CN111961617A

CN111961617A - 一株高产免疫多糖和细菌素的多效枯草芽孢杆菌及应用

Info

Publication number: CN111961617A
Application number: CN202010815030.3A
Authority: CN
Inventors: 张日俊; 姚蒙蒙; 胡聪; 李仲玄; 黄燕; 斯大勇; 王俊永
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-08-13
Filing date: 2020-08-13
Publication date: 2020-11-20
Anticipated expiration: 2040-08-13
Also published as: CN111961617B

Abstract

本发明提供了一株高产免疫多糖和细菌素的多效枯草芽孢杆菌及应用。本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)保藏编号为CGMCC NO.20463，该菌具有优良的产胞外免疫多糖能力，常规方法发酵后纯化发酵液测得胞外多糖产量高达8203.64mg/L，且该菌具有优良的产细菌素能力和消解内毒素能力，能够有效抑制沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、藤黄八叠球菌、链球菌、产气荚膜梭菌等致病或有害菌。本发明的枯草芽孢杆菌可作为食品添加剂或饲料添加剂，具有良好的免疫调节、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化能力，在抗病防病及畜禽抗生素替代方面有广阔的应用前景。

Description

一株高产免疫多糖和细菌素的多效枯草芽孢杆菌及应用

技术领域

本发明涉及微生物与发酵技术领域，具体地涉及一株高产胞外多糖的枯草芽孢杆菌及其菌剂的应用。

背景技术

微生物胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)是其在生长代谢过程中分泌到细胞外与本体分离的次级代谢产物，由10个以上醛糖或者酮糖由糖苷键组成的高分子聚合物，自然界中普遍存在，生物学功能极其广泛，例如淀粉和糖原是植物和动物的能量来源，纤维素和几丁质参与动物和植物的骨架构成。胞外多糖有同多糖和杂多糖两种类型，同多糖只含有一种单糖，而杂多糖是由重复的单元组成，大小从双糖到七糖不等。细菌胞外多糖最早在19世纪中期从葡萄酒中被发现，后来被称为右旋糖酐。随着时间的推移和科学技术的进步，其他胞外多糖包括纤维素、藻酸盐和黄原胶等逐渐被发现及应用。其中黄原胶是非常重要的细菌胞外多糖。黄原胶、结冷胶广泛应用于食品和工业生产，透明质酸保湿功能显著而广泛应用于化妆品行业。胞外多糖还因具有抑制肿瘤、免疫调节、抗炎、抗病毒、降低血糖血脂、抗氧化等药用功效在制药和医疗保健行业发挥着重要的应用价值。

微生物胞外多糖的应用有多重优势：1、生产周期短。2、成本相对较低。3、可大规模发酵制备，生产条件易于控制，不受季节或天气的影响。微生物胞外多糖能够分泌到细胞外培养基中，易于分离纯化且产量相对较高而备受研究者青睐，具有广阔的应用前景。

枯草芽孢杆菌是能够产生芽孢的革兰氏阳性菌，好氧生长，在自然界广泛存在，对人畜无毒害，对环境无污染，易分离培养，营养要求简单，因能产生芽孢，对干燥，高温，高压等不良环境抵抗力强。枯草芽孢杆菌能分泌多种抗菌肽、细菌素、蛋白酶、水解酶、胞外多糖等有益代谢产物，在农业、畜牧业、工业中应用前景和潜力巨大。

虽然研究枯草芽孢杆菌产胞外多糖的研究也不少，但是应用于工业生产中的胞外多糖却不多，畜牧业上应用胞外多糖的稀有报道。主要是研究稀少，也可能因为畜牧业要求成本低，这在很大程度上限制了其研究发展的兴趣及大规模应用。

胞外多糖的产量有差异，菌株本身起到决定性的作用。培养基为微生物的生长提供必要的营养成分。培养基基础成分中最重要的就是碳源和氮源。碳源能够为微生物生长代谢提供必要的碳元素，氮源为机体内重要生命物质-蛋白质和核酸的代谢奠定了基础，也是微生物生长酶的合成必不可少的营养物质。

发明内容

本发明的目的是提供一种胞外多糖产量高、具有抑制有害或致病菌、消解内毒素等能力的饲用枯草芽孢杆菌及其应用。

本发明提出的解决方案是，从自然界众多生境样品中筛选出高产胞外多糖的菌株，并进行菌种鉴定，再对培养基进行碳源氮源优化以提高胞外多糖产量，为进行其生理活性及机理研究和生产应用奠定基础。

