CN103450354B - 一种黄芪糖蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种黄芪糖蛋白及其制备方法和用途，本发明所述黄芪糖蛋白是从黄芪水提液中经硫酸铵盐析，Sevage法除游离蛋白质，再经透析和DEAE-C32阴离子交换树脂柱层析，分离纯化得到的一类新的活性组分。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析，得其分子量约为53.26kD。经过实验进一步测定了该新活性组分的理化性质，并通过药效实验证明，本发明黄芪糖蛋白具有显著的免疫抑制作用，临床上可以作为一种经济有效的免疫抑制剂使用，具有广阔的市场前景。

Description

一种黄芪糖蛋白及其制备方法和用途

本申请是第200910089580.5号专利的分案申请。原申请的申请日是2009.07.23，名称是《一种黄芪糖蛋白及其制备方法和用途》。

发明领域

本发明涉及一种黄芪提取物，特别涉及一种黄芪糖蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

糖蛋白（glycoprotein）是一类由糖类与多肽或蛋白质以共价键连接而形成的结合蛋白，广泛地存在于自然界动物植物和某些微生物中，是生物体内重要的一类大分子。20世纪60年代，生物化学家和化学家们对长期忽视的糖蛋白产生了兴趣，开展了多方面的研究。越来越多的研究发现，糖蛋白具有显著的药用功效和保健功能，能够增强免疫调节、抑制肿瘤、降低血糖、血脂、抗氧化、防衰老等，对于人体极具利用价值。目前已应用于临床并具有高效的免疫活性的药用蛋白制剂大都是糖蛋白。近年来，植物和天然产物来源的糖蛋白，在生物化学、生物工程学、临床化学、药学及食品等领域受到高度重视。特别是存在于植物中的糖蛋白，在新型特种药物及功能性食品开发方面具有广阔的运用前景。

山西道地药材黄芪是一种常用补气固表中药材，能够增强机体的免疫功能。自20世纪70年代以来,国内外学者对黄芪化学成分及药理作用进行了大量的研究，从中提取分离许多黄酮类、皂苷类、多糖等化合物，并对其药理作用及生物活性进行了研究。但迄今为止,尚未见到有关黄芪糖蛋白的研究报道。

发明内容

本发明目的在于公开一种黄芪糖蛋白，本发明的目的还在于公开该糖蛋白的制备方法，本发明的目的还在于公开该糖蛋白的用途。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

本发明黄芪糖蛋白由如下方法制备：

取黄芪药材，将其粉碎成粉末状，称取200-600重量份，加水1200-2000体积份,浸泡8-16小时，40-60℃以下浸提1-3小时，过滤；残渣中再加水800-1600体积份，40-60℃以下浸提1-3小时，过滤，合并两次滤液，以2000-4000r/min速度离心20-40分钟，合并上清液，得粗提液；

将粗提液浓缩至200-400体积份，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和，于2-6℃下静置12—24小时，以2000-4000r/min速度离心20-40分钟，弃去上清液，得沉淀；

沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置1-3小时，以2000-4000r/min速度离心20-40分钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋白；

把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇10-30分钟，离心，倾出上清液，除去中间层变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；

将上清液置于透析袋中，纯水透析24-72小时，得黄芪糖蛋白溶液，经冷冻干燥，得乳白色粉状物黄芪糖蛋白（HQGP）。

本发明黄芪糖蛋白优选如下方法制备：

取黄芪药材，将其粉碎成粉末状，称取400重量份，加水1600体积份,浸泡12小时，55-60℃以下浸提2小时，过滤；残渣中再加水1200体积份，55-60℃以下浸提2小时，过滤，合并两次滤液，以3000r/min速度离心30分钟，合并上清液，得粗提液；

将粗提液浓缩至300体积份，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和，于4℃下静置12小时，以3000r/min速度离心30分钟，弃去上清液，得沉淀；

沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置2小时，以3000r/min速度离心30分钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋白；

把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇20分钟，离心，倾出上清液，除去中间层黄色胶状变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；

将上清液置于透析袋中，在空气恒温振荡器上用纯水透析48小时，得黄芪糖蛋白溶液，经冷冻干燥，得乳白色粉状物黄芪糖蛋白（HQGP）。

本发明黄芪糖蛋白优选如下方法制备：

取黄芪药材，将其粉碎成粉末状，称取300重量份，加水1900体积份,浸泡9小时，50℃以下浸提3小时，过滤；残渣中再加水1500体积份，50℃以下浸提1小时，过滤，合并两次滤液，以3500r/min速度离心35分钟，合并上清液，得粗提液；

将粗提液浓缩至250体积份，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和，于3℃下静置24小时，以3500r/min速度离心35分钟，弃去上清液，得沉淀；

沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置1小时，以2500r/min速度离心35分钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋白；

把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇25分钟，离心，倾出上清液，除去中间层黄色胶状变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；

