CN106520894A - 一种利用虾废料同时制取虾青素、壳聚糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是关于虾废弃物的重新再利用，具体为一种利用虾废料同时制取虾青素、壳聚糖的方法,利用枯草芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌协同作用加以葡萄糖来发酵虾皮和虾头进行脱盐和脱蛋白质，然后利用嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌共生体系发酵一周进行脱钙和脱色，利用甲壳素脱乙酰酶处理甲壳素得壳聚糖，用革兰氏阴性菌类志贺邻单胞菌处理得虾青素。在发酵的过程中无需大量的酸碱加入，减少了环境污染，并且微生物发酵比采用酶发酵节约成本，得到的活性成分含量更高，实现了对原料有效成分的完全利用，经济可行。

Description

一种利用虾废料同时制取虾青素、壳聚糖的方法

技术领域

本发明是关于虾废弃物的重新再利用，具体为一种利用虾废料同时制取虾青素、壳聚糖的方法，即利用微生物协同发酵技术从虾废弃物中同时提取活性物质虾青素、壳聚糖的方法。

背景技术

我国对虾产量很高并远销国外市场，对新鲜虾的食用和加工过程中主要是弃去头部和外壳，缺乏完全利用造成虾壳和虾头中营养成分的极大浪费同时也增加了环境的负担，虾头和虾壳中含有丰富的壳聚糖、氨基酸、不饱和脂肪酸、矿物质和多种微量元素，目前世界上许多国家都着力开发这一资源。

在制备方法上，传统水产品下脚料通常采用酸和酶来提取生物活性物质，如公开号CN104938604A的发明专利，该申请公开了一种水产加工下脚料综合利用方法，其分别公开了生产虾青素、脂肪酸和水解蛋白产品：1将水产加工下脚料洗净，在真空低温冷冻式干燥机中40-60℃低温干燥，至含水量达2-10%，冷冻粉碎至20-100目；2往步骤1处理后的原料中，加入原料干重的2-20倍水，调pH值6-10，加入脂肪酶和木瓜蛋白酶，其重量比为底物重量的0.1-0.5%和0.2-0.8%，水解2-20h，在水解1-3h后，再按底物干重比添加0.1-1.2%的风味酶，直至水解完成；3将步骤2的产物灭酶后，进入离心机，2000-8000rpm，10-50分钟进行固液分离，得到固相和液相，并分别待用；4将步骤3得到的液体进行反渗透脱水，得到脂肪酸、虾青素和水解蛋白混合物，然后加入包埋剂β-环状糊精和麦芽糖糊精，加入按三者重量比，脂肪酸、虾青素和水解蛋白混合物：β-环状糊精：麦芽糖糊精=20-80：0.1-5：25-75，然后进行高压均质，使溶入脂肪酸的虾青素与水溶性的水解蛋白完全均质融合；5将步骤4的产物输入真空低温冷冻式干燥机，40-60℃干燥至含水量为2-10%为止，精制成粉，或按常规方法制粒、压片即得含虾青素、脂肪酸的水解蛋白片。由以上可知，该申请主要是利用酶来提取虾青素。

生产甲壳素及其衍生物壳聚糖产品：将步骤3中分离的固体，加入原料干重的2-10%柠檬酸、苹果酸和乳酸，三酸体积比2：2：1，料液比为1~10：5~20（kg/L），提取2-10h，然后由输送泵打入离心机离心，2000-8000rpm，10-50分钟，进行固液分离，液体和固体分别用于提取有机钙和甲壳素及其衍生物壳聚糖，放入具有150-200目筛板的贮罐中，用水冲洗2-3次，即得白色甲壳素；2所得甲壳素，加原料干重的0.2-1.2%的纤维素酶,调pH值4-6，在40-60℃下，水解2-10h，降解脱甲壳素分子中的乙酰基，然后通过离心机2000-8000rpm离心10-50分钟，进行固液分离；3将分离的液体40-60℃减压浓缩至比重1.0-1.3后，输入真空低温冷冻式干燥机40-60℃干燥至含水量2-10%，即得壳聚糖。由以上可知，该申请主要是利用酸和酶来提取甲壳素。该专利的工艺中多次使用酶进行生产，而酶制剂的成本昂贵，不适合大工业化生产，微生物繁殖能力强，成本低，产率高，优势明显。

