CN105483201A - 乳清抗氧化肽的发酵制备方法 - Google Patents

乳清抗氧化肽的发酵制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了乳清抗氧化肽的发酵制备方法，以脱盐乳清粉为原料经菌种发酵得到乳清蛋白抗氧化肽，其中，菌种由乳双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按体积比为1:1:1混合。应用该方法制备的乳清抗氧化肽是以脱盐乳清粉经微生物发酵得到乳清蛋白抗氧化肽，其分子量在500～800D，肽含量不低于2.1g/L，纯度不低于94％，自由基清除率不低于41％，具有清除自由基效果好、活性肽分子量小、易被肠胃吸收。不仅可作为添加物添加到食品和化妆品中，还可以做成不同类型的保健食品。

Description

乳清抗氧化肽的发酵制备方法
技术领域
本发明涉及生物活性肽技术领域。更具体地说，本发明涉及一种乳清抗氧化肽的发酵制备方法。
背景技术
乳清蛋白被称为蛋白之王，是公认的一种高营养价值的蛋白质，一般而言,必需氨基酸种类和含量齐全并能提供人体需要的蛋白质可以称为优质蛋白质,也叫完全蛋白质。乳清蛋白粉属于完全蛋白质,也是动物性蛋白,且氨基酸配比合理,接近人体的需求比例,其生物利用价值比其它高质量的膳食蛋白如蛋、牛肉或大豆都要高,是我们补充蛋白质的最佳选择。
乳清抗氧化肽作为乳清蛋白主要活性物质，因其能够清除自由基，抑制脂质氧化进而保障机体健康而受到广泛关注。乳清蛋白肽可以用酶解和微生物水解的方法获得，酶解的方法比较普遍,张和平等人采用胰蛋白酶水解热敏性乳清蛋白，获得热稳定好、易溶解的多肽,并以此开发出稳定性良好的乳清饮料。谢继志用酵母菌发酵乳清酒饮料，并确定了最佳的发酵条件。包怡红,张兰威作了乳清多肽方面的研究,首先采用酶解的方法确定了碱性蛋白酶为最佳的水解酶,并且用混合乳酸菌对乳清蛋白水解底物进行发酵，制备乳清饮料。中国农业大学李朝慧对乳清蛋白进行酶解,从中制备出了ACE抑制肽。
但是也有研究发现许多乳酸菌,包括瑞士乳杆菌，保加利亚乳杆菌等能水解牛乳蛋白产生活性肽。据资料显示，2005年，V.Virtanen等做了乳酸菌发酵乳清制备活性肽的研究，并对水解产物的抗氧化性、氨基酸组成、分子量作了初步研究。我国利用乳清蛋白为原料制备生物活性肽采用的方法多为酶解，仅有郭宇星做了微生物发酵制备ACE抑制肽的研究。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供乳清抗氧化肽的发酵制备方法，应用该方法制备的乳清抗氧化肽是以脱盐乳清粉经微生物发酵得到乳清蛋白抗氧化肽，清除自由基效果好、活性肽分子量小、易被肠胃吸收。不仅可作为添加物添加到食品和化妆品中，还可以做成不同类型的保健食品。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，以脱盐乳清粉为原料经菌种发酵得到乳清蛋白抗氧化肽，其中，菌种由乳双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按体积比为1:1:1混合。
优选的是，其中，将脱盐乳清粉融入蒸馏水中，制备质量浓度为13.4g/L的脱盐乳清粉溶液，用于接种菌种发酵制备乳清蛋白抗氧化肽。
优选的是，其中，发酵条件为：发酵温度：37～47℃，初始pH值：6.0～6.5，菌种接种量占脱盐乳清粉溶液体积的3～5％，发酵时间：20-24h。
优选的是，其中，发酵条件为：发酵温度：37～45℃，初始pH值：6.5，菌种接种量占脱盐乳清粉溶液体积的5％，发酵时间：24h。
优选的是，其中，还包括以下步骤：
5.1)菌种活化：菌种接入MRS液体培养基，37℃静止培养36h活化；
5.2)发酵：制备所述脱盐乳清粉溶液，将其在100-120℃条件下灭菌20min，冷却后在超净台中接入适量活化的菌种，置于培养箱中静止发酵获得发酵液；
5.3)调节发酵液pH至7.5，将发酵液在5000-8000r/min离心25-30min后，取上清液，冷藏保存备用；
5.4)超滤：将所述上清液再经2500-3500rpm离心15-20min，取第二上清液；应用规格为Φ1.0×100cm或Φ1.0×150cm的层析柱，装入已处理好的大孔吸附树脂HPD400A或HPD450A，对第二上清液进行真空抽滤，去除沉淀物；再用截留分子量为800D-1000D和100D-200D超滤膜依次对经真空超滤后的所述第二上清液进行除杂和除盐，获得滤液，备用；
5.5)纯化：将所述上清液过交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱，收集洗脱液，之后，应用截留分子量为6000D的超滤膜对洗脱液进行超滤浓缩除盐，真空干燥6h-12h得乳清抗氧化肽。
