CN101284872B - 一种抗氧化活性肽及其制备方法 - Google Patents

一种抗氧化活性肽及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101284872B
CN101284872B CN2008100642968A CN200810064296A CN101284872B CN 101284872 B CN101284872 B CN 101284872B CN 2008100642968 A CN2008100642968 A CN 2008100642968A CN 200810064296 A CN200810064296 A CN 200810064296A CN 101284872 B CN101284872 B CN 101284872B
Authority
CN
China
Prior art keywords
elutriant
vigor
chromatography
hcl
uv280nm
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2008100642968A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101284872A (zh
Inventor
刘晓兰
郑喜群
王晓杰
林杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiqihar University
Original Assignee
Qiqihar University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiqihar University filed Critical Qiqihar University
Priority to CN2008100642968A priority Critical patent/CN101284872B/zh
Publication of CN101284872A publication Critical patent/CN101284872A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101284872B publication Critical patent/CN101284872B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抗氧化活性肽及其制备方法，产品是以微生物纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)为菌种，玉米蛋白粉为原料，经液态培养，再通过离子交换层析、凝胶层析、反相色谱和电泳法对发酵液进行分离制备而成；该产品的分子量在20,100-31,000之间，N端5个氨基酸序列为：K-V-T-Y-H，抗氧化活力为236.68U/mL；本发明产品具有较高的抗氧化活力。

