CN104650176A

CN104650176A - 一种提取抗氧化性多肽的方法

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Publication number: CN104650176A
Application number: CN201510097006.XA
Authority: CN
Inventors: 张万刚; 邢路娟; 周光宏; 葛庆丰
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2015-03-04
Filing date: 2015-03-04
Publication date: 2015-05-27

Abstract

一种提取抗氧化性多肽的方法。提供一种发酵肉制品中抗氧化活性多肽的提取方法，具体提取步骤：取发酵肉制品的瘦肉，去除其中的肌腱和肌膜，切碎斩匀为细碎颗粒状肉粒，称量1份所述肉粒，投入到浸提液中，匀浆后得匀浆液；将所述匀浆液静置后进行第一次离心处理，然后过滤，得澄清上清液，往上清液中加入沉淀液，静置后进行第二次离心处理，得到二次上清液；将所述二次上清液过滤，旋转蒸发器浓缩，经冷冻干燥后得粗肽粉；对所述粗肽粉进行分离纯化，制得粉末态抗氧化活性肽。本发明操作简便，避免了采用酶解方法提取时多肽的降解，提取率高，所得的抗氧化多肽活性强，是一种可操作性强，应用价值高的天然抗氧化剂的提取方法。

Description

一种提取抗氧化性多肽的方法

技术领域

本发明涉及天然抗氧化剂的提取方法，尤其涉及以发酵肉制品为原料提取抗氧化性多肽的方法及其鉴定方法。

背景技术

近年来随着对天然抗氧化剂的研究深入，从植物、动物、微生物等原料中酶法降解、分离提取抗氧化多肽的报道也逐渐增多。与人工合成的抗氧化剂如BHT、BHA等相比，这些非人工合成的多肽具有分子量小、结构简单、活性强、易于吸收及无毒害等优点。目前，从植物中提取抗氧化肽的研究多见于大豆、豌豆、大米等原料中；从动物、微生物中提取抗氧化肽的研究多见于奶、鱼、肉、微生物发酵液等原料中。

目前，从动植物体提取多肽主要用酶解法，酶解控制困难，容易使多肽分裂降解,形成小分子肽，降低了抗氧化效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于避免多肽提取时降解，保持高抗氧化活性，提高提取精准度。

