CN100486593C - 一种可提高免疫功能的厚壳贻贝提取物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫制剂技术领域，是一种可提高免疫功能的厚壳贻贝提取物。本发明用碱提取法从厚壳贻贝软组织匀浆中提取有效成分，经动物试验及细胞免疫学试验，证明能提高免疫系统中的自然杀伤细胞、巨噬细胞、淋巴细胞，促进抗体和补体的生成，增强机体非特异性细胞免疫功能，因此可用于制备提高机体免疫功能的制剂。

Description

一种可提高免疫功能的厚壳贻贝提取物

技术领域

本发明涉及免疫制剂技术领域，是一种可提高免疫功能的厚壳贻贝提取物。

背景技术

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)是一种海洋软体动物，富产于浙江省嵊泗列岛周围海域，它富含粗蛋白、脂肪、碳水化合物，此外还有钙、磷、铁、维生素等多种营养物质，同时，贻贝又是补肾良药，明显功能是补肾壮阳，益精养血，消瘿散结，素有“元淡”之称，在明清时被列为进贡朝廷的贡品，号称“贡干”，现今已和南移的紫贻贝和睦相处，并能大量地自然繁殖，每年的养殖产量已达近二万吨。不仅原料充足，而且由于生长环境的水质良好，品质上乘。据上海市卫生防疫站对嵊山贻贝的鉴定，甲肝病毒为阴性、未检出副溶血性弧菌、挥发性盐基氮和镉等，均符合国家规定的指标。有报道，紫贻贝和翡翠贻贝的酶水解提取物具有抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、降血压、降血脂、提高免疫力等作用(洪鹏志等.翡翠贻贝肉酶解动物蛋白营养评价及其生理活性初探水产学报Vol.26，No.1，Feb.，2002；5-4贝类多糖抗肿瘤作用的研究胡健饶等.CarcinogenesisTerntogenesis and Mutagenesis Vol.11，No.6 1999)但至今未见有关厚壳贻贝的碱提取物具有提高免疫功能的报道。

发明内容

本发明提供一种厚壳贻贝碱提取物，经动物实验，证明其具有提高免疫功能的作用。本发明提取物的制备方法如下：

1.制备匀浆液：厚壳贻贝洗净，去壳，将其软组织用搅拌机打碎匀浆；

2.制备提取液：将上述匀浆液离心取沉淀，加入1％的甲醇浸泡24小时去脂，离心取沉淀，加入1％NaOH煮沸10小时，趁热抽滤得到滤液，再按滤液的1/2体积加入正丁醇分别萃取三次，将萃取后的水相用旋转蒸发仪在50℃减压浓缩，用0.5％活性炭脱色后加3倍体积的乙醇沉淀过夜，弃上清，沉淀自然干燥，得到块状及粉末状灰白色固体，加双蒸水在沸水浴中溶解，sevage法(氯仿与正丁醇的体积比为4:1)萃取多次以去除蛋白至水相不含蛋白质，得到提取液；

3.制备厚壳贻贝提取物：将上述提取液加三倍体积的乙醇沉淀过夜，弃上清，自然干燥即得本发明厚壳贻贝提取物。

动物实验是将上述提取物制成注射液，腹腔注射小鼠，能显著提高免疫功能，因此本发明厚壳贻贝提取物可用于制备提高免疫力的制剂。

附图说明

图1为本发明厚壳贻贝提取物对正常小鼠免疫功能的影响图

图2为本发明厚壳贻贝提取物对小鼠迟发性变态反应的左右足掌体积差影响图

图3为本发明厚壳贻贝提取物对小鼠溶血空斑数的影响图

图4为本发明厚壳贻贝提取物对小鼠碳廓清能力的影响图

具体实施方式

现结合实施例，对本发明作详细描述。

实施例1：制备厚壳贻贝提取物

厚壳贻贝洗净，去壳，将其软组织用搅拌机打碎匀浆；离心取沉淀44.5克，加入1升1％的甲醇浸泡24小时去脂，离心取沉淀，加入1升1％NaOH煮沸10小时后趁热抽滤得到滤液1240ml，再加入1/2体积的正丁醇萃取三次，将萃取后的水相用旋转蒸发仪在50℃减压浓缩至600ml，加入0.5％活性炭脱色后加3倍体积乙醇沉淀过夜，弃上清，沉淀放入蒸发皿中自然干燥，得到块状及粉末状灰白色固体3.2g，加入250ml双蒸水在沸水浴中溶解，sevage法(氯仿与正丁醇的体积比为4:1)萃取8次除去蛋白至水相不含蛋白质，得到提取液160ml；加三倍体积量的乙醇沉淀过夜，弃上清，沉淀自然干燥，得厚壳贻贝提取物1.421g。