Description

一种抗氧化活性肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种抗氧化活性肽，本发明还涉及一种该抗氧化活性肽的制备方法。
背景技术
玉米蛋白粉(Corn Gluten Meal缩写CGM)俗称玉米黄粉，是玉米湿法生产淀粉的副产物之一，约含60％的蛋白质，抽样检测其蛋白质组成为玉米醇溶蛋白(zein)占68％、谷蛋白(glutelin)占22％，其余为球蛋白(globulins)和白蛋白(albumin)。玉米蛋白粉是一种资源丰富、成本低廉的天然植物蛋白原料，但就其氨基酸组成而言，由于赖氨酸和色氨酸的含量都不高，所以玉米蛋白是一种非全营养蛋白。另外，玉米蛋白粉所含的蛋白质难溶于水，组成复杂，口感粗糙，因此，无论是在食品领域还是在饲料行业都很少有人予以重视，有些工厂甚至将其与其它副产物一起不加回收就自然排放掉了，这不仅是对粮食资源的一种浪费，同时也对生态环境造成了一定程度的污染。
再者，由于人类生存环境和生活方式、尤其是饮食结构的改变，体内环境也在发生着潜移默化的改变。以基础物质代谢为例，越来越多的过氧化物质和有害自由基正在人们体内源源不断的生成，严重地威胁着人们的健康。对此，绝大多数人都缺少认知。虽然医学专业人员为解决这一问题做了很多的研究，但是目前真正能够起到预防氧化、有效抑制体内自由基形成的高活性抗氧化物质还不很多，这就需要我们相关专业的技术人员进一步做出更多的努力。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种抗氧化活性肽，由于生产该产品的主要原料是玉米蛋白粉，首先为这种长期被冷落、被遗弃的天然资源提供了一种有效的利用途径，同时还开发出了一种具有防治疾病、抗衰老等功能，可以做为医药、化妆品等产品添加剂使用的抗氧化活性肽。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种该抗氧化活性肽的制备方法。
本发明产品抗氧化活性肽的分子量在20,100-31,000之间，N端5个氨基酸序列为：K-V-T-Y-H，抗氧化活力为236.68U/mL。
本发明产品抗氧化活性肽的制备方法：以微生物纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)为菌种，以玉米蛋白粉为原料，采用液态培养方式，获得具有抗氧化活性的多肽混合物，再通过离子交换层析、凝胶层析、反相色谱逐级收集高活性且分子量＞5,000Da部分，最后通过凝胶电泳获得。
在上述技术方案中所使用的纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)可以采用现有品种，该菌种目前已经很容易得到。本发明最优选的菌种是本课题组于日本传统食品纳豆中分离、筛选得到的，保藏号为CGMCC No.2236的菌株。该菌种最突出的特性就是其分泌蛋白酶的活力较现有菌株至少要高出2.66％。
本发明产品制备的具体方法：
1、发酵液的制备
以纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)为发酵菌种，将1mL种子培养液接入装有初始pH7.0的30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于34℃、200r/min条件下振荡培养32h后5000r/min离心10min，在沸水浴中灭酶活10min，所得液体为抗氧化活性肽的混合物。
2、DEAE-Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析
将第一步所得的混合物10000r/min离心15min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜，滤液进行弱阴离子交换层析(
Figure GSB00000595647700031
2.6＊20cm)。起始缓冲液：25mmol/L pH9.0Tris-HCl，洗脱液：含1mol NaCl的25mmol/L pH 9.0Tris-HCl，流速：1.5mL/min，UV280nm处检测。测定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性部分备用。
3、Sephadex G-25凝胶过滤层析
①将DEAE-Sepharose Fast Flow的高活力样品冷冻抽干浓缩后，用洗脱液25mmol/L pH 9.0Tris-HCl溶解后进行凝胶层析脱盐(
Figure GSB00000595647700032
1.6＊50)，流速2.0mL/min，UV280nm处检测。测定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性部分备用。
②将Q-Sepharose HP的高活力样品冷冻抽干浓缩后，用洗脱液双蒸水溶解后10000r/min离心10min，取上清液进行凝胶层析脱盐(
Figure GSB00000595647700033
1.6＊50)，流速2.0mL/min，UV280nm处检测，测定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性且分子量＞5,000Da部分备用。
4、Q-Sepharose HP强阴离子交换层析色谱
将进行过①Sephadex G-25脱盐后的活性部分进行Q-Sepharose HP分离。起始缓冲液：25mmol/L pH 9.0Tris-HCl，洗脱液：含1molNaCl的25mmol/L pH9.0Tris-HCl，流速2.0mL/min，UV280nm处检测，测定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性且分子量＞5,000Da部分备用。
5、CM-Sepharose Fast Flow弱阳离子交换层析
将进行过②Sephadex G-25脱盐后的活性部分进行CM-Sepharose FastFlow色谱分离。起始缓冲液：1mmol/L pH 3.0Gly-HCl，洗脱液：含1mol NaCl的0.001mol/L pH 3.0Gly-HCl，流速：2.0mL/min，UV280nm处检测，测定各管收集液的抗氧化活力，收集活性部分备用。