为解决上述问题，本发明提供一种发酵肉制品中抗氧化活性多肽的提取方法，具体提取步骤：

取发酵肉制品的瘦肉，去除其中的肌腱和肌膜，切碎斩匀为细碎颗粒状肉粒，称量1份所述肉粒，投入到浸提液中，匀浆后得匀浆液；

将所述匀浆液静置后进行第一次离心处理，然后过滤，得澄清上清液，往上清液中加入沉淀液，静置后进行第二次离心处理，得到二次上清液；

将所述二次上清液过滤，旋转蒸发器浓缩，经冷冻干燥后得粗肽粉；

对所述粗肽粉进行分离纯化，制得粉末态抗氧化活性肽。

所述步骤1）中匀浆条件为：20000-24000r/min^-，匀浆2-5次，每次8-15s，中间间歇8-15s。

所述步骤1）中浸提液为磷酸盐缓冲液或盐酸溶液，磷酸盐缓冲液浓度为0.02mol/L^-，盐酸溶液浓度为0.01 mol/L；所述浸提液的体积量为肉粒的3-4倍。

所述步骤2）中第一次离心处理条件为：所述匀浆液在4℃环境中静置15-25分钟后保持4℃离心，所述第二次离心处理条件为：静置时间为10-15小时。

所述步骤2）中沉淀液为乙醇溶液或三氟乙酸溶液，乙醇溶液浓度为40%，三氟乙酸溶液浓度为0.1%，所述沉淀液的体积量为上清液的3-4倍。

所述步骤3）中过滤采用0.45 μm滤膜过滤。

所述步骤4）中分离纯化依次采用凝胶层析法、阴离子交换柱层析法和反相高效液相色谱法。

所述凝胶层析法用超纯水平衡凝胶层析柱，填料为葡聚糖凝胶树脂SephadexG-25，上样量为2mL,洗脱速度为2mL/min,检测波长为280nm。

所述阴离子交换柱层析用磷酸盐缓冲液平衡层析柱，所述磷酸盐缓冲液浓度为0.02mol/L，pH值为8.0，填料为阴离子交换树脂，上样量为5 mL，以A液：磷酸盐缓冲液,B液：NaCl-磷酸盐缓冲液洗脱，所述NaCl-磷酸盐缓冲液浓度为1 mol/mL，洗脱速度为2 mL/min，检测波长为280nm ，0-100%B梯度洗脱。

所述反相高效液相色谱法用A：乙腈和B：甲酸0.1%作为洗脱液，流速0.3 mL/min，上样量为 0.5mL，检测波长为280nm。

本发明的有益效果是：本发明操作简便，避免了采用酶解方法提取时多肽的降解，提取率高，所得的抗氧化多肽活性强，是一种可操作性强，应用价值高的天然抗氧化剂的提取方法；本发明也为肉制品中活性多肽的基础研究及相关产品的开发应用提供了依据。

附图说明

图1 G-25凝胶层析对粗肽纯化的效果，

图2 不同峰段多肽对自由基的清除效果，

图3 阴离子交换柱层析对C片段多肽的分离效果，

图4 阴离子交换柱所得不同峰段多肽对自由基的清除效果，

图5 RP-HPLC 对C5片段多肽的分离效果。

具体实施方式

抗氧化多肽的制备方法如下：

1、粗肽的提取

粗肽的提取工艺为：

取发酵肉制品的瘦肉，去除其中的肌腱和肌膜，切碎斩匀为细碎颗粒状肉粒，称量1份所述肉粒，投入3-4倍体积量的浸提液中，20000-24000 r/min-，匀浆2-5次，每次8-15 s，中间间歇8-15 s，得匀浆液；将匀浆液在4℃环境中静置15-25分钟后进行第一次离心处理，然后过滤，得澄清上清液，往上清液中加入3-4倍体积量的沉淀液，静置10-15小时后进行第二次离心处理，然后上清液采用0.45 μm滤膜过滤，旋转蒸发器浓缩，经冷冻干燥后得粗肽粉。

2、抗氧化活性肽的分离、提纯

通过对凝胶层析法分离结果中抗氧化效果最强的片段（即C片段）进行阴离子交换柱层析，再对抗氧化高的峰段进行高效液相色谱分离。

3、抗氧化活性的检测方法

i DPPH自由基活性测定

DPPH自由基是目前检测抗氧化活性应用最多的自由基之一，测定对DPPH自由基的清除率，是评价天然抗氧化活性的一种快速、简便、灵敏的方法。方法如下：

a、用去离子水将粗肽粉配制成质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mgmL^-1-的溶液；

b、取1 mL粗肽液与1 mL DPPH自由基溶液（0.2 mmolL^-1, 95 %乙醇溶解），充分混匀后于室温下避光放置30 min；

c、517 nm波长处检测混合溶液的吸光值记为A_样品, 1 mL乙醇（95%）与1 mL去离子水混合为空白对照，吸光值记为A₀；1 mL DPPH自由基溶液与1 mL乙醇（95%）混合作为对照组，吸光值记为A_对照；

d、同时，配制相同质量浓度梯度的GSH作为对照，按照上述方法测定其对DPPH自由基的清除情况；

e、粗肽对DPPH自由基清除率的计算公式：

DPPH自由基清除率% = [1-（A_样品- A₀）/(A_对照- A₀)] ×100

ii 超氧阴离子自由基活性测定

超氧自由基是氧气进入生物体接受电子后最先形成的自由基，它可以经过一系列反应生成其它的氧离子自由基，进而对生物体产生损伤。方法如下：

a、取质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mgmL^-1-的粗肽液各1.5 mL；

b、将0.5 mL NBT（300 μmolL^-1）、0.3 mL NADH（468 μmolL^-1）及0.5 mL PMS（60 μmolL^-1）依次加入1.5 mL粗肽液中，混匀后置于25 ℃水浴5 min；

