CN103409347B - 一种产碱性蛋白酶的菌株及其工业化液体发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产碱性蛋白酶的菌株及其工业化液体发酵方法，属于生物工程技术领域，所述产碱性蛋白酶的菌株，具体为嗜碱芽孢杆菌（Bacillus？alcalophilus）突变株Ap180，保藏号为CGMCC？NO.7545。所述菌株由盐碱地的野生菌经反复的紫外诱变及亚硝基胍诱变、筛选获得，特性是产碱性蛋白酶效率高，稳定性好。本发明提供了一种适于工业化生产产碱性蛋白酶的嗜碱芽孢杆菌菌种，并优化了相应的发酵机制。该发酵机制，过程操作简便，培养条件温和，发酵酶活力在80000u/ml以上，降低了单位酶活的生产成本，大大满足了市场的需要。使碱性蛋白酶能够在洗涤剂、饲料、皮革制造等行业中得到更为广泛的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体是一种产碱性蛋白酶的菌株及其工业化液体发酵方法。
背景技术
碱性蛋白酶（Alkaline Protease）是一种最适PH为9-11的蛋白酶类，分子量26000-34000道尔顿，一般在PH5-10时较稳定。由于其活性中心含丝氨酸（Ser），故属于丝氨酸蛋白酶。它不但能水解肽键，还具有水解酯键、酰胺键和转酯及转肽的功能。广泛应用于洗涤剂、医疗、丝绸、制革等行业。
近年来，随着人们生活水平的提高以及环境保护的需要，含磷洗涤剂已基本被淘汰，取而代之的是各种加酶洗涤剂的大量应用。因洗涤剂的水溶液一般呈碱性，PH大约为9-11，故碱性蛋白酶已成为目前市场上使用最多的洗涤添加剂。它能大幅度提高洗涤去污能力，特别对奶渍、汗渍、血渍、油渍等蛋白类污垢,具有独特的洗涤效果。随着洗涤剂行业迅速发展，洗涤剂的用量增长迅速，市场对碱性蛋白酶的需求亦大幅度增加。
但是，目前市场上可产业化生产的碱性蛋白酶酶活力普遍较低，使得单位酶活力所对应的生产成本相对较高，这远远不能满足当前洗涤剂等行业的需求。如何提高碱性蛋白酶的酶活力，降低生产成本已成为现在最需要解决的问题。因此，使用优良菌株、改进发酵工艺，提高碱性蛋白酶酶活力对酶制剂工业具有非常广阔的开发潜力和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种产碱性蛋白酶的菌株及其工业化液体发酵方法。
本发明提供的产碱性蛋白酶的菌株具体为嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）突变株Ap180。该菌株已于2013年5月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编100101），保藏号为CGMCCNO.7545。
所述菌株由盐碱地的野生菌经反复的紫外诱变及亚硝基胍诱变筛选获得，特性是产碱性蛋白酶效率高，稳定性好。
所述菌株经液体深层通气发酵发酵液酶活力在80000u/ml以上。
所述菌株生产的碱性蛋白酶的最适作用温度为40-60℃，最适pH值为9-11。
本发明还提供一种以上述嗜碱芽孢杆菌菌株为生产菌株的液体深层通气发酵方法，包括如下步骤：
（1）一级种子培养：将嗜碱芽孢杆菌Ap180斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度34-35℃，培养时间10-15h；
（2）二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
（3）三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度34-35℃，培养时间10-15h；
（4）一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度32-36℃，搅拌速度200-400rpm，通风量（V/V）1:1-2,罐压0.05MPa,培养时间10-20小时；
（5）发酵培养：将一级种子罐菌种以5-10%接种量接入发酵罐，培养温度32-36℃，搅拌速度200-700r/m，通风量（V/V）1:1-3,罐压0.05MPa,培养时间70-100h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制发酵过程溶解氧15-30%；
pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH保持在7.0-7.5；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量使发酵液还原糖含量维持为2mg/ml-5mg/ml；
放罐标准：60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
（6）提取：发酵结束后，将发酵液进行絮凝、压滤、超滤膜浓缩后即得到不同规格的碱性蛋白酶成品。
所述一级、二级、三级种子培养基组成为：
酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，不足部分纯净水补足，pH7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min。
所述种子罐培养基组成为：
酵母粉0.4-0.8%，麦芽糊精5-15%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米浆0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，硫酸镁0.05-0.1%，不足部分纯净水补足，pH7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min。
所述发酵罐培养基组成为：
酵母粉0.7-1.4%，玉米粉10-15%，豆饼粉1.5-3.0%，玉米浆0.5-1%，氯化钙0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，硫酸镁0.05-0.1%，柠檬酸钠0.1-0.5%，不足部分纯净水补足，pH7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min。
