CN112931880A - 促益生菌生长和降血糖的糖基化鱼皮蛋白肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了促益生菌生长和降血糖的糖基化鱼皮蛋白肽，按质量计，包括以下原料：10～12份蛋白肽、1份低聚半乳糖通过糖基化反应生产糖基化鱼皮蛋白肽；所述蛋白肽中氨基酸序列为：Ala‑Gly‑Pro‑Arg‑Gly‑Pro‑Ala‑Gly‑Pr o‑Ile‑Asn,Gly‑Asp‑Glu‑Ile‑Pro‑Ala‑Gly‑Ser‑Pro‑His的肽达到50％以上。本发明还公开了提供上述糖基化鱼皮蛋白肽的制备方法。本发明的有益效果是：(1)本发明利用鳕鱼皮和低聚半乳糖开发的糖基化鱼皮蛋白肽整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性；(2)开发的糖基化鱼皮蛋白肽具有较好的促进益生菌生长和降血糖作用；(3)本发明利用特定频率超声波结合超高压技术处理的蛋白液，明显改善鱼皮蛋白对酶的敏感性，酶解液中蛋白质含量为11％以上，降低酶的使用量。
Description
技术领域
本发明涉及鱼皮蛋白肽领域，尤其涉及促益生菌生长和降血糖的糖基化鱼皮蛋白肽及其制备方法。
背景技术
益生菌是一类对人体健康具有重大意义的微生物。常见有双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、嗜热链球菌属等乳酸菌。益生菌具有促进机体吸收营养物质，提高机体免疫力，提高机体抗氧化水平，抑制肠道炎症等功能，对人体健康具有重要作用，如何高效促进益生菌的生长成为产业需要解决的问题。目前有许多研究报道，功能性低聚糖可以选择性地促进乳酸菌的增殖，常见的功能性低聚糖有大豆低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖等。近些年来，随着对人类健康研究的深入和物质分离纯化、鉴定技术的进步，介于氨基酸单体与大分子蛋白质之间的多肽的生理功能日益赢得科学界关注。依据肽的原料来源，外源性生物活性肽可分为动物源、植物源、微生物源活性肽等。生物活性肽的众多来源中，水生生物凭借资源丰富、生理结构和生理功能与陆生生物差别较大的特点，成为外源性生物活性肽资源的宝库。目前水生生物活性肽，发现了一系列具有抗氧化、降血压、降血糖、抗肿瘤等生理功能的活性肽。但关于蛋白肽与低聚糖结合对益生菌生长及降血糖的作用未见相关的公开文件报道。
本发明针对目前我国鱼皮蛋白资源没有得到充分利用，并根据鱼皮蛋白的结构特性，以鱼皮为原料，通过对鱼皮超高压、高频超声波等预处理，在不添加任何酸和碱条件下，利用多种蛋白复合酶进行分步酶解，通过膜分离、凝胶分离及反相HPLC分离技术，糖基化改性技术，开发了富含具有特定氨基酸多肽序列为Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Asn,Gly-Asp-Glu-Ile-Pro-Ala-Gly-Ser-Pro-His的具有促进益生菌生长和降血糖功能的糖基化鱼皮蛋白肽，以及具有特定功能的糖基化鱼皮蛋白肽的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以鱼皮为原料制备具有促进益生菌生长和降血糖的糖基化鱼皮蛋白肽，该蛋白肽具有较好的促进益生菌生长和降血糖作用。
促益生菌生长和降血糖的糖基化鱼皮蛋白肽，其特征在于，按质量计，包括以下原料：10～12份蛋白肽、1份低聚半乳糖；所述蛋白肽中氨基酸序列为：Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Asn,Gly-Asp-Glu-Ile-Pro-Ala-Gly-Ser-Pro-His的蛋白肽有50％以上。
本发明另一目的是提供上述糖基化鱼皮蛋白肽的制备方法，按质量计，包括如下步骤：
步骤(1)：选用1份鳕鱼皮，清洗后将鳕鱼皮打成浆，然后加入0.5～2.0份水，加热至110～125℃煮制60～120分钟，然后除去上层脂肪，得到去脂的蛋白液；
步骤(2)：将步骤(1)得到的蛋白液，温度调整到70～80℃，然后进行频率为120～140kHz的超声波处理20～30分钟，再进行压力为80～140MPa的高静水压力处理10～30分钟；
步骤(3)：调节步骤(2)得到的蛋白液中蛋白含量到10～12％，然后进行分步酶解，第一步加入蛋白液中蛋白质量0.4～0.8％的第一复合蛋白酶，在50～60℃条件下进行酶解反应0.5～2.0h；第一复合蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，其中碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1～2：1：0.5；第二步加入蛋白液中蛋白质量0.1～0.3％的第二复合蛋白酶，在50～60℃条件下进行酶解反应0.2～1.0h，第二复合蛋白酶包括菠萝蛋白酶、风味蛋白酶，其中菠萝蛋白酶、风味蛋白酶的质量比为1～2：1；在90～95℃下保温10～20分钟，然后冷却至室温，然后进行过滤分离，收集分离液；
步骤(4)：将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，先利用孔径为5000道尔顿的膜将分子量小于5000道尔顿的蛋白肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来，得到蛋白肽溶液；