为了实现本发明的目的，本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是从健康肉鸡肠道中筛选得到。经16S RNA基因序列分析，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，命名为H-4。该菌株已于2020年7月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏号为CGMCCNo.20463。

本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的生物学特性为：革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状，菌落前期表面光滑凸起，灰白半透明状，直径3-8mm，后期表面干燥褶皱，外圈凸起，中间凹陷，如图1。显微镜下细胞呈较短直杆状，见图2。

本发明提供含有该枯草芽孢杆菌的菌剂。

发明人研究发现，本发明所述的枯草芽孢杆菌分泌细菌素能力强，具有优良的发酵产胞外多糖的能力，且产生高活性的蛋白酶。

本发明提供一种产品，含有本发明所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，所述产品为药物、食品、保健品、饲料、或饲料添加剂。

进一步地，所述药物为抑制或杀灭细菌的药物。所述细菌为沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、链球菌、单增李斯特菌和产气荚膜梭菌。

本发明提供了所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其发酵产物，或含有该菌的菌剂在消解内毒素、促进动物生长、或提高饲料转化率中的应用。

本发明提供了所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其发酵产物，或含有该菌的菌剂在制备胞外多糖或细菌素中的应用。

本发明提供了所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其发酵产物，或含有该菌的菌剂在制备药品、食品、保健品、化妆品、饲料、或饲料添加剂中的应用。

本发明提供一种发酵生产胞外多糖的方法，将所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)接种于发酵培养基中发酵制得胞外多糖。

优选地，所述发酵培养基中含有蔗糖、和/或大豆蛋白胨、和/或锰离子。

更优选地，所述发酵培养基含有蔗糖1-10％，大豆蛋白胨0.5-3％；硫酸锰0.01-0.3％，磷酸氢二钠0.05-0.5％，磷酸二氢钾0.05-0.5％，葡萄糖0-3％。

上述方法中，发酵条件是25-42℃、发酵20-60h。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供的枯草芽孢杆菌具有优良的产胞外多糖的能力，在发酵培养基中常规方法发酵，纯化发酵液测得胞外多糖产量高达8203.64mg/Lmg/L，并且该菌具有优良的产细菌素能力，能够有效抑制沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、链球菌、单增李斯特菌和产气荚膜梭菌等菌。本发明的枯草芽孢杆菌可作为食品添加剂或饲料添加剂用于制备食品、保健品或饲料添加剂，还可用于工业生产胞外多糖以及以胞外多糖为原料的其他原料，如纤维素、藻酸盐、黄原胶、结冷胶等，广泛应用于畜牧业、食品加工业、医疗药物制备行业，具有良好的免疫调节、抗菌抗病毒、抗炎、抗氧化能力，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌落形态图。

图2为本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的革兰氏染色图。

图3为本发明实施例1中苯酚硫酸法葡萄糖标准曲线。

图4为本发明实施例1中DNS法葡萄糖标准曲线。

图5为本发明实施例2抗菌物质Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析。

图6为本发明实施例2抗菌物质的YMC-Pack Protein-RP C4反相柱层析。

图7为本发明实施例2抗菌物质的Zorbax PSM 60分子筛柱层析。

图8为本发明实施例2中组分A的Tricine-SDS-PAGE电泳图。

图9为本发明实施例2中组分B的Tricine-SDS-PAGE电泳图。

图10为本发明实施例4中细菌素对致病菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)形态结构的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H-4的分离与鉴定

1、样品的处理

取适量冻存好的健康家禽肠道内容物样品于芽孢杆菌富集液体培养基中，锥形瓶中放入适量玻璃珠，32℃、180r/min活化24-48h后，菌悬液置于85℃水浴锅中沸腾加热15min,杀死不能形成芽孢的其它菌体。将处理过的菌悬液用灭菌后生理盐水或灭菌后的富集培养基进行10倍梯度稀释,吸取10⁵-10⁷不同浓度稀释液100uL均匀涂布于BPY固体培养基上，32℃培养24-48h。每组梯度做三个重复。