优选的是，其中，所述交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱经预处理后使用，预处理的具体方法为：将交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱用去离子水以0.7-1mL/min流速洗柱1.5-2h，待基线走平，备用。
优选的是，其中，所述洗脱液为质量分数为55％-60％乙醇溶液，应用洗脱液洗柱约5-6h，洗脱至基线走平，用分布收集器进行定量收集。
优选的是，其中，所述MRS培养基组成：酵母膏0.5％、酪蛋白1％、KH2PO40.1％，MgSO40.02％、牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％、NaCl0.5％、葡萄糖1％、CH3COONa0.28％、C6H14N2O70.03％、pH为6.2-6.4。
优选的是，其中，所获得的乳清抗氧化肽的分子量在500～800D，肽含量不低于2.1g/L，纯度不低于94％，自由基清除率不低于41％。
本发明至少包括以下有益效果：
1.本发明方法为微生物发酵法制备乳清抗氧化多肽，该多肽是一种天然抗氧化剂，成本低廉，可广泛应用到食品、医疗、化妆品等领域，对它的研究开发具有很好的经济价值和应用潜力；
2.本发明采用高效层析的方法去除共存的其他蛋白，在分离纯化的同时去除其他杂志，保证了较高的纯度和肽含量，降低了成本，有利于生产的进一步进行；
3.应用本发明方法制备的乳清抗氧化多肽中分子量450D的乳清抗氧化肽占到85％以上，含量不低于2.1g/L，纯度不低于94％，自由基(DPPH)清除率不低于41％，分散均匀，无杂质，易于人体直接吸收利用。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的所述乳清抗氧化肽的发酵制备方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
如图1所示，本发明提供一种乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，以脱盐乳清粉为原料经菌种发酵得到乳清蛋白抗氧化肽，其中，菌种由乳双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按体积比为1:1:1混合。
一个优选方案是，将脱盐乳清粉融入蒸馏水中，制备质量浓度为13.4g/L的脱盐乳清粉溶液，用于接种菌种发酵制备乳清蛋白抗氧化肽。
一个优选方案是，发酵条件为：发酵温度：37～47℃，初始pH值：6.0～6.5，菌种接种量占脱盐乳清粉溶液体积的3～5％，发酵时间：20-24h。
一个优选方案是，发酵条件为：发酵温度：37～45℃，初始pH值：6.5，菌种接种量占脱盐乳清粉溶液体积的5％，发酵时间：24h。
一个优选方案是，还包括以下步骤：
5.1)菌种活化：菌种接入MRS液体培养基，37℃静止培养36h活化；
5.2)发酵：制备所述脱盐乳清粉溶液，将其在100-120℃条件下灭菌20min，冷却后在超净台中接入适量活化的菌种，置于培养箱中静止发酵获得发酵液；
5.3)调节发酵液pH至7.5，将发酵液在5000-8000r/min离心25-30min后，取上清液，冷藏保存备用；
5.4)超滤：将所述上清液再经2500-3000rpm离心15-20min，取第二上清液，应用规格为Φ1.0×100cm或Φ1.0×150cm的层析柱，装入已处理好的大孔吸附树脂HPD400A或HPD450A，对第二上清液进行真空抽滤，去除沉淀物；再用截留分子量为800D-1000D和100D-200D超滤膜依次对经真空超滤后的所述第二上清液进行除杂和除盐，获得滤液，备用；
5.5)纯化：将所述上清液过交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱，收集洗脱液，之后，应用截留分子量为6000D的超滤膜对洗脱液进行超滤浓缩除盐，真空干燥6h-12h得乳清抗氧化肽。
一个优选方案是，所述交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱经预处理后使用，预处理的具体方法为：将交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱用去离子水以0.7-1mL/min流速洗柱1.5-2h，待基线走平，备用。