c、取出混合液后在560 nm波长处检测其吸光值记为A_样品，将Tris-HCl缓冲溶液代替粗肽液作为空白对照记为A₀；

d、同时，配制相同质量浓度梯度的GSH作为对照，按照上述方法测定其对超氧自由基（O₂ ^-·）的清除情况；

e、计算粗肽液对O₂ ^-·的清除效果：

O₂ ^-·清除率% =（1- A_样品/ A₀）×100

f、粗肽液、NBT、NADH、PMS均用Tris-HCl缓冲溶液（50 mmol/L^-, pH8.0）配制。

为了进一步了解本发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，但本发明不限于以

下实施例，实施例中的发酵肉制品选择宣威火腿产品。提取、分离过程所用水均为去离子水。

实施例 1：粗肽的制备

a、取成熟16个月的宣威火腿产品后腿肉，去除瘦肉中肌腱及肌膜，切碎斩匀后准确称取30 g，加入90 mL磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH7.2）；22000 r/min^-，匀浆3次，每次10 s，中间间歇10 s。

b、取火腿匀浆液放入4 ℃，静置20 min后，4 ℃、12000 g离心20 min；取上清液使用滤纸过滤，上清液加入3倍体积的40%的乙醇溶液(V:V)，4 ℃，静置12 h后，4 ℃、12000 g离心10 min。

c、取上清液于0.45 μm滤膜过滤,旋转蒸发器浓缩，经冷冻干燥后即为粗肽粉。

d、测定粗肽粉的抗氧化活性。

实施例2：粗肽的制备

a、取成熟16个月的宣威火腿产品后腿肉，去除瘦肉中肌腱及肌膜，切碎斩匀后准确称取30 g，加入120 mL 浓度为0.01 mol/L的HCl；20000 r/min，匀浆5次，每次8 s，中间间歇8s。

b、取火腿匀浆液放入4 ℃，静置20 min后，4 ℃、12000 g离心20 min；取上清液使用滤纸过滤，上清液加入4倍体积的40%乙醇溶液(V:V)，4 ℃，静置10h后，4 ℃、12000 g离心10 min。

d、测定粗肽粉的抗氧化活性。

实施例3：粗肽的制备

a、取成熟16个月的宣威火腿产品后腿肉，去除瘦肉中肌腱及肌膜，切碎斩匀后准确称取30 g，加入90 mL浓度为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液，24000 r/min^-，匀浆2次，每次15 s，中间间歇15 s。

b、取火腿匀浆液放入4 ℃，静置20 min后，4 ℃、12000 g离心20 min；取上清液使用滤纸过滤，上清液加入3倍体积浓度为0.1%的三氟乙酸(TCA，质量浓度)，4 ℃，静置15h后，4 ℃、12000 g离心10 min。

d、测定粗肽粉的抗氧化活性。

实施例4：抗氧化活性肽的分离、提纯

用超纯水平衡凝胶层析柱，流速为3 mL/min。将实施例1中提取的宣威火腿粗肽液用超纯水溶解，并配置成10 mg/mL的溶液，上样量为2mL, 洗脱速度为2mL/min, 检测器设置280nm波长处，2 mL/管收集，并将处于同一峰值处的样品汇集到同一管内，-20℃冷冻，后干燥得到粉末状分离物。测定分离物的抗氧化活性。

将得到的分离物进行阴离子交换柱层析，用磷酸盐缓冲液（PBS，0.02 mol/L, pH 8.0）平衡层析柱，填料为阴离子交换树脂，流速为5 mL/min。将以上干燥得到的部分肽段样品用PBS配制成10 mg/mL的溶液，上样量为5 mL，A液：PBS（0.02 mol/L，pH8.0）B液：NaCl-PBS(1 mol/mL), 洗脱速度为2 mL/min，检测器设置280 nm波长处，0-100%B梯度洗脱，2 mL/管收集，并将处于同一峰值处的样品汇集到同一管内，-20℃冷冻，后干燥得到粉末状分离物。测定分离物的抗氧化活性。