步骤(5)：将步骤(4)所得的蛋白肽溶液，经过Sepha dex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第3个洗脱峰，然后通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱对得到的鱼皮蛋白肽进行1次分离，洗脱液为5～90％乙腈溶液，取第9～13分收集的蛋白肽溶液；通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，其中氨基酸序列为：Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Asn,Gly-Asp-Glu-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-His的肽的含量为50～55％；
步骤(6)：将步骤(5)所得的蛋白肽溶液与低聚半乳糖在90～100℃反应30～60min，蛋白肽与低聚半乳糖的质量比为10～12：1，然后通过浓缩、冷冻干燥，得到糖基化鱼皮蛋白肽粉。
步骤(1)中使用符合饮用水卫生标准的清洁水对鳕鱼皮进行清洗。
步骤(1)中通过打浆机对鳕鱼皮进行打浆。
步骤(3)中，第二步酶解，冷却至室温后，通过板框过滤进行过滤分离，收集分离液。
本发明的有益效果是：(1)本发明利用鳕鱼皮和低聚半乳糖开发的糖基化鱼皮蛋白肽整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性；(2)开发的糖基化鱼皮蛋白肽具有较好的促进益生菌生长和降血糖作用；(3)本发明利用特定频率超声波结合超高压技术处理的蛋白液，明显改善鱼皮蛋白对酶的敏感性，酶解液中蛋白质含量为11％以上，降低酶的使用量；(4)开发的产品在温和条件下，经过适度酶解获得的鱼皮蛋白肽与低聚半乳糖在较温和的条件下进行反应，不加任何添加剂；(5)本发明开发的产品具有良好的风味和色泽，能广泛应用于特需食品和营养食品；(6)本发明开发的产品具有较明确的肽的组成，其中Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Asn,Gly-Asp-Glu-Ile-Pro-Ala-Gly-Ser-Pro-His的肽的含量为52％以上。
具体实施方式
下面对本发明的实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1
一种促益生菌生长和降血糖的糖基化鱼皮蛋白肽制备方法，包括以下步骤，
(1)选用冷冻鳕鱼皮，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,用打浆机将鱼皮打成浆，然后加入0.5倍鱼皮重量的水，通过125℃处理60分钟，得到鱼皮浆液。去上层脂肪，得到去脂的鱼皮蛋白液。
(2)将(1)得到的鱼皮蛋白液，温度调整到70℃，利用超声波发生器经超声波(频率为140kHz)处理20分钟，再利用高静水压力(80Mpa)处理30分钟，改变鱼皮蛋白的组织结构。
(3)调节鱼皮蛋白液中蛋白含量为12％，按照鱼皮蛋白液中蛋白重量0.6％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步为蛋白重量0.5％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶)，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的质量比为2：1：0.5，在50℃条件下进行酶解反应2.0h；第二步为蛋白重量0.1％复合蛋白酶(菠萝蛋白酶、风味蛋白酶)，菠萝蛋白酶、风味蛋白酶的质量比为1：1，在50℃条件下进行酶解反应1.0h；在95℃下保温10分钟，冷却至室温，通过板框过滤分离，收集分离液。
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过Seph adex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第3个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，取9～13分分收集的肽溶液；通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Asn,Gly-Asp-Glu-Ile-Pro-Ala-Gly-Ser-Pro-His的肽的含量为52.8％。
(6)将步骤(5)得到的肽溶液与低聚半乳糖(肽：低聚半乳糖的质量比为10：1)在90℃反应60min,通过浓缩、冷冻干燥，得到糖基化鱼皮蛋白肽粉。
实施例2
一种促益生菌生长和降血糖的糖基化鱼皮蛋白肽制备方法，包括以下步骤，
(1)选用冷冻鳕鱼皮，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,用打浆机将鱼皮打成浆，然后加入1.0倍鱼皮重量的水，通过110℃处理120分钟，得到鱼皮浆液。去上层脂肪，得到去脂的鱼皮蛋白液。
(2)将(1)得到的鱼皮蛋白液，温度调整到80℃，利用超声波发生器经超声波(频率为80kH)处理20分钟，再利用高静水压力(120Mpa)处理10分钟，改变鱼皮蛋白的组织结构。
(3)调节鱼皮蛋白液中蛋白含量为12％，按照鱼皮蛋白液中蛋白重量1.0％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步为蛋白重量0.8％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶)，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的质量比为1：1：0.5，在60℃条件下进行酶解反应0.5h；第二步为蛋白重量0.2％复合蛋白酶(菠萝蛋白酶、风味蛋白酶)，菠萝蛋白酶、风味蛋白酶的质量比为2：1，在50℃条件下进行酶解反应0.5h；在90℃下保温20分钟，冷却至室温，通过板框过滤分离，收集分离液。