将上清液置于透析袋中，在空气恒温振荡器上用纯水透析24小时，得黄芪糖蛋白溶液，经冷冻干燥，得乳白色粉状物黄芪糖蛋白（HQGP）。

本发明黄芪糖蛋白优选如下方法制备：

取黄芪药材，将其粉碎成粉末状，称取500重量份，加水1300体积份,浸泡15小时，45℃以下浸提1小时，过滤；残渣中再加水900体积份，45℃以下浸提3小时，过滤，合并两次滤液，以2500r/min速度离心25分钟，合并上清液，得粗提液；

将粗提液浓缩至350体积份，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和，于5℃下静置18小时，以2500r/min速度离心25分钟，弃去上清液，得沉淀；

沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置3小时，以3500r/min速度离心25分钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋白；

把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇15分钟，离心，倾出上清液，除去中间层黄色胶状变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；

将上清液置于透析袋中，在空气恒温振荡器上用纯水透析72小时，得黄芪糖蛋白溶液，经冷冻干燥，得乳白色粉状物黄芪糖蛋白（HQGP）。

其中，所述的重量份与体积份是g/ml的关系。

本发明所述黄芪蛋白呈乳白色粉状，易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等有机溶剂；浓度为0.096mg/ml的黄芪糖蛋白水溶液于23℃下测定pH值为5.8；浓度为0.08g/100ml的黄芪糖蛋白水溶液的比旋光度为-56.38°；紫外光谱图的特征吸收峰为485nm和280nm；红外光谱图显示于3399.2cm^-1，2962.6cm^-1，1643.2cm^-1，1546.2cm^-1，1403.0，1246.5cm^-1处有明显吸收峰；黄芪糖蛋白中糖肽的结合方式为N-糖苷键；黄芪糖蛋白的分子量为50-55kD，优选53.26kD。

附图说明

图1：黄芪提取物紫外光谱图

图2：黄芪提取物红外光谱图

图3：提取物在DEAE-Cellulose32层析柱上的洗脱曲线

图4：黄芪提取物经过碱处理前后紫外光谱图

图5：标准曲线

图6：单糖组成分析图，图6.1：HQGP样品GC图，图6.2：木糖（局部），图6.3：阿拉伯糖（局部），图6.4：甘露糖（局部），图6.5：半乳糖（局部），图6.6：葡萄糖（局部）

图7：SDS-PAGE电泳图谱，1、2为HQGP样品；3为标准蛋白。

本发明所述黄芪糖蛋白（HQGP）是采用硫酸铵盐析，Sevage法除游离蛋白质，再经透析和DEAE-C32阴离子交换树脂柱层析，从黄芪水提液中分离得到的一类新的活性组分。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析，得其分子量约为53.26kD。经过实验进一步得到该新活性组分的理化性质，并通过小鼠脾淋巴细胞体外转化实验证明，本发明方法制得的具有本发明所述理化性质的黄芪糖蛋白（HQGP）对体外培养正常小鼠脾淋巴细胞及免疫低下的小鼠脾淋巴细胞的增殖均呈抑制作用，不同剂量HQGP组与空白对照组进行统计学比较，均有极显著差异，并且抑制作用呈现出剂量依赖性；同时本发明黄芪糖蛋白对活化状态下小鼠脾细胞体外增殖具有显著的抑制活性。由此证明，本发明黄芪糖蛋白具有显著的免疫调节活性。

下述实验例和实施例进一步说明但不限于本发明

实验例1本发明黄芪糖蛋白的理化性质研究实验

1、实验材料

（1）原料：黄芪，购自山西浑源。

（2）试剂：丙烯酰胺（Acrylamide）、双丙烯酰胺（Bis-Acrylamide）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、β-巯基乙醇、考马斯亮蓝R-250、溴酚兰（BBI进口原装）；低分子量蛋白标准（LMW-SDS markerkit）（Amersham公司）；甘氨酸（Gly）、三羟甲基甲基甘氨酸（Tricine）、十二烷基硫酸钠（SDS）、过硫酸铵（Ammonium Persulfate，AP)（均为Amresco公司进口分装）；DEAE-Cellulose32（国药集团化学试剂有限公司）；氯化钠、氢氧化钠、盐酸、硫酸铵、冰醋酸、甲醇、乙醇、正丁醇、甘油、氯仿（均为国产分析纯）；二次蒸馏水；透析袋（美国）。

（3）仪器：AKTA Purifier-10型生物活性分子系统，美国PharmaciaBiotech公司；TE612-L型电子天平，德国赛多利斯仪器系统有限公司；VarianCary50紫外可见分光光度计；LR4001型旋转蒸发仪，德国HE100LPH公司；98-1-B型电子恒温电热套，Heto FD8真空冷冻干燥箱(丹麦)；天津市泰斯特仪器有限公LD5-10B型低速离心机，北京医用离心机厂；CA-1111型冷水循环装置，上海爱朗仪器有限公司；SHB-88型循环水式真空泵，郑州长城科贸有限公司；THE-D台式恒温振荡器（空气浴），太仓市实验设备厂。

2、实验方法

（1）按本发明实施例1所述方法经过分离、纯化制得本发明黄芪提取物。

（2）物态：(1)所得黄芪提取物呈乳白色粉状。

（3）溶解性测定：取（1）所得黄芪提取物少量，分别以水，甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等有机溶剂试验其溶解性，结果表明该提取物呈乳白色粉状，易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等有机溶剂。

