CN105456294A - 一种兽用胎盘肽药液的制备方法及产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种兽用胎盘肽药液的制备方法，其特征在于，包括：取新鲜健康动物胎盘或取-20℃冷冻保存24小时的健康动物胎盘解冻，洗净、清理后，制匀浆，反复冻融，酸化、水解、中和，4～10℃离心取上清液，去除上清液中生物有害物质，透析和/或超滤，用0.22μm微孔滤膜除菌过滤，分装保存。本发明还提供了兽用胎盘肽产品。本发明提供的方法在低温下操作，能减少胎盘有效成分的损失，并能保证有效成分的生物活性和产品安全；试验表明，本发明提供的兽用胎盘肽药液中蛋白含量(Lowry法测定)为0.8-1.5mg/ml，未粘附白细胞抑制指数(NAI)大于20％，其能提高兔淋巴细胞的转化率。
Description
技术领域
本发明属于医用生物产品技术领域，具体涉及一种兽用胎盘肽药液的制备方法及产品。
背景技术
动物胎盘肽的研究报道始于上世纪四十年代，瑞士和日本学者从羊胎盘中提取出了具有抗衰老功能的羊胎素，后来发现动物胎盘也含有多种激素和生长因子，家畜胎盘肽的制备与活性物质研究日益引起关注，其中以羊胎盘肽的报道较多。研究表明羊胎盘肽作为一种免疫活性提取物，具有免疫促进作用，其促进作用是通过促进T细胞免疫功能、体液免疫功能和巨噬细胞免疫功能进行。
目前市场上用作治疗或保健的胎盘肽，多数采用高温、酶解等方法制取，其中的生物活性物质大多被破坏，丧失了治疗作用。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的一个目的是提供一种兽用胎盘肽药液的制备方法，该方法在低温下操作，减少了胎盘有效成分的损失，能保证有效成分的生物活性，并保证产品安全。
本发明的另一个目的是提供采用上述兽用胎盘肽药液的制备方法所得到的兽用胎盘肽产品。
为达到以上目的，本发明采用的技术方案是：一种兽用胎盘肽药液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取新鲜健康动物胎盘或取-20℃冷冻保存24小时的健康动物胎盘常温解冻，洗净、清理后，制匀浆，反复冻融，酸化、水解、中和，4～10℃离心取上清液，去除上清液中生物有害物质，透析和/或超滤，用0.22μm微孔滤膜除菌过滤，分装保存。
需注意，新鲜健康的胎盘取出后应按无菌操作手续放入无菌容器内，并在-20℃冷藏保存以备用。
本发明通过反复冻融可使细胞膜破碎，离心操作可以去除大的组织块，透析或超滤可以去除溶液中的大分子，微孔滤膜过滤可以去除液体中的细菌。
进一步，动物胎盘为猪胎盘；洗净、清理步骤包括洗净胎盘中的血液，用生理盐水冲洗，去除脐带、包膜及母体面结缔组织。
进一步，制匀浆的步骤包括将洗净、清理后的胎盘绞碎，按重量比1：1加入灭菌生理盐水或蒸馏水，用胶体磨反复磨碎3-5次，得到匀浆。
进一步，反复冻融步骤包括将匀浆置于-16～-20℃下冷冻20～24小时，在不超过37℃条件下融化，冻融反复进行至少3次。反复冻融的目的要使细胞破碎率达90％以上。也可以用其他方法(如超声波法、高速组织捣碎法)达到细胞破碎的目的，但应控制过程温度不超过37℃。
再进一步，酸化、水解、中和的过程包括将冻融后的匀浆用酸调pH为3.5～4.5，在33-37℃下水浴保温1.0～2.0小时水解，再用碱中和至pH为6.5～7.0。
更进一步，离心在转速为2000～2500r/min条件下进行25-30min。离心用的离心管应煮沸消毒。离心收取的上清液应在0～4℃下放置不超过24小时。
进一步，采用巴氏消毒法去除上清液中的生物有害物质，具体在58～62℃、1个大气压下持续10～12小时。
进一步，超滤在15～22℃进行，用截留分子量为10000dalton的超滤膜。超滤应保证分子量10000以上的物质不能通过，故在操作前作防漏检查。
进一步，所述制备方法还包括将除菌过滤后的胎盘肽液体冻干，得到胎盘肽冻干粉，冻干过程包括：先迅速将制品温度降到-40～－55℃，维持2～3小时，抽真空至10Pa以下，经20小时缓慢升温升至25～30℃维持3小时左右。