壳聚糖具有独特的理化性质和生物活性功能，易于被人体吸收。其化学结构为带阳离子的高分子碱性多糖聚合物，可经甲壳素脱乙酰基制得。不仅具有减肥调脂、美容护肤得功效，还可以升高血液pH值，增强免疫活性细胞质量和数量，抑制肿瘤血管内皮细胞的生长；活化修复干细胞，强化肝脏功能；促使胰岛素分泌，防治高血压；促进肠道有益菌得繁殖，吸附排除体内重金属等作用。以往传统方法生产甲壳素一般使用高浓度的酸碱处理原料，脱除其中的矿物质、脂质、蛋白质等杂质，再经过脱色而成，导致甲壳素的结构被酸碱破坏，并产生大量的废水污染环境。现有技术中加入蛋白酶进行水解虽然避免了强酸碱的使用，但是商品化酶制剂增加了运营成本，而发酵法利用微生物繁殖过程中产酸去除矿物质，产蛋白酶去除蛋白质，发酵过程中不会水解甲壳素，提高了提取率。

虾青素是一种类胡萝卜素，是单线态氧的淬灭剂，也是人类发现自然界最强的抗氧化剂，其抗氧化能力超过现有的抗氧化剂，在体内可与蛋白质结合呈现青、蓝色，对人体有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、预防动脉硬化和心脑血管疾病等作用。虾青素的化学合成困难，采用有毒溶剂进行提取安全性不可知并且动物体对天然虾青素的吸收比化学合成要强，因此，利用自然界的微生物进行天然虾青素的提取成为研究的热点，利用已经除去蛋白质的甲壳素上清液进行提取简化了工序，对壳聚糖和虾青素的综合提取利用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵虾废料同时制备虾青素、壳聚糖的方法，发酵生产的活性物质可安全用于食品、保健品等多领域。

为了实现本发明的目的所采用的技术方案是：

S1：新鲜虾壳和虾头经清洗、粉碎后加水制成浆液并水煮灭菌；

S2：加入10%葡萄糖，均质处理3-5min，将扩大培养的微生物菌液接种到S1制备的浆液中进行发酵；

S3：灭菌后将发酵液分离得上清液和残渣，残渣中含有甲壳素；

S4：将S3中得到的残渣水洗，干燥，加入1%醋酸溶液按1:4固液比配置成甲壳素溶液，调节pH4-5，加入脱乙酰酶；灭酶活后固液分离取沉淀水洗、干燥得到壳聚糖；

S5：上清液用邻单胞杆菌（plesiomonas）处理，灭菌、过滤、喷雾干燥后得到虾青素，具体步骤为：37℃下，活化31-35h；以10%-20%的接种量，接入上清液中，发酵条件为：35-40℃、150-180rpm下震荡36-50h。

进一步地，所述S2中微生物菌包括枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)。要求枯草芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌依次加入，经过72h发酵后再加入嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌共生体系发酵一周。进一步地，所述S3中发酵液采用2000-5000r/min离心机离心5-15min分离成发酵液和残渣。

进一步地，所述S4中灭酶活的条件优选为90-100℃，处理3-5min。

进一步地，所述S4中所述的干燥方式包括真空冷冻干燥或者喷雾干燥。

进一步地，所述S5中 所述的嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌的活化条件：37℃下，活化25-33h，以5%-20%的接种量，接入到灭好菌的虾浆中；发酵条件为：30-40℃、170-200rpm下震荡一周。

进一步地，所述S1、S3、S5中灭菌方式采用蒸汽灭菌条件为120℃，25-30min或者巴氏杀菌。

本发明利用枯草芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌协同作用加以葡萄糖来发酵虾皮和虾头进行脱盐和脱蛋白质，然后利用嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌共生体系发酵一周进行脱钙和脱色，利用甲壳素脱乙酰酶处理甲壳素得壳聚糖，用革兰氏阴性菌类志贺邻单胞菌处理得虾青素。在发酵的过程中无需大量的酸碱加入，减少了环境污染，并且微生物发酵比采用酶发酵节约成本，得到的活性成分含量更高，实现了对原料有效成分的完全利用，经济可行。

附图说明

图1：本发明的流程示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。本发明中的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）菌种编号：CGMCC1.934、氧化葡糖杆菌（Gluconobacteroxydans）菌种编号：CGMCC1.110、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)菌种编号：CGMCC1.3996、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)菌种编号：CGMCC1.3342等微生物均可购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)菌种编号：ACCC10638，购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。类志贺邻单胞菌（Plesiomonasshigelloides）菌种编号：CICC10380可购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。也可以是从其它途径获得，具有相同或类似代谢功能的菌株。

实施例1：

制备匀浆：取新鲜虾头、虾壳20g粗粉后加60g水溶解，并在120℃条件下灭菌25min。

加葡萄糖：收集匀浆加入160g10%的葡萄糖溶液均质处理3min。

接入菌种：（1）将已经冷藏保存的枯草芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌依次进行活化。活化方法：接种于种子培养基置于37℃恒温箱中振荡培养28h。先将枯草杆菌以8%的接种量接种到培养基中，38℃培养48h后按照同样方法接种氧化葡糖杆菌38℃继续培养24h。测定工艺中的脱盐率为：93.52%，脱蛋白率95.32%。

