CN115466705B - 具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物及其制备方法和应用 - Google Patents

具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体讲，涉及一种具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物，其制备方法和应用。本发明的具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物包括由瑞士乳杆菌CICC 6064对发酵培养基进行发酵所获得的发酵产物，发酵培养基中含有谷类或牛奶。本发明提供了一种具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物，具有天然绿色等特点，容易被现代消费者认可。本发明的瑞士乳杆菌发酵产物对大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大庆盐单胞菌具有广谱抑菌效果，且具有较强防腐性能，可作为食品、药品或化妆品的防腐剂使用，特别适用于控制化妆品生产控制菌及产生物膜菌株。

Description

具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体讲，涉及一种具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物，其制备方法和应用。
背景技术
随着人们健康意识的增强和对更适合皮肤的高功效产品的追求，新型天然安全产品的市场需求不断提升，使用更有效、更安全的天然防腐剂取代化学合成防腐剂已成为一种趋势。近年来，天然防腐剂的需求日益增高，也成为目前化妆品原料开发的热点。
微生物原料具有天然、安全性强、功效多样等优点，基于益生菌、益生元、后生元三种影响皮肤微生态技术的形式，以“微生物组友好型”为主要目的，开发有益于皮肤环境平衡的化妆品防腐原料，对天然、绿色化妆品产品的开发具有重要意义。芽胞杆菌属、肠杆菌科细菌以及酵母菌和米曲霉等真菌均能够产生抑菌活性物质，但因其抑菌范围狭窄和安全性因素一直未被使用。乳酸菌被认为是对人体安全的细菌，一直是开发生物防腐剂的研究重点，其代谢过程中能够产生多种抑菌活性物质，如有机酸、过氧化氢和多肽类抑菌或杀菌物质等。而目前的天然防腐剂存在抑菌谱较窄的缺陷。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物，其制备方法和应用。
本发明提供了一种具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物，其包括由瑞士乳杆菌CICC 6064对发酵培养基进行发酵所获得的发酵产物，发酵培养基中含有谷类、谷类产品和奶制品中的一种或多种。
可选的，谷类包括禾谷类、豆类中的至少一种；豆类包括大豆、黑豆、绿豆中至少一种；谷类产品选自豆粕、大豆蛋白、豆浆中的至少一种；奶制品选自来源于哺乳动物的鲜奶或奶粉；发酵培养基中谷类、谷类产品或奶制品的质量百分比含量按照干重计为5% ~ 15%，优选10 % ~ 15%。
可选的，发酵底物中还包括碳源，优选为葡萄糖或糖蜜，发酵培养基中碳源的质量百分比含量为2% ~ 5%，优选3% ~ 5%。
可选的，发酵产物选自发酵液、发酵滤液或发酵浓缩液。
可选的，具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物的活性物包括有机酸活性物质、多肽活性物质和蛋白质活性物质，有机酸活性物质中含有乳酸、丙酮酸、柠檬酸、琥珀酸和乙酸中的至少一种，多肽活性物质和蛋白质活性物质可以被胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K分解而失活。
本发明提供了上述具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物的制备方法，至少包括以下步骤：
S1、获得发酵培养基；
S2、活化瑞士乳杆菌CICC 6064，得到种子液；
S3、将种子液接种于发酵培养基中进行发酵，经后处理获得发酵产物。
可选的，在S1中，获得发酵培养基包括以下方式：
方式1、粉碎谷类或谷类产品得到粉状物，将粉状物、碳源和水混合后灭菌；
