CN102397293A

CN102397293A - 脾脏免疫因子及其制备方法

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Publication number: CN102397293A
Application number: CN2010102855294A
Authority: CN
Inventors: 曹吉祥
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-09-19
Filing date: 2010-09-19
Publication date: 2012-04-04

Abstract

本发明公开了一种脾脏免疫因子及其制备方法，属生物医药技术领域。该脾脏免疫因子或特异性脾脏免疫因子采用超滤法或透析法制备。本发明脾脏免疫因子的分子量小于20000道尔顿，含有转移因子所没有的蛋白质成份，生物活性高。本发明脾脏免疫因子的开发与应用，不仅拓展了动物(鸡、猪等)脾脏资源的利用效率，增强了脾脏提取物的生物活性，而且为治疗人类、动物界的顽固性疾病，如禽流感、肿瘤等，提供了一种原料易得、成本低廉、无毒副作用的制剂原料，适宜于工业化生产。

Description

脾脏免疫因子及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫因子，尤其涉及脾脏免疫因子及其制备方法，属生物医药技术领域。

背景技术

脾脏是人、动物体内最大的淋巴器官；脾脏亦是机体的中枢免疫器官。脾脏的免疫学功能主要体现在生成免疫活性细胞、识别抗原、生成抗体等方面。脾脏中T淋巴细胞和B淋巴细胞可以制造免疫球蛋白、补体等免疫活性物质以及干扰素、转移因子等各种活性因子。当血液中出现病菌、病毒、原虫等抗原或异物时，脾脏中的这些活性细胞和活性物质就可以发挥主动或被动的免疫作用，将进入机体的细菌、病毒及其它异物吞噬、中和或杀灭。

禽类(鸡、鸭等)、畜类(猪、牛、羊等)的脾脏容易获得，尤其是鸡、猪的脾脏资源量非常大。肉鸡及猪的脾脏为屠宰加工过程中的下脚料，因为人们没有食用脾脏的习惯，脾脏经常作为非食用部分被弃去。将这些下脚料资源充分利用，变废为宝，能够创造极大的经济效益和社会效益。但目前对脾脏的利用仅仅是从中提取转移因子(Transfer Factor，TF)。TF的制备方法已有多个专利，如中国发明专利CN1087520公开了猪脾脏提取转移因子的方法；中国发明专利CN1408367A则阐述了一种鸡脾转移因子的生产工艺及其制备方法。TF为分子量介于3000～6000道尔顿的小分子核苷酸-多肽类物质，它作为一种特定的细胞因子参与机体的免疫反应，能够提高机体细胞免疫功能，抵抗真菌、病毒等非细菌性感染；同时有促进B细胞的抗体分泌作用，能够诱导细胞释放干扰素，进而促进机体抗感染、防御能力。然而脾脏中的活性物质远非仅仅转移因子TF一族。脾脏的应用价值有待进一步挖掘。本发明经过研究探索，提取出了动物脾脏免疫因子，经检索，未见现有技术中有关脾脏免疫因子的相关文献报道。

发明内容

本发明目的旨在充分利用动物屠宰环节产生的丰富下脚料——脾脏，制备具有多种生物活性的脾脏免疫因子，从而提供一种能够提高人类、动物机体免疫功能以及防治病毒性、细菌性等疾病的生物制剂，使脾脏这种丰富的生物资源得以充分利用；另一目的在于提供其制备方法。

本发明的技术实施方案如下：我们利用经过检疫的鸡、猪等的脾脏为原料，经冻融破碎细胞后将脾脏成份提取出来，经过滤、离心，然后超滤；超滤后收集分子量小于20000道尔顿的脾脏成份，我们将其称为脾脏免疫因子(Spleen Immune Factor)、脾脏因子(Spleen Factor)或活性蛋白因子(Active Protein Factor，简称APF)。

与转移因子TF相似(任丽君等，转移因子研究及其临床应用，生物学杂志，1997年第14卷第15期)，脾脏免疫因子可分为特异性脾脏免疫因子和非特异性脾脏免疫因子两大类。特异性脾脏免疫因子系采用某种特定病原感染或免疫机体后再提取含该抗原特异活性的脾脏免疫因子，针对性强，治疗效果突出。非特异性脾脏免疫因子是指用自然机体脾脏提取的具有多种免疫活性的脾脏免疫因子，可非特异性调节机体的免疫机能，从而提高机体的抵抗力或疫苗的免疫效果。试验表明，由对病原体的抑杀效果和免疫活性来看，特异性脾脏免疫因子活性为非特异性脾脏免疫因子活性的40～50倍。

一、非特异性脾脏免疫因子通过如下步骤制备：

首先将经过检疫的新鲜、健康脾脏，用无菌纯水反复清洗，将脾脏表面的油脂、筋膜处理干净；将脾脏切块放入高速组织捣碎机中捣碎，分盘后入冷库(-25℃～-30℃)速冻，冻融3～5次，加3～5倍无菌纯水，混匀，然后置于胶体磨中乳化，离心分离固体物与提取物，每分钟3000～16000转；滤液收集于容器中，滤液过滤；超滤，截留分子量小于20000道尔顿得到的超滤产物即为脾脏免疫因子。其为分子量小于20000道尔顿的混合物。

