CN109355335B - 芹菜籽发酵制备的降血脂肽的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种芹菜籽发酵制备降血脂肽的方法，它涉及一种液态发酵工艺，其特点是采用超声处理的芹菜籽粕发酵培养基接种枯草芽孢杆菌后进行震荡培养。本发明首先对发酵培养基进行超声处理，通过调控发酵时间、发酵温度、接种量进行单因素和正交实验确定最优的发酵工艺条件，保证最大程度获得芹菜籽多肽，不仅实现了对芹菜籽的进一步利用，同时发酵法明显降低了芹菜籽蛋白分子量，使其转化成更加容易被人体消化吸收的小分子多肽，通过对多肽和蛋白胆酸盐结合能力、表面特性以及内部结构的探究，发现经发酵处理，芹菜籽蛋白分子量降低，表观形态以及内部结构都发生了变化，导致其降血脂活性增强。从而研制出一种降血脂的芹菜籽蛋白肽生产方法。

Description

芹菜籽发酵制备的降血脂肽的提取方法

技术领域：

本发明属于液态发酵领域，涉及芹菜籽，尤其是一种芹菜籽发酵制备的降血脂肽的提取方法。

背景领域：

生物活性肽是指能够调节生物机体的生命活动或具有特殊生理作用的多功能肽。传统观念认为氨基酸是人体吸收蛋白的主要形式，但随着科学研究的进一步发展，人们发现小分子肽在一定程度上比游离氨基酸更容易被机体吸收和利用。某些小分子肽具有蛋白质不可比拟的生理功能，除了可以为机体提供营养物质外，还具有促进免疫、抗菌、抗病毒、降血脂等生理作用。

近年来，人们饮食结构发生改变，高血脂等多种疾病的发病率较以往更高，严重威胁着人体的健康。在其治疗方面，虽然有一些疗效不错的药物，但它们或多或少有一定毒副作用，并不受欢迎。随着科学研究的发展，植物源活性肽由于其资源丰富和自身营养特性逐渐受到国内外研究者的重视，相关的基础性研究开发日益增多，但是，由于国内起步较晚，目前整个植物源活性肽的研究都还处于实验阶段，其应用前景广阔。

芹菜具有独特香气，常作为原材料或者调味品应用于食品工业。不仅口感好而且营养价值高，深受大家的喜爱。目前国内外对芹菜的报道颇多，从品种、营养价值和种植技术等多方面均有涉及，其中对芹菜籽的系统研究却不多。芹菜籽含多种活性成分，最早在《新修本草》中记载了其药用价值。在功效方面，其具有一定的降血压、降胆固醇、抗氧化效果，并且所含降压、降脂成分是芹菜的50倍。但是目前为止对其开发主要局限于芹菜籽挥发性油，对蛋白的研究有所欠缺，造成资源的极大浪费，所以以芹菜籽粕为原料，采取一定手段获得功能性更强的生物活性肽，并研究其在降血脂方面的特性，不但满足了人们对天然健康降脂食品的渴求，也为特殊膳食食品等产业注入新的活力，更填补了植物蛋白关于芹菜籽这方面的空白。

芹菜籽蛋白肽可以降低血脂的机制在于，在保持胆固醇平衡的过程中，胆汁酸的生物合成起着重要作用。胆汁酸代谢是一个相对复杂的过程。在血液中，羟化酶催化胆固醇转化成胆汁酸后，在胆汁中形成胆酸盐，胆酸盐随胆汁进入小肠，大部分被重吸收，后经门静脉重新回到肝脏，肝细胞处理后，与新合成的胆汁酸一道再经胆道排入肠道，此过程称为胆汁酸的肝肠循环，其中未被重吸收的胆酸盐则随粪便排出体外。根据胆酸盐肝肠循环，芹菜籽蛋白肽可以在肠道内结合胆酸盐，阻碍胆汁酸的重吸收，则胆汁酸无法由小肠经肠肝循环返回肝脏，肝脏就会大量降解胆固醇，故进一步增加血液中胆固醇流入肝脏的量，降低血液中胆固醇含量，起到降血脂作用。