（4）PH值测定：将（1）所得黄芪提取物配制成浓度为0.096mg/ml的水溶液，于23.°C测定PH值=5.8。

（5）比旋光度测定：将（1）所得黄芪提取物配置成浓度为0.08g/100ml的水溶液，以二次蒸馏水做空白，1.002g/100ml的葡萄糖溶液做校正测量得HQGP的比旋光度为：-56.38°。

（6）紫外、红外光谱分析

将（1）所得黄芪提取物配置成浓度为0.5mg/ml的水溶液，以水为空白，在200nm-320nm波长范围内扫描得紫外光谱图，如附图1所示，紫外光谱图显示特征吸收峰为485nm和280nm。

取上述水溶液少量，采用KBr压片法，在4000cm^-1-500cm^-1范围内扫描，得红外图谱，如附图2所示，吸收峰位于3500cm^-1-2800cm^-1之间，表明本发明提取物为糖类化合物，3399.2,2962.6,1643.2,1546.2,1403.0,1246.5cm-1处有明显吸收峰，进一步证明该样品为糖蛋白。其中3399.2cm^-1左右为多糖羟基伸缩振动吸收峰，2962.6cm^-1左右为糖C-H伸缩振动吸收峰，1403cm^-1为多糖C-O振动吸收峰，1246.5cm^-1为吡喃糖环醚键C-O-C的吸收峰，1643.2cm^-1和1546.2cm^-1处为酰胺基的N-H振动吸收峰。

（7）生物活性分子系统分析

取（1）所得的黄芪提取物，经DEAE-Cellulose32柱层析，分别用0.05mol/lLNaCl和0.1mol/LNaCl为洗脱液依次洗脱，在糖蛋白特征吸收峰485nm和280nm处测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，得出HQGP吸光度与流出时间曲线图。如附图3所示，485nm处多糖吸光峰和280nm处蛋白吸光峰出现的时间一致，说明该提取物具有糖蛋白的特征。

（8）糖肽键类型的测定

取（1）所得的黄芪提取物配成0.5mg/ml的水溶液和0.5mg/ml的NaoH（0.2mol/L）溶液，于45°C水浴处理2h，分别以水和0.2mol/L的NaoH溶液为空白，在200nm-400nm范围内扫描得紫外光谱图，如附图4所示，水溶液和碱处理样品的紫外光谱图在230nm-240nm间均未出现吸收，及未出现羟基不饱和氨基酸的特征吸收，由此确定该黄芪提取物中糖肽的结合方式为N-糖肽键。

（9）总糖含量测定

用硫酸-苯酚法显色，以0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.10mg/ml的葡萄糖溶液做标准在475nm处测定，得标准曲线为Abs=5.22884*C+0.23032；r=0.98042；将（1）所得黄芪提取物配制成0.5mg/ml水溶液，在同等条件下测定吸光度，计算得总糖含量为6.0%，见附图5。

（10）单糖组成分析

取木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸各4.6mg于6支安瓿瓶中，各加2moL/L的F₃CCOOH2mL后封管，120°C水解3h，滤去水解液中的残渣，蒸干后用1mL水洗一次，蒸干水分，各加入0.13mL无水吡啶和4mg盐酸羟胺，于90°C水浴30min，冷却后各加0.2mL无水乙酸酐，于90°C乙酰化30min，浓缩，进行GC分析。取糖混合样4.6mg（含上述六种糖各约0.8mg）和4.6mg的该黄芪提取物样品同上法制得供试品。

GC分析条件：19091J-433HP-5毛细管柱（30m*0.25mm*0.25um）；升温程序为80°C始以8.0°C/min升至160°C并保持2min，以5.0°C/min升至200°C并保持3min，再以2.0°c/min升至230°C并保持2.0min；FID检测器，N₂为载气，流速为0.6mL/s,分流为10mL/min。

如图6所示，该提取物单糖组成主要含有葡萄糖和阿拉伯糖等。

（11）分子量测定

取（1）所得黄芪提取物进行SDS-PAGE电泳，分离胶质量分数为l5％，电极缓冲液为pH=8.3的1.5mol/L Tris-Gly-SDS溶液，采用考马斯亮蓝R-250染色，脱色液为7％的冰乙酸，上样量25μg。同时，采用LMW-SDS markerkit作为对照，溴酚蓝为指示剂，得SDS-PAGE电泳图谱，如附图7所示，样品经SDS-PAGE电泳后，用考马斯亮蓝R-250染色，得一条均一的染色带区，表明该提取物达到电泳纯。根据样品的相对迁移率，测得其分子量约为53.26kD。

