CN112877391B - 一种具有促益生菌生长和抗氧化作用的牛骨蛋白糖肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及动物食品加工技术领域，具体涉及一种具有促益生菌生长和抗氧化作用的牛骨蛋白糖肽及其制备方法与应用。本发明提供的牛骨蛋白糖肽制备方法，包括如下步骤：以牛骨为原料，将经预处理的原料经两步酶解制得酶解物；所述两步酶解中，第一步酶解使用的复合蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶，第二步酶解使用的复合蛋白酶为风味蛋白酶、木瓜蛋白酶。本发明所述的牛骨胶原蛋白糖肽是牛骨胶原蛋白肽与低聚果糖的糖基化反应产物，且含有特定的氨基酸多肽序列，具有促进益生菌生长和抗氧化的功能。
Description
技术领域
本发明涉及动物食品加工技术领域，具体涉及一种具有促进益生菌生长和抗氧化功能的牛骨蛋白糖肽，以及所述牛骨蛋白糖肽的制备方法。
背景技术
益生菌是一类对人体健康具有重大意义的微生物。常见的益生菌有双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、嗜热链球菌属等。益生菌具有促进机体吸收营养物质，提高机体免疫力，提高机体抗氧化水平，抑制肠道炎症等功能，对人体健康具有重要作用，如何高效促进益生菌的生长成为一个需解决的问题。目前有许多研究报道功能性低聚糖可以选择性地促进乳酸菌的增殖，常见的功能性低聚糖有大豆低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖等。
近些年来，随着对人类健康研究的深入和物质分离纯化、鉴定技术的进步，介于氨基酸单体与大分子蛋白质之间的多肽的生理功能日益赢得科学界关注。依据肽的原料来源，外源性生物活性肽可分为动物源、植物源、微生物源活性肽等。生物活性肽的众多来源中，动物骨蛋白资源丰富、生理结构与生理过程与其它物料差别较大，成为外源性生物活性肽资源的宝库。目前在骨蛋白生物活性肽中，发现了一系列具有抗氧化、降血压、降血糖、抗肿瘤等生理功能的活性肽。但关于骨蛋白肽对益生菌生长的作用还没有相关的发明专利和研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有促进益生菌生长和抗氧化功能的牛骨蛋白糖肽，以及所述牛骨蛋白糖肽的制备方法。
本发明以开发同时具有促进益生菌生长及抗氧化功能的牛骨蛋白糖肽为研究目标。针对牛骨的原料特性和组成组分等特点，开发以牛骨和低聚果糖为原料生产具促进益生菌生长及抗氧化功能的牛骨蛋白糖肽的工艺。牛骨中的蛋白经酶解后的多肽产物组成十分复杂，其中包含大量未知序列、未知功能的多肽，而具有特定功能的活性肽可能包含具有不同氨基酸组成、不同分子量大小的多种肽，较难通过某些共性特征将其区分。这些都对具有特定功能的牛骨蛋白肽开发带来较大困难。
现有技术中的牛骨蛋白肽并不具有促进益生菌生长的功能，同时具有较好的抗氧化和促进益生菌功能的牛骨蛋白肽更是甚少。此外，现有技术在酶解过程中，多需要添加酸碱调节pH，这不仅增加了工艺的复杂性和成本，而且，也可能会影响产品的功能特性，增加产品灰分含量。
现有技术的酶解研发过程，虽然能够获得分子量较小的肽，但获得的肽根本不具有促进益生菌功能，还有一些方法需要依赖酸碱反复调节pH。在众多方法中，本发明确定了适于牛骨的、不依赖酸或碱或pH的两步酶解法，酶解得到的特定牛骨胶原蛋白肽与低聚果糖进行糖基化反应，能够获得一种具有较好的抗氧化和促进益生菌生长功能的牛骨蛋白糖肽。
第一方面，本发明提供一种具有促进益生菌生长和抗氧化功能的牛骨蛋白糖肽的制备方法，包括如下步骤：以牛骨为原料，将经预处理后的原料进行两步酶解制得酶解产物；所述酶解产物超滤纯化后与低聚果糖进行糖基化反应。
在本发明所述制备方法中，以质量单位计，所述两步酶解中，第一步酶解所用复合蛋白酶中，碱性蛋白酶：中性蛋白酶：胰蛋白酶为(1-2)：1：1；第二步酶解所用复合蛋白酶中，风味蛋白酶：木瓜蛋白酶为(1-2)：1。
在本发明提供的制备方法中，经预处理得到的牛骨蛋白液中牛骨蛋白含量为11-13％；第一步酶解所用复合蛋白酶占牛骨蛋白的0.5-0.9％；第二步酶解所用复合蛋白酶占牛骨蛋白的0.1-0.3％。
在本发明提供的制备方法中，所述第一步酶解的条件为50-60℃下反应0.5-2h；第二步酶解的条件为50-60℃条件下反应0.2-1h后在95-100℃下保温10-20分钟。
在本发明提供的制备方法中，所述预处理包括：向粉碎后的牛骨中加入水，在100-125℃处理90-150分钟，去除脂肪及骨渣后，经110-130KH的超声波处理20-30min，超声波处理后在400-500Mpa处理20-30min。利用特定频率超声波结合超高压技术处理，可改变骨蛋白的组织结构，获得的牛骨蛋白液中，骨蛋白含量更高。
在本发明提供的制备方法中，对两步酶解后的产物进行超滤纯化，包括如下步骤：