实施例2：小鼠免疫实验

1.试剂：甲醇、氯仿、正丁醇、葡萄糖、苯酚、酸化异丙醇、印度墨汁、Na₂CO₃：华美试剂公司产品；

MTT、PHA、瑞氏染液、NP₄₀、percoll分离液：生工生物工程有限公司产品；

新鲜绵羊红血球(SRBC)：由上海长海医院检验科提供；

LDH试剂盒：南京建成生物试剂有限公司产品；

Earles液：NaCl6.8g，KCl0.4g，NaH₂PO₄·H₂O0.14g，MgSO₄·7H₂O0.2g，葡萄糖1g，10％酚红1ml，加双蒸水至100ml，再加2％CaCl₂10ml，加双蒸水至1000ml，加热溶解后滤过分装，8磅高压灭菌，4℃保存；

肠毒内毒素：由上海长海医院中心实验室提供；

Alsever液：葡萄糖2.05g，NaCl0.42g，枸橼酸钠·H₂O0.8g，柠檬酸0.55g加双蒸水到100ml，加热溶解后滤过分装，8磅高压灭菌，4℃保存；

2.厚壳贻贝：产自浙江省嵊泗市嵊山镇海域；

3.昆明种小鼠、Balb/c小鼠、豚鼠血清：由第二军医大学动物中心提供；

4.K562细胞株：由中科院细胞所提供；

5.实验方法

5.1.小鼠脾淋巴细胞转化实验：

昆明种小鼠24只，体重18-20g，雌性，随机分成4组，每组6只，除对照组外，其它3组为本发明提取物低、中、高剂量组，浓度分别为2mg/ml、4mg/ml、7.5mg/ml，每鼠均注射0.1ml，对照组注射等量生理盐水，连续注射13天，第14天引颈法处死小鼠，剖取小鼠脾脏，将其通过200目钢丝网，用Hank’s液清洗后离心，用Hank’s液制成脾淋巴细胞悬液(1×10⁶/ml)，将脾淋巴细胞用RPMI-1640(10％胎牛血清及20μg/mlPHA)1ml悬浮，37℃，5％CO₂培养48小时后离心，去上清，取细胞涂片，干燥，瑞氏染色。观察计数200个淋巴细胞，根据转化的形态学指标，计算出由母细胞转化为具有免疫作用的淋巴细胞的转化百分率。

以转化百分率作图，见图1。由图1可见，随本发明提取物浓度增高，脾淋巴细胞转化率增强(P<0.01)，说明厚壳贻贝提取物能提高动物体非特异性的细胞免疫功能。

5.2.NK细胞活性测定：

Balb/c小鼠24只，体重18-20g，雌雄各半，随机分成4组，每组6只，除对照组外，其它3组为本发明提取物低、中、高剂量组，注射剂量同前，对照组注射等量生理盐水，连续注射10天，第11天从小鼠内眦静脉丛取血2ml，加入肝素抗凝血的PBS中，用percoll分离其中的NK细胞，Hank’s液洗涤两次后用含小牛血清的RPMI-1640培养液调节细胞浓度至1×10⁷/ml。将培养24h的对数生长期的K562细胞，Hank’s液洗涤一次，用含小牛血清的RPMI-1640培养液调节细胞浓度至1×10⁵/ml。在40孔板中每孔加K562细胞100μl，再加入NK细胞100μl，各孔总体积为200μl。自然释放组以含小牛血清的RPMI-1640培养液代替NK细胞，最大释放组为1％NP₄₀代替NK细胞，每个标本需三个复孔，37℃，5％CO₂培养4小时后离心，各孔吸出液体于EP管中，用LDH试剂盒于570nm处测定LDH释放率，按下式计算NK细胞自然杀伤率：

自然杀伤率(％)＝(样品释放平均OD值-自然释放平均OD值)/(最大释放平均OD值—自然释放平均OD值)×100％

以NK细胞的自然杀伤率作图，见图1。由图1可见，随本发明提取物浓度增高，NK细胞的自然杀伤率增高(P<0.01)，说明不同浓度的厚壳贻贝提取物均有增强小鼠NK细胞活性作用。