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过Seph adex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第3个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，取9～13分分收集的肽溶液；通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Asn,Gly-Asp-Glu-Ile-Pro-Ala-Gly-Ser-Pro-His的肽的含量为52.1％。
(6)将步骤(5)得到的肽溶液与低聚半乳糖(肽：低聚半乳糖的质量比为12：1)在95℃反应45min,通过浓缩、冷冻干燥，得到糖基化鱼皮蛋白肽。
实施例3
一种促益生菌生长和降血糖的糖基化鱼皮蛋白肽制备方法，包括以下步骤，
(1)选用冷冻鳕鱼皮，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,用打浆机将鱼皮打成浆，然后加入2.0倍鱼皮重量的水，通过110℃处理120分钟，得到鱼皮浆液。去上层脂肪，得到去脂的鱼皮蛋白液。
(2)将(1)得到的鱼皮蛋白液，温度调整到70℃，利用超声波发生器经超声波(频率为100kH)处理25分钟，再利用高静水压力(100Mpa)处理20分钟，改变鱼皮蛋白的组织结构。
(3)调节鱼皮蛋白液中蛋白含量为11％，按照鱼皮蛋白液中蛋白重量0.8％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步为蛋白重量0.6％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶)，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的质量比为2：1：0.5，在60℃条件下进行酶解反应1.0h；第二步为蛋白重量0.2％复合蛋白酶(菠萝蛋白酶、风味蛋白酶)，菠萝蛋白酶、风味蛋白酶的质量比为2：1，在50℃条件下进行酶解反应1.0h；在95℃下保温15分钟，冷却至室温，通过板框过滤分离，收集分离液。
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过Seph adex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第3个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，取9～13分分收集的肽溶液；通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Asn,Gly-Asp-Glu-Ile-Pro-Ala-Gly-Ser-Pro-His的肽的含量为52.7％。
(6)将步骤(5)得到的肽溶液与低聚半乳糖(肽：低聚半乳糖的质量比为11：1)在100℃反应60min,通过浓缩、冷冻干燥，得到糖基化鱼皮蛋白肽。
实验例1
本发明糖基化鱼蛋白肽促进益生菌生长能力的测定试验，试验样品：样品1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3步骤(6)制备的糖基化鱼蛋白肽；样品4、5、6分别为实施例1中步骤(3)、(4)、(5)经过浓缩、冷冻干燥后制备的产品。
促进益生菌生长测定按照如下方法进行：
将活化好的益生菌菌种(乳双歧杆菌Bi-07和嗜酸乳杆菌)以液体培养基体积1％的量接种于对应的液体培养基(对照组为纯培养基，实验1组、2组、3组、4组、5组、6组为分别在相应的培养基中添加5％的样品1、2、3、4、5、6)，然后将接种菌液后的培养基在厌氧条件下37℃培养，培养至6、12、18、24h时分别取200μL菌液于96孔板中，用酶标仪测定菌液在600nm处的吸光度，测定OD600值。取0.5mL培养24h的菌液4.5mL于无菌生理盐水中进行梯度稀释，取合适稀释梯度的100μL菌悬液于固体培养基中进行涂布，将涂布好的平板放置于厌氧条件下37℃培养36h，取出计算菌落总数。具体结果见表1和表2。
表1各组样品对乳双歧杆菌Bi-07生长试验结果
表2各组样品对嗜酸乳杆菌生长试验结果
从表1和表2可知：本发明的糖基化鱼皮蛋白肽及各类蛋白肽产品和对照组相比对益生菌的生长有较好的提升作用，尤其是利用本发明的糖基化鱼皮蛋白肽具有显著提升促益生菌的生长作用。
实验例2
本发明糖基化鱼蛋白肽降血糖活性的测定试验，试验样品：样品1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3步骤(6)制备的糖基化鱼蛋白肽；样品4、5、6分别为实施例1步骤(3)、(4)、(5)经过浓缩、冷冻干燥后制备的产品；样品7为合成的氨基酸序列为Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Asn的纯肽产品；样品8为合成的氨基酸序列为Gly-Asp-Glu-Ile-Pro-Ala-Gly-Ser-Pro-His的纯肽产品。
降血糖活性的测定按照如下方法进行：
