CN114409826A - 一种从美洲大蠊药渣中提取甲壳素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从美洲大蠊药渣中提取甲壳素的方法,包括以下步骤:将美洲大蠊药渣预处理后得到药渣粉;在所述药渣粉中添加葡萄糖、酵母膏和水搅拌后进行灭菌,得到药渣培养基质;在所述药渣培养基质中接种枯草芽孢杆菌后进行发酵,得到枯草芽孢杆菌发酵液;向所述枯草芽孢杆菌发酵液中加入葡萄糖,得到乳酸发酵基质;向所述乳酸发酵基质中接种乳酸杆菌后进行发酵,得到乳酸杆菌发酵液;收集所述乳酸杆菌发酵液中的悬浮物;将收集的所述悬浮物水洗至中性,得到中性悬浮物;向所述中性悬浮物中加入双氧水脱色,得到脱色悬浮物;将所述脱色悬浮物洗净烘干,得到甲壳素;本发明提取方法简单、环保、低成本,且甲壳素品质高。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物分离提取技术领域,具体是一种从美洲大蠊药渣中提取甲壳素的方法。
背景技术
美洲大蠊(Periplanetaamericana)是蜚蠊科昆虫,作为传统中药材,以成虫入药。由于其具有促进创面愈合、抗肿瘤等功效,每年约有1000吨药材提取后制成制剂应用于临床,由此产生了大量的药渣,且未得到开发利用,造成了资源的浪费。
甲壳素又名几丁质,是自然界中迄今为止被发现的唯一带正电荷的动物纤维素。甲壳素来源广泛,分布于虾蟹、昆虫、低等类植物菌类等甲壳类动物的外壳以及真菌、绿藻的细胞壁中。目前,提取甲壳素应用较多的原料是废弃的虾蟹壳,存在原料来源相对单一,且所得甲壳素存在钙含量偏高、重金属离子难以脱除、很难获得高纯度产品的缺点;同时,虾蟹壳来源的甲壳素结晶度较高,分子内氢键结合牢固,较难实现后续加工。
目前专门针对美洲大蠊甲壳素的提取方法研究较少,一般为传统提取虾蟹壳的化学法,即先脱脂,后通过氢氧化钠溶液脱蛋白,再用盐酸脱去钙盐,洗至中性后,用高锰酸钾或双氧水脱色,最后干燥得到甲壳素。该方法高效、廉价,适用于几乎所有的几丁质源,但会产生酸碱废液,对环境污染大;美洲大蠊相对虾蟹壳组成成分不同,含有大量的脂肪和蛋白,利用传统提取虾蟹壳的化学法提取美洲大蠊中的甲壳素,其中的脂肪、蛋白等资源不能二次利用,造成浪费;也有采用酶取代酸碱提取甲壳素的研究,但酶价格高昂,对反应条件要求较高,反应过程中容易产生腐败,所得产物具有明显的苦涩味和腥臭味,且生产成本高,不适宜生产推广。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种工艺简单、反应条件温和、成本较低且脱脂、脱蛋白、脱钙效果较好的从美洲大蠊药渣中提取甲壳素的方法,得到质量纯度高的甲壳素。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种从美洲大蠊药渣中提取甲壳素的方法,
包括以下步骤:
S1:将美洲大蠊药渣在40-50℃干燥后粉碎,并过60-80目筛网,得到药渣粉;
S2:在所述药渣粉中添加葡萄糖、酵母膏和水后搅拌均匀,得到混合物,对所述混合物进行灭菌后得到药渣培养基质;
S3:在所述药渣培养基质中接种枯草芽孢杆菌,发酵,后得到枯草芽孢杆菌发酵液;
S4:向所述枯草芽孢杆菌发酵液中加入体积为所述药渣培养基质体积的4-6%的葡萄糖后搅拌均匀,得到乳酸发酵基质;
S5:向所述乳酸发酵基质中接种乳酸杆菌,发酵,得到乳酸杆菌发酵液;
S6:收集所述乳酸杆菌发酵液中悬浮于发酵液上层的悬浮物;