方式2、将谷类或谷类产品加水研磨得到浆状物，将浆状物和碳源混合后灭菌；
方式3、将奶粉和水混合后灭菌，
方式4、将鲜奶灭菌；
灭菌的温度为95℃~121℃，灭菌的时间为15 ~ 30分钟。
在S2中，活化包括：
S21、取冷冻保存的瑞士乳杆菌CICC 6064接种至MRS液体培养基中，36 ℃ ~ 38℃厌氧静置培养18 ~ 24小时，获得一代种子液；
S22、将一代种子液转接至装有MRS液体培养基的蓝盖瓶中，36 ℃ ~ 38℃厌氧静置培养18 ~ 24小时，获得二代种子液。
在S3中，种子液的浓度为1×108 CFU/mL ~ 9×108 CFU/mL。
可选的，在S3中，接种的接种量为1% ~ 10%；发酵的温度为30℃ ~ 45℃；发酵时间为12 ~ 96小时；发酵采用静置培养或振荡培养，振荡培养的速度为10 ~ 200转/分钟。
可选的，在S3中，后处理包括以下方式中的任意一种：
1）离心；
2）离心、过滤；
3）离心、过滤和浓缩；
离心的转速为4000 ~ 5000转/分钟，离心的时间为10 ~ 15分钟，得到发酵液；过滤使用0.22 μm的滤膜过滤发酵液，得到发酵滤液；浓缩为采用40℃~50℃条件下旋转蒸发发酵滤液，得到发酵浓缩液；发酵浓缩液与发酵滤液的体积比为1：5 ~ 10。
本发明提供了上述具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物或上述制备方法制备得到的天然防腐剂在制备食品、药品或化妆品中的应用。
本发明提供了上述具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物或上述制备方法制备得到的天然防腐剂用于抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大庆盐单胞菌中至少一种的用途。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明提供了一种具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物，发酵菌株为瑞士乳杆菌，发酵底物为谷类、谷类产品或奶制品。本发明的具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物具有天然绿色等特点，易被现代消费者认可。
本发明的具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物对大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大庆盐单胞菌具有广谱抑菌效果，且具有较强防腐性能。可作为食品、药品或化妆品的防腐剂使用，特别适用于控制化妆品生产控制菌及产生物膜菌株。
附图说明
图1为8种有机酸混合标准品的色谱图；
图2为本发明实施例发酵滤液的色谱图；
图3为本发明实施例发酵浓缩液的色谱图；
图4为γ-氨基丁酸标准品的色谱图；
图5为本发明实施例发酵滤液的色谱图；
图6为本发明实施例发酵浓缩液的色谱图；
图7为本发明实施例发酵浓缩液及相同浓度有机酸溶液抑菌实验结果图；
图8为本发明实施例发酵浓缩液中抑菌物质蛋白特性确认结果图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例中提到是的术语“天然防腐剂”也称天然有机防腐剂，是由生物体分泌或者体内存在的具有抑菌作用的物质，经人工提取或者加工而成为防腐剂。此类防腐剂为天然物质，对人体无毒害。
本发明实施例提出一种具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物，其包括由瑞士乳杆菌CICC 6064对发酵培养基进行发酵所获得的发酵产物，属于天然防腐剂的范畴，其中，发酵培养基中含有谷类、谷类产品和奶制品中的一种或多种。
本发明实施例在瑞士乳杆菌发酵产物的研究过程中，对于能产生生物防腐功能物质的细菌，例如乳杆菌、芽胞杆菌属、肠杆菌科细菌以及酵母菌和米曲霉等真菌进行了深入的研究和筛选，最终发现瑞士乳杆菌，特别是瑞士乳杆菌CICC 6064，在发酵过程中不仅可以产生抑菌活性物质，并且安全性良好，并通过对发酵培养基的进一步研究，通过天然防腐剂发酵中常用的培养基进行筛选，发现发酵培养基中含有谷类、谷类产品和奶制品中的一种或多种时，可以进一步提高了天然防腐剂的抑菌效果，从而完成了本发明。