将以上得到的活性最强的分离物进行反相高效液相色谱分离，以A：乙腈和B：甲酸0.1%（质量浓度）作为洗脱液，洗脱条件为0-5min，100% A；5-20min，30%-80% A；20-25min，100% B。流速0.3 mL/min，进样量为 0.5mL。检测器设置280 nm波长处。并将处于同一峰值处的样品汇集到同一收集管内，-20℃冷冻，后干燥得到粉末状分离物。

结果分析

1、粗肽提取情况

通过测定粗提物中多肽的含量并计算多肽提取率可得，实施例2可提取的粗肽物质最多，肽类物质的提取率高于其他两种方法。实施例1所得的粗肽物质最少，肽类物质提取量也最小，

表1中a~c不同字母代表三种方法对粗肽提取结果的的差异性。

2、DPPH自由基活性检测结果

由表2可知，三种方法提取的粗肽均表现出较好的DPPH自由基清除能力，且清除率随着质量浓度的增加而增强。相比之下，实施例1提取粗肽对DPPH自由基的清除率最高，当质量浓度为5.0 mg/mL时，实施例1所得粗肽对DPPH自由基的清除率为64.71%，而此浓度下，实施例2和实施例3所得粗肽的DPPH自由基清除率为26.68%和44.10%，当质量浓度为5mg/mL时，实施例1 的DPPH自由基清除率高于GSH。说明实施例1对提取抗氧化活性粗肽具有良好的效果。

表2 不同提取方法所得粗肽对DPPH自由基的清除效果

a~d不同字母代表同种方法不同浓度粗肽对DPPH自由基清除效果的差异性，

w~z不同字母代表相同浓度下不同提取方法提取的粗肽对DPPH自由基清除效果的差异性。

3、超氧自由基活性检测结果

由表3可知，随着质量浓度的增大，三个实施例提取的粗肽对超氧阴离子自由基的清除效果均相应增强；质量浓度为0.1 mg/mL的实施例1所得粗肽对超氧阴离子的清除率为25.15%，是实施例3所得粗肽清除率的6.2倍。同等质量浓度下，实施例1所得粗肽对超氧阴离子自由基（O₂ ^-·）的清除效果显著高于GSH和其他两种提取方法。

表3 不同提取方法所得粗肽对超氧自由基的清除效果

a~d不同字母代表同种方法不同浓度粗肽对超氧自由基清除效果的差异性，

w~z不同字母代表相同浓度下不同提取方法提取的粗肽对超氧自由基清除效果的差异性。

4、抗氧化活性多肽的分离结果

（1）凝胶层析法分离

经过G-25凝胶层析色谱柱的分离，可得到如附图1所示的不同峰段，根据G-25对物质分离效果的原理可知，保留时间越长的峰段所代表的物质具有更小的分子量，结合附图2中各峰段多肽片段对不同自由基的清除效果可知：A片段多肽对超氧自由基的清除效果最强，C片段多肽对DPPH 自由基和O₂ ^-·自由基的清除效果高于其他峰段。综合各片段对自由基清除的结果可判断C片段多肽的总体抗氧化效果最强，因此选择C片段作为进一步纯化的物质，以此得到活性最强的抗氧化多肽。

（2）阴离子交换柱层析结果

根据本发明的结果(如附图3)，抗氧化活性肽段C经阴离子交换柱而分离成五部分，其中第一部分的峰值最高，峰面积最大，结合各片段对自由基清除情况可知C5片段具有较高的抗氧化活性(见附图4),当质量浓度为1mg/mL时，C5片段对DPPH自由基的清除率为82.14%，对O₂ ^-·自由基的清除率为54.95%，显著高于其他峰段的自由基清除率。故将C5片段的多肽作为抗氧化活性多肽的主要分离部分。