芽孢富集培养基：胰蛋白胨1％，酵母浸粉0.3％，淀粉0.3％，硫酸锰0.01％，磷酸二氢钾1.5％，磷酸氢二钠2％，pH自然，121℃，灭菌20min。

BPY培养基：牛肉膏0.5％、酵母浸粉0.5％、胰蛋白胨1％、氯化钠0.5％，葡萄糖0.5％、氯化钠0.5％，121℃灭菌20min，固体培养基加2％琼脂。

2、菌落拉丝法初筛

BPY平板上能够长出的菌株暂定为芽孢杆菌，根据其培养基上外观形态特征,挑取疑似单菌落进行菌落拉丝筛选，用无菌枪头接触菌落，轻轻往外拉，将能够拉丝或者菌落光滑粘稠的代表性单菌落进行标记并编号。对菌落镜检看是否产生芽孢，分离纯化几次，看是否保持拉丝和粘稠特性，菌落形态是否有所变化，拍照，对初筛的候选的13株菌株采用甘油保存法，保存步骤如下：

(1)将要保存菌种接种于LB液体培养至对数生长期，肉眼见培养体系内浑浊即可；

(2)将甘油稀释至浓度为50％，等体积蒸馏水加等体积甘油，甘油需要慢慢吸；

(3)条件下将菌液与50％浓度甘油1:1等体积混合于离心管中，甘油终浓度为于-80℃冰箱内保存,有效期1年。

3、苯酚硫酸法测多糖复筛

将初筛筛选的候选菌株13株取出进行复筛。

发酵液制备：-80℃冰箱里编号的13株初筛得到的甘油保藏的芽孢杆菌活化3代后接入LB液体培养基中作为种子液，用相应培养基稀释OD600＝1后以4％的接种量接入BPY-T培养基32℃，180rpm培养36h。

LB培养基：酵母浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％，121℃灭菌20min。

BPY-T培养基：牛肉膏0.5％、酵母浸粉0.5％、胰蛋白胨1％、氯化钠0.5％，葡萄糖0.5％、蔗糖0.5％、氯化钠0.5％，121℃灭菌20min。

粗胞外多糖的提取：取10mL发酵液，沸水浴10min，冷却到室温，10000rpm 4℃离心15min，上清液取4.75mL加入80％质量分数的三氯乙酸(TCA)250μL至终浓度4％(m/v)，震荡混匀后，4℃静置6h，10000rpm离心20min，取上清2mL至干净干燥的50mL离心管，加入3倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜，10000rpm 4℃离心20min，去上清，沉淀用4mL去离子水复溶，装入透析袋(截留分子量8000-14000Da)，去离子水4℃透析24h，中间换水3次，得到粗多糖样品，胞外多糖产量用苯酚硫酸法测定。

葡萄糖标准曲线的建立：准确称取制作标准曲线的葡萄糖100mg定容至100mL容量瓶；摇匀得到1mg/mL的葡萄糖溶液。再吸取5mL至50mL容量瓶中，定容摇匀后得到0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。取8支洗干净烘干的试管，分别吸取0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL于每支试管中，每支试管再用去离子水补足至1mL。在各个试管中分别加入1mL 6％新制苯酚溶液，摇匀后迅速加入5mL浓硫酸，混匀后，室温下静置30min，在490nm波长下测定各试管中溶液的吸光度值，并以不同稀释液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。试验中根据样品的吸光度值，代入标准曲线方程中计算胞外多糖产量。葡萄糖标准曲线如图3所示，葡萄糖标准曲线方程为y＝0.0059x+0.01，R²＝0.999，R²大于0.9，且接近1，表明线性较好，可以使用此标准方程。

苯酚硫酸法测菌液中胞外多糖含量：由上述步骤获得的粗胞外多糖样品，稀释适当的倍数，取1mL于每支试管中，再在各个试管中分别加入1mL 6％新制苯酚溶液，摇匀后迅速加入5mL浓硫酸，剧烈摇晃，室温下静置30min，在490nm波长下测定各试管中溶液的吸光度值。将吸光值代入葡萄糖标准曲线方程中计算胞外多糖产量。

共进行两次苯酚硫酸法测胞外多糖的复筛，第一次复筛重复3次，为了减少不同批次产生的试验误差，将第一次复筛产胞外多糖含量均高的菌株放在同一批次中再进行第二次复筛，第二次复筛重复3次，批间差异不显著，统计结果见表1。