本发明的方法选用冻融将组织细胞膜破坏，因此得到的全部是细胞内含物，超滤保证分子量10000以上物质不能通过，保存了小于10000分子量的生物活性物质如多肽、氨基酸、核苷酸及各种微量元素；本发明采用低温提取工艺，减少了胎盘有效成分的损失，并能保证有效成分的生物活性，能有效去除生物有害物质，保证产品安全。检测结果表明，本发明提供的兽用胎盘肽药液中蛋白含量(Lowry法测定)为0.8-1.5mg/ml，未粘附白细胞抑制指数(NAI)大于20％，其能提高兔淋巴细胞的转化率。
Lowry法测定蛋白含量的具体方法如下：
1)标准蛋白溶液配制：使用中国药品生物产品检定所提供的牛血清白蛋白标准品,精密称取标准品适量,用0.02％NaN3溶液配制成浓度为0.2mg/mL的溶液,摇匀,备用。
2)方法
2.1)标准曲线的绘制
精密量取标准蛋白溶液0，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9mL，分别置带塞试管中，加水至1.0mL；再加入5.0mL碱性铜试液和0.5mL1N福林-酚试液；充分摇匀后，置55℃水浴中准确加热5分钟，水冷却10分钟；在650nm波长下测定吸光度，以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作线性回归，得到标准曲线y(mg/mL)＝a+bx，x为吸光度值，a、b为线性回归得到的标准曲线的系数(相关系数方差应大于0.995)，y为标准蛋白浓度。
2.2)样品的测定
精密量取待测样品0.5mL置带塞试管中，加水至1.0mL；再加入5.0mL碱性铜试液和0.5mL1N福林-酚试液；充分摇匀后，置55℃水浴中准确加热5分钟，水冷却10分钟；在650nm波长下测定吸光度，从回归方程中求得样品蛋白含量。
3)结果计算
根据下列公式计算待测样品中蛋白浓度Y：
Y(mg/mL)＝(a+bx)×稀释倍数
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述。
实施例1
胎盘收集：将取得的猪胎盘于-20℃冷冻保存。
预处理：将冷冻的猪胎盘在无菌室常温解冻，用灭菌蒸馏水洗净胎盘中的血液，用生理盐水冲洗，去除脐带、包膜及母体面结缔组织。
制均浆：将处理后的猪胎盘剪成小块并绞碎，称重1000g,加入等重量的灭菌蒸馏水，在高速组织捣碎机中制成均浆，共获均浆1900ml。
反复冻融：将匀浆于-20℃下冷冻20小时，在不超过37℃条件下融化，冻融反复进行至少4次，使细胞破碎达90％以上，末次融化后冻存，于-20℃冻存。
酸化、水解、中和：将冻存的冻融后的匀浆解冻后，用盐酸调pH为3.5，在37℃下水浴保温1小时水解，再用NaOH中和至pH为6.7。
离心取上清液：将酸化、水解、中和后的匀浆于8℃、2500r/min离心25min，得到1800ml上清液，4℃放置。
去除上清液中生物有害物质：对离心取得的上清液在60℃、1个大气压下持续消毒10小时(巴氏消毒法)。
透析：在4℃采用透析方法对消毒后的上清液中有效成份进一步分离提取，收集提取液；在20℃采用截留分子量10000dalton超滤膜对提取液进行超滤，同时去除＞0.01μm的病毒，收集超滤液2300ml，于-20℃冻存。
除菌过滤：用0.22μm微孔滤膜对解冻后的超滤液进行除菌过滤，得到除菌滤液(即胎盘肽药液)总量为2200ml，立刻分装于无菌瓶中。
实施例1制得胎盘肽药液，外观：微黄色，味道：无味，pH为6.7，蛋白含量(Lowry法检测，同一批次检测2-3个平行样)为1.8mg/ml。
取实施例1在透析时获得的提取液，用紫外可见光光度计(型号：TU-1810、北京普析通用仪器有限责任公司)检测，在252nm有最大吸收峰。
实施例2
胎盘收集：将取得的猪胎盘于-18℃冷冻保存。
预处理：将冷冻的猪胎盘在无菌室常温解冻，用灭菌蒸馏水洗净胎盘中的血液，用生理盐水冲洗，去除脐带、包膜及母体面结缔组织。