6、反相色谱
①RESOURCETM RPC(3mL)反相色谱分离
将经过②Sephadex G-25脱盐后活性部分进行RESOURCETM RPC 3mL反相色谱分离。洗脱液A：0.065％TFA，2％乙腈；洗脱液B：0.05％TFA，80％乙腈；流速：1.0mL/min，UV280nm处检测。测定各管收集液的抗氧化活力，收集活性部分作下一步色谱分离用。
②第一次SymmetryShieldTMRP 18(5μm)反相色谱
将进行过CM-Sepharose Fast Flow的高活力样品，进行Symmetry ShieldTMRP 18反相色谱分离。洗脱液A：0.065％TFA，2％乙腈；洗脱液B：0.05％TFA，80％乙腈；流速：1.0mL/min，UV280nm处检测。测定各管收集液的抗氧化活力，收集活性部分进行第二次SymmetryShield TMRP 18反相色谱分离。
③第二次SymmetryShield TMRP 18(5μm)反相色谱
将第一次进行SymmetryShield TMRP 18反相色谱分离的高活力部分冷冻抽干后进行第二次SymmetryShield TMRP 18分离。洗脱液A：0.065％TFA，8％乙腈；洗脱液B：0.05％TFA，60％乙腈；流速：1.0mL/min，UV280nm处检测，测定各管收集液的抗氧化活力，收集活性部分进行蛋白质电泳。
7、酸、碱性PAGE凝胶电泳：垂直板电泳槽中灌注交联度为2.6％，浓度为10％(w/v)分离胶和5％(w/v)浓缩胶。碱性电泳浓缩胶部分恒压40v，分离胶部分恒压70v，电泳2.0h左右。酸性电泳浓缩胶部分恒压100v，分离胶部分恒压200v，电泳4.0h。
本发明的有益效果是：本发明设计的产品具有很高的抗氧化活力，经测定为236.68U/mL。纯品可满足对抗氧化活性肽结构、物性测定，活性、毒理实验，乃至于治疗、培育等大规模应用的要求。同时抗氧化活性物质对超氧阴离子自由基和羟基自由基有强烈的清除作用，并能显著抑制红细胞和肝脏、心脏、脑组织脂质过氧化反应的发生，具有防治疾病、抗衰老等功能，所以本发明产品可进一步开发成医药、化妆品等产品添加剂使用。
本发明中优选的纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)菌株已由本申请人于2007年10月30日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提供了保藏，保藏号为CGMCC No.2236。
具体实施方式
实施例1：
1、菌种：纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)菌株，保藏号为CGMCC No.2236。
2、斜面培养基及培养条件：
斜面培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂2g，水100mL，pH7.0-7.2，37℃培养12h。
实施例2：
1、菌种、斜面培养同实施例1
2、种子培养基及培养条件：
种子培养基：蛋白胨1g，葡萄糖2g，K2HPO40.1g，MgSO4 0.05g，水100mL，pH7.0-7.2，37℃、200r/min条件下振荡培养12h。
实施例3：
1、菌种、斜面培养同实施例1
2、种子培养同实施例2
3、主要检测方法
(1)蛋白含量测定：Folin-酚法
(2)抗氧化活力测定：邻苯三酚自氧化法
4、发酵培养基及发酵条件：
发酵培养基：玉米蛋白粉与水按一定比例配制。
取1mL种子培养液接入装有初始pH7.0的30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，34℃、200r/min条件下振荡培养32h。
实施例4：
1、斜面培养同实施例1
2、种子培养同实施例2
3、发酵条件同实施例3
4、抗氧化活性肽的分离纯化
将发酵液10000r/min离心15min后，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液进行弱阴离子交换层析，收集活性高的部分用Sephadex G-25凝胶层析脱盐。脱盐后的活性部分进行Q-Sepharose HP色谱分离，收集活性高的部分用Sephadex G-25凝胶层析进行脱盐。脱盐后的收集的活性部分再次进行弱阴离子交换层析分离并脱盐。收集活性部分进行Symmetry Shield TMRP 18反相色谱分离，收集高活性部分第二次经SymmetryShield TMRP 18反相色谱分离，收集活性部分进行蛋白质电泳，并印迹至PVDF膜上。
实施例5：
1、斜面培养同实施例1
2、种子培养同实施例2
3、发酵条件同实施例3
4、抗氧化活性肽的分离纯化同实施例4
5、抗氧化活性肽的氨基酸序列的测定
将印迹到PVDF膜上的肽送到上海生化蛋白质组学研究分析中心用PE公司的ABI491A氨基酸序列分析仪进行氨基酸序列测定。
实施例6
本发明产品抗氧化活力的测定，采用的方法是改进的邻苯三酚自氧化法，采用4.5mL体系对各组分进行邻苯三酚自氧化的测定。Tris-HCl(pH8.2，0.05mol/L)4.5mL，25℃水浴保温20min，对照管中加0.01mol/L HCl 10μL和4.5mL Tris-HCl，空白管中加入25℃预热的45mmol/L的邻苯三酚10μL和4.5mLTris-HCl混匀，开始计时，反应30s后，于325nm处作时间扫描，反应4min，空白最佳的自氧化速率控制为0.070±0.002A/min，取玉米蛋白水解液10μL加入到Tris-HCl缓冲液4.5mL中，同25℃预热的45mmol/L的邻苯三酚10μL混匀，30s后，于325nm处扫描，最后计算抗氧化活力。
计算：酶活力(U/mL)＝(ODA-ODB)/ODA×100％/50％×V1×N/V2
其中：V1-反应液总体积，mL
V2-测定样品的体积，mL
N-样品稀释倍数
ODA-邻苯三酚自氧化法速率
ODB-样品光密度值变化速率
经测定其抗氧化活力为236.68U/mL。
实施例7
本发明产品氨基酸序列的测定，所采用的方法是Edman降解法，测定该抗氧化活性肽的氨基酸序列结果是该肽N端5个氨基酸序列为：K-V-T-Y-H。