（12）氨基酸组成分析：取（1）所得的黄芪提取物，采用氨基酸自动分析仪检测，该提取物的氨基酸组成如表1所示：

表1.黄芪提取物中氨基酸组成及含量

实验例2本发明黄芪糖蛋白的小鼠脾淋巴细胞体外转化实验

1、实验材料

（1）动物：8～12周龄雄性Balb/c小鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所

（2）试剂：本发明实施例1所得的黄芪提取物（HQGP）山西中医学院提供；

黄芪多糖粉针剂（Astragalus polysaccharides,APS-P）美国泛华医药公司；环磷酰胺（CTX）山西普德药业有限公司；

刀豆蛋白A、脂多糖（LPS）、四噻唑盐（MTT）为Sigma公司产品；

RPMI1640培养基Hyclone改良型，赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；

小牛血清杭州四季青生物材料有限公司

（3）仪器：CO₂培养箱（德国BINDER）；酶标仪（瑞士Tecan Safire2）；低温离心机（日本Sanyo）

2、实验方法

（1）动物处理：将10只小鼠随机分为两组，腹腔注射给药。第一组为正常对照组，注射生理盐水，0.1ml/10g体重，第二组为模型组，注射环磷酰胺，40ml/10g体重。给药2天。

（2）小鼠脾细胞制备：第三天颈椎脱臼处死小鼠，75%乙醇浸泡3分钟，无菌取出脾脏，通过200目细胞筛，1500r/min离心10分钟，弃上清，加入6ml8.3ml/L Tris-NH4CL,室温放置10分钟裂解红细胞后1500r/min离心10分钟，弃上清，加入无血清RPMI1640培养基洗涤2次，每次1500r/min离心10分钟，弃上清，加入1～2ml RPMI1640培养基，调节细胞悬液密度为3x106/ml，并用台盼蓝染色检测细胞活力>95%。

（3）脾淋巴细胞体外转化的测定：将制备的正常对照组脾细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔100μl，分为4组：①空白对照，加入RPMI1640培养基100μl；②刀豆蛋白A8μl终浓度为4μg/ml；③脂多糖30μl终浓度为15μg/m；④不同浓度的本发明实施例1所得的黄芪提取物(0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、90μg/ml)。总体积为200μl。每组设3个复孔。

将制备的模型组脾细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔100μl。分组及给药剂量同正常对照组脾细胞。每组设3个复孔。

然后将细胞板放入37℃CO2培养箱68小时，吸弃100μl上清，每孔加入5mg/ml MTT10μl，继续培养6小时，每孔加入100μl含0.01N盐酸的10%SDS，充分溶解细胞。在Tecan Safire2全波长酶标仪上测OD570吸光值，以表示淋巴细胞转化增殖的大小。

3、统计学处理

数据资料用表示，应用SPSS13.0进行统计学处理，各组均数之间比较进行one-way ANOVA检验。

4、实验结果

MTT结果见表2、表3。黄芪提取物对体外培养正常小鼠脾淋巴细胞及免疫低下的小鼠脾淋巴细胞的增殖均呈抑制作用，不同剂量HQGP组与空白对照组进行统计学比较，均有极显著差异，并且抑制作用呈现出剂量依赖性，该黄芪提取物具有显著的免疫调节活性。

表2黄芪提取物对正常小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响

与空白对照组相比，*P<0.01

表3黄芪提取物对免疫低下小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响

与空白对照组相比，*P<0.01

实验例3本发明黄芪糖蛋白对活化状态下小鼠脾细胞体外增殖抑制活性实验

1、实验材料

（1）动物：8～12周龄雄性Balb/c小鼠，B57BL/6J小鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所。动物批号：SCXK（京）2004-0001

（2）试剂：本发明实施例2制备的黄芪提取物山西中医学院提供；刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖（LPS）、四噻唑盐（MTT）、RNase-A为Sigma公司产品；碘化丙啶（PI）；RPMI1640培养基Hyclone改良型，赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；小牛血清杭州四季青生物材料有限公司

（3）仪器：CO2培养箱（德国BINDER）、酶标仪（瑞士Tecan Safire2）、低温离心机（日本Sanyo）、流式细胞仪、恒温水浴箱

2、实验方法

（1）小鼠脾细胞制备：同实验例1。

（2）不同浓度的HQGP对小鼠脾淋巴细胞体外转化的影响

ConA刺激下对T细胞增殖的影响：于96孔平底细胞培养板中每孔加入制备好的脾细胞悬液100μl及ConA6μl(终浓度3μg/ml)。加入不同浓度的HQGP。HQGP的浓度设为9个实验组（n=3），分别为0、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、3.0、10.0μg/ml；每孔再加入完全1640培养基，使终体积均为200μl。

LPS刺激下对B细胞增殖的影响：实验方法及HQGP药物浓度、实验组同上，每孔加入的LPS为30μl(终浓度15μg/ml)。

将细胞板置于含5%CO₂及饱和湿度条件下的培养箱，37℃孵育72小时。于终止孵育前6小时每孔吸弃100μl培养液上清，加入5mg/ml MTT10μl，继续孵育6小时后，每孔加入100μl含0.01N盐酸的10%SDS，充分溶解细胞。在Tecan Safire2全波长酶标仪上测OD₅₇₀吸光值，以表示淋巴细胞转化增殖的大小。

（3）不同时间给予HQGP对小鼠T淋巴细胞增殖的影响

于96孔平底细胞培养板中每孔加入制备好的脾细胞悬液100μl及ConA6μl(终浓度3μg/ml)。分别于不同时间加入同一浓度HQGP（10μg/ml）。细胞孵育开始时加入HPGP记为0h,孵育12小时记为12h，以此类推。将实验分为7个组（n=4），分别为0、12、24、46、48、60h，对照组仅加入完全RPMI-1640培养基，不加HQGP。终体积为200μl。孵育及检测方法同(2)。