一个优选方案是，所述洗脱液为质量分数为55％-60％乙醇溶液，应用洗脱液洗柱约5-6h，洗脱至基线走平，用分布收集器进行定量收集。
一个优选方案是，所述MRS培养基组成：酵母膏0.5％、酪蛋白1％、KH2PO40.1％，MgSO40.02％、牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％、NaCl0.5％、葡萄糖1％、CH3COONa0.28％、C6H14N2O70.03％、pH为6.2-6.4。
一个优选方案是，所获得的乳清抗氧化肽的分子量在500～800D，肽含量不低于2.1g/L，纯度不低于94％，自由基清除率不低于41％。
应用上述方法生产乳清抗氧化肽，具体为：
实施例1
浓缩乳清粉加蒸馏水按，120℃条件下灭菌20min，冷却后在超净台中接入适量菌种，置于培养箱中静止发酵。发酵温度：37℃，初始pH值：6.5，接种量：5％，发酵时间：24h，发酵结束后，调节发酵液pH至7.5，8000r/min离心30min后，取上清液冷藏保存备用。
取适量大孔吸附树脂(型号：HPD400(A))，用95％乙醇浸泡24h，充分溶胀后用蒸馏水洗净备用，将乳清蛋白酶解物以3000rpm离心20min，取上清液；取一支层析柱(Φ1.0×100cm)，装入已处理好的HPD400(A)的大孔吸附树脂对上清液进行真空抽滤，去除沉淀物。再用截留分子量为100D和1000D超滤膜进行除杂和除盐，滤液待用。
取交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱，用去离子水以1mL/min流速洗柱约2h，待基线走平，把处理好的乳清蛋白酶解液加入层析柱中，再以质量分数为60％乙醇溶液洗柱约6h，洗脱至基线走平，最佳收集时间为7.5h，用截留分子量为6000D的超滤膜对洗脱液进行超滤浓缩除盐。真空干燥6h得乳清康氧化肽。检测乳清抗氧化肽分子量450D的乳清抗氧化肽占到84％，肽含量为2.564g/L，纯度为94.1％，清除率为42.37％。
其中，应用采用分光光度法检测各管中TBARS值，比较各个时间段下的清除DHHP自由基和纯度，确定最佳的收集时间；
收集抗氧化能力较高的解析液，用截留分子量为6000D的超滤膜对洗脱液进行超滤浓缩除盐。真空干燥6h以上得乳清抗氧化肽；
在波长325nm处每30s测定一次吸光值A，计算线性范围内每分钟A的增值，此即为邻苯三酚的自氧化速率A0；
乳清抗氧化肽活性测定按上述操作，加入邻苯三酚前，先加入一定量样液，并减少同体积双蒸水,其它操作均与上述相同，所测吸光度为Ai。
实施例2
浓缩乳清粉加蒸馏水按，120℃条件下灭菌20min，冷却后在超净台中接入适量菌种，置于培养箱中静止发酵。发酵温度：40℃，初始pH值：6.5，接种量：4％，发酵时间：22h，发酵结束后，调节发酵液pH至7.5，8000r/min离心30min后，取上清液冷藏保存备用。
取适量大孔吸附树脂(型号：HPD450(A))，用95％乙醇浸泡24h，充分溶胀后用蒸馏水洗净备用，将乳清蛋白酶解物以3000rpm离心20min，取上清液；取一支层析柱(Φ1.0×150cm)，装入已处理好的HPD450(A)的大孔吸附树脂，进行真空抽滤，去除沉淀物。再用截留分子量为100D和800D超滤膜进行除杂和除盐，滤液待用。
取交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱，用去离子水以1mL/min流速洗柱约2h，待基线走平，把处理好的乳清蛋白酶解液加入层析柱中，再以质量分数为60％乙醇溶液洗柱约6h，洗脱至基线走平，最佳收集时间为7.5h，用截留分子量为6000D的超滤膜对洗脱液进行超滤浓缩除盐。真空干燥6h得乳清康氧化肽。检测乳清抗氧化肽分子量450D的乳清抗氧化肽占到82％，肽含量为2.503g/L，纯度为94.5％，自由基清除率为42.19％。
实施例3
浓缩乳清粉加蒸馏水按，120℃条件下灭菌20min，冷却后在超净台中接入适量菌种，置于培养箱中静止发酵。发酵温度：45℃，初始pH值：6.3，接种量：3％，发酵时间：20h，发酵结束后，调节发酵液pH至7.5，8000r/min离心30min后，取上清液冷藏保存备用。
取适量大孔吸附树脂(型号：HPD450(A))，用95％乙醇浸泡24h，充分溶胀后用蒸馏水洗净备用，将乳清蛋白酶解物以3000rpm离心20min，取上清液；取一支层析柱(Φ1.0×150cm)，装入已处理好的HPD450(A)的大孔吸附树脂，进行真空抽滤，去除沉淀物。再用截留分子量为100D和800D的超滤膜进行除杂和除盐，滤液待用。
