(2)机械细胞破碎并超滤分离，脾脏原料与水的质量比为1:1～1:4，10～15℃条件下使用研磨分散机进行匀浆，转速12000～20000rpm匀浆10～25min；匀浆后的物料进行超滤分离，得细胞破碎液；所述机械细胞破碎后获得的体系的粒径20μm以下的累计率超过60％；
(3)包被处理：
a、用柠檬酸调整步骤(2)获得的细胞破碎液pH值为4.8；
b、配置浓度为2wt％的海藻酸钠水溶液；
c、配置浓度为2.5wt％的精氨酸水溶液；
d、配置浓度为3wt％的海藻糖水溶液；
e、将步骤(3b)获得的海藻酸钠溶液加入步骤(3a)获得的细胞破碎液，400rpm搅拌15min；海藻酸钠溶液与步骤(3a)获得的细胞破碎液的质量比为1:20，海藻酸钠溶液的温度在40℃之下；
f、将步骤(3c)获得的精氨酸溶液加入步骤(3e)获得的反应体系，200rpm搅拌15min；精氨酸溶液与步骤(3a)获得的细胞破碎液的质量比为1:20，精氨酸溶液的温度在40℃之下；
g、将步骤(3d)获得的海藻糖溶液加入步骤(3f)获得的反应体系，200rpm搅拌15min；海藻糖溶液与步骤(3a)获得的细胞破碎液的质量比为1:20，海藻糖溶液的温度在40℃之下；
(4)干燥：对步骤(3)获得的包被液进行喷雾干燥，进口温度为200～260℃，出口温度为65～120℃。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞因子包括胰岛素样生长因子、白细胞介素和干扰素；所述的白细胞介素包括IL-1型和IL-2型，所述的干扰素包括干扰素γ，所述的胰岛素样生长因子包括IGF-1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脾脏源饲料添加剂的原料为猪、牛、羊或鸡的脾脏。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)的工作条件为：
选择猪、牛、羊或鸡的脾脏作为原料，于-18～-20℃条件下冷冻贮藏，使用前0～4℃条件下解冻2～6h。
5.一种如权利要求1～4任一项所述的具有免疫、生长促进功能的脾脏源饲料添加剂的制备方法所制备的脾脏源饲料添加剂在制备猪、鸡、鱼虾的饲料中的应用，所述具有免疫、生长促进功能的脾脏源饲料添加剂在饲料中的质量占比如下：
仔猪2wt％～6wt％，母猪0.5wt％～1.5wt％，肉小鸡1wt％～1.3wt％，肉中大鸡1.2wt％～2wt％，种禽0.8wt％～1.2wt％，鱼虾0.5wt％～1wt％。
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