根据大量文献可知，有关芹菜籽蛋白肽的研究报道极少，提取蛋白肽的方式更是单一，其中的提取方法有常规搅拌提取、超声提取等。如CN102020695B公开了一种从芹菜籽中提取天然活性蛋白质和多肽的方法。通过超声提取、硫酸铵沉淀得到具有生物活性(如抗氧化活性)的蛋白质和多肽，再通过常规方法确定提取的蛋白质和多肽的成分及其分子量和确定蛋白质和多肽的抗氧化活性。CN101906132B公开了一种芹菜籽中原生抗氧化多肽的快速制备方法，该方法通过磷酸缓冲溶液提取、硫酸铵沉淀、以及阴离子交换树脂DEAE柱吸附、洗脱等步骤分离得到具有抗氧化活性的多肽。

本文在此基础上加以改进，采用超声辅助液态发酵法制备芹菜籽多肽，利用超声处理芹菜籽粕发酵培养基后进行枯草芽孢杆菌的接种发酵，采用最佳提取工艺条件，增加芹菜籽多肽产量。

发明内容：

本发明的目的是提供一种芹菜籽发酵制备降血脂肽的提取方法，采用芹菜籽作为原料，首先通过超声处理芹菜籽粕发酵培养基，然后进行液态发酵。将枯草芽孢杆菌接种到发酵培养基中进行发酵产生芹菜籽蛋白发酵多肽。发酵后，芹菜籽蛋白分子量降低，表观形态以及内部结构都发生了变化，导致其降血脂活性增强。从而研制出一种降血脂的芹菜籽蛋白肽生产方法。

一种芹菜籽发酵制备降血脂肽的提取方法，将芹菜籽粕、氯化钠、无水葡萄糖按照50～60：5～6：1～2的质量比加入蒸馏水中，其中芹菜籽粕的质量百分含量为4.7％～5.6％，混匀，灭菌，冷却至室温备用，使用前进行超声处理制得的发酵培养基，接种10％～14％的枯草芽孢杆菌进行发酵，灭菌灭酶，在发酵温度为35℃～39℃条件下震荡培养1d～3d，离心、最后过膜取上清液得到蛋白发酵液，将发酵液浓缩冷冻干燥24h得到芹菜籽蛋白发酵多肽粉末。

而且，芹菜籽粕制作工艺流程为：芹菜籽依次经过除杂、干燥、粉碎过筛、石油醚浸泡得到脱脂粕成品。

而且，超声处理功率为100～200W，处理时间10～30min。

而且，灭菌灭酶为将培养基在120～130℃、0.1MPa条件下灭菌灭酶10～20min。

而且，离心速率为3000～5000r/min的条件下离心15～25min，得到稳定均一的溶液。

而且，过膜用0.3～0.5μm的滤膜过滤上清液得到蛋白发酵液。

而且，工艺流程如下：

步骤1：原料预处理

将芹菜籽处理得到芹菜籽粕，芹菜籽粕为脱脂粕，其制作工艺流程为：芹菜籽依次经过除杂、干燥、粉碎过筛、石油醚浸泡得到脱脂粕成品。

步骤2：培养基的配置

液体种子培养基：2～3g牛肉膏，4～6g蛋白胨，2～3g氯化钠，加入400～600mL蒸馏水，搅拌混匀，调节pH至7.0～7.5，沸水浴30～50min至各组分充分溶解混合为止，110～130℃、0.1～0.3MPa条件下灭菌15～30min，冷却至室温备用；

固体活化培养基：琼脂2％，其余各组分与处理过程与液体种子培养基一致，冷却至40℃左右于超净台倒平板后凝固备用；

发酵培养基：芹菜籽粕、氯化钠、无水葡萄糖按照50:5:1的质量比加入蒸馏水中，其中芹菜籽粕的质量百分含量为4.7％～5.6％，混匀，灭菌，冷却至室温备用，使用前进行超声处理，超声处理功率为100～200W，处理时间10～30min，以防止培养基结块。

步骤3：接菌种

在无菌操作环境下从固体活化培养基上挑取1～3环枯草芽孢杆菌，接入液体培养基中，30～40℃、100～150r/min震荡培养，培养时间为15h～25h，培养结束后，生理盐水稀释，调整种子菌液的浓度，血球计数法于显微镜下观察并计算菌种浓度，保证待用的种子培养液浓度达到10⁷～10⁹CFU/mL，接入发酵培养基。