制均浆：将处理后的猪胎盘剪成小块并绞碎，称重1000g,加入等重量的灭菌蒸馏水，在高速组织捣碎机中制成均浆，共获均浆1900ml。
反复冻融：将均浆于-18℃下冷冻24小时，在不超过37℃条件下融化，冻融反复进行至少5次，使细胞破碎达90％以上，末次融化后冻存，于-18℃冻存。
酸化、水解、中和：将冻存的冻融后的均浆解冻后，用盐酸调pH为4.5，在35℃下水浴保温1.5小时水解，再用NaOH中和至pH为7.0。
去除生物有害物质：对酸化、水解、中和后的匀浆在60℃、1个大气压下持续消毒10小时(巴氏消毒法)。
离心取上清液：将酸化、水解、中和后的匀浆于10℃、2200r/min离心30min，得到1800ml上清液，4℃放置。
透析和超滤：在4℃采用透析方法对消毒后的上清液中有效成份进一步分离提取，收集提取液；在20℃采用截留分子量10000dalton超滤膜对提取液进行超滤，同时去除＞0.01μm的病毒，收集超滤液2100ml，于-18℃冻存。
除菌过滤：用0.22μm微孔滤膜对解冻后的超滤液进行除菌过滤，得到除菌滤液(即胎盘肽药液)总量为2000ml，立刻分装于无菌瓶中。
实施例2制得胎盘肽药液，外观：微黄色液体，味道：无味，pH为6.8，蛋白含量(Lowry法检测，同一批次检测2-3个平行样)为2.1mg/ml。
取实施例2在透析时获得的提取液，用紫外可见光光度计(型号：TU-1810、北京普析通用仪器有限责任公司)检测，在252nm有最大吸收峰。
实施例3
胎盘收集：将取得的猪胎盘于-20℃冷冻保存。
预处理：将冷冻的猪胎盘在无菌室常温解冻，用灭菌蒸馏水洗净胎盘中的血液，用生理盐水冲洗，去除脐带、包膜及母体面结缔组织。
制均浆：将处理后的猪胎盘剪成小块并绞碎，称重1000g，加入等重量的灭菌蒸馏水，在高速组织捣碎机中制成均浆，共获均浆1850ml。
反复冻融：将均浆于-22℃下冷冻20小时，在不超过37℃条件下融化，冻融反复进行至少4次，使细胞破碎达90％以上，末次融化后冻存，于-22℃冻存。
酸化、水解、中和：将冻存的冻融后的均浆解冻后，用盐酸调pH为4.0，在33℃下水浴保温2.0小时水解，再用NaOH中和至pH为6.5。
离心取上清液：将酸化、水解、中和后的均浆于6℃、2000r/min离心30min，得到1750ml上清液，4℃放置。
去除上清液中生物有害物质：对离心取得的上清液在60℃、1个大气压下持续消毒10小时(巴氏消毒法)。
透析和超滤：在2℃采用透析方法对消毒后的上清液中有效成份进一步分离提取，收集提取液；在18℃采用截留分子量10000dalton超滤膜对提取液进行超滤，同时去除＞0.01μm的病毒，收集超滤液2200ml，于-22℃冻存。
除菌过滤：用0.22μm微孔滤膜对解冻后的超滤液进行除菌过滤，得到除菌滤液(即胎盘肽药液)总量为2100ml，立刻分装于无菌瓶中。
实施例3制得胎盘肽药液，外观：微黄色，味道：无味，pH为6.5，蛋白含量(Lowry法检测，同一批次检测2-3个平行样)为2.3mg/ml。
取实施例3在透析时获得的提取液，用紫外可见光光度计(型号：TU-1810、北京普析通用仪器有限责任公司)检测，在252nm有最大吸收峰。
实施例4
胎盘收集：将取得的猪胎盘于-20℃冷冻保存。
预处理：将冷冻的猪胎盘在无菌室常温解冻，用灭菌蒸馏水洗净胎盘中的血液，用生理盐水冲洗，去除脐带、包膜及母体面结缔组织。
制均浆：将处理后的猪胎盘剪成小块并绞碎，称重1000g,加入等重量的灭菌蒸馏水，在高速组织捣碎机中制成均浆，共获均浆1900ml。
反复冻融：将均浆于-20℃下冷冻22小时，在不超过37℃条件下融化，冻融反复进行至少5次，使细胞破碎达90％以上，末次融化后冻存，于-20℃冻存。
酸化、水解、中和：将冻存的冻融后的均浆解冻后，用盐酸调pH为3.5，在36℃下水浴保温1.0小时水解，再用NaOH中和至pH为6.7。
离心取上清液：将酸化、水解、中和后的均浆于8℃、2500r/min离心30min，得到1700ml上清液，4℃放置。
去除上清液中生物有害物质：对离心取得的上清液在60℃、1个大气压下持续消毒11小时(巴氏消毒法)。