利用孔径为6000道尔顿和3000道尔顿的纳米级别陶瓷膜超滤，分离分子量小于3000道尔顿的蛋白肽液；
将所述分子量小于3000的蛋白肽液经SephadexG-15凝胶分离，在280nm下进行检测并收集第2个洗脱峰；对收集得到的蛋白肽液进行RP-HPLC反相高效液相色谱，收集9-12分钟时的蛋白肽溶液。
在本发明所提供的制备方法中，调整RP-HPLC反相高效液相色谱得到的蛋白肽溶液与低聚果糖的质量比为(8-10)：1，在80-90℃反应30-60min，通过浓缩、冷冻干燥，得到牛骨蛋白糖肽制品。
通过LC-MS/MS对RP-HPLC反相高效液相色谱得到的蛋白肽溶液的主要成分进行测定，检测结果显示氨基酸序列为Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Asp-Gly-Ala、Hyp-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala的肽的含量为50-55％。
本发明针对目前我国骨资源较丰富，骨蛋白资源没有得到充分的利用，根据骨蛋白的特性，以牛骨为原料，通过对牛骨高压、高频超声波、高静压水等预处理，在不添加任何酸和碱条件下，利用多种蛋白复合酶进行分步酶解，通过膜分离、凝胶分离及反相HPLC分离技术，开发了具有特定氨基酸多肽序列(Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Asp-Gly-Ala、Hyp-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala)的具有促进益生菌生长和抗氧化功能的牛骨蛋白糖肽，建立一套具有特定功能的牛骨蛋白糖肽的制备方法。
具体地，一种具有促进益生菌生长和抗氧化功能的牛骨蛋白糖肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)以牛骨为原料，将所述原料粉碎为粒径为8-15mm的颗粒，然后加入1-3倍骨颗粒重量的水，100-125℃处理90-150分钟，去除脂、骨渣，得牛骨蛋白液；
(2)将(1)得到的牛骨蛋白液调整到70-80℃，利用110-130kH超声波处理20-30分钟后，400-500Mpa处理20-30分钟，改变骨蛋白的组织结构；
(3)调节(2)得到的牛骨蛋白液中蛋白含量为11-13％，加入占所述蛋白重量0.6-1.1％的复合蛋白酶进行两步酶解；第一步酶解所用复合酶中碱性蛋白酶：中性蛋白酶：胰蛋白酶为(1-2)：1：1，酶解的条件为50-60℃下反应0.5-2.0h；第二步酶解所用复合蛋白酶中风味蛋白酶：木瓜蛋白酶为(1-2)：1，酶解的条件为50-60℃反应0.2-1h后在95-100℃下保温10-20分钟，冷却至室温，通过板框过滤分离，收集分离液；
(4)将(3)所得的分离液二步超滤处理，利用孔径为6000道尔顿和3000道尔顿的纳米级别陶瓷膜超滤，分离分子量小于3000的牛骨蛋白肽液；
(5)取分子量小于3000的牛骨蛋白肽液，经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；对收集得到的牛骨蛋白肽液进行浓缩、冷冻干燥，得到牛骨蛋白肽；
(6)对凝胶分离收集得到的牛骨蛋白肽液进行RP-HPLC反相高效液相色谱，收集9-12分钟时的蛋白肽溶液，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液；调整RP-HPLC反相高效液相色谱得到的蛋白肽溶液与低聚果糖的质量比为(8-10)：1，在80-90℃反应30-60min，通过浓缩、冷冻干燥，得到牛骨蛋白糖肽制品。
第二方面，本发明提供一种牛骨蛋白糖肽，使用上述的制备方法制备得到；所述牛骨蛋白糖肽为牛骨胶原蛋白肽与低聚果糖的糖基化反应产物。
本发明提供的牛骨蛋白糖肽中含有50％以上Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Asp-Gly-Ala和Hyp-Gly-Val-Ala–Pro–Gly–Pro-Ala所示的小肽。
本发明所提供的牛骨蛋白糖肽为含有Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Asp-Gly-Ala和Hyp-Gly-Val-Ala–Pro–Gly–Pro-Ala的蛋白肽与低聚果糖进行糖基化反应的产物；经试验检测证实，本发明所述牛骨蛋白糖肽具有促进益生菌生长和抗氧化的作用，所述益生菌为嗜酸乳杆菌NCFM和/或动物双歧杆菌Bb-12。
根据本领域技术人员的理解，本发明还要求保护上述的制备方法或上述的牛骨蛋白糖肽在制备药品、食品或食品添加剂中的应用。本发明还要求保护含有本发明所述牛骨蛋白糖肽的食品、药品或食品添加剂。
本发明的有益效果：
(1)本发明利用牛骨和低聚果糖开发的新型的牛骨蛋白糖肽，整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性；