（4）流式细胞仪测定HQGP对小鼠T淋巴细胞周期的影响

于6孔平底细胞培养板中每孔加入制备好的脾细胞悬液1ml、ConA50μl(终浓度2.5μg/ml)、HQGP20μl（终浓度1μg/ml）或Tri20μl（终浓度0.01μg/ml）以及完全RPMI-1640培养基950μl。终体积为2ml。于含5%CO₂及饱和湿度条件下的培养箱，37℃孵育72小时。设三个复孔。

将细胞板中的细胞收集于离心管中离心，200g，10分钟。用PBS洗涤细胞2次，加0.5mL PBS吹匀，务必吹散。用1mL注射器将细胞吸起，用力打入1mL70%(预冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定24小时以上。取300g，离心10分钟，收集固定细胞，PBS洗2次；用0.2mL PBS重悬细胞并转至1.5ml离心管中轻轻吹打（防止细胞破碎）；加RNase-A约10μL至终浓度约为50μg/mL，37℃水浴消化30min；冷却后加PI约10μL至终浓度约为50μg/mL，在冰浴中避光染色30min。用300目（孔径40～50微米）尼龙网过滤，流式细胞仪检测。

（5）HQGP抑制小鼠脾淋巴细胞增殖与淋巴细胞活化的关系

于96孔平底细胞培养板中每孔加入制备好的脾细胞悬液100μl、HQGP（5μg/ml）及不同浓度的ConA。将实验分为6个组（n=3），ConA浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0μg/ml。对照组分别加以上不同浓度的ConA，但不加HQGP。终体积为200μl。孵育及检测方法同（2）。计算刺激指数SI=实验组OD₅₇₀值/对照组OD₅₇₀值表示细胞的增殖反应。

（6）HQGP在小鼠同种异体双向混合淋巴反应中的抑制作用

分别取C57BL/6J和Balb/C小鼠脾脏制备细胞悬液，方法同（1），调整细胞密度均为2x10⁶/ml。96孔平底细胞培养板中，每孔中分别加入两种脾细胞悬液各100μl、不同浓度的HQGP。设实验组7个（n=3），HQGP的浓度分别为0、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μg/ml。另设单独C57BL细胞孔和单独Balb/C细胞孔，以及阳性药物Tri（0.05μg/ml）孔和ConA刺激孔，均为三复孔。CO₂孵葙培养4天。培养及酶标仪测定方法同（2）。根据以下公式计算抑制率：

抑制率＝（混合空白对照孔OD₅₇₀值－实验药物细胞孔OD₅₇₀值）/混合空白对照孔OD570值。

3、统计学处理

数据资料用表示，应用SPSS13.0进行统计学处理，各组均数之间比较进行one-way ANOVA检验。

4、实验结果

（1）不同浓度的HQGP对小鼠脾淋巴细胞体外转化的影响。见表4、表5。HQGP可抑制ConA、LPS诱导的小鼠T细胞、B细胞增殖，并且对T、B淋巴细胞的增殖抑制表现出明显的剂量依赖性。但HQGP对T细胞作用更显著，而对B细胞的作用只有在高剂量时才显现出来。

表4HQGP对conA(3μg/ml)刺激下小鼠脾T淋巴细胞增殖的影响

与空白对照组相比，*P<0.05

表5HQGP对LPS(15μg/ml)刺激下小鼠脾B淋巴细胞增殖的影响

与空白对照组相比，*P<0.05

（2）不同时间给予HQGP对小鼠T淋巴细胞增殖的影响。见表6，HQGP在不同时间对T淋巴细胞增殖均起到抑制作用，但只有0h、12h、24h给药与对照组有显著性差异（P<0.05）,且在12h加入HQGP产生的抑制作用最强。48h、60h给药也表现出抑制作用但没有统计学意义。

表6不同时间给药对淋巴细胞增殖的影响

与空白对照组相比，*P<0.05

（3）HQGP对小鼠T淋巴细胞周期的影响。见表7，HQGP（1μg/ml）作用后，G0/G1期细胞与对照组相比增多（P<0.05），G2/M期细胞也比对照组增多（P<0.05），但S期细胞却明显减少（P<0.05）。同时阳性药物Tri（0.01μg/ml）作用后，G0/G1期细胞与对照组相比增多明显（P<0.05），G2/M期细胞与对照组相比没有变化，S期细胞减少非常明显（P<0.05）。

表7HQGP对小鼠T淋巴细胞细胞周期的影响（72h）

与空白对照组相比，*P<0.05

（4）HQGP抑制小鼠脾淋巴细胞增殖与淋巴细胞活化的关系。见表8,HQGP（5μg/ml）作用后，不同ConA浓度下脾淋巴细胞的增殖均被抑制。从刺激指数看，淋巴细胞活化程度与HQGP的抑制作用没有正相关性。当没有ConA作用时（淋巴细胞处于静止状态），HQGP也表现出抑制作用。