透析和超滤：在2℃采用透析方法对消毒后的上清液中有效成份进一步分离提取，收集提取液；在20℃采用截留分子量10000dalton超滤膜对提取液进行超滤，同时去除＞0.01μm的病毒，收集超滤液2100ml，于-20℃冻存。
除菌过滤：用0.22μm微孔滤膜对解冻后的超滤液进行除菌过滤，得到除菌滤液(即胎盘肽药液)总量为2000ml。
冻干：将除菌滤液迅速降温到-40℃，维持3小时，抽真空至10Pa以下，经20小时缓慢升温升至25～30℃维持3小时左右，得到胎盘肽冻干粉，。
取实施例4在透析时获得的提取液，用紫外可见光光度计(型号：TU-1810、北京普析通用仪器有限责任公司)检测，在252nm有最大吸收峰。
实施例4制得胎盘肽冻干粉，外观：微黄色粉末，味道：微腥。
活性试验
分别取实施例1-4得到的猪胎盘肽药液样品，以小鼠白细胞粘附抑制试验法对胎盘肽的活性进行测定，同一批样品检测3个平行样。
1)试验材料
1.1)小鼠白细胞悬液的制备
取体重22～25g健康小鼠5只，脱颈处死。无菌取出脾脏，Hank’s液洗3次，用无菌铜网轻轻压碎制成细胞悬液。用1640培养液洗3次(1500r/min离心15分钟。然后每只鼠脾脏加3ml无菌蒸馏水破坏红细胞，再加3.6％氯化钠溶液1ml调整渗透压，混匀后用200目尼龙网过滤，滤液1500r/min离心5分钟。再分别用0.9％氯化钠溶液和1640培养液各洗1次，收集细胞，用1640培养液调整细胞浓度为1.0×106～3.0×106/ml，备用。
1.2)待检样品溶液的制备
取待检样品1瓶，加注射用水2ml充分溶解。
2)试验步骤
取洁净的离心管6支，各加细胞悬液1ml，前3管加待检样品1ml为试验管，另3管加无菌Hank’s液1ml为对照管。37℃致敏30分钟，1500r/min离心10分钟，弃上清液，每管沉淀分别准确加入1640培养液1ml。CO2培养箱内37℃培养1～2小时，取出轻轻摇匀，静置1～3分钟，显微镜下计数未粘附的白细胞数。
3)结果判定
未粘附白细胞抑制指数(NAI)≥20％判定为活性合格。
NAI＝(试验组平均未粘附细胞数－对照组平均未粘附细胞数)/对照组平均未粘附细胞数×100％。
测定结果见表1。
表1
| 实施例 | NAI |
| 实施例1 | 28％ |
| 实施例2 | 22％ |
| 实施例3 | 25％ |
| 实施例4 | 26％ |
从表1可以看出，本发明实施例1-4制得的猪胎盘肽液体样品的活性是合格的。
药理作用实验(兔淋巴细胞转化试验)
T淋巴细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。
本实验采用MTT比色法测定实施例1得到的猪胎盘肽对兔淋巴细胞的转化促进作用。
1)试验材料
1.1)试剂和设备
RPMI1640培养基，Hyclone公司生产；ConA，Sigma公司生产；MTT，BiomaI公司生产；淋巴细胞分离液，上海试剂二厂生产；小牛血清，浙江天杭生物科技有限公司生产；SpectraMAX190酶标仪，美国MolecularDevice公司生产；96孔细胞培养板，NHncIOn公司生产，HZ-9211KBCO2培养箱，华利达公司生产。
1.2)兔外周血淋巴细胞悬液的制备
无菌心脏采兔血10mL，加肝素1mL抗凝，置于超净工作台内再加入10mLRPMI1640完全营养液(含10％小牛血清)，血样沿离心管管壁小心加于4mL淋巴细胞分离液上层，2000r/min水平离心20min，吸取白色淋巴细胞层，移入另一无菌离心管，加1640完全营养液2～3mL，吹散淋巴细胞，2000r/min，水平离心20min，淋巴细胞再用1640完全营养液洗涤2遍，每次用量为2mL，吹散离心同上。0.6％台盼蓝染色，活淋巴细胞计数，无血清RPMI1640调整细胞浓度为4x106个/mL。
2)试验步骤
淋巴细胞培养及检测