表1各菌株苯酚硫酸法测胞外多糖的产量

由上述复筛结果，发现H-4发酵生产胞外多糖的产量高且稳定高产，将该株菌作为后续研究菌株。

4、DNS法验证还原糖

(1)DNS法葡萄糖标准曲线的建立

精确称取100mg标准品葡萄糖，去离子水定容至100mL洁净的容量瓶中，配制成1mg/mL葡萄糖标准液按照下表进行操作，混匀后沸水加热5min，冷却至室温后，每管加入4mL去离子水，混匀，用不加葡萄糖标准液的作为空白对照，540nm测吸光值。

(2)DNS试剂的配制

称取0.315g 3,5-二硝基水杨酸，加适量水，置45℃水浴锅中搅拌。称取5.24g氢氧化钠，溶于适量去离子水中，逐步加入上述溶液中，不断搅拌至溶液透亮。逐步加入9.1g四水合酒石酸钾钠，0.25g苯酚，0.25g无水亚硫酸钠，继续45℃水浴加热，同时加水，并不断搅拌，直至沉淀完全溶解。定容至250mL容量瓶中，置于棕色瓶中保存，4℃放置7天后使用。

(3)DNS法测还原糖含量

使用苯酚硫酸法测多糖复筛中提取纯化得到的粗EPS溶液，取0.5mL加入干净试管中，再加入配制好的DNS试剂，混匀后沸水加热，冷却后加入4mL去离子水，混匀，用不加葡萄糖标准液的作为空白对照，540nm测溶液吸光度。DNS法葡萄糖标准曲线见图4。

DNS法测得粗EPS溶液中不含还原糖。故表明苯酚硫酸法测得的糖含量为多糖含量。

5、菌种鉴定

用天根细菌基因组试剂盒提取菌株的DNA，PCR扩增后送金唯智公司进行测序，本发明分离筛选到的菌株H-4为枯草芽孢杆菌，该菌种的生物学特性如下：前期表面光滑凸起，灰白半透明状，直径3-8mm，后期表面干燥褶皱，外圈凸起，中间凹陷，如图1。显微镜下细胞呈较短直杆状如图2。

该菌株已于2020年7月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏号为CGMCC No.20463。

6、菌株的基因组分析

(1)菌株的复苏和基因组的提取：从实验室斜面保种管中挑取一环芽孢杆菌H-4，接种于含有100ml营养肉汤培养基的三角瓶中，37℃摇床(110转/分钟)培养12h获得种子液。再将种子液以2％比例(v/v)接种到含500ml BHI培养基的三角瓶中，37℃摇床(110转/分钟)培养12h。基因组的提取采用QIAGEN细菌基因组提取试剂盒进行，具体操作流程参照生产商提供的操作手册。

(2)基因组测序、装配和补洞

基因组提取后经过纯度和浓度的检测,确定其符合Illumina测序的要求后，取约10μgDNA，用超声波打断成，补平片段末端，3’末端加A，添加Pair-end接头。连接片段经1.5％的琼脂糖凝胶电泳，回收300bp～500bp范围的片段。回收的片段通过10个循环的PCR扩增，构建Pair-end文库。文库取10ng DNA，在C-bot中进行Cluster generation，然后Hiseq2000进行双向测序，经历200个循环，得到2×100bp的数据。芽孢杆菌H-4全基因组测序工作在中国科学院微生物研究所完成。

使用Velvet软件对测序产生的Pair-end数据进行拼接。拼接的结果为基因组Scaffolds，将Scaffolds内部的缺口区N序列断开，为基因组Contigs。

利用比对软件MU Mmer将由基因组拼接软件形成的Scaffolds和Contigs比对到解淀粉芽孢杆菌FZB42完整基因组序列上,由参考序列，确定Contig排列关系，在gap两端的保守区域设计引物进行PCR。将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带，将回收的目的条带用ABI 3730XL测序仪上测定基因序列。测定的序列采用软件PhredPhrap拼接，用Consed软件查看拼接结果。得到枯草芽孢杆菌H-4基因组特点及其它芽孢菌比较结果，见表2。

表2枯草芽孢杆菌H-4基因组特点及其它芽孢菌比较

实施例2枯草芽孢杆菌H-4所产细菌素的分子量测定和部分序列鉴定

1、H-4所产抗菌物质的分离纯化

取H-4发酵液100ml，12000g离心15分钟，除去大部分菌体，再将离心后的上清液用0.22μm的滤膜过滤，除去余下的菌体，此时的上清液为无细胞上清液(cell-freesupernatant，CFS)。