(2)本发明开发的牛骨蛋白糖肽产品具有较好的促进益生菌生长和抗氧化作用；
(3)本发明利用特定频率超声波结合超高压技术处理的牛骨蛋白液，明显改善骨蛋白对酶的敏感性，酶解液中蛋白质含量为11％以上，降低酶的使用量；
(4)本发明采用多种食品级复合蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶)，经在温和条件下，经过适度酶解获得的牛骨蛋白肽与低聚果糖在较温和的条件下进行反应，不加任何添加剂，开发的产品安全；
(5)本发明开发的产品具有良好的风味和色泽，能广泛应用于特需食品和营养食品；
(6)本发明开发的产品具有较明确的肽的组成，其中Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Asp-Gly-Ala、Hyp-Gly-Val-Ala–Pro–Gly–Pro-Ala的肽的含量为50％以上。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明实施例中所用蛋白酶的酶活单位为：
碱性蛋白酶：500000-110000U/mL；中性蛋白酶：300000-650000U/mL；胰蛋白酶：400000-1000000U/mL；风味蛋白酶：150000-250000U/mL；木瓜蛋白酶：500000-1350000U/mL。
实施例1具有促进益生菌生长和抗氧化作用的骨蛋白糖肽及其制备方法
本实施例提供一种具有促进益生菌生长和抗氧化作用的牛骨蛋白糖肽，制备方法如下：
(1)选用冷冻牛骨，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗，用粉碎机粉碎为粒径为8-15mm的颗粒，然后加入2.0倍骨重量的水，通过125℃处理90分钟，得到牛骨浆液，去上层脂肪，得到去脂的牛骨浆液，利用离心分离机去骨渣，得到牛骨蛋白液；
(2)将(1)得到的牛骨蛋白液，温度调整到80℃，利用超声波发生器经超声波(频率为110kH)处理20分钟，再利用高静水压力(500Mpa)处理20分钟，改变骨蛋白的组织结构；
(3)调节骨蛋白液中蛋白含量为13％，按照骨蛋白液中蛋白重量1.0％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步为蛋白重量0.8％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶组成，质量比为2：1：1)，在50℃条件下进行酶解反应2.0h；第二步为蛋白重量0.2％的复合蛋白酶(风味蛋白酶、木瓜蛋白酶，质量比为1：1)，在55℃条件下进行酶解反应0.5h；在98℃下保温10分钟，冷却至室温，通过板框过滤分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为6000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于6000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到骨蛋白肽；
再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取9-12分收集的肽溶液；
通过LC-MS/MS对肽溶液的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Asp-Gly-Ala、Hyp-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala的肽的含量为51.5％；
(6)调整步骤(5)中经RP-HPLC反相高效液相色谱得到的肽溶液与低聚果糖的质量比为8：1，在90℃反应30min，通过浓缩、冷冻干燥，得到牛骨蛋白糖肽产品。
实施例2具有促进益生菌生长和抗氧化作用的牛骨蛋白糖肽及制备方法
本实施例提供一种具有促进益生菌生长和抗氧化作用的牛骨蛋白糖肽，制备方法如下：
(1)选用冷冻牛骨，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗，用粉碎机粉碎为粒径为8-15mm的颗粒，然后加入1.0倍骨重量的水，通过115℃处理150分钟，得到牛骨浆液，去上层脂肪，得到去脂的牛骨浆液，利用离心分离级去骨渣，得到牛骨蛋白液；
(2)将(1)得到的牛骨蛋白液，温度调整到70℃，利用超声波发生器经超声波(频率为120kH)处理30分钟，再利用高静水压力(500Mpa)处理30分钟，改变牛骨蛋白的组织结构；