通过基因分析研究，本发明实施例采用的发酵菌株瑞士乳杆菌CICC 6064中含有细菌素AP03290编码基因，位于6号Scaffold上，该Scaffold全长43278bp，预测到43条编码基因。本基因在该Scaffold上起始位点1425，结束位点1700。经核苷酸比对，瑞士乳杆菌CICC 6064与细菌素AP03290编码基因的核苷酸同源性为75%，具有生产具有抑菌效果细菌素的潜力，且未检测到相关毒力和耐药基因。
本发明实施例研究发现，发酵培养基的主要成分采用谷类、谷类产品和奶制品中的一种或多种，具体的，谷类包括禾谷类、豆类中的至少一种，豆类包括大豆、黑豆、绿豆中至少一种。谷类产品选自豆粕、豆浆和大豆蛋白中的至少一种；其中，豆粕是大豆提取豆油后得到的副产品，豆浆是大豆用水泡涨后磨碎、过滤、煮沸而成，大豆蛋白指粉状大豆蛋白产品，是以大豆为原料经脱脂、去除或部分去除碳水化合物而得到的富含大豆蛋白质的产品。奶制品选自来源于哺乳动物的鲜奶或奶粉，例如牛、羊来源的鲜奶或奶粉，鲜奶或奶粉可以为全脂或脱脂产品。
作为本发明实施例的一种改进，发酵培养基中含有豆类，并优选大豆或黑豆，大豆、黑豆富含约40%的蛋白质、20% ~ 30%的糖类及多种氨基酸，其自身组成即可加速微生物生长和代谢，产生抗菌肽、抗氧化肽等活性物质。因此，采用大豆或黑豆为底物，利用瑞士乳杆菌CICC 6064发酵特性和蛋白水解活性进行发酵，从而获得了具有安全、高防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物。同时，大豆或黑豆还中含有大豆异黄酮，及其他活性物质，当该瑞士乳杆菌发酵产物作为化妆品生物防腐剂时，还具有美白、抗衰老等功效。
进一步的，发酵培养基中大豆、黑豆、绿豆等豆类采用豆粉或豆浆的形式添加，豆粉的粒径为40目筛，该粒径可以保证瑞士乳杆菌CICC 6064对其充分的降解。豆浆可用水将豆类泡涨后磨碎、过滤而成。
根据对瑞士乳杆菌发酵产物组成分析以及蛋白质酶解的研究显示，本发明实施例的具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物的抑菌活性由多种物质共同作用，包括有机酸和具有蛋白性质的生物活性物质，且同时含有具有潜在活性的肽类及其它大豆活性物质。
作为本发明实施例的一种改进，发酵培养基中谷类、谷类产品或奶制品的质量百分比含量按照干重计为5% ~ 15%。其中按照干重计的含义是指，当发酵培养基中添加豆浆时，发酵培养基中谷物的质量百分比含量为豆浆中干物质的含量；当发酵培养基中添加鲜奶时，发酵培养基中奶制品的质量百分比含量为鲜奶中干物质的含量。
作为本发明实施例的一种改进，发酵培养基中谷类、谷类产品或奶制品的质量百分比含量按照干重计优选为10% ~ 15%，具体可选用的质量百分比含量为5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%；更优选10%。如果谷类、谷类产品或奶制品的添加量过小，防腐生物活性物质产生的数量不足；而如果谷类、谷类产品或奶制品的添加量过大，则发酵培养基较粘稠，发酵产物得率明显降低。
作为本发明实施例的一种改进，发酵底物中还添加少量的碳源，以加快发酵速度，并保障抑菌生物活性物质的产生。优选的，当发酵培养基中含有谷类或谷类产品时，进一步添加碳源。碳源选用天然的糖类物质，并优选为葡萄糖或糖蜜，发酵培养基中碳源的质量百分比含量为2% ~ 5%，优选3% ~ 5%，具体可选用的质量百分比含量为2%、3%、4%或5%，更优选4 %。如果碳源的添加量过小，防腐生物活性物质产生的数量不足，发酵速度过慢；而如果碳源的添加量过大，菌株代谢产生大量有机酸，抑制发酵菌株自身生长和代谢。
作为一个具体的实施方式，培养基中同时添加有大豆粉和葡萄糖。其中，大豆粉含量为10% ~ 15%，葡萄糖含量为2% ~ 4%。通过该特定比例制备的大豆培养基，用于发酵产物制备时，有利于多种抑菌活性物质的生成，发酵产物对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大庆盐单胞菌具有广谱抑制作用。
作为本发明实施例的一种改进，发酵产物选自发酵液、发酵滤液或发酵浓缩液。发酵产物经过初步离心，得到得发酵液；发酵液经滤膜过滤，得到发酵滤液；发酵滤液经过浓缩，得到发酵浓缩液。发酵浓缩液，其抑菌活性明显增大，且最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）较低。