步骤4：震荡培养

将发酵培养基于恒定的培养环境下震荡培养，发酵时间为1d～3d，发酵温度为35℃～39℃。

步骤5：灭菌灭酶

发酵完成后，120～130℃、0.1MPa条件下灭菌灭酶10～20min。

步骤6：离心

将灭菌后的发酵培养基冷却至室温，3000～5000r/min的条件下离心15～25min，使其中的残渣以及死亡的菌体沉淀。

步骤7：过膜

用0.3～0.5μm的滤膜过滤上清液得到蛋白发酵液。

步骤8：冷冻干燥

将发酵液浓缩冷冻干燥24h得到芹菜籽蛋白发酵多肽粉末。

一种由本方法制备得到的降血脂肽，氨基酸总量为45.0～46.0(mg/g)，包括三类氨基酸(必需氨基酸、非必需氨基酸和半必需氨基酸)，其中必需氨基酸总量为17.0～18.0(mg/g)，包括：苏氨酸0.5～0.6(mg/g)，缬氨酸2.5～2.6(mg/g)，甲硫氨酸1.9～2.0(mg/g)，异亮氨酸1.7～1.8(mg/g)，苯丙氨酸10.0～11.0(mg/g)；其他氨基酸包括：天冬氨酸3.0～4.0(mg/g)，丝氨酸0.4～0.5(mg/g)，谷氨酸5.0～6.0(mg/g)，丙氨酸1.0～2.0(mg/g)，酪氨酸6.0～7.0(mg/g)，组氨酸10.0～11.0(mg/g)。

本发明的优点和有益效果：

1、本发明以芹菜籽粕为原料，实现了原料的高效利用，获得功能性更强的生物活性肽，并研究其在降血脂方面的特性，不但满足了人们对天然健康降脂食品的渴求，也为特殊膳食食品等产业注入新的活力，更填补了植物蛋白关于芹菜籽这方面的空白。

2、本发明采用超声辅助液态发酵法制备芹菜籽多肽，制备的发酵培养基在使用前进行超声处理，以防止培养基结块，为后续的液态发酵提供良好的环境。

3、本发明采用比浊法测定发酵菌种的浓度来确定枯草芽孢杆菌的生长周期，选用发酵18h作为种子培养液的最佳培养时长，此时菌体多数形态和生理特征较一致，有强的抵抗外来不利生长条件的能力，并且代谢物杂质少，对发明结果干扰小。

4、相比于芹菜蛋白而言，在发酵处理中三类氨基酸(必需氨基酸、非必需氨基酸和半必需氨基酸)均显著增加。此外，在所有氨基酸中，具有抗氧化活性的苯丙氨酸、组氨酸以及酪氨酸增加最为明显。在糖代谢和蛋白质代谢中起重要作用的谷氨酸的增加量也较大。而发酵处理虽苦味氨基酸有一定程度的增加，但同时增加了多种其他呈味氨基酸，包括谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和苏氨酸等，其中谷氨酸和天冬氨酸可以呈现明显的鲜味，苏氨酸、丝氨酸属于甜味氨基酸，呈良好气味氨基酸占氨基酸总量的28.87％，说明发酵在增加其营养价值和生物活性的同时有改善感官特性的潜在价值。氨基酸含量的增加可能促进暴露更多活性位点，为其结合更多胆酸盐提供了可能。

5、芹菜籽多肽与芹菜籽蛋白相比，经过相同的肠胃处理后，对三种胆酸盐的结合量均有所增加，其中对无水胆酸钠的吸附改善效果最为明显，此外对SDC和STC的吸附效果也得到较好的改善。枯草芽孢杆菌发酵使芹菜籽蛋白小分子量亚基的比例明显增加，从而在一定程度上提高了对胆酸盐的吸附量，进而达到降血脂的作用。

附图说明

图1为芹菜籽蛋白及多肽FTIR图谱。

具体实施方式：

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1：

一种芹菜籽发酵制备的降血脂肽，包括如下步骤：

步骤1：原料预处理

将芹菜籽处理得到芹菜籽粕，芹菜籽粕为脱脂粕，其制作工艺流程为：芹菜籽除杂、干燥、粉碎过筛、石油醚浸泡得到脱脂粕成品。

步骤2：培养基的配置

液体种子培养基：2.5g牛肉膏，5g蛋白胨，2.5g氯化钠，加入500mL蒸馏水，搅拌混匀，调节pH至7.2，沸水浴40min左右至各组分充分溶解混合为止，121℃、0.1MPa条件下灭菌20min，冷却至室温备用；