5.3.腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验：

昆明种小鼠24只，体重18-20g，雌性，随机分成4组，每组6只，除对照组外，其它3组为本发明提取物低、中、高剂量组，注射剂量同前，对照组注射等量生理盐水，连续注射10天后，第11天放血处死小鼠，消毒腹部，沿腹中线注入3ml冰中预冷的无菌PBS-H(含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS)，轻轻按摩腹部5分钟，剪开腹壁，吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔3次，合并渗出液于离心管中，离心，弃上清，用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞三次并悬浮细胞(10⁶/ml)，即得巨噬细胞悬液；由鸡翼下抽取静脉血，加入5倍量的Alsever液，用PBS将红细胞比容配成5％的浓度制成鸡红细胞悬液，用巨噬细胞悬液1ml，加入0.04ml鸡红细胞悬液，离心，弃上清。涂片，Gimsa染色，计数，计算吞噬百分比，以吞噬百分比作图，见图1。由图1可见，随本发明提取物浓度增高，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性增强(P<0.01)，说明厚壳贻贝提取物也能促进单核—巨噬细胞功能。

5.4.迟发型变态反应：

昆明种小鼠12只，体重18-20g，雌性，随机分成2组，每组6只，于第1天以10％SRBC 0.5ml/鼠腹腔注射致敏，实验组注射厚壳贻贝提取物溶液0.1ml(浓度为7.5mg/ml)，对照组注射等量生理盐水，连续注射6天，于第7天在小鼠左足掌注射50μl 10％SRBC，右足掌注射等量生理盐水，24h后测量左右足掌之体积，以左右足掌的体积差作图，详见图2。由图2可见，随本发明提取物浓度增高，小鼠左右足掌体积差增大(P<0.01)，说明厚壳贻贝提取物能非常显著地增强正常小鼠的迟发型变态反应。

5.5.抗体生成细胞的检测：

昆明种小鼠24只，体重18-20g，雌雄各半，随机分成4组，每组6只，除对照组外，其它3组为本发明提取物低、中、高剂量组，注射剂量同前，对照组注射等量生理盐水，连续注射10天后，第11天给小鼠腹腔注射5％SRBC1ml以免疫小鼠，将免疫4天的小鼠脱颈椎法处死，剖取小鼠脾脏，将其通过200目钢丝网，用Earles液清洗后离心，用Earles液制成细胞悬液(1×10⁷/ml)，取试管，加入10％SRBC 0.05ml，脾淋巴细胞悬液0.1ml后置45℃水浴中混匀，再加1640琼脂糖液(1％琼脂糖加热溶化后，加入等量预热的双倍1640液，摇匀)0.4ml，仍在水浴中混匀，迅速倒于载玻片上，置于湿盒中，温育后加入稀释的豚鼠血清，继续温育2小时，即可出现肉眼可见的溶血空斑。计算每个小鼠脾脏的溶血空斑数。以脾脏的溶血空斑数作图，详见图3。由图3可见，随本发明提取物浓度增高，小鼠抗体形成细胞活性作用增强(P<0.01)，说明厚壳贻贝提取物还能促进机体特异性的体液免疫功能。

5.6.碳廓清实验：

昆明种小鼠24只，体重18-20g，雌雄各半，随机分成4组，每组6只，除对照组外，其它3组为本发明提取物低、中、高剂量组，注射剂量同前，对照组注射等量生理盐水，连续注射10天后，第11天在小鼠尾静脉注射印度墨汁0.1ml，立即计时。注入后2分钟及10分钟分别从内眦静脉丛取血，加入Na₂CO₃，测OD值。以吞噬指数K为指标，计算白细胞对碳粒的廓清作用：

K＝(logOD₁-logOD₂)/(t₂-t₁)

以白细胞对碳粒的廓清作用的吞噬指数K作图，见图4。由图4可见，随本发明提取物浓度增高，小鼠白细胞对碳粒的廓清作用增强(P<0.01)。说明厚壳贻贝提取物也能促进单核—巨噬细胞功能。

本发明制备方法简单，上述实验证实了厚壳贻贝提取物能提高免疫系统中的自然杀伤细胞、巨噬细胞、淋巴细胞，促成抗体和补体的生成，增强机体非特异性的细胞免疫功能，因此本发明提取物可用于制备提高机体免疫功能的制剂。

Claims (1)

1、一种厚壳贻贝提取物，制备方法如下：

(1)制备厚壳贻贝提取液：

将厚壳贻贝的软组织打碎匀浆，离心取沉淀，用1％甲醇浸泡24小时去脂，离心取沉淀，加1％NaOH煮沸10小时，趁热抽滤得滤液，再按滤液体积的一半量加入正丁醇分别萃取3次，将萃取后的水相在50℃下减压浓缩，用活性炭脱色后加3倍体积的乙醇沉淀过夜，弃上清，沉淀自然干燥，得灰白色固体，加双蒸水在沸水浴中溶解，再用氯仿：正丁醇＝4：1进行多次萃取，以除去蛋白质，得厚壳贻贝提取液；

(2)制备厚壳贻贝提取物：

将上述提取液加入3倍体积量的乙醇沉淀过夜，弃上清，自然干燥，得厚壳贻贝提取物。

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