所述补料培养基组成为：麦芽糊精30-50%，豆饼水解液2.0-5.0%，不足部分纯净水补足，pH7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min。
所述发酵罐培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调pH6.0，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温15-30min，然后缓慢升温至90℃保温15-30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min备用。
所述豆饼水解液的制备方法为：将豆饼与水按照质量比1:5-7均匀混合，然后加入豆饼质量5-7%的石灰，搅拌均匀，于120℃反应60-70min，降至室温，既得豆饼水解液。
有益效果：
本发明提供了一种适于工业化生产产碱性蛋白酶的嗜碱芽孢杆菌菌种，并优化了相应的发酵机制。该发酵机制，过程操作简便，培养条件温和，发酵酶活力在80000u/ml以上，降低了单位酶活的生产成本，大大满足了市场的需要。使碱性蛋白酶能够在洗涤剂、饲料、皮革制造等行业中得到更为广泛的应用。
附图说明
图1为实施例3发酵过程酶活力增长曲线；
图2为实施例4发酵过程酶活力增长曲线；
图3为实施例5发酵过程酶活力增长曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：出发菌株的筛选
（1）从有机质含量丰富的盐碱地取2g土样，加到含有50mL冷却无菌水的小三角瓶中，摇床200r/min，摇动20min，然后放在80℃水浴锅中，水浴10min，不断摇动三角瓶混匀土样，静置5min吸取上清液100μL，依次梯度稀释到10-1～10-9浓度，选取10-3，10-4，10-5，10-6浓度涂布牛肉膏蛋白胨平板，37℃培养24h，继续30℃培养24h。
（2）根据微生物菌落的形状、大小、表面结构、边缘结构、质地、光泽、透明度、颜色和产生的可溶色素等方面的特征，用接种环将孤立的单个菌落挑出，移到筛选培养基平板上，并编号，34℃培养48h。
所述筛选培养基组成为：牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白陈10g，琼脂粉15g，蒸馏水l000mL，pH7.2，121℃灭菌20min。
（3）待菌株在平板上培养48h后，将不同编号平板上的优势菌落接种到筛选培养基斜面上，保藏以供复筛使用。
（4）将保藏的不同编号的菌株分别接种到斜面活化2次后，将活化好的菌种接入种子培养基，180r/min，37℃，培养18h。再按5%的接种量接种到发酵培养基，200r/min，28℃，发酵48h。将所得发酵液10000r/min离心去菌体，发酵液上清液进行碱性蛋白酶酶活力测定实验。
所述种子发酵培养基组成为：葡萄糖2g，蛋白胨1g，NaH2PO4·2H2O0.2g，Na2HPO4·2H2O0.4g，MgSO4·7H2O0.05g，蒸馏水100ml，pH7.4，121℃灭菌20min。
所述发酵培养基组成为：葡萄糖2g，蛋白胨2g，NaH2PO4·2H2O0.02g，Na2HPO4·2H2O0.04g，MgSO4·7H2O0.01g，CaCl20.01g，MnSO40.002g,蒸馏水l00mL pH7.4，121℃灭菌20min。
（5）挑选产碱性蛋白酶酶活力强的菌株进行甘油保存，得到本发明菌株的出发菌株。
实施例2菌株的诱变筛选
（1）紫外线诱变
吸取出发菌株10-12h菌液，注入平面皿中，每个平面皿的菌液量为10mL。将盛有菌液的平皿置于诱变箱内紫外灯管下的磁力搅拌器上，平皿距紫外灯管的垂直距离为30cm。打开紫外灯，预热30min，使光波稳定。调节搅拌子的转速，转速稳定后，打开平皿盖子照射，并开始计时，平皿的照射时间分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10min。从每个平皿中取出0.1ml的菌悬液，做适当稀释，得不同稀释度的菌悬液。吸取稀释后的菌悬液0.3ml涂布分离培养基平板，置于恒温箱培养(为避免光复活平皿需用黑纸或牛皮纸包裹，整个诱变操作过程均在红光下进行)。
（2）亚硝基胍诱变
将亚硝基胍少许粉末置于平板培养基中央，培养过程中，亚硝基胍逐步扩散、在平板上形成自中央向外的浓度梯度，经培养可出现以平板中央为圆心的同心圆菌落群，平板中央临近区域菌落数为零，平板边缘区域菌落依次增多。出发菌种在不同致死率下产生不同程度变异菌种。
（3）平板初筛
利用透明圈大小进行初筛。将诱变后长出的菌落点种在分离平板上，34-35℃培养10-15h后，观察其周围透明圈大小，选取酪蛋白透明圈直径与菌落直径比值较大的菌落进行摇瓶复筛。
所述分离平板培养基组成为：酵母粉0.2%，酪蛋白0.2%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.7%，磷酸氢二钾1.0%，氯化钠0.1%，琼脂1.8%，不足部分纯净水补足，pH7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min。
（4）摇瓶复筛
将初筛得到的菌落接种于复筛培养基中，34℃培养48小时，检测碱性蛋白酶酶活。
所述复筛培养基组成为：酵母粉0.2%，葡萄糖1%，蛋白胨0.4%，玉米粉0.6%，磷酸氢二钾0.8%，不足部分纯净水补足，pH7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min。
（5）菌株稳定性检测：
将复筛所得高酶活菌株进行传代培养，并跟踪摇瓶检测其酶活。经摇瓶复筛，最终确定SJ-14-62为生产菌株，并将其命名为Ap180，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.7545。该菌株的特性是产碱性蛋白酶效率高，稳定性好。