（2）发酵完全后进行灭菌，再加入嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌共生体系，37℃下，活化30h，以15%的接种量接种于培养基中，发酵条件为：37℃、180rpm下震荡培养一周。测定工艺中的脱钙率：91.33%，脱色率达35.23%。

分离：灭菌后所得的菌液于4000r条件下离心10min，可以分离出上清液以及发酵残渣。

残渣处理得壳聚糖：加入醋酸溶液调节残渣pH值4.5，温度50℃，甲壳素脱乙酰酶40mg/L处理24h，灭酶活后固液分离取沉淀水洗、干燥后得到壳聚糖2.53g。

上清液处理得虾青素：上清液用类志贺邻单胞菌处理，活化温度为37℃，活化时间32h，10%的接种量，35℃，180rpm下震荡50h培养，灭菌、过滤、喷雾干燥得到虾青素2mg。

实施例2：

其他同实施例1，只不过枯草芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌的接种量分别为5%，测定工艺中的脱盐率91.32%，脱蛋白率90.63%。

实施例3：

其他同实施例1，只不过枯草芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌的接种量分别为6%，测定工艺中的脱盐率92.65%，脱蛋白率91.25%。

实施例4：

其他同实施例1，只不过嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌共生体系接种量为20%，测定工艺中的脱钙率91.13%，脱色率34.35%。

实施例5：

其他同实施例1，只不过嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌共生体系接种量为10%，测定工艺中的脱钙率90.28%，脱色率34.55%。

实施例6：

其他同实施例1，只不过类志贺邻单胞菌活化32h，以15%的接种量最终得到虾青素1.8mg。

实施例7：

其他同实施例1，只不过类志贺邻单胞菌活化32h，以20%的接种量最终得到虾青素1.7mg。

上述结果表明，枯草芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌依次加入的最佳接种量分别为8%时脱盐率和脱蛋白质率最高。嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌共生体系的接种量在15%时，脱钙和脱色率最高。处理虾青素的类志贺邻单胞菌活化32h，接种10%的量时可得到喷雾干燥虾青素2mg。

Claims (7)

1.一种利用虾废料同时制取虾青素、壳聚糖的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1：新鲜虾壳和虾头经清洗、粉碎后加1:3-5倍水，制成浆液并在120℃水煮灭菌25-30min；

S2：加入10%的葡萄糖，均质处理3-5min，接入菌种，将扩大培养的微生物菌液接种到S1制备的浆液中进行发酵；

S3：灭菌后将发酵液分离得上清液和残渣，残渣中含有甲壳素；

S4：将S3中得到的残渣水洗，干燥，加入1%的醋酸溶液按1：4配置成甲壳素溶液，调节pH4-5，加入脱乙酰酶；灭酶活后固液分离取沉淀水洗、干燥得到壳聚糖；

S5：上清液用邻单胞杆菌处理，灭菌、过滤、喷雾干燥后得到虾青素，具体步骤为：37℃下，活化31-35h；以10%-20%的接种量，接入上清液中，发酵条件为：35-40℃、150-180rpm下震荡36-50h。

2.根据权利要求1所述的一种利用虾废料同时制取虾青素、壳聚糖的方法，其特征在于，所述步骤S2中微生物菌包括枯草芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌。

3.根据权利要求2所述的一种利用虾废料同时制取虾青素、壳聚糖的方法，其特征在于，枯草芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌依次加入，经过72h发酵后再加入嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌共生体系发酵一周，在加入之前需要进行菌种活化。

4.根据权利要求2所述的一种利用虾废料同时制取虾青素、壳聚糖的方法，其特征在于，嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌的活化条件：37℃下，活化25-33h，以5%-20%的接种量，接入到灭好菌的虾浆中；发酵条件为：30-40℃、170-200rpm下震荡一周。

5.根据权利要求1所述的一种利用虾废料同时制取虾青素、壳聚糖的方法，其特征在于，所述S3中发酵液采用2000-5000r/min离心机离心5-15min分离成发酵液和残渣。

6.根据权利要求1所述的一种利用虾废料同时制取虾青素、壳聚糖的方法，其特征在于，所述S4中灭酶活的条件为90-100℃，处理3-5min，所述S4中的干燥方式包括真空冷冻干燥或者喷雾干燥。

7.根据权利要求1所述的一种利用虾废料同时制取虾青素、壳聚糖的方法，其特征在于，所述S1、S3、S5中灭菌方式采用蒸汽灭菌条件为120℃，25-30min或者巴氏杀菌。