阴离子交换层析填充物为Q-Sepharose Fast Flow，使用层析柱规格为1.6cm×25cm，装填料后，先用15mM，pH为8.0的乙酸铵-氨水缓冲液，平衡2个柱体积，将上一步的浓缩蛋白上样，以缓冲液配制的1mol/LNaCl洗脱，流速为2ml/min。按管收集洗脱液，测定抑菌活性。将活性组分混合。

YMC-Pack蛋白-RP C4为反相预装柱置于

explorer 10蛋白纯化仪上，上样前用溶液A(含0.06％TFA的水溶液)平衡3个柱体积，上样，再用溶液B(含0.06％TFA的乙腈溶液)进行梯度洗脱，收集活性峰，冻干待用。

Agilent Zorbax SB-C18反相预装柱，对上一步的活性峰进行进一步的线性洗脱，平衡洗脱条件，同上一步反相柱操作。

Zorbax PSM 60为分子筛预装柱，对活性组分按照分子量的差异进行分离，用0.15mM乙酸铵溶液进行平衡和洗脱，先平衡3个柱体积，再上样洗脱。以上纯化操作均在280nm下监测。

H-4所产抗菌物质的纯化过程中若无特殊说明均在室温20℃下进行。H-4培养24h后离心除菌得到CFS(无细菌细胞上清液)。由于硫酸铵盐析、有机溶剂沉淀和PEG6000均不能有效提出抗菌物质，因此，选择用CFS直接上样，先将100ml CFS上样于已经平衡好的阴离子Q-Sepharose Fast Flow交换柱。采用盐离子梯度洗脱，如图5所示，有两个较大的蛋白洗脱峰Q1和Q2。其中Q1为没有挂柱子上的穿透峰，Q2为结合在柱子上的蛋白洗脱峰。经检测，Q1存在很强的抗菌活性，而Q2不存在抗菌活性。因此，选择Q1峰进行进一步纯化。

将收集到的Q1峰上样YMC-Pack Protein-RP C4反相柱进一步分离纯化，得到2个活性峰Y1、Y2见图6，Y1没有结合上反相柱，直接被洗脱下来，但活性强；Y2能够挂上反相柱，且活性弱。由于Y2活性弱，对指示菌不敏感，无法进行下一步的纯化。因此，把峰Y2记作抗菌组分A(Fraction A)。而将峰Y1进行下一步的分离纯化。

将收集到的活性峰Y1上第二轮的Agilent Zorbax SB-C18反相柱，所得到的活性峰仍未能结合到C18柱，但是却除去了部分的杂质，将穿透活性峰收集后，上Zorbax PSM60分子筛柱，得到了两个活性峰，分别记为Fraction B，Fraction C，见图7。

经过上述各步纯化后，枯草芽孢杆菌H-4抗菌物质的产量和活性见表3。由表中可以看出，经过Q-sepharose Fast Flow柱层析、YMC-Pack Protein-RP C4柱层析、AgilentZorbax SB-C18柱层析和Zorbax PSM 60柱层析后，共有3个组分被纯化得到记作FractionA，B和C。其中Fraction A没有在该表中体现，因为第一步反相得到的fraction A活性很弱，无法用指示菌指示进行下面的纯化操作。Fraction B和C的比活力从最初的944.6U/mg分别提高到11217,10290U/mg，纯化了近10倍，活性回收率分别为0.4％，0.07％。

表3菌株H-4所产抗菌物质的纯化效果

2、Tricine-SDS-PAGE对H-4所产细菌素的分子量及抑菌活性测定

将第一步反相分离下来的组分A及由最后一步分子筛分离得到的组分B进行了Tricine-SDS-PAGE电泳，估测抗菌肽的分子量。

由图8所示，在标准蛋白4.6kD与10kD之间，样品泳道有一条非常清晰的蛋白条带，且在另一半胶的对应位置上对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌圈，因此，推测该抗菌蛋白的分子量约为5.5kD。