S7:将收集的所述悬浮物水洗至中性,得到中性悬浮物;
S8:向所述中性悬浮物中加入30%的双氧水,在55-65℃水浴条件下浸泡脱色6h,得到脱色悬浮物;
S9:将所述脱色悬浮物洗净后烘干,得到美洲大蠊甲壳素。
本发明基于美洲大蠊的组成成分研发针对美洲大蠊药渣中的甲壳素的提取方法,先接种枯草芽孢杆菌脱除美洲大蠊药渣中的大量的脂肪和蛋白;再接种乳酸杆菌,以葡萄糖为碳源,以所述枯草芽孢杆菌降解的蛋白为氮源,生长产生乳酸,进而脱除美洲大蠊药渣中的钙;本发明将脱脂、脱蛋白与脱钙三个工艺过程耦合,药渣中富含的脂肪、蛋白质可被再次利用,且提取美洲大蠊药渣中的甲壳素的提取工艺简单、节能环保、成本较低。
进一步的,步骤S3中枯草芽孢杆菌的接种量为所述药渣培养基质体积的1-3%,所述枯草芽孢杆菌为产脂肪酶菌和产蛋白酶菌,能有效脱除美洲大蠊药渣中的大量脂肪和蛋白。
进一步的,所述乳酸杆菌的接种量为乳酸发酵基质体积的2-5%;所述乳酸杆菌为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌中的任意一种或多种;所述乳酸杆菌为产酸菌,以葡萄糖为碳源,以所述枯草芽孢杆菌降解的蛋白为氮源,生长产生乳酸,脱除美洲大蠊药渣中的钙。
进一步的,接种所述枯草芽孢杆菌和所述乳酸杆菌后分别在35-38℃、150-200rpm的条件下发酵72-96h,保证所述枯草芽孢杆菌和所述乳酸杆菌的发酵,以脱除美洲大蠊药渣中的脂肪、蛋白和钙。
进一步的,向所述中性悬浮物中按固液比为1:12加入30%的双氧水脱色6h;保证得到的甲壳素颜色基本脱除,呈淡黄至乳白色。
本发明的有益效果是:本发明以枯草芽孢杆菌为产脂肪酶菌和产蛋白酶菌,以乳酸杆菌为产酸菌,首先利用所述枯草芽孢杆菌进行脱脂和脱氮后,直接接种乳酸杆菌进行脱钙过程;由于美洲大蠊钙含量较低,乳酸杆菌就能起到很好的脱钙效果,不需采用醋酸杆菌,发酵不需要加入乙醇,降低成本;本发明将所述乳酸杆菌和所述枯草芽孢杆菌两种微生物发酵合二为一,无需两次灭菌,工艺简单,节能环保,将脱脂、脱蛋白与脱钙三个工艺过程耦合;本发明涉及的从美洲大蠊中提取甲壳素的方法所提取的甲壳素,其蛋白含量低于2%,甲壳素得率为4-5%,灰分低于1.5%,纯度最高为96.62%。
具体实施方式
下面进一步详细描述本发明的技术方案,但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1:
一种从美洲大蠊药渣中提取甲壳素的方法,包括以下步骤:
S1:将美洲大蠊药渣在40℃干燥后粉碎,并过60目筛网,得到药渣粉;
S2:在所述药渣粉中添加葡萄糖、酵母膏和水后搅拌均匀,得到混合物,所述药渣粉、葡萄糖以及酵母膏的加量分别为加入水的体积的4%、4%、0.4%,对所述混合物进行灭菌后得到药渣培养基质;
S31:取pH为7.0的2ml LB肉汤培养基于10ml试管中,所述LB肉汤培养基的组成为胰蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,氯化钠10g/L,在121℃下灭菌15min;冷却后得到灭菌LB 肉汤培养基;
S32:在装有所述灭菌LB肉汤培养基试管的斜面上接种2环未复壮的枯草芽孢杆菌,在 37℃、180rpm条件下培养至OD600=0.8,得到一代枯草芽孢杆菌;
S33:然后向500ml三角瓶中装入100ml所述LB肉汤培养基,在121℃下灭菌15min,冷却后接种1ml所述一代枯草芽孢杆菌,在37℃、180rpm条件下培养至OD600=0.8,得到枯草芽孢杆菌;