作为本发明实施例的一种改进，本发明实施例中发酵产物的活性物包括有机酸活性物质、多肽活性物质和蛋白质活性物质，其中，有机酸活性物质中含有乳酸、丙酮酸、柠檬酸、琥珀酸和乙酸中的至少一种，例如，在发酵浓缩液中，乳酸的含量为100 ~ 140 mg/mL、丙酮酸的含量为6 ~ 10 mg/mL、柠檬酸的含量为3 ~ 6 mg/mL、琥珀酸的含量为3 ~ 6 mg/mL、乙酸的含量为1.5 ~ 2.1 mg/mL，γ-氨基丁酸含量为80 ~ 100 μg/mL。多肽活性物质和蛋白质活性物质可以被胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K分解而失活，多肽含量和酸溶蛋白大约为26.7 mg/mL和32.2mg/mL。
本发明实施例提出上述具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物的制备方法，至少包括以下步骤：
S1、获得发酵培养基；
S2、活化瑞士乳杆菌CICC 6064，得到种子液；
S3、将种子液接种于发酵培养基中进行发酵，经后处理获得发酵产物。
其中，在S1中，获得发酵培养基包括以下方式：
方式1、粉碎谷类或谷类产品得到粉状物，将粉状物、碳源和水混合后灭菌；
方式2、将谷类或谷类产品加水研磨得到浆状物，将浆状物和碳源混合后灭菌；
方式3、将奶粉和水混合后灭菌，
方式4、将鲜奶灭菌；
在S1中，灭菌的温度为95℃~121℃，灭菌的时间为15 ~ 30分钟；方式1和方式2中的灭菌条件具体可选用在115℃高温高压灭菌至少20分钟。方式3和方式4中灭菌条件具体可采用99℃加热30分钟，或115℃加热20分钟。
作为本发明实施例的一种改进，在S2中，活化包括：
S21、取冷冻保存的瑞士乳杆菌CICC 6064接种至MRS液体培养基中，36 ℃~ 38 ℃厌氧静置培养18 ~ 24小时，获得一代种子液；
S22、培养结束后，将一代种子液转接至装有MRS液体培养基的蓝盖瓶中，36 ℃~38 ℃厌氧静置培养18 ~ 24小时，获得二代种子液。
进一步优选的，培养的温度为37 ℃。
作为本发明实施例的一种改进，在S3中，种子液浓度为1×108 CFU/mL ~ 9×108CFU/mL，种子液接种的接种量为1% ~ 10%，例如可选用2%、3%、4%、5%、8%或9%，并优选为3% ~5%，最优选为3%，以上百分比均为体积百分比。
作为本发明技术方案中的一种改进，在S3中，二代种子液接种于发酵培养基后，发酵的温度为30℃~ 45℃，例如可选用30℃、32℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃或42℃，并优选37℃。
作为本发明技术方案中的一种改进，在S3中，二代种子液接种于发酵培养基后，进行静置培养或振荡培养，发酵的时间为6 ~ 120小时，并优选为48 ~ 96小时，并进一步优选为96小时。其中，振荡培养速度为10 ~ 200转/分钟，并优选10 ~ 100转/分钟，更优选10 ~50转/分钟，最优选50转/分钟。
作为本发明技术方案中的一种改进，在S3中，后处理包括以下方式中的任意一种：
1）离心；
2）离心、过滤；
3）离心、过滤和浓缩；
其中，离心的转速为4000 ~ 5000转/分钟，离心的时间为10 ~ 15分钟，得到得发酵液。
其中，发酵液中可能仍存在部分杂质、菌体或其他细菌，因此将发酵液进一步使用0.22 μm的滤膜过滤除菌，得到发酵滤液。
其中，浓缩为采用40℃~50℃条件下旋转蒸发发酵滤液，得到发酵浓缩液；发酵浓缩液与发酵滤液的体积比为1：5 ~ 10。发酵浓缩液中的抗菌物质浓度得到进一步浓缩，其抗菌防腐活性得到进一步的增强。
本发明实施例还提出上述具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物或上述制备方法制备得到的天然防腐剂在制备食品、药品或化妆品中的应用，并特别优选在化妆品中的应用。
本发明实施例还提出上述具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物或上述制备方法制备得到的天然防腐剂用于抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大庆盐单胞菌中至少一种的用途。采用琼脂扩散法测定天然防腐剂的抑菌活性，证实本发明的瑞士乳杆菌发酵产物对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大庆盐单胞菌4株指示菌株具有广谱抑菌活性，特别是对大庆盐单胞菌的抑菌效果获得了显著提高。并且，发酵浓缩液的抑菌活性获得显著提升，其MIC/MBC值更低，更适合作为生物防腐剂应用于化妆品产品配方开发中。