（3）RP-HPLC分离效果

C5片段经C₁₈柱分离结果如附图5 所示，根据物质极性的不同，C5片段主要分离出7个峰段，其中第3、5、6、7峰段的峰值较高，其峰面积占总峰面积的82.7%。根据洗脱液和洗脱时间的变化，可推测第7峰段的物质具有较强的疏水性，进而可判断该峰段的多肽含有较多的疏水性氨基酸，将不同峰段多肽分别收集浓缩后检测抗氧化活性。经LC-MS/MS检测所得，活性最高的第7峰段由D-L-E-E四肽组成，根据查阅文献可知，Leu，Glu是发挥抗氧化活性的主要基团，从而找到了宣威火腿中起主要抗氧化活性的片段。

对于领域技术人员来说，本发明不仅限于宣威火腿,也适用于其他发酵肉制品抗氧化多肽的提取。

Claims

1.一种提取抗氧化性多肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）、取发酵肉制品的瘦肉，去除其中的肌腱和肌膜，切碎斩匀为细碎颗粒状肉粒，称量1份所述肉粒，投入到浸提液中，匀浆后得匀浆液；

2）、将所述匀浆液静置后进行第一次离心处理，然后过滤，得澄清上清液，往上清液中加入沉淀液，静置后进行第二次离心处理，得到二次上清液；

3）、将所述二次上清液过滤，旋转蒸发器浓缩，经冷冻干燥后得粗肽粉；

4）、对所述粗肽粉进行分离纯化，制得粉末态抗氧化活性肽。

2.根据权利要求1 所述的一种提取抗氧化性多肽的方法，其特征在于，所述步骤1）中匀浆条件为：20000-24000r/min^-，匀浆2-5次，每次8-15s，中间间歇8-15s。

3.根据权利要求1 所述的一种提取抗氧化性多肽的方法，其特征在于，所述步骤1）中浸提液为磷酸盐缓冲液或盐酸溶液，磷酸盐缓冲液浓度为0.02mol/L^-，盐酸溶液浓度为0.01 mol/L；所述浸提液的体积量为肉粒的3-4倍。

4.根据权利要求1 所述的一种提取抗氧化性多肽的方法，其特征在于，所述步骤2）中第一次离心处理条件为：所述匀浆液在4℃环境中静置15-25分钟后保持4℃离心，所述第二次离心处理条件为：静置时间为10-15小时。

5.根据权利要求1 所述的一种提取抗氧化性多肽的方法，其特征在于，所述步骤2）中沉淀液为乙醇溶液或三氟乙酸溶液，乙醇溶液浓度为40%，三氟乙酸溶液浓度为0.1%，所述沉淀液的体积量为上清液的3-4倍。

6.根据权利要求1 所述的一种提取抗氧化性多肽的方法，其特征在于，所述步骤3）中过滤采用0.45 μm滤膜过滤。

7.根据权利要求1 所述的一种提取抗氧化性多肽的方法，其特征在于，所述步骤4）中分离纯化依次采用凝胶层析法、阴离子交换柱层析法和反相高效液相色谱法。

8.根据权利要求7所述的一种提取抗氧化性多肽的方法，其特征在于，所述凝胶层析法用超纯水平衡凝胶层析柱，填料为葡聚糖凝胶树脂SephadexG-25，上样量为2mL,洗脱速度为2mL/min,检测波长为280nm。

9.根据权利要求7所述的一种提取抗氧化性多肽的方法，其特征在于，所述阴离子交换柱层析用磷酸盐缓冲液,平衡层析柱，所述磷酸盐缓冲液浓度为0.02mol/L，pH值为8.0，填料为阴离子交换树脂，上样量为5mL，以A液：磷酸盐缓冲液, B液：NaCl-磷酸盐缓冲液洗脱，所述NaCl-磷酸盐缓冲液浓度为1mol/mL，洗脱速度为2mL/min，检测波长为280nm ，0-100%B梯度洗脱。

10.根据权利要求7所述的一种提取抗氧化性多肽的方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱法用A：乙腈和B：甲酸0.1%作为洗脱液，流速0.3mL/min，上样量为0.5mL，检测波长为280nm。