S34:在所述药渣培养基质中接种体积为所述药渣培养基质体积的1%的所述枯草芽孢杆菌,在35℃、150rpm条件下发酵72h,得到枯草芽孢杆菌发酵液;
S4:向所述枯草芽孢杆菌发酵液中加入体积为所述药渣培养基质体积的4%的葡萄糖后搅拌均匀,得到乳酸发酵基质;
S51:取2ml MRS液体培养基于10ml试管中,所述MRS液体培养基的组成为蛋白胨10g/L,牛肉膏10g/L,酵母粉5g/L,磷酸氢二钾2g/L,柠檬酸二铵2g/L,乙酸钠5g/L,葡萄糖20g/L,吐温-80 1ml/L,七水硫酸镁0.58g/L,四水硫酸锰0.25g/L,琼脂18g/L,琼脂18g/L;在121℃下灭菌15min,冷却后得到灭菌MRS液体培养基;
S52:在装有所述灭菌MRS液体培养基的试管的斜面上接种2环未复壮的乳酸杆菌于试管斜面,在37℃、180rpm的条件下培养至OD600=0.8,得到一代乳酸杆菌;
S53:在500ml的三角瓶中装入100ml的MRS液体培养基,在121℃下灭菌15min,冷却后接1ml所述一代乳酸杆菌,在37℃、180rpm的条件下培养至OD600=0.8,得到乳酸杆菌;
S54:向所述乳酸发酵基质中接种体积为乳酸发酵基质体积的2%的所述乳酸杆菌,在35℃、 150rpm条件下发酵72h,得到乳酸杆菌发酵液;
S6:收集所述乳酸杆菌发酵液中悬浮于发酵液上层的悬浮物;
S7:将收集的所述悬浮物水洗至中性,得到中性悬浮物;
S8:向所述中性悬浮物中按固液比为1:12加入30%的双氧水,在55℃水浴条件下浸泡脱色6h,得到脱色悬浮物;
S9:将所述脱色悬浮物洗净后烘干,得到美洲大蠊甲壳素。
实施例2:
一种从美洲大蠊药渣中提取甲壳素的方法,包括以下步骤:
S1:将美洲大蠊药渣在45℃干燥后粉碎,并过70目筛网,得到药渣粉;
S2:在所述药渣粉中添加葡萄糖、酵母膏和水后搅拌均匀,得到混合物,所述药渣粉、葡萄糖以及酵母膏的加量分别为加入水的体积的5%、5%、0.5%,对所述混合物进行灭菌后得到药渣培养基质;
S31:取pH为7.0的2ml LB肉汤培养基于10ml试管中,所述LB肉汤培养基的组成为胰蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,氯化钠10g/L,在121℃下灭菌15min;冷却后得到灭菌LB 肉汤培养基;
S32:在装有所述灭菌LB肉汤培养基试管的斜面上接种3环未复壮的枯草芽孢杆菌,在 37℃、180rpm条件下培养至OD600=0.8,得到一代枯草芽孢杆菌;
S33:然后向500ml三角瓶中装入100ml所述LB肉汤培养基,在121℃下灭菌15min,冷却后接种1ml所述一代枯草芽孢杆菌,在37℃、180rpm条件下培养至OD600=0.9,得到枯草芽孢杆菌;
S34:在所述药渣培养基质中接种体积为所述药渣培养基质体积的2%的所述枯草芽孢杆菌,在37℃、180rpm条件下发酵80h,得到枯草芽孢杆菌发酵液;
S4:向所述枯草芽孢杆菌发酵液中加入体积为所述药渣培养基质体积的4-6%的葡萄糖后搅拌均匀,得到乳酸发酵基质;
S51:取2ml MRS液体培养基于10ml试管中,所述MRS液体培养基的组成为蛋白胨10g/L,牛肉膏10g/L,酵母粉5g/L,磷酸氢二钾2g/L,柠檬酸二铵2g/L,乙酸钠5g/L,葡萄糖20g/L,吐温-80 1ml/L,七水硫酸镁0.58g/L,四水硫酸锰0.25g/L,琼脂18g/L,琼脂18g/L;在121℃下灭菌15min,冷却后得到灭菌MRS液体培养基;