由图9所示，在标准蛋白4.6kD与1.7kD之间，样品泳道有一条比较清晰且略带弥散的蛋白条带。该蛋白条带在另一半胶的相对位置也对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌圈，推测该抗菌蛋白的分子量约为3.5kD。3、LC-MS/MS对H-4所产细菌素的氨基酸序列分析

将蛋白胶内的组分A酶解后，用LC-MS/MS测定，测得组分A的部分序列为LVQSPNGNFAASFVLDG TK。将这段蛋白序列输入蛋白质数据库进行检索，搜索结果见表4。共有3条同源蛋白质序列被检索出来，其氨基酸序列见表5。如表5所示，组分A的部分序列与C4P928和P82243的部分序列完全相同，而与A7Z160的部分序列只有1个氨基酸不同。

表4组分A部分序列在蛋白质数据库中的检索结果

表5与组分A同源的蛋白的氨基酸序列

从Tricine-SDS-PAGE的电泳结果来看，组分A中约为5.5kD的蛋白具有抗菌活性。将组分A的抗菌肽从胶上酶解回收，利用LC-MS/MS串联质谱测得部分序列为LVQSPNGNFAASFVLDG TK，与检索出的抗菌肽LCI蛋白部分序列完全相同，且分子量非常接近，分别为5.5kD和5464Da。抗菌肽LCI同样是由枯草芽孢杆菌产生的具有抗菌作用的肽，因此，可以初步推测组分A的抗菌蛋白可能就是抗菌肽LCI。抗菌肽LCI的敏感指示菌为野油菜假单胞菌水稻变种(Xanthomonas campestris pv.oryzae)。但在本试验中，选用的指示菌为金黄色葡萄球菌IVDC C56005，组分A中的抗菌肽对该指示菌活性较弱，使得无法用该指示菌进行逐步的分离，因为，随着分离步骤的增多，会逐步地造成抗菌肽损失，为检测活性造成困难，所以，只能将组分A挥干去除乙腈，蒸馏水复溶进行Thricine-SDS-PAGE电泳检测。

组分B的Tricine-SDS-PAGE电泳检测出3.5kD左右的抗菌肽，这与MALDI-TOF/TOF检测出的组分B精确分子量相一致。在对以往的枯草芽孢杆菌细菌素的研究中，发现subtilin(3320Da)、subtilosin A(3398.9Da)、sublancin 168(3877.78Da)、mersacidin(1825Da)、ericin S和ericin A(3342.8Da和2986Da)。这些枯草芽孢杆菌细菌素都为羊毛硫抗生素，且除了mersacidin以外，其他细菌素的分子量均在3.0-3.5kD之间。而本发明发现的组分B中的3个蛋白分子量分别是3371.811，3442.379和3486.596Da，单从分子量上进行比较，组分B中的抗菌蛋白与已经发现的枯草芽孢杆菌细菌素的分子量均不相同，且范围在3.0-3.5kD之间。从生化特性上看，组分B的蛋白再进行2次反相层析时，均不能与反相柱结合，而直接被洗脱出来，这也表明组分B的抗菌蛋白疏水性弱，也与已发现的细菌素不同。因此，有理由相信，组分B中存在不同于以往的新抗菌肽或是细菌素。由于组分B中含有3个蛋白成分，使得Tricine-SDS-PAGE电泳的蛋白条带比较弥散，无法进行切胶回收，测定氨基酸序列。同时，这3个蛋白分子量相近，特性相似，因此无法得到有效的分离，为氨基酸序列的测定带来困难。

通过最后的分子筛分离，得到了组分C，经过质谱的测定发现，组分C中含有的成分较多，但它们的分子量均在1.0kD一下，属于小肽。枯草芽孢杆菌能够产生抗菌的脂肽，它们的分子量虽小，但都在1.0kD以上，且大多以多种同系物共同存在。而在组分C的质谱图中，没有发现分子量相差14的同系物存在。因此，组分C中含有不同于脂肽的小分子抗菌肽或细菌素。