二、特异性脾脏免疫因子通过如下步骤制备：

用某种特定疾病抗原免疫猪、鸡等动物，待免疫成功后取免疫动物的脾脏，无菌匀浆，冻融3～5次，使细胞彻底破坏；将匀浆冻融液放入透析袋中透析，收集其中分子量20000道尔顿以下部分，即为特异性脾脏免疫因子。其为分子量小于20000道尔顿的混合物。

三、脾脏免疫因子检测

1、蛋白质定性试验：蛋白质具有缩二脲显色反应，而多肽没有；在试管中加入2mL脾脏免疫因子溶液，再加10％氢氧化钠溶液2mL，然后加几滴1mol·L^-1硫酸铜溶液，可观察到在脾脏免疫因子溶液内有紫色出现；表明脾脏免疫因子含有蛋白质成份；而主要为多肽成份的脾脏转移因子TF蛋白质鉴定为阴性。

2、蛋白质含量测定：蛋白及多肽含量测定采用Bradford法进行，计算公式为：蛋白及多肽含量(mg/g)＝(浓度×提取液总体积/测定时取样体积)/脾脏重量。结果为脾脏免疫因子中蛋白及多肽含量6～10mg/g，平均值为7mg/g。

3、外观鉴定：脾脏免疫因子为澄明液体，无异物、浑浊或沉淀。

4、脾脏免疫因子成份组成：所述脾脏免疫因子用SDS-PAGE电泳(7.5％分离胶)检测，电泳图谱呈现分散的数条区带(见附图1)，经电泳考马斯亮兰R250染色呈现蓝色；经与标准分子量对照物比较，各区带的分子量依次为3000～6000、14000、17000、18000以及接近20000道尔顿；通过免疫印记Western-blotting检测表明，上述区带所对应的蛋白质分别为溶菌酶、干扰素、白细胞介素以及补体系统的分子片段(见表1)。

由此可知，脾脏免疫因子是一类分子量在20000道尔顿以下(3000～20000道尔顿)、包含转移因子、溶菌酶、干扰素、白介素及补体系统等细胞因子的复合体；但其成份组成以及组成比例会随不同的脾脏来源或者不同的生理状况等因素的变化而变动。

脾脏免疫因子制备过程中，分子量上限设定为20000道尔顿具有很好的实际意义。分子量在20000道尔顿以下能充分保证脾脏免疫因子溶液的澄清，为下一步发展注射用制剂奠定良好基础；若分子量超过20000道尔顿，一是水溶性不好，影响制剂稳定性和疗效，二是脾脏免疫因子制备过程中的反复冻融环节容易破坏大分子的空间结构而使其失去活性。

表1凝胶电泳区带所对应的多肽、蛋白质种类

5、脾脏免疫因子活性检测：采取上述工艺由同批脾脏原料中同时制备抗乙型肝炎脾脏免疫因子和转移因子，然后采用白细胞粘附抑制试验测定抗乙型肝炎脾脏免疫因子和转移因子的生物活性。抗乙型肝炎脾脏免疫因子和转移因子能够抑制白细胞在玻璃器皿表面的粘附作用，根据未粘附白细胞数计算抑制指数来测定其活性。

小鼠白细胞悬液的制备：取体重22～25g健康小鼠5只，由眼静脉放血，无菌取出脾脏，以1640培养液洗3次，用无菌铜网轻轻压碎制成细胞悬液，用1640培养液洗3次(1500r/min离心15分钟)，然后每只鼠脾脏加3ml水破坏红细胞，再加3.6％氯化钠溶液1ml调整渗透压，混匀后用200目尼龙网过滤，滤液经1500r/min离心5分钟，再分别用0.9％氯化钠溶液和1640培养液各洗1次，收集细胞，备用。

活性测定：按标示量加注射用水制成1mg/ml的溶液。取洁净的离心管2支，各加细胞悬液1ml，一管加供试品1ml，为供试品管；另一管加无菌0.9％氯化钠溶液1ml，为对照管。置37℃致敏30分钟，1500r/min离心10分钟，弃上清夜，每管沉淀分别准确加入1640培养液1ml。取无菌培养瓶6个，前3瓶各加供试品管细胞悬液0.2ml，后3瓶各加对照管细胞悬液0.2ml，然后每瓶内加纯化的30～100μg/ml HBsAg 0.2ml，1640培养液0.6ml，置CO₂培养箱内37℃培养1～2小时后，取出轻轻摇匀，静置1～3分钟，显微镜下计数未粘附的白细胞数。