S52:在装有所述灭菌MRS液体培养基的试管的斜面上接种3环未复壮的乳酸杆菌于试管斜面,在37℃、180rpm的条件下培养至OD600=0.8,得到一代乳酸杆菌;
S53:在500ml的三角瓶中装入100ml的MRS液体培养基,在121℃下灭菌15min,冷却后接1ml所述一代乳酸杆菌,在37℃、180rpm的条件下培养至OD600=0.9,得到乳酸杆菌;
S54:向所述乳酸发酵基质中接种体积为乳酸发酵基质体积的4%的所述乳酸杆菌,在37℃、 180rpm条件下发酵80h,得到乳酸杆菌发酵液;
S6:收集所述乳酸杆菌发酵液中悬浮于发酵液上层的悬浮物;
S7:将收集的所述悬浮物水洗至中性,得到中性悬浮物;
S8:向所述中性悬浮物中按固液比为1:12加入30%的双氧水,在60℃水浴条件下浸泡脱色6h,得到脱色悬浮物;
S9:将所述脱色悬浮物洗净后烘干,得到美洲大蠊甲壳素。
实施例3:
一种从美洲大蠊药渣中提取甲壳素的方法,包括以下步骤:
S1:将美洲大蠊药渣在50℃干燥后粉碎,并过80目筛网,得到药渣粉;
S2:在所述药渣粉中添加葡萄糖、酵母膏和水后搅拌均匀,得到混合物,所述药渣粉、葡萄糖以及酵母膏的加量分别为加入水的体积的6%、6%、0.6%,对所述混合物进行灭菌后得到药渣培养基质;
S31:取pH为7.0的2ml LB肉汤培养基于10ml试管中,所述LB肉汤培养基的组成为胰蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,氯化钠10g/L,在121℃下灭菌15min;冷却后得到灭菌LB 肉汤培养基;
S32:在装有所述灭菌LB肉汤培养基试管的斜面上接种2-3环未复壮的枯草芽孢杆菌,在37℃、180rpm条件下培养至OD600=0.8,得到一代枯草芽孢杆菌;
S33:然后向500ml三角瓶中装入100ml所述LB肉汤培养基,在121℃下灭菌15min,冷却后接种1ml所述一代枯草芽孢杆菌,在37℃、180rpm条件下培养至OD600=1.0,得到枯草芽孢杆菌;
S34:在所述药渣培养基质中接种体积为所述药渣培养基质体积的3%的枯草芽孢杆菌,在38℃、200rpm条件下发酵96h,得到枯草芽孢杆菌发酵液;
S4:向所述枯草芽孢杆菌发酵液中加入体积为所述药渣培养基质体积的6%的葡萄糖后搅拌均匀,得到乳酸发酵基质;
S51:取2ml MRS液体培养基于10ml试管中,所述MRS液体培养基的组成为蛋白胨10g/L,牛肉膏10g/L,酵母粉5g/L,磷酸氢二钾2g/L,柠檬酸二铵2g/L,乙酸钠5g/L,葡萄糖20g/L,吐温-80 1ml/L,七水硫酸镁0.58g/L,四水硫酸锰0.25g/L,琼脂18g/L,琼脂18g/L;在121℃下灭菌15min,冷却后得到灭菌MRS液体培养基;
S52:在装有所述灭菌MRS液体培养基的试管的斜面上接种3环未复壮的乳酸杆菌于试管斜面,在37℃、180rpm的条件下培养至OD600=0.8,得到一代乳酸杆菌;
S53:在500ml的三角瓶中装入100ml的MRS液体培养基,在121℃下灭菌15min,冷却后接1ml所述一代乳酸杆菌,在37℃、180rpm的条件下培养至OD600=1.0,得到乳酸杆菌;
S54:向所述乳酸发酵基质中接种体积为乳酸发酵基质体积的5%的所述乳酸杆菌,在38℃、 200rpm条件下发酵96h,得到乳酸杆菌发酵液;
S6:收集所述乳酸杆菌发酵液中悬浮于发酵液上层的悬浮物;