固体活化培养基：琼脂2％，其余各组分与处理过程与液体种子培养基一致，冷却至40℃左右于超净台倒平板后凝固备用；

发酵培养基：芹菜籽粕7.5g，氯化钠0.75g，无水葡萄糖0.15g，加入蒸馏水150mL，混匀，灭菌20min冷却至室温备用，使用前进行超声处理(150W、20min)以防止培养基结块。

步骤3：接菌种

在无菌操作环境中从固体活化培养基上挑取1环枯草芽孢杆菌，接入液体培养基中，36℃、130r/min震荡培养，培养时间为18h。培养结束后，生理盐水稀释，调整种子菌液的浓度，血球计数法于显微镜下观察并计算菌种浓度，保证待用的种子培养液浓度达到10⁸CFU/mL，将12％接入发酵培养基。

步骤4：震荡培养

将发酵培养基于恒定的培养环境下震荡培养，发酵时间为2d，发酵温度为37℃。

步骤5：灭菌灭酶

发酵完成后，将培养基在121℃、0.1MPa条件下灭菌灭酶10min。

步骤6：离心

将灭菌后的发酵培养基冷却至室温，4000r/min离心20min，使其中的残渣以及死亡的菌体沉淀。

步骤7：过膜

用0.45μm的滤膜过滤上清液得到蛋白发酵液。

步骤8：冷冻干燥

将发酵液浓缩冷冻干燥24h得到芹菜籽蛋白发酵多肽粉末。

实施例2：

一种芹菜籽发酵制备的降血脂肽，包括如下步骤：

步骤1：原料预处理

将芹菜籽处理得到芹菜籽粕，芹菜籽粕为脱脂粕，其制作工艺流程为：芹菜籽除杂、干燥、粉碎过筛、石油醚浸泡得到脱脂粕成品。

步骤2：培养基的配置

液体种子培养基：2g牛肉膏，4g蛋白胨，2g氯化钠，加入400mL蒸馏水，搅拌混匀，调节pH至7，沸水浴30min左右至各组分充分溶解混合为止，110℃、0.1MPa条件下灭菌30min，冷却至室温备用；

固体活化培养基：琼脂2％，其余各组分与处理过程与液体种子培养基一致，冷却至40℃左右于超净台倒平板后凝固备用；

发酵培养基：芹菜籽粕9g，氯化钠0.9g，无水葡萄糖0.3g，加入蒸馏水150mL，混匀，灭菌20min冷却至室温备用，使用前进行超声处理(100W、30min)以防止培养基结块。

步骤3：接菌种

在无菌操作环境中从固体活化培养基上挑取2环枯草芽孢杆菌，接入液体培养基中，33℃、120r/min震荡培养，培养时间为20h。培养结束后，生理盐水稀释，调整种子菌液的浓度，血球计数法于显微镜下观察并计算菌种浓度，保证待用的种子培养液浓度达到10⁷CFU/mL，将14％接入发酵培养基。

步骤4：震荡培养

将发酵培养基于恒定的培养环境下震荡培养，发酵时间为3d，发酵温度为35℃。

步骤5：灭菌灭酶

发酵完成后，将培养基在121℃、0.1MPa条件下灭菌灭酶10min。

步骤6：离心

将灭菌后的发酵培养基冷却至室温，3000r/min离心25min，使其中的残渣以及死亡的菌体沉淀。

步骤7：过膜

用0.4μm的滤膜过滤上清液得到蛋白发酵液。

步骤8：冷冻干燥

将发酵液浓缩冷冻干燥24h得到芹菜籽蛋白发酵多肽粉末。

实施例3：

一种芹菜籽发酵制备的降血脂肽，包括如下步骤：

步骤1：原料预处理

将芹菜籽处理得到芹菜籽粕，芹菜籽粕为脱脂粕，其制作工艺流程为：芹菜籽除杂、干燥、粉碎过筛、石油醚浸泡得到脱脂粕成品。

步骤2：培养基的配置

液体种子培养基：3g牛肉膏，6g蛋白胨，3g氯化钠，加入600mL蒸馏水，搅拌混匀，调节pH至7.5，沸水浴50min左右至各组分充分溶解混合为止，130℃、0.1MPa条件下灭菌15min，冷却至室温备用；