取RPMI1640营养液(分别含10％小牛血清10μg/mLConA)加入无菌96孔细胞培养板，每孔50μL；再加前项淋巴细胞悬液50μL/weII，合计每孔100μL，每个样品重复做3个孔，且重复做两块细胞培养板，抑制组仅加入顺铂15μL，另以无细胞RPMI1640完全营养液调零。细胞培养板置于CO2培养箱(37.0C、5％CO2、饱和湿度)分别培养取48h，置于超净工作台内，加浓度为5mg/mLMTT15μL/weII，继续培养4h后取出，置于超净工作台内，加80μL二甲基亚砜，吹打至蓝色沉淀完全溶解，用酶标仪测OD570nm的光吸收值。
3)结果判定
从表2可以看出，猪胎盘肽不同稀释度组的吸光度均高于抑制组，低于对照组，并与抑制组有显著性差异，说明猪胎盘肽能提高兔淋巴细胞的转化率，其中1：102和1：103两组最显著。
表2
| 组别 | OD570 | 与抑制组相比P值 |
| 抑制组 | 0.732±0.022 | |
| 对照组 | 0.857±0.013 | P<0.01 |
| 1：10 | 0.832±0.004 | P<0.01 |
| 1：102 | 0.849±0.008 | P<0.01 |
| 1：103 | 0.841±0.017 | P<0.01 |
| 1：104 | 0.817±0.022 | P<0.01 |
| 1：105 | 0.763±0.011 | P<0.01 |
上述实施例只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种兽用胎盘肽药液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取新鲜健康动物胎盘或取-20℃冷冻保存24小时的健康动物胎盘解冻，洗净、清理后，制匀浆，反复冻融，酸化、水解、中和，4～10℃离心取上清液，去除上清液中生物有害物质，透析和/或超滤，用0.22μm微孔滤膜除菌过滤，分装保存。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，动物胎盘为猪胎盘；洗净、清理步骤包括洗净胎盘中的血液，用生理盐水冲洗，去除脐带、包膜及母体面结缔组织。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制匀浆的步骤包括将洗净、清理后的胎盘绞碎，按重量比1:1加入灭菌生理盐水或蒸馏水，用胶体磨反复磨碎3-5次，得到匀浆。
4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，反复冻融的步骤包括将匀浆置于-18～-25℃下冷冻20～24小时，在不超过37℃条件下融化，冻融反复进行至少3次。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，酸化、水解、中和的过程包括将冻融后的匀浆用酸调pH为2.5～4.5，在33-37℃下水浴保温2～3小时水解，再用碱中和至pH为6.7～7.0。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，离心在转速为2000～2500r/min条件下进行25-30min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用巴氏消毒法去除上清液中的生物有害物质，具体在58～62℃、1个大气压下持续10小时。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，超滤在15～22℃进行，用截留分子量为10000dalton的超滤膜。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将除菌过滤后的胎盘肽液体冻干，得到胎盘肽冻干粉，冻干过程包括：
先迅速将制品温度降到-40～－55℃，维持2～3小时，抽真空至10Pa以下，经20小时缓慢升温升至25～30℃，维持3小时左右。
10.一种兽用胎盘肽产品，其特征在于，采用权利要求1-9任一所述的方法制成的产品。
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