S7:将收集的所述悬浮物水洗至中性,得到中性悬浮物;
S8:向所述中性悬浮物中按固液比为1:12加入30%的双氧水,在65℃水浴条件下浸泡脱色6h,得到脱色悬浮物;
S9:将所述脱色悬浮物洗净后烘干,得到美洲大蠊甲壳素。
表1:甲壳素提取实验数据
蛋白含量(%) | 得率(%) | 灰分(%) | 纯度(%) | |
实施例1 | 1.98 | 4.7 | 1.46 | 96.21 |
实施例2 | 1.96 | 5.0 | 1.42 | 96.62 |
实施例3 | 1.97 | 4.0 | 1.48 | 95.87 |
蛋白含量通过BCA法得到。
本发明涉及的方法制备的甲壳素蛋白含量低于2%,甲壳素得率为4-5%,灰分低于1.5%,纯度最高为96.62%,实施例2提取效果最佳;整个提取过程方法简单,节能环保,成本较低,得到的甲壳素质量较好,且提取过程中不会发生产生腐败,得到的产物无苦涩味和腥臭味。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式,不应看作是对其他实施例的排除,而可用于各种其他组合、修改和环境,并能够在本文所述构想范围内,通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围,则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一种从美洲大蠊药渣中提取甲壳素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:将美洲大蠊药渣在40-50℃干燥后粉碎,并过60-80目筛网,得到药渣粉;
S2:在所述药渣粉中添加葡萄糖、酵母膏和水后搅拌均匀,得到混合物,对所述混合物进行灭菌后得到药渣培养基质;
S3:在所述药渣培养基质中接种枯草芽孢杆菌,发酵,后得到枯草芽孢杆菌发酵液;
S4:向所述枯草芽孢杆菌发酵液中加入体积为所述药渣培养基质体积的4-6%的葡萄糖后搅拌均匀,得到乳酸发酵基质;
S5:向所述乳酸发酵基质中接种乳酸杆菌,发酵,得到乳酸杆菌发酵液;
S6:收集所述乳酸杆菌发酵液中悬浮于发酵液上层的悬浮物;
S7:将收集的所述悬浮物水洗至中性,得到中性悬浮物;
S8:向所述中性悬浮物中加入双氧水,在55-65℃水浴条件下浸泡脱色,得到脱色悬浮物;
S9:将所述脱色悬浮物洗净后烘干,得到美洲大蠊甲壳素。
2.根据权利要求1所述的一种从美洲大蠊药渣中提取甲壳素的方法,其特征在于:步骤S3中枯草芽孢杆菌的接种量为所述药渣培养基质体积的1-3%。
3.根据权利要求1所述的一种从美洲大蠊药渣中提取甲壳素的方法,其特征在于:步骤S5中所述乳酸杆菌为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌中的任意一种或多种。
4.根据权利要求3所述的一种从美洲大蠊药渣中提取甲壳素的方法,其特征在于:所述乳酸杆菌的接种量为乳酸发酵基质体积的2-5%。
5.根据权利要求1所述的一种从美洲大蠊药渣中提取甲壳素的方法,其特征在于:接种所述枯草芽孢杆菌和所述乳酸杆菌后分别在35-38℃、150-200rpm的条件下发酵72-96h。
6.根据权利要求1所述的一种从美洲大蠊药渣中提取甲壳素的方法,其特征在于:步骤S8中向所述中性悬浮物中按固液比为1:12加入30%的双氧水,60℃脱色6h。
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