结果：按下式计算结果：NAI＝(S-C)/C×100％。式中：NAI未粘附白细胞抑制指数；S供试品组平均未粘附细胞数；C对照组平均未粘附细胞数。

结果显示，抗乙型肝炎脾脏免疫因子的NAI未粘附白细胞抑制指数为抗乙型肝炎转移因子的1.8倍，表明抗乙型肝炎脾脏免疫因子的活性为抗乙型肝炎转移因子活性的1.8倍。

特异性脾脏免疫因子可以用来作为一种特定性疫病的治疗药物使用，非特异性脾脏免疫因子可作为一些难以控制的疫病的预防或辅助治疗使用。脾脏免疫因子具有以下用途：脾脏免疫因子作为一类能够增强免疫功能以及特异性杀灭病原体的制剂，在人类、动物临床上的应用范围非常广阔：1、作为兽药原料，为畜禽饲养业提供安全可靠的预防和治疗药物。A、治疗目前尚无特效药的病毒性疾病，如禽流感、法氏囊病、新城疫、鸭肝、传支、传喉等；B、取代西药的使用，解决药残问题。我国养殖产品出口中，产品药残检测很严格，成为制约产品出口的主要障碍。脾脏免疫因子无药残，无毒副作用。2、作为人用保健品和药品原料，提高人体免疫力，治疗肝炎、流感等病毒性疾病以及肿瘤等。脾脏免疫因子实际应用时，辅以常规辅料，可以做成片剂、颗粒剂、胶囊剂、粉散剂、冻干粉针等固体制剂，也可以做成口服液、水针等液体制剂。

本发明与现有技术相比，创新点及优点在于：本发明脾脏免疫因子的分子量小于20000道尔顿，其含有蛋白质成份，而转移因子没有；脾脏免疫因子生物活性高，转移因子生物活性低。本发明脾脏免疫因子开发与应用，不仅拓展了脾脏资源的利用效率，增强了脾脏提取物的生物活性，而且为治疗人类、动物界的顽固性疾病，如禽流感、肿瘤等，提供了一种原料易得、成本低廉、无毒副作用的制剂原料，适宜于工业化生产。

附图说明

图为脾脏免疫因子SDS-PAGE电泳图谱。图中右侧标记为分子量，KDa代表分子量1000道尔顿。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。

本发明中的脾脏来源，除来源广泛的鸡、鸭、猪、牛、羊外，还包括鹅、鸽、鹌鹑、火鸡、雉鸡、鸵鸟、孔雀等野生或饲养的禽鸟类以及马、狗、兔等野生或饲养的畜类甚至猴子、猩猩等灵长类。

实施例1用超滤法制备脾脏免疫因子

将经过检疫的新鲜、健康脾脏，用无菌纯水反复清洗，将脾脏表面的油脂、筋膜处理干净；将脾脏切块放入高速组织捣碎机中捣碎，分盘后入冷库(-25℃～-30℃)速冻，冻融3～5次，加3～5倍无菌纯水，混匀，然后置于胶体磨中乳化，离心分离固体物与提取物，每分钟15000转；滤液收集于容器中，滤液过滤；最后超滤，截留分子量20000道尔顿得到的超滤产物即为脾脏免疫因子。其为分子量小于20000道尔顿的混合物。

实施例2匀浆透析法制备特异性脾脏免疫因子

以肿瘤组织的特异性脾脏免疫因子的制备为例。首先将新鲜的肿瘤组织反复多次匀浆、冻融，使肿瘤细胞彻底破碎，然后用其免疫经过检疫的健康猪。待免疫成功后取猪脾脏无菌匀浆、冻融3～5次，使细胞彻底破坏，再将匀浆冻融液放入透析袋中透析，收集其中分子量小于20000道尔顿的部分，即为特异性脾脏免疫因子。

Claims

1.脾脏免疫因子的其制备方法，其特征在于，非特异性脾脏免疫因子通过如下步骤制备：

首先将经过检疫的新鲜、健康脾脏，用无菌纯水反复清洗，将脾脏表面的油脂、筋膜处理干净；将脾脏切块放入高速组织捣碎机中捣碎，分盘后入冷库(-25℃～-30℃)速冻，冻融3～5次，加3～5倍无菌纯水，混匀，然后置于胶体磨中乳化，离心分离固体物与提取物，每分钟3000～16000转；滤液收集于容器中，滤液过滤；超滤，截留分子量小于20000道尔顿得到的超滤产物即为脾脏免疫因子。

2.脾脏免疫因子的制备方法，其特征在于，特异性脾脏免疫因子通过如下步骤制备：

用某种特定疾病抗原免疫猪、鸡等动物，待免疫成功后取免疫动物的脾脏，无菌匀浆，冻融3～5次，使细胞彻底破坏；将匀浆冻融液放入透析袋中透析，收集其中分子量小于20000道尔顿的成份，即为特异性脾脏免疫因子。

3.脾脏免疫因子，其特征在于，其通过权利要求1或2所述的方法制得，为分子量小于20000道尔顿的混合物。

4.如权利要求3所述的脾脏免疫因子，其特征在于，其包含有转移因子、溶菌酶、干扰素、白介素及补体系统分子片段。