Claims (1)

1.一种抗氧化活性肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）发酵液的制备
以保藏号为CGMCC No.2236的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）为发酵菌种，以玉米蛋白粉为原料，将1mL种子培养液接入装有初始pH7.0的30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于34℃、200r/min条件下振荡培养32h后5000 r/min离心10min，在沸水浴中灭酶活10min，所得液体为抗氧化活性肽的混合物；
（2）DEAE-Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析
将第（1）步所得的混合物10000r/min离心15min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜，滤液进行弱阴离子交换层析（φ2.6*20cm）；起始缓冲液：25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl ，洗脱液：含1mol NaCl的25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl，流速：1.5mL/min，UV280nm处检测，测定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性部分备用；
（3）Sephadex G-25凝胶过滤层析
将DEAE-Sepharose Fast Flow的高活力样品冷冻抽干浓缩后，用洗脱液25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl溶解后进行凝胶层析脱盐（φ1.6*50），流速2.0mL/ min，UV280nm处检测，测定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性部分备用；
（4）Q-Sepharose HP强阴离子交换层析色谱
将进行过Sephadex G-25脱盐后的活性部分进行Q-Sepharose HP分离。起始缓冲液: 25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl，洗脱液:含1molNaCl的25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl，流速2.0mL/min， UV280nm处检测，测定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性且分子量＞5,000Da部分备用；
（5）Sephadex G-25凝胶层析
将Q- Sepharose HP的高活力样品冷冻抽干浓缩后，用洗脱液双蒸水溶解后10000r/min离心10min，取上清液进行凝胶层析脱盐（φ1.6*50），流速2.0mL/min，UV280nm处检测，测定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性且分子量＞5,000Da部分备用；
（6）CM-Sepharose Fast Flow弱阳离子交换层析
将进行过Sephadex G-25脱盐后的活性部分进行CM-Sepharose Fast Flow色谱分离。起始缓冲液：1mmol/L pH 3.0 Gly-HCl，洗脱液：含1mol NaCl的0.001mol/L pH 3.0 Gly-HCl，流速：2.0mL/min， UV280nm处检测，测定各管收集液的抗氧化活力，收集活性部分备用；
（7）反相色谱 
①第一次SymmetryShield TMRP 18（ 5μm）反相色谱
将进行过CM-Sepharose Fast Flow的高活力样品，进行Symmetry Shield TMRP 18反相色谱分离。洗脱液A：0.065%TFA ，2%乙腈；洗脱液B：0.05%TFA，80%乙腈；流速：1.0mL/min，UV280nm处检测。测定各管收集液的抗氧化活力，收集活性部分进行第二次SymmetryShield TMRP 18反相色谱分离；
②第二次SymmetryShield TMRP 18 （5μm）反相色谱
将第一次进行SymmetryShield TMRP 18反相色谱分离的高活力部分冷冻抽干后进行第二次SymmetryShield TMRP 18分离；洗脱液A：0.065%TFA，8%乙腈；洗脱液B：0.05%TFA，60%乙腈；流速：1.0mL/min，UV280nm处检测，测定各管收集液的抗氧化活力，收集活性部分。
CN2008100642968A 2008-04-09 2008-04-09 一种抗氧化活性肽及其制备方法 Expired - Fee Related CN101284872B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2008100642968A CN101284872B (zh) 2008-04-09 2008-04-09 一种抗氧化活性肽及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2008100642968A CN101284872B (zh) 2008-04-09 2008-04-09 一种抗氧化活性肽及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101284872A CN101284872A (zh) 2008-10-15
CN101284872B true CN101284872B (zh) 2012-06-06