(3)调节骨蛋白液中蛋白含量为11％，按照骨蛋白液中蛋白重量1.1％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步为蛋白重量0.8％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶组成，质量比为2：1：1)，在50℃条件下进行酶解反应2.0h；第二步为蛋白重量0.3％的复合蛋白酶(风味蛋白酶、木瓜蛋白酶，质量比为2：1)，在50℃条件下进行酶解反应1.0h；在95℃下保温20分钟，冷却至室温，通过板框过滤分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为6000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于6000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到骨蛋白肽；
再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取9-12分收集的肽溶液；通过LC-MS/MS对肽溶液的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Asp-Gly-Ala、Hyp-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala的肽的含量为52.7％；
(6)调整步骤(5)中经RP-HPLC反相高效液相色谱得到的肽溶液与低聚果糖的质量比为10：1，在80℃反应60min，通过浓缩、冷冻干燥，得到牛骨蛋白糖肽。
实施例3具有促进益生菌生长和抗氧化作用的骨蛋白糖肽及制备方法
本实施例提供一种具有促进益生菌生长和抗氧化作用的牛骨蛋白糖肽，制备方法如下：
(1)选用新鲜或冷冻牛骨，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗，用粉碎机粉碎为粒径为8-15mm的颗粒，然后加入3.0倍骨重量的水，通过105℃处理150分钟，得到牛骨浆液，去上层脂肪，得到去脂的牛骨浆液，利用离心分离级去骨渣，得到牛骨蛋白液；
(2)将(1)得到的牛骨蛋白液，温度调整到75℃，利用超声波发生器经超声波(频率为120kH)处理25分钟，再利用高静水压力(450Mpa)处理25分钟，改变骨蛋白的组织结构；
(3)调节骨蛋白液中蛋白含量为12％，按照骨蛋白液中蛋白重量0.6％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步为蛋白重量0.5％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶组成，质量比为1：1：1)，在55℃条件下进行酶解反应1.0h；第二步为蛋白重量0.1％的复合蛋白酶(风味蛋白酶：木瓜蛋白酶的质量比为1：1)，在60℃条件下进行酶解反应0.5h；在95℃下保温15分钟，冷却至室温，通过板框过滤分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为6000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于6000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到骨蛋白肽；
再用RP-HPLC反相高效液相色谱对蛋白肽液进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取9-12分收集的肽溶液；
通过LC-MS/MS对肽溶液的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Asp-Gly-Ala、Hyp-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala的肽的含量为53.1％；
(6)调整步骤(5)中经RP-HPLC反相高效液相色谱得到的肽溶液与低聚果糖的质量比为9：1，在85℃反应60min，通过浓缩、冷冻干燥，得到牛骨蛋白糖肽。
实验例1牛骨蛋白糖肽促进益生菌生长能力的测定试验
试验样品：样品1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3步骤(6)制备的牛骨蛋白糖肽；样品4、5、6分别为为实施例1步骤(3)、(4)、(5)经过冷冻干燥后制备的产品。
促进益生菌生长测定按照如下方法进行：
将活化好的2种益生菌菌种(嗜酸乳杆菌NCFM、动物双歧杆菌Bb-12)以液体培养基体积1％的量接种于对应的液体培养基(对照组为纯培养基，实验1组、2组、3组、4组、5组、6组为分别在相应的培养基中添加5％的样品1、2、3、4、5、6)，然后将接种菌液后的培养基在厌氧条件下37℃培养，培养至6、12、18、24h时分别取200μL菌液于96孔板中，用酶标仪测定菌液在600nm处的吸光度，测定OD600值。同时取0.5mL培养24h的菌液于4.5mL无菌生理盐水中进行梯度稀释，取合适稀释梯度的100μL菌悬液于固体培养基中进行涂布，将涂布好的平板放置于厌氧条件下37℃培养36h，取出计算菌落总数。
表1本发明牛骨蛋白糖肽的促嗜酸乳杆菌NCFM生长试验结果