表8HQGP抑制小鼠脾淋巴细胞增殖与淋巴细胞活化的关系

（5）HQGP在小鼠同种异体双向混合淋巴反应中的抑制作用。见表9，不同浓度的HQGP对同种异体混合淋巴反应均有抑制作用，但高浓度的抑制作用更加显著，抑制率为74.77%。阳性对照药Tri也具有显著的抑制作用，并且与GP（10μg/m）比较有显著差异(P＜0.05)，抑制率为85.17%。

表9GP对小鼠同种异体混合淋巴细胞反应的抑制作用

与空白对照组相比，*P<0.05

与GP（10μg/ml）组相比，a．P＜0.05。

实验例4黄芪糖蛋白在小鼠体内的免疫活性实验

1、实验材料

（1）动物:8～12周龄雄性Balb/c小鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所，批号：SCXK（京）2004-0001

（2）试剂：本发明实施例1所述的黄芪提取物（HQGP）

雷公藤甲素（Triptolide，Tri）中国药品生物制品检定所批号：111567-200502

FITC荧光素标记的抗小鼠CD3抗体美国eBioscience公司产品

PE标记的抗小鼠CD8抗体美国eBioscience公司产品

PerCP标记的抗小鼠CD4抗体美国BD公司产品

APC标记的抗小鼠CD19抗体美国eBioscience公司产品

APC标记的抗小鼠CD49b抗体美国eBioscience公司产品

裂解液

目录号为88-8115-40的小鼠调节性T细胞染色试剂盒，包含如下组分：

1.FITC标记的抗小鼠CD4抗体：50μg

2.PE标记的抗小鼠CD25抗体：50μg

3.PE-Cy5标记的抗小鼠/大鼠Foxp3抗体：25μg

4.PE-Cy5标记大鼠IgG2a同型对照：25μg

5.亲和纯化的抗小鼠CD16/32抗体：50μg

6.流式细胞仪染色缓冲液：200ml美国eBioscience公司产品

7.固定/破膜浓缩液30ml美国eBioscience公司产品

8.固定/破膜稀释液：100ml美国eBioscience公司产品

9.破膜缓冲液（10倍浓度）100ml美国eBioscience公司产品

（3）仪器：低温离心机（日本Sanyo）；流式细胞仪FACSCalibur（美国BD）；蜗旋振荡器；肝素钠抗凝真空采血管。

2、实验方法

（1）动物处理

小鼠适应饲养一周，自由饮水、进食。按照小鼠体重，用CHISS软件将10只小鼠随机分为5组，每组8只。

分组：正常对照组、HQGP低、中、高剂量组、雷公藤甲素组。

给药：每组小鼠腹腔注射给药，按0.1ml/kg.d，连续给药7天，第8天摘眼球取血。各组给药剂量如下：

（2）流式细胞仪分析小鼠外周血中淋巴细胞亚群及FoxP3的表达

小鼠外周血淋巴细胞亚群流式细胞术分析步骤

1)在每个流式上样管中加入100ul抗凝小鼠外周血。

2)加入推荐最适量荧光标记表面抗原抗体与全血均匀混合，实验设计为2个测试管：

a)CD3FITC/CD8PE/CD4PerCP/CD19APC

b)CD3FITC/CD49b APC

3）常温避光反应20分钟，每管中加入2ml红细胞裂解工作液，裂解10分钟。300g离心5分钟，弃上清。

4）加入2ml预冷PBS重悬细胞，300g离心5分钟，弃上清。

5）加入500ul PBS重悬细胞，上机检测。

小鼠调节性T细胞FoxP3表达流式细胞术分析步骤

1）在每个流式上样管中加入100ul抗凝小鼠眼底血。

2）加入推荐最适量荧光标记表面抗原抗体(CD4,CD25)。

3）常温避光反应20分钟，每管加入2ml红细胞裂解工作液，裂解10分钟，300g离心5分钟，弃上清，2ml PBS重悬细胞，洗涤细胞一次。

4）用预冷的Flow Cytometry Staining Buffer或预冷的PBS洗涤细胞。

5）旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization），并再次旋涡混匀。

6）避光4℃，孵育30分钟。

7）加入2ml Permeabilization Buffer（Cat.No00-8333）工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。

8）重复第5步操作洗涤细胞。

9）加入适量Affinity Purified anti-mouse CD16/32(Fc Block)（用Permeabilization Buffer工作液进行稀释），在避光4℃孵育15分钟。

10）封闭液无需洗去，直接加入适量的荧光标记Foxp3抗体（用Permeabilization Buffer工作液进行稀释，根据推荐浓度进行稀释，建议稀释成10ul/Test，含有推荐浓度的抗体），避光4℃孵育至少30分钟。

11）加入2ml Permeabilization Buffer工作液，离心洗涤细胞并弃去上清液。

12）重复上一步洗涤细胞。

13）用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测分析。

由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。

（3）数据处理

流式细胞仪数据分析采用CellQuest软件分析。各组细胞亚群比例数据资料用表示，应用SPSS13.0进行统计学处理，各组均数之间比较进行one-way ANOVA检验。