具体实施例：
以下实施例中所用到的试剂和原料均为市售。
实施例1
本实施例用于说明瑞士乳杆菌大豆发酵产物的制备：
制备方法包括如下步骤：
（1）发酵培养基制备：称取1 kg大豆，经粉碎，过40目筛，得到大豆粉。取10%大豆粉和4%葡萄糖于纯水中，混匀，于115℃灭菌20分钟。
（2）接种种子液的制备：吸取冷冻保存的瑞士乳杆菌CICC 6064菌液100 µL，接种至4 mL MRS肉汤培养基中，于37℃厌氧静置培养得到一代种子液。培养24 h后，将培养液转接至80 mL MRS肉汤培养基中，相同条件下静置培养24 h，获得二代种子液，备用。
（3）发酵：将3%二代种子液接种至大豆发酵培养基中，在37℃，转速为50转/分钟条件下发酵96小时。将发酵液于4000转/分钟离心10 min，取上清液，于0.22 μm聚醚砜滤膜过滤，制得发酵滤液。
实施例2
本实施例用于说明本发明实施例瑞士乳杆菌发酵产物的抑菌活性测定：
按照实施例1的方法进行制备瑞士乳杆菌发酵产物，区别在于发酵培养基的组成和发酵条件如表1所示：
表1：抑菌活性测定试验分组
其中，样品28为实施例1所获得的发酵滤液，样本29为将样本28采用40 ~ 50℃旋转蒸发仪浓缩8倍后的发酵浓缩液，样本30为空白对照，样本31为阳性对照。
采用琼脂扩散法测定发酵产物的抑菌活性，抑菌实验具体包括如下步骤：
（1）指示菌株菌悬液制备：以大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大庆盐单胞菌4株生产控制菌为指示菌。将指示菌株接种于TSA培养基进行活化，37℃条件下培养24小时。使用无菌生理盐水中制备菌悬液，菌悬液浓度为0.5 ~ 1.0麦氏浊度。
（2）抑菌试验-琼脂扩散法：将指示菌株菌悬液均匀涂布于TSA平皿培养基表面。使用无菌镊子，将已灭菌的牛津杯放置于已涂抹指示菌株的TSA平皿上，加入240 μL发酵产物，于4℃冰箱中扩散后，置于37℃培养24小时。选择5 g/L的聚赖氨酸溶液为阳性对照，未接种瑞士乳杆菌的发酵培养基为阴性对照。使用游标卡尺测量抑菌圈直径，评价发酵产物的抑菌效果。
获得抑菌实验的结果如表2所示。
表2：抑菌试验结果
“-”表示无可见抑菌圈。（牛津杯直径为8 mm）
从表2种可知，瑞士乳杆菌CICC 6064在适宜发酵条件下所得发酵产物对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大庆盐单胞菌4株指示菌株具有广谱抑菌活性。发酵培养基中大豆粉和葡萄糖含量、接种浓度、发酵温度、时间、振荡速度不同均对发酵产物抑菌活性具有影响。
在不同发酵条件下所得发酵滤液中，样品28对4株指示菌株抑菌圈直径最大，分别为21.41±0.16 mm、15.34±0.37 mm、23.07±0.21 mm和39.78±0.15 mm，抑菌效果优于其它发酵条件所得样品。与阳性对照5 g/L聚赖氨酸溶液相比，两者对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌抑制效果相近。而对大庆盐单胞菌，样品28的抑菌效果明显高于阳性对照。
为进一步提升发酵产物的抑菌活性，将样品28进行浓缩处理得到样品29，其对4株指示菌株抑菌效果明显提升，抑菌圈直径为样品28的1.6 ~ 2.2倍。
实施例3
本实施用于说明本发明实施例瑞士乳杆菌发酵产物最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定：
实验分组：按表2中的样本28（发酵滤液）、样本29（发酵浓缩液）。
最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定包括如下步骤：
（1）指示菌株菌悬液制备
以大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大庆盐单胞菌4株菌株作为指示菌。将指示菌株接种于TSA培养基进行活化，置于37℃培养24 小时。使用无菌棉签蘸取指示菌株新鲜平皿培养物于无菌生理盐水中制备菌悬液，菌悬液浓度为0.5 麦氏单位的菌悬液（1×108 CFU/mL）。使用TSB肉汤对菌悬液进行梯度稀释，稀释至浓度为1×106 CFU/mL，备用。