固体活化培养基：琼脂2％，其余各组分与处理过程与液体种子培养基一致，冷却至40℃左右于超净台倒平板后凝固备用；

发酵培养基：芹菜籽粕8.25g，氯化钠0.825g，无水葡萄糖0.225g，加入蒸馏水150mL，混匀，灭菌20min冷却至室温备用，使用前进行超声处理(200W、10min)以防止培养基结块。

步骤3：接菌种

在无菌操作环境中从固体活化培养基上挑取3环枯草芽孢杆菌，接入液体培养基中，39℃、140r/min震荡培养，培养时间为15h。培养结束后，生理盐水稀释，调整种子菌液的浓度，血球计数法于显微镜下观察并计算菌种浓度，保证待用的种子培养液浓度达到10⁹CFU/mL，将10％接入发酵培养基。

步骤4：震荡培养

将发酵培养基于恒定的培养环境下震荡培养，发酵时间为1d，发酵温度为39℃。

步骤5：灭菌灭酶

发酵完成后，将培养基在121℃、0.1MPa条件下灭菌灭酶10min。

步骤6：离心

将灭菌后的发酵培养基冷却至室温，5000r/min离心15min，使其中的残渣以及死亡的菌体沉淀。

步骤7：过膜

用0.5μm的滤膜过滤上清液得到蛋白发酵液。

步骤8：冷冻干燥

将发酵液浓缩冷冻干燥24h得到芹菜籽蛋白发酵多肽粉末。

本降血脂肽的效果的实验数据如下：

将芹菜籽提取得到的蛋白和经发酵得到的多肽分别与三种不同胆酸盐结合，探究其胆酸盐结合能力，实验结果汇总如表所示。

对芹菜籽蛋白和发酵多肽进行氨基酸含量分析，结果如表所示。

Claims (6)

1.一种芹菜籽发酵制备降血脂肽的方法，其特征在于：将以芹菜籽粕为原料制得发酵培养基，经过超声处理后，接种10％～14％的枯草芽孢杆菌进行发酵，灭菌灭酶，震荡培养，离心、最后过膜取上清液得到蛋白发酵液，将发酵液浓缩冷冻干燥得到芹菜籽蛋白发酵多肽粉末，所述的震荡培养是基于恒定的培养环境下，发酵时间为1d～3d、发酵温度为35℃～39℃，所述发酵培养基的制备方法为：将芹菜籽粕、氯化钠、无水葡萄糖按照50～60：5～6：1～2的质量比加入蒸馏水中，其中芹菜籽粕的质量百分含量为4.7％～5.6％，混匀，灭菌，冷却至室温备用，使用前进行超声处理，超声处理功率为100～200W，处理时间10～30min，所述的芹菜籽粕为脱脂粕，其制作工艺流程为：芹菜籽依次经过除杂、干燥、粉碎过筛、石油醚浸泡得到脱脂粕成品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的灭菌灭酶为将培养基在120～130℃、0.1MPa条件下灭菌灭酶10～20min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的离心速率为3000～5000r/min的条件下离心15～25min，得到稳定均一的溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的膜为0.3～0.5μm的滤膜。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述接种为在无菌操作环境下从固体活化培养基上挑取1-3环枯草芽孢杆菌，接入液体种子培养基中，30～40℃、100～150r/min震荡培养，培养时间为15h～25h，培养结束后，生理盐水稀释，调整种子菌液的浓度，血球计数法于显微镜下观察并计算菌种浓度，保证待用的种子培养液浓度达到10⁷～10⁹CFU/mL，接入发酵培养基。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的液体种子培养基是将2～3g牛肉膏，4～6g蛋白胨，2～3g氯化钠，加入400～600mL蒸馏水，搅拌混匀，调节pH至7.0～7.5，沸水浴30～50min至各组分充分溶解混合为止，110～130℃、0.1～0.3MPa条件下灭菌15～30min，冷却至室温备用；所述的固体活化培养基含有琼脂2％，其余各组分与处理过程与液体种子培养基一致，冷却至40℃于超净台倒平板后凝固备用。

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