高产菌株Ap180连续传代6次的摇瓶结果如表1所示：
表1.菌株Ap180稳定性检测结果
| 摇瓶酶活力（u/ml） | 相对酶活力（%） | |
| F1 | 42309 | 100 |
| F2 | 42568 | 100.6 |
| F3 | 43150 | 102.0 |
| F4 | 42106 | 99.5 |
| F5 | 43300 | 102.3 |
| F6 | 43098 | 101.9 |
实施例3
一种以Ap180嗜碱芽孢杆菌菌株为生产菌株的液体深层通气发酵方法，包括如下步骤：
（1）一级种子培养：将嗜碱芽孢杆菌Ap180斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度34℃，培养时间11h；
（2）二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
（3）三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度34℃，培养时间11h；
（4）一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度35℃，搅拌速度200rpm，通风量（V/V）1:1,罐压0.05MPa,培养时间15小时；
（5）发酵培养：将一级种子罐菌种以8%接种量接入发酵罐，培养温度34℃，搅拌速度200r/m，通风量（V/V）1:1,罐压0.05MPa,培养时间84h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制发酵过程溶解氧15%；
pH控制：通过补氨水，控制发酵过程中pH保持在7.2；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至5mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量使发酵液还原糖含量维持为2mg/ml-5mg/ml；
以Folin试剂显色法测定放罐发酵液酶活力为83210u/ml。
（6）提取：发酵结束后，将发酵液进行絮凝、压滤、超滤膜浓缩后即得到不同规格的碱性蛋白酶成品。
所述一级、二级、三级种子培养基组成为：
酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氢二钾0.8%，不足部分纯净水补足，pH7.0，121℃灭菌30min。
所述种子罐培养基组成为：
酵母粉0.4%，麦芽糊精5%，蛋白胨0.1%，玉米浆0.1%，磷酸氢二钾0.8%，硫酸镁0.05%，不足部分纯净水补足，pH7.0，121℃灭菌30min。
所述发酵罐培养基组成为：
酵母粉0.7%，玉米粉10%，豆饼粉1.5%，玉米浆0.5%，氯化钙0.1%，磷酸氢二钾0.8%，硫酸镁0.05%，柠檬酸钠0.1%，不足部分纯净水补足，pH7.0，121℃灭菌30min。
所述补料培养基组成为：麦芽糊精30%，豆饼水解液2.0%，不足部分纯净水补足，pH7.0，121℃灭菌30min。
所述发酵罐培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调pH6.0，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温15min，然后缓慢升温至90℃保温15min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH7.5，121℃灭菌30min备用。
所述中温淀粉酶与高温淀粉酶均为山东隆科特酶制剂有限公司生产。
所述豆饼水解液的制备方法为：将豆饼与水按照质量比1:5均匀混合，然后加入豆饼质量5%的石灰，搅拌均匀，于120℃反应60min，降至室温，既得豆饼水解液。
实施例4
一种以Ap180嗜碱芽孢杆菌菌株为生产菌株的液体深层通气发酵方法，包括如下步骤：
（1）一级种子培养：将嗜碱芽孢杆菌Ap180斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度35℃，培养时间13h；
（2）二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
（3）三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度35℃，培养时间13h；
（4）一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度35℃，搅拌速度300rpm，通风量（V/V）1:1.5,罐压0.05MPa,培养时间15小时；
（5）发酵培养：将一级种子罐菌种以10%接种量接入发酵罐，培养温度34℃，搅拌速度500r/m，通风量（V/V）1:2,罐压0.05MPa,培养时间95h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制发酵过程溶解氧25%；
pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH保持在7.2；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至5mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量使发酵液还原糖含量维持为2mg/ml-5mg/ml；
以Folin试剂显色法测定放罐发酵液酶活力为82196u/ml。
（6）提取：发酵结束后，将发酵液进行絮凝、压滤、超滤膜浓缩后加入稳定剂除菌即得到不同规格的碱性蛋白酶成品。
所述一级、二级、三级种子培养基组成为：
酵母粉0.4%，葡萄糖1.2%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氢二钾1.0%，不足部分纯净水补足，pH7.5，122℃灭菌35min。
所述种子罐培养基组成为：
酵母粉0.6%，麦芽糊精12%，蛋白胨0.3%，玉米浆0.3%，磷酸氢二钾1.0%，硫酸镁0.08%，不足部分纯净水补足，pH7.5，122℃灭菌35min。