（2）微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度和最小杀菌浓度
使用TSB肉汤作为稀释液，将发酵产物进行倍半稀释。将不同稀释倍数的发酵产物稀释液分别加入96孔板中，每孔100 μL。在含有发酵产物稀释液的微孔中，分别加入100 μL指示菌株菌悬液，指示菌株在微孔中的终浓度为5×105 CFU/mL。将制备好的96孔板置于37℃培养18 ~ 24小时。在620 nm波长下测定其吸光度，确定其最小抑菌浓度。取96孔培养物，每孔吸取10 μL点种在TSA平皿培养基中以进一步观察微生物的生长。未观察到菌落生长的最高发酵产物浓度，为最小杀菌浓度。实验结果如表3所示。
表3：瑞士乳杆菌发酵产物最小抑菌浓度和最小杀菌浓度实验结果
根据表3可知，样本29（发酵浓缩液）对4株指示菌株的MIC/MBC值明显降低。样本28（发酵滤液）对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的MIC值为25%，MBC值为50%，而样本29的MIC值降低至1.563%和3.125%，MBC值降低至3.125%。对于铜绿假单胞菌和大庆盐单胞菌，发酵液的MIC值为12.5%，MBC值为25%和12.5%，其浓缩液MIC值降低至3.125%，MBC值为6.25%和3.125%。
以上结果显示，样品29（发酵浓缩液）的MIC/MBC值更低，更适合作为生物防腐剂应用于化妆品产品配方开发中。
实施例4
本实施例用于说明瑞士乳杆菌发酵产物中有机酸和γ-氨基丁酸的测定：
实验分组同实施例3。
（1）HPLC法测定发酵产物及浓缩液中有机酸
有机酸标准品的配制：精确称取适量乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酮酸、甲酸、丙酸、丁酸、琥珀酸标准品，用超纯水溶解并配制成浓度为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8mg/mL、1 mg/mL、1.6 mg/mL的系列标准溶液，过0.22 μm滤膜，进样10 μL。将系列混合标准溶液分别注入高效液相色谱仪，测定其保留时间和相应的峰面积。以混合标准溶液的浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
色谱条件：高效液相色谱仪；色谱柱：Rezex ROA Organic Acid H+（7.8 × 300mm，8 μm）或同等性能的色谱柱；流动相：5 mmol/L H2SO4；流速：0.6 mL/min；柱温：80 ℃；检测器：PDA；检测波长：210 nm；进样量：10 µL。
样品溶液的测定：将制备好的样液注入高效液相色谱仪，测得峰面积，以保留时间定性。根据标准曲线得到待测液中各目标化合物的浓度。
（2）HPLC法测定发酵产物及浓缩液中γ-氨基丁酸
柱前衍生化：取200 μL待测液或GABA标准液，加入800 μL OPA衍生液，振荡5秒，过0.45 μm滤膜后，立即进样。
色谱分析条件：A相：纯乙腈；B相：25 mmol/L乙酸钠。流速：1.0 mL/min;柱温：40℃；检测波长：334 nm，洗脱梯度如表4所示。
表4：洗脱梯度
标准曲线的绘制：将不同浓度γ-氨基丁酸标准溶液分别注入高效液相色谱仪，测定相应的峰面积。以混合标准溶液的浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
样品溶液的测定：将制备好的样液注入高效液相色谱仪，测得峰面积，以保留时间定性。根据标准曲线得到待测液中γ-氨基丁酸的浓度。
样本28（发酵滤液）、样本29（发酵浓缩液）中有机酸和γ-氨基丁酸含量测定色谱图如图1~图6所示。样本28（发酵滤液）、样本29（发酵浓缩液）中主要有机酸为乳酸、丙酮酸、柠檬酸、琥珀酸和乙酸。