（4）实验结果

1）小鼠的一般情况

腹腔注射黄芪糖蛋白三天后，高剂量组小鼠开始表现出和对照组明显的差异。出现毛色无光泽、萎靡不振、弓背少动、反应迟钝、体重下降、并且有畏寒等现象。中剂量组的状况比高剂量组稍好，但也表现出和对照组明显的差别。对照组小鼠却表现良好，无以上症状。

2）各组小鼠体重变化

各组小鼠平均体重给药前后变化明显，见表10，尤其是黄芪糖蛋白高剂量与中剂量组。

表10给药前后各组小鼠体重

在HQGP的三个剂量中，高剂量（10mg/kg.d）对小鼠体重的影响最明显，平均体重降低3.75克，中（5mg/kg.d）、低剂量（1mg/kg.d）组的作用依次减弱。

3）小鼠外周血总淋巴细胞比例

小鼠外周血中总淋巴细胞占白细胞数目的比例如表11。

表11HQGP对总淋巴细胞占白细胞比例的影响

与空白组相比，**.P＜0.01；与空白组相比*.P＜0.05

给药后，HQGP各组与Tri组外周血中总淋巴细胞数目都减小了。HQGP高、中、低剂量组的总淋巴细胞占白细胞的比例显著降低，与正常组比较P＜0.01。Tri组与正常组比较也有统计学意义，P＜0.05。

4）小鼠外周血T淋巴细胞亚群

小鼠外周血中总T细胞、CD3+CD4+CD8-T细胞、CD3+CD4-CD8+T细胞占淋巴细胞的比例及CD3+CD4+/CD3+CD8+比值如表12。

表12HQGP对T细胞及T细胞亚群的影响

与空白组相比*.P＜0.05

HQGP中、低剂量组总的T细胞占淋巴细胞的比例下降，与正常组对比有显著性差异，P＜0.05。

表12，HQGP中剂量使T细胞亚群CD4+CD8-T细胞占淋巴细胞的比例明显降低，与正常组比较P＜0.05；而使CD4-CD8+T细胞占淋巴细胞的比例明显升高，与正常组比较P＜0.05。CD4+/CD8+比值显著下降，与正常组比较P＜0.05。同时，Tri使CD3+CD8+T细胞占淋巴细胞的比例明显升高，与正常组比较P＜0.05。CD4+/CD8+比值显著下降，与正常组比较P＜0.05。

在平行实验中，HQGP中剂量组与Tri组对小鼠外周血中T细胞亚群的影响相同。

5）小鼠外周血调节性T细胞foxP3表达

HQGP对小鼠调节性T细胞foxP3表达的影响如表13所示。

表13HQGP对小鼠调节性T细胞foxP3表达的影响

与空白组相比*.P＜0.05；与空白组相比**.P＜0.01

由以上数据可知，HQGP高、中、低各组小鼠外周血调节性T淋巴细胞（CD4+CD25+）表达FoxP3的细胞占CD4+的比例与正常组比较有极显著的差异，P＜0.01；同时还比较了CD4+CD25+FoxP3+细胞占淋巴细胞的比例，与正常组对比，HQGP高、中剂量组差异极显著，P＜0.01。低剂量组差异显著，P＜0.05。在实验个组中，CD4+CD25+T细胞中表达FoxP3的细胞比例没有统计学差异，P>0.05。

6）小鼠外周血NK细胞比例

HQGP对小鼠外周血中NK、NKT细胞占淋巴细胞的比例影响，如表14。

表14HQGP对NK、NKT细胞比例的影响

与空白组相比*.P＜0.05；与空白组相比**.P＜0.01

高、中、低剂量HQGP对小鼠外周血中NK细胞比例均有提高，但只有高剂量组与正常组比较有显著性差异，P＜0.05。对NKT细胞的影响却非常明显，高、中剂量HQGP作用小鼠后，外周血中NKT细胞比例显著增高，且呈剂量依赖性。高、中剂量组与正常组比较有极显著差异，P＜0.01。HQGP小剂量组与正常组比较NKT细胞比例降低并有显著差异，P＜0.05。同时Tri组在NKT细胞的增殖抑制方面却表现出极显著差异。

4.4.7小鼠外周血B细胞比例

HQGP对小鼠外周血B细胞比例的影响见表15。

表15HQGP对小鼠外周血B细胞比例的影响

与空白组相比*.P＜0.05；

由表15可知，HQGP高、中剂量可提高小鼠外周血B细胞占淋巴细胞的比例，与正常组比较有显著性差异，P＜0.05，并表现出剂量依赖性。Tri组与正常组比较没有差异。

下述实施例均能实现上述实验例所述的效果

具体实施方式

实施例1：黄芪糖蛋白的制备

取黄芪药材，将其粉碎成粉末状，称取400g，加水1600ml,浸泡12小时，55-60℃以下浸提2小时，过滤；残渣中再加水1200ml，55-60℃以下浸提2小时，过滤，合并两次滤液，以3000r/min速度离心30分钟，合并上清液，得粗提液；

将粗提液浓缩至300ml，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和，于4℃下静置12小时，以3000r/min速度离心30分钟，弃去上清液，得沉淀；

沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置2小时，以3000r/min速度离心30分钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋白；