所述发酵罐培养基组成为：
酵母粉1.0%，玉米粉13%，豆饼粉1.5%，玉米浆1%，氯化钙0.3%，磷酸氢二钾1.5%，硫酸镁0.06%，柠檬酸钠0.2%，不足部分纯净水补足，pH7.5，122℃灭菌35min。
所述补料培养基组成为：麦芽糊精35%，豆饼水解液3.0%，不足部分纯净水补足，pH7.5，122℃灭菌35min。
所述发酵罐培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调pH6.0，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温20min，然后缓慢升温至90℃保温20min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH7.6，122℃灭菌35min备用。
所述中温淀粉酶与高温淀粉酶均为山东隆科特酶制剂有限公司生产。
所述豆饼水解液的制备方法为：将豆饼与水按照质量比1:6均匀混合，然后加入豆饼质量6%的石灰，搅拌均匀，于120℃反应65min，降至室温，既得豆饼水解液。
实施例5
一种以Ap180嗜碱芽孢杆菌菌株为生产菌株的液体深层通气发酵方法，包括如下步骤：
（1）一级种子培养：将嗜碱芽孢杆菌Ap180斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度34℃，培养时间15h；
（2）二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
（3）三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度34℃，培养时间15h；
（4）一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度34℃，搅拌速度400rpm，通风量（V/V）1:2,罐压0.05MPa,培养时间16小时；
（5）发酵培养：将一级种子罐菌种以10%接种量接入发酵罐，培养温度34℃，搅拌速度700r/m，通风量（V/V）1:3,罐压0.05MPa,培养时间96h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制发酵过程溶解氧25%；
pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH保持在7.3；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至5mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量使发酵液还原糖含量维持为2mg/ml-5mg/ml；
以Folin试剂显色法测定放罐发酵液酶活力为84105u/ml。
（6）提取：发酵结束后，将发酵液进行絮凝、压滤、超滤膜浓缩后加入稳定剂除菌即得到不同规格的碱性蛋白酶成品。
所述一级、二级、三级种子培养基组成为：
酵母粉0.5%，葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.8%，磷酸氢二钾1.5%，不足部分纯净水补足，pH8.0，123℃灭菌40min。
所述种子罐培养基组成为：
酵母粉0.8%，麦芽糊精15%，蛋白胨0.5%，玉米浆0.5%，磷酸氢二钾1.5%，硫酸镁0.1%，不足部分纯净水补足，pH8.0，123℃灭菌40min。
所述发酵罐培养基组成为：
酵母粉1.4%，玉米粉14%，豆饼粉1.8%，玉米浆1%，氯化钙0.2%，磷酸氢二钾1.3%，硫酸镁0.05%，柠檬酸钠0.1%，不足部分纯净水补足，pH8.0，123℃灭菌40min。
所述补料培养基组成为：麦芽糊精45%，豆饼水解液4.0%，不足部分纯净水补足，pH8.0，123℃灭菌40min。
所述发酵培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调pH6.0，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温30min，然后缓慢升温至90℃保温30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH8.0，123℃灭菌40min备用。
所述中温淀粉酶与高温淀粉酶均为山东隆科特酶制剂有限公司生产。
所述豆饼水解液的制备方法为：将豆饼与水按照质量比1:7均匀混合，然后加入豆饼质量7%的石灰，搅拌均匀，于120℃反应70min，降至室温，既得豆饼水解液。
Claims (3)
1.一种产碱性蛋白酶的菌株，具体为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)Ap180，保藏号为CGMCC NO.7545。
2.一种以权利要求1所述的产碱性蛋白酶的菌株为菌种的工业化液体发酵方法，包括如下步骤：
(1)一级种子培养：将嗜碱芽孢杆菌Ap180斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度34-35℃，培养时间10-15h；
(2)二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
(3)三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度34-35℃，培养时间10-15h；
(4)一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度32-36℃，搅拌速度200-400rpm，通风量V/V 1:1-2,罐压0.05MPa,培养时间10-20小时；
(5)发酵培养：将一级种子罐菌种以5-10％接种量接入发酵罐，培养温度32-36℃，搅拌速度200-700r/m，通风量V/V 1:1-3,罐压0.05MPa,培养时间70-100h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30％；