其中，发酵滤液中5种有机酸含量分别为12.236 mg/mL、1.065 mg/mL、0.691 mg/mL、0.867 mg/mL、0.911 mg/mL，γ-氨基丁酸含量为8.21 μg/mL。由于发酵浓缩液是由发酵产物体积浓缩为1/8所得，故其有机酸含量约为发酵产物的8倍，5种有机酸含量分别为103.963 mg/mL、7.728 mg/mL、4.553mg/mL、4.518 mg/mL、1.802 mg/mL，γ-氨基丁酸含量为90.2 μg/mL。发酵产物中多种有机酸可使皮肤pH呈弱酸性，达到平衡肌肤表面pH的功效，保证皮肤微生态健康平衡。已有技术中报道了γ-氨基丁酸具有细胞激活、淡化细纹、嫩肤养颜、美白等功效。因此，瑞士乳杆菌大豆发酵产物除具有抑菌效果外，还具有多重潜在功效。
实施例5
本实施例用于说明瑞士乳杆菌发酵产物中有机酸抑菌作用的确认：
实验分组：按表5分组。
表5：有机酸抑菌作用确认实验分组
样品32中有机酸种类和含量同样本29的发酵浓缩液。
抑菌试验采用琼脂扩散法，具体操作步骤同实施例2。抑菌实验结果如表6和图7所示，发酵浓缩液对4株指示菌株的抑菌圈直径均明显大于相同浓度有机酸溶液对4株指示菌株的抑菌圈直径，说明发酵浓缩液中具有抑菌作用的物质除有机酸外还含有其它活性物质。
表6：发酵浓缩液及相同浓度有机酸溶液抑菌实验结果
实施例6
本实施例用于说明瑞士乳杆菌发酵产物中抑菌物质蛋白特性的确认：
实验分组：按表7所示。
表7：发酵浓缩液中抑菌物质蛋白特性确认实验分组
抑菌试验采用琼脂扩散法，具体操作步骤同实施例2。发酵浓缩液经不同蛋白酶处理后抑菌活性实验结果如图8所示。
其中，发酵浓缩液经过蛋白酶处理后对4株指示菌抑菌圈直径明显减小，其中，胰蛋白酶处理后所得酶解液对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌失去抑制活性；木瓜蛋白酶处理后对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌失去抑制活性；经蛋白酶K处理后对大肠埃希氏菌失去抑制活性；胃蛋白酶处理后所得酶解液对大肠埃希氏菌抑制活性明显降低。结果表明，发酵浓缩液中含有具有蛋白特性的抑菌活性物质。
实施例7
本实施例用于说明瑞士乳杆菌发酵产物中多肽含量的测定：
实验分组：按表2中的样本29（发酵浓缩液）。
多肽含量测定方法参考GB/T 22492。经测定，样本29（发酵浓缩液）中多肽含量为26.7 mg/mL；酸溶蛋白含量为32.2 mg/mL；游离氨基酸含量为5.5 mg/mL。
实施例8
本实施例用于说明瑞士乳杆菌CICC 6064安全性评价及潜在功能基因分析：
通过全基因组测序技术和基因注释分析对所选发酵菌株进行安全性评价和潜在功能基因分析。结合表型分析结果，为菌株的潜在遗传基础和抗菌机制提供线索。全基因组测序结果显示，共组装了180个支架，总长度为1921402 bp，GC含量为36.58 mol%，N50长度为20166 bp，预测了2161个基因。
在CARD、ResFinder、VFDB和Virulence Finder数据库中检索细菌抗生素耐药基因和毒力基因的存在。结果表明，未检测到潜在的抗生素耐药相关基因和毒力相关基因。基于病原体查找数据库(https://cge.cbs.dtu.dk/services /PathogenFinder/)通过分析菌株的蛋白质序列、基因组序列或原始序列来预测菌株的致病性。分析结果表明，瑞士乳杆菌CICC 6064为非人类病原体，可作为发酵菌株安全应用于发酵产物的生产中。
为了评估瑞士乳杆菌CICC 6064的潜在抗菌机制，在DRAMP和APD数据库中进行了基因组比对分析。结果表明，瑞士乳杆菌CICC 6064含有编码细菌素AP03290基因，核苷酸同源性为75%。根据文献报道，细菌素AP03290对金黄色葡萄球菌ATCC 29213、25923（抑菌圈直径为23.1 ~ 24.4 mm）、粪肠球菌ATCC 29212（抑菌圈直径为12.9 mm）、单增李斯特菌CMCC54004（抑菌圈直径为21.7 mm）、耐药金黄色葡萄球菌1（抑菌圈直径为13.2 mm）、耐药金黄色葡萄球菌3（抑菌圈直径为10.6 mm）和耐药金黄色葡萄球菌4（抑菌圈直径为11.6 mm）、大肠埃希氏菌ATCC25922（抑菌圈直径为20.9 mm）、沙门氏菌CMCC 50071（抑菌圈直径为27.3mm）、阪崎克罗诺菌ATCC 29544（抑菌圈直径为22.7 mm）具有抗菌活性，对抗生素耐药的阪崎克罗诺菌（抑菌圈直径为21.5 ~ 23.5 mm）和沙门氏菌557D（抑菌圈直径为22 mm）也具有活性。结合表型分析的结果，揭示了瑞士乳杆菌CICC 6064的潜在遗传基础和抗菌机制，并为在基因水平上建立高通量筛选模型提供了基础。