Family

ID=40057298

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2008100642968A Expired - Fee Related CN101284872B (zh) 2008-04-09 2008-04-09 一种抗氧化活性肽及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101284872B (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101904406B (zh) * 2010-07-02 2012-07-25 山西大学 一种葵花籽多肽的制备方法和用途
CN103798911B (zh) * 2012-11-15 2015-10-28 浙江海洋学院 一种抗氧化型黄鲫发酵液的制备方法
CN104650176A (zh) * 2015-03-04 2015-05-27 南京农业大学 一种提取抗氧化性多肽的方法
CN108456243B (zh) * 2015-09-09 2020-08-04 齐齐哈尔大学 玉米抗氧化活性肽及其制备方法
CN107574213A (zh) * 2016-11-21 2018-01-12 广西大学 一种利用纳豆菌发酵制备玉米肽的方法
CN108623654B (zh) * 2017-03-24 2022-03-04 中粮营养健康研究院有限公司 一种玉米活性肽及其制备方法和应用
CN107217018B (zh) * 2017-06-19 2019-10-25 武汉轻工大学 高抗性枯草芽孢杆菌及其应用
CN108047313B (zh) * 2017-12-29 2020-09-15 中国农业大学 鸡血球抗氧化肽及其发酵制备方法
CN118085025A (zh) * 2022-08-18 2024-05-28 齐齐哈尔大学 一种玉米活性肽及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHENG,X.等.Production of hydrolysate with antioxidative activity by enzymatic hydrolysis of extruded corn gluten.《Appl Microbiol Biotechnol》.2006,第73卷第763－770页. *
张晓峰等.玉米短肽的制备及其抗氧化活性的研究.《食品科学》.2005,第26卷(第9期),第33-35页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101284872A (zh) 2008-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101284872B (zh) 一种抗氧化活性肽及其制备方法
CN102071162B (zh) 枯草芽孢杆菌lfb112、其产生的细菌素及应用
CN101294188B (zh) 乳铁蛋白抗菌肽及其制备方法与它们的用途
CN100999752B (zh) 一种源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物及其制备方法和用途
CN107602663B (zh) 一种苦荞麦活性肽及其应用
CN101418037A (zh) 一种牦牛骨肽及其制备方法
CN103232526A (zh) 一种生物活性多肽lplp及其制备和应用
CN108823261A (zh) 一种超低分子量铁皮石斛多糖及其制备与应用
CN101669571A (zh) 乳酸菌混菌发酵结合酶解法生产蛋白饲料源小肽工艺
CN111961617A (zh) 一株高产免疫多糖和细菌素的多效枯草芽孢杆菌及应用
CN110218688A (zh) 海内氏芽孢杆菌ly-23、菌剂及其应用和应用其的产品
CN105175518A (zh) 凝结芽孢杆菌fm603产生的细菌素及其制备方法
CN103432158A (zh) 一种防治猪腹泻的多糖复合剂及用途
CN104610430A (zh) 利用灵芝蛋白制备的抗氧化多肽及其制备方法
JP5449834B2 (ja) リポ多糖、イネ発酵エキス及びイネ発酵エキス配合物
CN100387704C (zh) 可高产糖肽复合物的灵芝真菌及其诱变选育方法和用途
CN101962402B (zh) 一种黄芪糖蛋白及其制备方法和用途
CN104231106B (zh) 一种类芽孢杆菌的胞外多糖、制备方法及其应用
CN104311645A (zh) 具有抑菌活性的螺旋藻多肽p1及其应用
CN101301316A (zh) 一种含乳酸菌发酵物的复方制剂及其制备方法和应用
CN101679984B (zh) 具有抗微生物活性的RumC肽
KR100855039B1 (ko) 지에이비에이가 함유된 계란의 생산방법 및 이 방법으로생산된 계란
CN110106121A (zh) 一种产胞外多糖的植物乳杆菌
CN103450354B (zh) 一种黄芪糖蛋白及其制备方法和用途
CN105483201A (zh) 乳清抗氧化肽的发酵制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120606

Termination date: 20150409

EXPY Termination of patent right or utility model