把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇20分钟，离心，倾出上清液，除去中间层黄色胶状变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；

将上清液置于透析袋中，在空气恒温振荡器上用纯水透析48小时，得黄芪糖蛋白溶液，经冷冻干燥，得乳白色粉状物黄芪糖蛋白（HQGP），经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析测得分子量为53.26kD。

实施例2：黄芪糖蛋白的制备

取黄芪药材，将其粉碎成粉末状，称取300g，加水1900ml,浸泡9小时，50℃以下浸提3小时，过滤；残渣中再加水1500ml，50℃以下浸提1小时，过滤，合并两次滤液，以3500r/min速度离心35分钟，合并上清液，得粗提液；

将粗提液浓缩至250ml，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和，于3℃下静置24小时，以3500r/min速度离心35分钟，弃去上清液，得沉淀；

沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置1小时，以2500r/min速度离心35分钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋白；

把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇25分钟，离心，倾出上清液，除去中间层黄色胶状变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；

将上清液置于透析袋中，在空气恒温振荡器上用纯水透析24小时，得黄芪糖蛋白溶液，经冷冻干燥，得乳白色粉状物黄芪糖蛋白（HQGP），经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析测得分子量为53.26kD，紫外光谱图的特征吸收峰为485nm和280nm。

实施例3：黄芪糖蛋白的制备

取黄芪药材，将其粉碎成粉末状，称取500g，加水1300ml,浸泡15小时，45℃以下浸提1小时，过滤；残渣中再加水900ml，45℃以下浸提3小时，过滤，合并两次滤液，以2500r/min速度离心25分钟，合并上清液，得粗提液；

将粗提液浓缩至350ml，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和，于5℃下静置18小时，以2500r/min速度离心25分钟，弃去上清液，得沉淀；

沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置3小时，以3500r/min速度离心25分钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋白；

把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇15分钟，离心，倾出上清液，除去中间层黄色胶状变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；

将上清液置于透析袋中，在空气恒温振荡器上用纯水透析72小时，得黄芪糖蛋白溶液，经冷冻干燥，得乳白色粉状物黄芪糖蛋白（HQGP），经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析测得分子量为53.26kD，红外光谱图显示于3399.2cm^-1，2962.6cm^-1，1643.2cm^-1，1546.2cm^-1，1403.0，1246.5cm^-1处有明显吸收峰。

Claims (1)

1.一种黄芪糖蛋白的制备方法，其特征在于，由如下步骤组成：

取黄芪药材，所述黄芪药材购于山西浑源，将其粉碎成粉末状，称取200-600重量份，加水1200-2000体积份,浸泡8-16小时，40-60℃以下浸提1-3小时，过滤；残渣中再加水800-1600体积份，40-60℃以下浸提1-3小时，过滤，合并两次滤液，以2000-4000r/min速度离心20-40分钟，合并上清液，得粗提液；

将粗提液浓缩至200-400体积份，加入研磨成粉状的硫酸铵，边加边搅拌至饱和，于2-6℃下静置12—24小时，以2000-4000r/min速度离心20-40分钟，弃去上清液，得沉淀；

沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸铵至饱和，静置1-3小时，以2000-4000r/min速度离心20-40分钟，弃去上清液，沉淀再用少量水溶解，重复上述步骤，得到沉淀，为粗糖蛋白；

把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag试剂，剧烈振摇10-30分钟，离心，倾出上清液，除去中间层黄色胶状变性蛋白和下层氯仿，重复该步骤至中间层几乎无变性蛋白；

将上清液置于透析袋中，纯水透析24-72小时，得黄芪糖蛋白溶液，经冷冻干燥，得乳白色粉状物黄芪糖蛋白；

该黄芪糖蛋白的分子量为53.26kD；

该黄芪糖蛋白配置成浓度为0.5mg/ml的水溶液，采用KBr压片法，在4000cm^-1-500cm^-1范围内扫描，得红外图谱，吸收峰位于3500cm^-1-2800cm^-1之间，3399.2,2962.6,1643.2,1546.2,1403.0,1246.5cm^-1处有明显吸收峰；其中3399.2cm^-1为多糖羟基伸缩振动吸收峰，2962.6cm^-1糖C-H伸缩振动吸收峰，1403cm^-1为多糖C-O振动吸收峰，1246.5cm^-1为吡喃糖环醚键C-O-C的吸收峰，1643.2cm^-1和1546.2cm^-1处为酰胺基的N-H振动吸收峰；

该黄芪糖蛋白中氨基酸组成及含量为：每100g黄芪糖蛋白含氨基酸总量57.18g，其中天门冬氨酸4.50g，苏氨酸3.20g，丝氨酸2.33g，谷氨酸6.49g，甘氨酸3.83g，丙氨酸1.68g，胱氨酸1.42g，缬氨酸5.99g，蛋氨酸0.92g，异亮氨酸2.31g，亮氨酸2.34g，酪氨酸4.39g，苯丙氨酸1.93g，赖氨酸6.50g，组氨酸2.00g，精氨酸1.44g，脯氨酸5.91g；

该黄芪糖蛋白的糖肽的结合方式为N-糖肽键。