实施例9
本实施例用于说明具有较强抑菌活性发酵组合的筛选：
选择16株分离于传统发酵食品的菌株，分别以大豆、大米、黑麦细粉和萝卜为发酵培养基，进行发酵。
实验分组：按表8所示。
表 8：具有抑菌活性发酵组合筛选实验分组
样品42-样品47所用发酵培养基制备前，先将大米加热糊化，然后加入α-淀粉酶和糖化酶进行糖化，制备大米溶液。样品48-样品53所用发酵培养基制备前，黑麦粉先进行糖化处理。
表8中样品发酵时，发酵菌株接种量为5%，发酵温度为37℃，发酵时间为48小时。发酵后经过离心、过滤，得到发酵滤液。
抑菌试验采用琼脂扩散法，具体操作步骤同实施例2。不同菌株和发酵培养基制备所得发酵滤液抑菌活性测定结果如表9所示。
表 9：不同发酵组合抑菌实验结果
“-”表示无可见抑菌圈。（牛津杯直径为8 mm）
根据表9可知，乳酸菌以大豆、大米、黑麦和萝卜为底物进行发酵，均可产生具有抑菌活性物质。其中，样品37、样品40、样品41和样品62对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大庆盐单胞菌4株指示菌株具有广谱抑菌活性。瑞士乳杆菌CICC 6064发酵大豆和牛奶所得发酵产物抑菌圈直径最大，且对铜绿假单胞菌和大庆盐单胞菌的抑菌效果明显优于阳性对照，防腐效果好。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种具有高生物防腐性能的瑞士乳杆菌发酵产物的制备方法，其特征在于，所述发酵产物为由瑞士乳杆菌CICC 6064对发酵培养基进行发酵所获得的发酵产物，所述发酵培养基为大豆粉和葡萄糖，大豆粉的含量为10％，葡萄糖的含量为2％～4％；所述发酵产物选自发酵液、发酵滤液或发酵浓缩液；
所述发酵产物的活性物包括有机酸活性物质、多肽活性物质和蛋白质活性物质，所述有机酸活性物质中含有乳酸、丙酮酸、柠檬酸、琥珀酸和乙酸中的至少一种，所述多肽活性物质和所述蛋白质活性物质可以被胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K分解而失活；
制备方法至少包括以下步骤：
S1、获得所述发酵培养基；
S2、活化瑞士乳杆菌CICC 6064，得到种子液；
S3、将所述种子液接种于所述发酵培养基中进行发酵，所述接种的接种量为3％～5％，所述发酵时间为48～96小时；所述发酵采用静置培养或振荡培养，所述振荡培养的速度为10～50转/分钟；经后处理获得所述发酵产物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在S1中，获得所述发酵培养基的方式为：将所述大豆粉、葡萄糖和水混合后灭菌；
所述灭菌的温度为95℃～121℃，所述灭菌的时间为15～30分钟；和/或，
在S2中，所述活化包括：
S21、取冷冻保存的瑞士乳杆菌CICC 6064接种至MRS液体培养基中，36℃～38℃厌氧静置培养18～24小时，获得一代种子液；
S22、将所述一代种子液转接至装有MRS液体培养基的蓝盖瓶中，36℃～38℃厌氧静置培养18～24小时，获得二代种子液；和/或，
在S3中，所述种子液的浓度为1×108CFU/mL～9×108CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在S3中，所述发酵的温度为30℃～45℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在S3中，所述后处理包括以下方式中的任意一种：
1)离心；
2)离心、过滤；
3)离心、过滤和浓缩；
所述离心的转速为4000～5000转/分钟，离心的时间为10～15分钟，得到发酵液；
所述过滤使用0.22μm的滤膜过滤所述发酵液，得到发酵滤液；
所述浓缩为采用40℃～50℃条件下旋转蒸发所述发酵滤液，得到发酵浓缩液；所述发酵浓缩液与所述发酵滤液的体积比为1：5～10。
5.如权利要求1～4任一项所述的制备方法制备得到的瑞士乳杆菌发酵产物在制备化妆品中的应用。
6.如权利要求1～4任一项所述的制备方法制备得到的瑞士乳杆菌发酵产物用于抑制化妆品中的大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大庆盐单胞菌的用途。
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