样品的DPP-Ⅳ抑制能力按照如下方法进行测定：将样品用100mmol/L的Tris-HCL(pH8.0)缓冲液稀释至合适的浓度，吸取25μL样品稀释液与25μL底物(浓度为1.6mmol/L)混合，加入到96孔酶标板中。在37℃下孵育10min后，加入50μL DPP-IV酶液(酶活力为8U/L)，混匀后在37℃下精确孵育60min，立即加入100μL 1mol/L的醋酸-醋酸钠(pH 4.0)缓冲液终止反应，于405nm下测吸光值A，并根据下列公式计算样品的DPP-IV抑制率。
DPP-IV抑制率％＝{1-(A样品-A样品空白对照)/(A阴性对照-A阴性空白对照)}×100
A样品：为样品反应液在405nm处的吸光值A；
A样品空白对照：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液作为样品空白对照的吸光值A；
A阴性对照：以Tris-HCL缓冲液代替样品作为阴性对照的吸光值；
A阴性空白对照：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液和样品作为阴性空白对照的吸光值；
DPP-IV抑制的IC50值测定：测定样品在不同浓度下的DPP-IV抑制率，以多肽浓度的对数值与抑制率做回归曲线，得到回归方程，由此计算IC50，即50％的DPP-IV酶活性抑制时肽的浓度。具体结果见表3。
表3各组样品的DPP-IV抑制试验结果
从表3可知，本发明开发的糖基化鱼蛋白肽具有显著的促进益生菌的生长作用外，还有显著的降血糖作用，其DPP-IV抑制活性(IC50值)小于0.12mg/mL。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围。
Claims (5)
1.促益生菌生长和降血糖的糖基化鱼皮蛋白肽，其特征在于，按质量计，包括以下原料：10～12份蛋白肽、1份低聚半乳糖；所述蛋白肽中氨基酸序列为：Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Asn,Gly-Asp-Glu-Ile-Pro-Ala-Gly-Ser-Pro-His的蛋白肽有50％以上。
2.促益生菌生长和降血糖的糖基化鱼皮蛋白肽制备方法，其特征在于，按质量计，包括如下步骤：
步骤(1)：选用1份鳕鱼皮，清洗后将鳕鱼皮打成浆，然后加入0.5～2.0份水，加热至110～125℃煮制60～120分钟，然后除去上层脂肪，得到去脂的蛋白液；
步骤(2)：将步骤(1)得到的蛋白液，温度调整到70～80℃，然后进行频率为120～140kHz的超声波处理20～30分钟，再进行压力为80～140MPa的高静水压力处理10～30分钟；
步骤(3)：调节步骤(2)得到的蛋白液中蛋白含量到10～12％，然后进行分步酶解，第一步加入蛋白液中蛋白质量0.4～0.8％的第一复合蛋白酶，在50～60℃条件下进行酶解反应0.5～2.0h；第一复合蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，其中碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1～2：1：0.5；第二步加入蛋白液中蛋白质量0.1～0.3％的第二复合蛋白酶，在50～60℃条件下进行酶解反应0.2～1.0h，第二复合蛋白酶包括菠萝蛋白酶、风味蛋白酶，其中菠萝蛋白酶、风味蛋白酶的质量比为1～2：1；在90～95℃下保温10～20分钟，然后冷却至室温，然后进行过滤分离，收集分离液；
步骤(4)：将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，先利用孔径为5000道尔顿的膜将分子量小于5000道尔顿的蛋白肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来，得到蛋白肽溶液；
步骤(5)：将步骤(4)所得的蛋白肽溶液，经过SephadexG-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第3个洗脱峰，然后通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱对得到的鱼皮蛋白肽进行1次分离，洗脱液为5～90％乙腈溶液，取第9～13分收集的蛋白肽溶液；通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，其中氨基酸序列为：Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ile-Asn,Gly-Asp-Glu-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-His的肽的含量为50～55％；
步骤(6)：将步骤(5)所得的蛋白肽溶液与低聚半乳糖在90～100℃反应30～60min，蛋白肽与低聚半乳糖的质量比为10～12：1，然后通过浓缩、冷冻干燥，得到糖基化鱼皮蛋白肽粉。
3.根据权利要求2所述的促益生菌生长和降血糖的糖基化鱼皮蛋白肽制备方法，其特征在于，步骤(1)中使用符合饮用水卫生标准的清洁水对鳕鱼皮进行清洗。
4.根据权利要求2所述的促益生菌生长和降血糖的糖基化鱼皮蛋白肽制备方法，其特征在于，步骤(1)中通过打浆机对鳕鱼皮进行打浆。
5.根据权利要求2所述的促益生菌生长和降血糖的糖基化鱼皮蛋白肽制备方法，其特征在于，步骤(3)中，第二步酶解，冷却至室温后，通过板框过滤进行过滤分离，收集分离液。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210611 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |