CN103798911B - 一种抗氧化型黄鲫发酵液的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种抗氧化型黄鲫发酵液的制备方法，其特征在于步骤：1）鱼肉发酵培养基制备：将鱼糜与水按照料液比0.5~1.1g：0.5~1.1mL混合，按照装液体积加入质量分数1.5~2.5%葡萄糖，然后调节混合浆液pH至中性，将混合浆液按照每250mL锥形瓶中分装70~100mL，然后118~125℃灭菌20~40min备用；2）按鱼肉发酵培养基的混合浆液体积，以体积分数1.0~3.0%的比例接入纳豆芽孢杆菌种子液，混匀，在25~45℃下发酵，摇床转速120~160rpm，发酵时间20~36h；3）发酵结束后将发酵混合物过滤或者离心分离，得到发酵液，在不高于-20℃冰箱中冻藏或者干燥后保藏。本发明以黄鲫为原料，采用纳豆芽孢杆菌纯种发酵方式制备，大大提高了黄鲫发酵液的抗氧化性，制得的黄鲫发酵液能有效地抑制脂质的氧化，可以替代化学合成型抗氧化剂，具有天然、安全无毒的特点，且成本低廉。

Description

一种抗氧化型黄鲫发酵液的制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗氧化型黄鲫发酵液的制备方法。

背景技术

脂质氧化是食品加工者和消费者所关心的主要问题之一，因为脂质氧化作用会影响食品的风味、质地和感官，甚至还会生成一些有毒、有害物质(Rajapakse N,Mendis E,Byun H G，et al.Purification and in vitro antioxidative effects of giant squid muscle peptideson free radical-mediated oxidative systems[J].J Nutr Biochem,2005,16:562–569.)。自由基与脂质氧化有关，一些自由基如：羟自由基、超氧阴离子自由基非常不稳定，能够与人体内化学物质发生反应导致细胞DNA，蛋白质和脂质发生氧化损伤。虽然化学合成型抗氧化剂能够有效地抑制脂质的氧化，但因为存在对人体健康潜在的化学毒性，所以化学抗氧化剂的使用受到严格控制，只能在某些食品中添加(Winata A,Lorenz K.Antioxidantpotential of 5-N pentadecylresorcinol[J].J Food Process Pres,1996,20:417–429;Park P J,Jung W K,Nam K S,et al.Purification and characterization of antioxidative peptides fromprotein hydrolysate of lecithin-free egg yolk[J].JAm Oil Chem Soc,2001,78:651–656.)。寻找高效、天然的抗氧化剂代替化学合成型抗氧化剂引起高度重视，水产品及其加工副产物富含蛋白质，采用商业蛋白酶水解法制备抗氧化型寡肽是近年来最为活跃的一个研究领域。与商业蛋白酶水解法相比较，生物发酵法历史更悠久，已证实水产蛋白发酵产物具有多种生物活性(Ichimura T,Hu J,Aita D Q,et al.Angiotensin I-converting inhibitoryenzyme activity and insulin secretion stimulative activity of fermented fish sauce[J].J BiosciBioeng,2003,96:496-499;Rajapakse N,Mendis E,Jung W K,et al.Purification of a radicalscavenging peptide from fermented mussel sauce and its antioxidant properties[J].Food ResInter,2005,38:75-82;Sachindra N M,Bhaskar N.In vitro antioxidant activity of liquor fromfermented shrimp biowaste[J].Bioresour Technol.2008,99:90139016;Wang Y K,He H L,Chen X L,et al.Production of novel angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides byfermentation of marine shrimp Acetes chinensis with Lactobacillus fermentum SM 605[J].Appl Microbiol Biotechnol,2008,79:785–791.)，而且生物发酵法成本低，更适合大批量生产活性物质。

以捕获量大的海产低值小杂鱼黄鲫为原料，制备黄鲫蛋白抗氧化型发酵液，相关此类研究还尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种抗氧化型黄鲫发酵液的制备方法，采用安全性高的纳豆芽孢杆菌纯种发酵方式进行制备，大大提高了黄鲫发酵液的抗氧化性，制得的黄鲫发酵液纯天然、安全无毒，且成本较低。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种抗氧化型黄鲫发酵液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）鱼肉发酵培养基制备：将鱼糜与蒸馏水按照料液比0.5~1.1g：0.5~1.1mL混合，按照鱼糜质量加入质量分数1.5~2.5%葡萄糖，然后调节混合浆液pH值至中性，每250mL锥形瓶分装70~100mL混合浆液，然后118~125℃下灭菌20~40min。

2）发酵：根据鱼肉发酵培养基的混合浆液体积，以体积分数1.0~3.0%的比例接入纳豆芽孢杆菌种子液，混匀，在25~45℃下发酵，摇床转速120~160rpm，发酵时间20~36h；

3）发酵结束后将发酵混合物过滤或者离心分离，得到发酵液，在不高于-20℃冰箱中冻藏或者采取喷雾干燥方式干燥后保藏。

作为改进，所述步骤1）的鱼糜是将黄鲫去除鱼头和内脏，清洗后将鱼体切成小块，然后用高速组织捣碎机捣碎得到的，鱼糜与蒸馏水的料液比为1g：1mL。

再改进，所述步骤1）的调节混合浆液pH值至中性是采用5.5~6.5mol/L氢氧化钠和5.5~6.5mol/L盐酸进行调节的。

最后，所述步骤2）的纳豆芽孢杆菌种子液的制备过程为：

a、先配制种子液培养基：酵母提取物4.5~5.5g/L，蛋白胨9~11g/L，NaCl 9~11g/L，调节pH至7.1~7.3，按照每250mL锥形瓶中加入45~55mL种子培养基分装，然后118~125℃加热灭菌15~25min。

b、用接种环从斜面保存的纳豆芽孢杆菌的菌苔上挑取2环纳豆芽孢杆菌，接入到种子液培养基中，培养温度25~45℃，摇床转速120~160rpm，培养20~36h，得到纳豆芽孢杆菌种子液。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明以黄鲫为原料，采用安全性高的纳豆芽孢杆菌纯种发酵方式制备抗氧化型黄鲫发酵液，大大提高了黄鲫发酵液的抗氧化性，制得的黄鲫发酵液中含有大量抗氧化型氨基酸、疏水性氨基酸，能够有效地抑制脂质的氧化，本发明的抗氧化型黄鲫发酵液可以替代化学合成型抗氧化剂，具有天然、安全无毒的特点，且成本低廉。

附图说明

图1是本发明的制备方法的工艺流程图；

图2是黄鲫蛋白纳豆芽孢杆菌发酵液和未发酵样品的DPPH自由基清除能力比较，其中HA—灭菌鱼糜；HAG—灭菌的鱼肉培养基，HAGF—灭菌鱼肉培养基且经纳豆芽孢杆菌发酵，图中数据用平均值±标准差表示(n=3)，不同字母表示差异显著（P<0.05）；

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一种抗氧化型黄鲫发酵液的制备方法，工艺流程见图1，具体步骤为：

1、鱼肉发酵培养基制备

采用手工去除黄鲫鱼头和内脏，将鱼体切成小块，然后用高速组织捣碎机捣碎得到鱼糜，将鱼糜与蒸馏水按照1：1（w/v）混合，按照鱼肉质量加入2%（质量分数）葡萄糖，用6mol/L氢氧化钠和6mol/L盐酸调节混合浆液pH值（7.0左右），将混合浆液按照85.9mL/250mL锥形瓶分装，然后121℃灭菌30min，备用。

2、种子液制备

先配制种子液培养基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，调节pH 7.2，按照每250mL锥形瓶中加入50mL种子培养基分装，然后121℃加热灭菌20min。

纳豆芽孢杆菌（Natto Bacillus 20443，购于中国微生物菌种保存中心）按照菌种使用说明书进行活化处理，然后用营养琼脂试管斜面加液体石蜡法4℃保存。用接种环从斜面保存菌种挑取2环纳豆芽孢杆菌，接入到种子液培养基中，培养温度37℃，摇床转速150rpm，培养24h，得到纳豆芽孢杆菌种子液。

3、黄鲫蛋白抗氧化型发酵液的制备

根据鱼肉发酵培养基的混合浆液体积，以2%（体积分数）比例接入纳豆芽孢杆菌种子液，混匀，37℃下发酵，摇床转速150rpm，发酵时间24h。

4、发酵液分离及保存

发酵结束后将黄鲫蛋白发酵混合物过滤或者离心分离，弃去残渣，得到淡黄色带有香气的发酵液，-20℃冰箱中冻藏或者采取喷雾干燥方式保藏。

下面通过实验数据对本发明做进一步说明：

1、发酵工艺参数优化

在生物发酵中，一些参数，如：接种量、发酵温度、发酵时间、摇床转速、料液比等均会影响发酵最终产物生成。在前期单因素研究基础上，选择葡萄糖加入量（%，w/v），装液量（250mL锥形瓶）和液料比（蒸馏水：鱼糜，v/w）三个因素进行三水平的Box-Behnken响应面分析试验（见表1），以发酵液的DPPH自由基清除率为响应值，建立数学模型（见公式1），其中y是变量，β₀为常数项，β_j,β_jj和β_ij分别是模型中一次项、二次项和交互项。响应面试验结果见表2，方差分析结果见表3。 $y={\mathrm{\&beta;}}_0+\underset{j=1}{\overset{3}{\mathrm{\&Sigma;}}}{\mathrm{\&beta;}}_j{X}_j+\underset{j=1}{\overset{3}{\mathrm{\&Sigma;}}}{\mathrm{\&beta;}}_{\mathrm{jj}}{X}_j^2+\underset{i=1}{\overset{2}{\mathrm{\&Sigma;}}}\underset{j=i+1}{\overset{3}{\mathrm{\&Sigma;}}}{\mathrm{\&beta;}}_{\mathrm{ij}}{X}_i{X}_j$ （公式1）

表1Box-Behnken响应面分析因数和水平编码值

表2Box-Behnken响应面分析试验结果^a

序号	X1	X2	X3	DPPH自由基清除率（%）
					1	1.0	50.0	2.0	90.90
2	2.0	50.0	2.0	91.41
					3	1.0	100.0	2.0	90.76
4	2.0	100.0	2.0	92.09
					5	1.0	75.0	1.0	90.99
6	2.0	75.0	1.0	92.94
					7	1.0	75.0	3.0	90.21
8	2.0	75.0	3.0	91.16
					9	1.5	50.0	1.0	90.44
10	1.5	100.0	1.0	91.07
					11	1.5	50.0	3.0	88.96
12	1.5	100.0	3.0	89.78
					13	1.5	75.0	2.0	90.93
14	1.5	75.0	2.0	90.95
					15	1.5	75.0	2.0	90.95
16	1.5	75.0	2.0	91.47
					17	1.5	75.0	2.0	90.48

^a纳豆芽孢杆菌种子液加入量2%(v/v).发酵条件37℃，摇床转速150rpm，发酵时间24h

根据表2试验结果得到响应面分析模型公式为：

$y=90.96+0.59X_1+0.25X_2-0.67X_3+0.20X_1{X}_2-0.25X_1{X}_3+0.048X_2{X}_3+0.80X_1^2-0.46X_2^2-0.43X_3^2$

由表3方差分析结果可知模型P值为0.0018，属于高度显著（P<0.01），模型失拟项0.6103（P>0.01）不显著，R²=0.9391，表示试验确定的数学模型能够反映真实测定值。根据P值大小可知X₁，X₃，X₁ ²，X₂ ²和X₃ ²均为显著项（P<0.05）。

表3Box-Behnken响应面分析试验的方差分析

R²＝0.9391

根据响应面分析数学模型，得出最佳发酵条件为鱼肉培养基中葡萄糖添加量2.0%，250mL锥形瓶的装液量85.9mL，鱼肉培养基中鱼肉糜和蒸馏水比值1：1（w/v）时。在上述最优条件下，在37℃发酵时间24h（摇床转速150rpm）得到抗氧化活性强的黄鲫蛋白发酵液，经计算该发酵液的DPPH自由基清除率为92.92%，与实际测定值（验证值）93.25%无显著性差异（P>0.05），说明响应面分析所确定的最优发酵条件是科学合理的，可在黄鲫蛋白抗氧化性发酵液制备中实际应用。

2、黄鲫蛋白抗氧化型发酵液的氨基酸组成分析

测定最优发酵条件下所得黄鲫蛋白抗氧化型发酵液的氨基酸组成，具体结果见表4。

表4黄鲫蛋白抗氧化型发酵液的氨基酸组成（mg/g，干重）

注：ND表示未检测。

表4结果显示最优发酵条件下所得的黄鲫蛋白抗氧化型发酵液含17种氨基酸，其中谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸的含量较高。该抗氧化型蛋白发酵液的必需氨基酸总量达到148.725mg/g，占氨基酸总量的34.52%，其中必需氨基酸中的赖氨酸和亮氨酸总量为72.869mg/g，占必需氨基酸总量50%以上。另外，该抗氧化型蛋白发酵液的风味型氨基酸（包括天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸）含量较高，总量为178.636mg/g，占氨基酸总量的41.46%。

黄鲫蛋白抗氧化型发酵液中丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨基酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸总量为168.586mg/g，占氨基酸总量的39.13%，据报道这些氨基酸与抗氧化活性有关(Marcuse R.Antioxidative effect of amino acids[J].Nature,1960,186:886–887;Chen H M,Muramo K,YamauchiF，et al.Antioxidant activity o f designed peptides based on theantioxidative peptide isolated from digests of a soybean protein[J].J Agric Food Chem,1996,44:26192623.)。此外，蛋白水解液及发酵液中疏水性氨基酸含量高有助于提高抗氧化活性(Rajapakse N,Mendis E,Byun H G，et al.Purification and in vitro antioxidative effectsof giant squid muscle peptides on free radical-mediated oxidative systems[J].J Nutr Biochem,2005,16:562-569;Chen H M,Muramo K,Yamauchi F,et al.Antioxidant activity ofdesigned peptides based on the antioxidative peptide isolated from digests of a soybeanprotein[J].JAgric Food Chem,1996,44:2619–2623.)。黄鲫蛋白抗氧化型发酵液中疏水性氨基酸（包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨基酸、苯丙氨酸、辅氨酸）总量139.031mg/g，占氨基酸总量32.27%。黄鲫蛋白发酵液的抗氧化性可能与这些大量存在的抗氧化型氨基酸、疏水性氨基酸以及由这些氨基酸所构成的抗氧化性肽段有关。

结论：

图2结果显示经过灭菌处理的黄鲫鱼糜（HA）的DPPH自由基清除率为49.49%，说明经过灭菌处理后的黄鲫肉糜本身具有一定的抗氧化能力。在鱼糜中加入葡萄糖制备的鱼肉培养基经过灭菌处理，所得灭菌产物（HAG）的DPPH自由基清除率能力增强，清除率达到62.57%，显著高于HA（P<0.05），揭示在鱼糜中加入葡萄糖且经过杀菌热处理会生成一些具有抗氧化作用的化合物，可能与发生美拉德反应有关。但是灭菌鱼肉培养基经过纳豆芽孢杆菌发酵所得产物HAGF的DPPH自由基清除率达到89.28%，显著高于HAG和HA的DPPH自由基清除率（P<0.05），说明由于纳豆芽孢杆菌的发酵作用提高了黄鲫蛋白液的抗氧化性。

Claims (4)

1.一种抗氧化型黄鲫发酵液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）鱼肉发酵培养基制备：将鱼糜与蒸馏水按照料液比0.5~1.1g：0.5~1.1mL混合，按照鱼肉质量加入质量分数1.5~2.5%葡萄糖，然后调节混合浆液pH值至中性，将混合浆液按照每250mL锥形瓶分装70~100mL，然后118~125℃下灭菌20~40min，备用；

2）发酵：根据鱼肉发酵培养基的混合浆液体积，以体积分数1.0~3.0%的比例接入纳豆芽孢杆菌种子液，混匀，在25~45℃下发酵，摇床转速120~160rpm，发酵时间20~36h；

3）发酵结束后将发酵混合物过滤或者离心分离，得到发酵液，在不高于-20℃冰箱中冻藏或者采取喷雾干燥方式干燥后保藏。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）的鱼糜是将黄鲫去除鱼头和内脏，清洗后将鱼体切成小块，然后用高速组织捣碎机捣碎得到的，鱼糜与蒸馏水的料液比为1g：1mL。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）的调节混合浆液pH值至中性是采用5.5~6.5mol/L氢氧化钠和5.5~6.5mol/L盐酸进行调节的。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤2）的纳豆芽孢杆菌种子液的制备过程为：

a、先配制种子液培养基：酵母提取物4.5~5.5g/L，蛋白胨9~11g/L，NaCl 9~11g/L，调节pH至7.1~7.3，按照每250mL锥形瓶中加入45~55mL种子培养基分装，然后118~125℃加热灭菌15~25min；

b、用接种环从斜面保存的纳豆芽孢杆菌的菌苔上挑取2环纳豆芽孢杆菌，接入到种子液培养基中，培养温度25~45℃，摇床转速120~160rpm，培养20~36h，得到纳豆芽孢杆菌种子液。