取交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱，用去离子水以1mL/min流速洗柱约2h，待基线走平，把处理好的乳清蛋白酶解液加入层析柱中，再以质量分数为60％乙醇溶液洗柱约6h，洗脱至基线走平，最佳收集时间为7.5h，用截留分子量为6000D的超滤膜对洗脱液进行超滤浓缩除盐。真空干燥6h得乳清康氧化肽。
检测乳清抗氧化肽分子量450D的乳清抗氧化肽占到85％，肽含量为2.591g/L，纯度为94.9％，自由基清除率为43.01％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，以脱盐乳清粉为原料经菌种发酵得到乳清蛋白抗氧化肽，其中，菌种由乳双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按体积比为1:1:1混合。
2.如权利要求1所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，将脱盐乳清粉融入蒸馏水中，制备质量浓度为13.4g/L的脱盐乳清粉溶液，用于接种菌种发酵制备乳清蛋白抗氧化肽。
3.如权利要求1所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，发酵条件为：发酵温度：37～47℃，初始pH值：6.0～6.5，菌种接种量占脱盐乳清粉溶液体积的3～5％，发酵时间：20-24h。
4.如权利要求1所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，发酵条件为：发酵温度：37～45℃，初始pH值：6.5，菌种接种量占脱盐乳清粉溶液体积的5％，发酵时间：20-24h。
5.如权利要求1所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
5.1)菌种活化：菌种接入MRS液体培养基，37℃静止培养36h活化；
5.2)发酵：制备所述脱盐乳清粉溶液，将其在100-120℃条件下灭菌20min，冷却后在超净台中接入适量活化的菌种，置于培养箱中静止发酵获得发酵液；
5.3)调节发酵液pH至7.5，将发酵液在5000-8000r/min离心25-30min后，取上清液，冷藏保存备用；
5.4)超滤：将所述上清液再经2500-3500rpm离心15-20min，取第二上清液；应用规格为Φ1.0×100cm或Φ1.0×150cm的层析柱，装入已处理好的大孔吸附树脂HPD400A或HPD450A，对第二上清液进行真空抽滤，去除沉淀物；再用截留分子量为800D-1000D和100D-200D超滤膜依次对经真空超滤后的所述第二上清液进行除杂和除盐，获得滤液，备用；
5.5)纯化：将所述上清液过交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱，收集洗脱液，之后，应用截留分子量为6000D的超滤膜对洗脱液进行超滤浓缩除盐，真空干燥6h-12h得乳清抗氧化肽。
6.如权利要求5所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，所述交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱经预处理后使用，预处理的具体方法为：将交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱用去离子水以0.7-1mL/min流速洗柱1.5-2h，待基线走平，备用。
7.如权利要求5所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，所述洗脱液为质量分数为55-60％乙醇溶液，应用洗脱液洗柱约5-6h，洗脱至基线走平，用分布收集器进行定量收集。
8.如权利要求5所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，所述MRS培养基组成：酵母膏0.5％、酪蛋白1％、KH2PO40.1％，MgSO40.02％、牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％、NaCl0.5％、葡萄糖1％、CH3COONa0.28％、C6H14N2O70.03％、pH为6.2-6.4。
9.如权利要求5所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，所获得的乳清抗氧化肽的分子量在500～800D，肽含量不低于2.1g/L，纯度不低于94％，自由基清除率不低于41％。
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