表2本发明牛骨蛋白糖肽的促动物双歧杆菌Bb-12生长试验结果
实验例2本发明牛骨蛋白糖肽的抗氧化活性的测定试验
试验样品：样品1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3步骤(6)制备的蛋白肽产品；样品4、5、6分别为为实施例1步骤(3)、(4)、(5)经过冷冻干燥后制备的产品；样品7、8为合成的纯肽产品。
抗氧化活性的测定按照如下方法进行：
(1)清除DPPH自由基能力：取0.2mg/mL的样品1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振荡混匀，室温下避光水浴30min，然后在517nm下检测体系吸光值。吸光值越低，体系的清除DPPH自由基能力越强。空白对照即是将样品溶液1.5mL换成去离子水1.5mL。
DPPH自由基清除能力％＝((空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值)×100；
(2)还原力测定：取0.2mg/mL的样品1mL，加入0.2M磷酸缓冲液(pH 6.6)2.5mL和1％(质量分数)的铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，然后在50℃水浴加热20min。取出迅速冷却，加入10％(质量分数)三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均匀，然后在3000g下离心10min。取上清液2.5mL，加入去离子水2.5mL和1％(质量分数)三氯化铁溶液0.5mL，充分混匀，在室温下反应10min，用700nm波长测定吸光度。还原力即可用700nm波长处吸光值表示。
表3本发明牛骨蛋白糖肽的抗氧化活性试验结果
表3结果显示本发明的牛骨蛋白糖肽具有较好的抗氧化能力，在0.2mg/mL的条件下，其清除DPPH自由基能力达到91％以上，还原力达到0.90以上，是一种较好的抗氧化物质。
从表1、表2可以看出，牛骨蛋白糖肽可以有效促进益生菌的生长，开发的牛骨蛋白糖肽和对照组相比对益生菌的促生长作用有显著的提升。表3可以看出本发明开发的牛骨蛋白糖肽有显著的促进益生菌的生长外，还有显著的抗氧化作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种牛骨蛋白糖肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以牛骨为原料，将所述原料粉碎为粒径为8-15mm的颗粒，然后加入1-3倍骨颗粒重量的水，100-125℃处理90-150分钟，去除脂、骨渣，得牛骨蛋白液；
（2）将（1）得到的牛骨蛋白液调整到70-80℃，利用110-130kH超声波处理20-30分钟后，400-500Mpa处理20-30分钟，改变骨蛋白的组织结构；
（3）调节经步骤（2）处理后得到的牛骨蛋白液中蛋白含量为11-13%，加入占所述蛋白重量0.6-1.1%的复合蛋白酶进行两步酶解；第一步酶解所用复合酶中碱性蛋白酶：中性蛋白酶：胰蛋白酶为（1-2）：1：1，酶解的条件为50-60℃下反应0.5-2.0h；第二步酶解所用复合蛋白酶中风味蛋白酶：木瓜蛋白酶为（1-2）：1，酶解的条件为50-60℃反应0.2-1h后在95-100℃下保温10-20分钟，冷却至室温，通过板框过滤分离，收集分离液；
（4）将（3）所得的分离液二步超滤处理，利用孔径为6000道尔顿和3000道尔顿的纳米级别陶瓷膜超滤，分离分子量小于3000道尔顿的牛骨蛋白肽液；
（5）取分子量小于3000道尔顿的牛骨蛋白肽液，经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰，获得牛骨蛋白肽液；
（6）对凝胶分离收集得到的牛骨蛋白肽液进行RP-HPLC反相高效液相色谱，收集9-12分钟时的蛋白肽溶液，RP-HPLC反相高效液相色谱的分离条件是以5-90%乙腈溶液作为洗脱液；调整RP-HPLC反相高效液相色谱得到的蛋白肽溶液与低聚果糖的质量比为（8-10）：1，在80-90℃反应30-60min，通过浓缩、冷冻干燥，得到牛骨蛋白糖肽制品；
所述牛骨蛋白糖肽中含有50%以上Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Asp-Gly-Ala和Hyp-Gly-Val-Ala–Pro–Gly–Pro-Ala所示的小肽；
所述牛骨蛋白糖肽促进益生菌生长、具备抗氧化能力。
2.一种牛骨蛋白糖肽，其特征在于，使用权利要求1所述的制备方法制备得到；所述牛骨蛋白糖肽为牛骨胶原蛋白肽与低聚果糖的糖基化反应产物。
3.权利要求2所述牛骨蛋白糖肽在制备药品、食品或食品添加剂中的应用。
4.包含权利要求2所述牛骨蛋白糖肽的药品、食品或食品添加剂。
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