pH值控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值值保持在7.0-7.5；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量使发酵液还原糖含量维持为2mg/ml-5mg/ml；
(6)提取：发酵结束后，将发酵液进行絮凝、压滤、超滤膜浓缩后即得到不同规格的碱性蛋白酶成品；
一级、二级、三级种子培养基组成为：酵母粉0.3-0.5％，葡萄糖1-1.5％，蛋白胨0.3-0.5％，牛肉膏0.5-0.8％，磷酸氢二钾0.8-1.5％，不足部分纯净水补足，pH值7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min；
种子罐培养基组成为：酵母粉0.4-0.8％，麦芽糊精5-15％，蛋白胨0.1-0.5％，玉米浆0.1-0.5％，磷酸氢二钾0.8-1.5％，硫酸镁0.05-0.1％，不足部分纯净水补足，pH值7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min；
发酵罐培养基组成为：酵母粉0.7-1.4％，玉米粉10-15％，豆饼粉1.5-3.0％，玉米浆0.5-1％，氯化钙0.1-0.5％，磷酸氢二钾0.8-1.5％，硫酸镁0.05-0.1％，柠檬酸钠0.1-0.5％，不足部分纯净水补足，pH值7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min；
所述补料培养基组成为：麦芽糊精30-50％，豆饼水解液2.0-5.0％，不足部分纯净水补 足，pH值7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min；
发酵罐培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调pH值为6.0，加入中温淀粉酶3u/g玉米粉与高温淀粉酶30u/g玉米粉，同时边搅拌边升温至70℃保温15-30min，然后缓慢升温至90℃保温15-30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH值为7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min备用；
所述豆饼水解液的制备方法为：将豆饼与水按照质量比1:5-7均匀混合，然后加入豆饼质量5-7％的石灰，搅拌均匀，于120℃反应60-70min，降至室温，即得豆饼水解液。
3.如权利要求2所述的液体发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)一级种子培养：将嗜碱芽孢杆菌Ap180斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度34℃，培养时间15h；
(2)二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
(3)三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度34℃，培养时间15h；
(4)一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度34℃，搅拌速度400rpm，通风量V/V 1:2,罐压0.05MPa,培养时间16小时；
(5)发酵培养：将一级种子罐菌种以10％接种量接入发酵罐，培养温度34℃，搅拌速度700r/m，通风量V/V 1:3,罐压0.05MPa,培养时间96h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧25％；
pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH保持在7.3；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至5mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；
以Folin试剂显色法测定放罐发酵液酶活力为84105u/ml；
(6)提取：发酵结束后，将发酵液进行絮凝、压滤、超滤膜浓缩后加入稳定剂除菌即得到不同规格的碱性蛋白酶成品；
一级、二级、三级种子培养基组成为：
酵母粉0.5％，葡萄糖1.5％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.8％，磷酸氢二钾1.5％，不足部分纯净水补足，pH8.0，123℃灭菌40min；
种子罐培养基组成为：
酵母粉0.8％，麦芽糊精15％，蛋白胨0.5％，玉米浆0.5％，磷酸氢二钾1.5％，硫酸镁 0.1％，不足部分纯净水补足，pH8.0，123℃灭菌40min；
发酵罐培养基组成为：
酵母粉1.4％，玉米粉14％，豆饼粉1.8％，玉米浆1％，氯化钙0.2％，磷酸氢二钾1.3％，硫酸镁0.05％，柠檬酸钠0.1％，不足部分纯净水补足，pH8.0，123℃灭菌40min；
所述补料培养基组成为：麦芽糊精45％，豆饼水解液4.0％，不足部分纯净水补足，pH78.0，123℃灭菌40min；
发酵培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调pH6.0，加入中温淀粉酶3u/g玉米粉与高温淀粉酶30u/g玉米粉，同时边搅拌边升温至70℃保温30min，然后缓慢升温至90℃保温30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH8.0，123℃灭菌40min备用；
所述豆饼水解液的制备方法为：将豆饼与水按照质量比1:7均匀混合，然后加入豆饼质量7％的石灰，搅拌均匀，于120℃反应70min，降至室温，即得豆饼水解液。
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