实施例3枯草芽孢杆菌的抑菌特性或抑菌谱

1、发酵菌株菌液制备

将枯草芽孢杆菌H-4活化后接种于LB液体培养基中，培养12h作为种子液。按照4％的接种量接种到BPY培养基中发酵24h备用。

BPY培养基配方：牛肉膏0.5％、酵母浸粉0.5％、胰蛋白胨1％、氯化钠0.5％，葡萄糖0.5％、蔗糖0.5％。

2、指示菌平板制备

本试验选取实验室19株病原菌(见表6)进行抑菌试验。将指示菌活化后，采用平板划线的方法，挑取单菌落接种于液体培养基中，于37℃，转速200r/min的条件下培养24h后，其浓度约达到10¹⁰CFU/mL，再用灭菌的生理盐水稀释至10^6-7CFU/mL备用，取无菌培养皿，加入15-20mL LB培养基(琼脂含量2％)后，置于水平面上凝固；将稀释好的指示菌悬液，取200μL于LB平板上，用已灭菌的棉棒，将菌悬液均匀的涂在平板上，待用。

3、抑菌试验

在每个指示菌平板表面小心放置3个牛津杯，然后吸取200μL细菌素粗提液加入牛津杯内，以不接种菌液的液体培养基经滤膜过滤后作为空白对照组，于37℃培养箱中静置培养24h，测定抑菌圈直径大小。

细菌素粗提液是将枯草芽孢杆菌H-4发酵液经10000rpm在4℃下离心15分钟取上清液，在上清液中慢慢加入硫酸铵固体粉末进行盐析，边加边搅拌，直至饱和度达70％，然后在4℃下静置过夜，再在10000rpm4℃下离心30分钟，弃去上清液得到细菌素沉淀，沉淀物复溶于0.10M的磷酸盐缓冲液。

排除有机酸的干扰：因为枯草芽孢杆菌H-4的发酵液在24h时pH约为9，所以，排除有机酸抗菌的影响。

排除上清液菌体残留细胞的影响：将离心上清液用无菌滤菌器(0.22μm)过滤除菌后进行抑菌试验，排除上清液中残留菌体细胞对抑菌效果的影响。

蛋白质的粗分离:将硫酸铵粉末缓缓加入20ml离心上清液中，边加边搅拌，使最终饱和度为70％，可看到有絮状沉淀出现，置于4℃冰箱静置过夜，再在10000rpm4℃下离心30分钟，将沉淀复溶于2ml pH 6.8的磷酸盐缓冲液，进行抑菌实验，同时以饱和硫酸铵溶液和磷酸盐缓冲液作为对照组。

结果如表6所示，枯草芽孢杆菌H-4产生的细菌素对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌等动物临床致病菌有抑制作用，对链球菌和单增李斯特菌和产气荚膜梭菌都有抑制作用。

表6枯草芽孢杆菌H-4细菌素的抑菌种类及效果

注：表中符号“-”，表示不抑菌，即对该株菌没有抑制。这些指示菌来自不同的菌株保藏中心

实施例4枯草芽孢杆菌H-4细菌素的杀菌机理

选取购自于中国兽医微生物菌种保藏管理中心的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，简称为S.aureus)ATCC 25923和中国普通微生物菌种保藏管理中心大肠杆菌(Escherichia coli，简称为E.coli)CVCC 245作为指示菌。S.aureus ATCC25923和E.coli CVCC 245均可于37℃，在水解酪蛋白肉汤培养基(Mueller-Hinton，简称为MH)中进行。

将两种指示菌过夜培养至对数生长期，用培养基稀释菌液至0.5个麦氏比色单位(约108CFU/ml)，然后将细菌素加入到稀释后的菌液中至其终浓度为1×MICs，37℃震荡(180rpm)培养，分别于0h、2h、4h取混合液4ml，12000rpm低温离心10min，弃上清，用PBS缓冲液清洗菌体沉淀3次，加入500μl 2.5％的戊二醛重悬菌体，4℃固定过夜。而后用PBS缓冲液清洗菌体沉淀3次，每次10min使用1％锇酸二次固定2h；再次用PBS缓冲液冲洗三次，用不同梯度乙醇(50％-100％)对菌体脱水，每次15min，最后再用无水乙醇处理2次，每次处理15min；1:1乙醇与醋酸异戊酯混合液处理30min，醋酸异戊酯处理2h；临界干燥，喷金后置于S-3400N扫描电镜中观察。结果见如图10。

由图可知，未经细菌素处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞表面光滑，呈现出完整的杆状和葡萄状结构；而经细菌素处理2h后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜表面均出现了很多“孔洞”(如红色箭头所示)，目标指示菌(大肠杆菌、金葡菌)细胞膜破损严重；随着作用时间的延长，在处理4h后，视野里能看到很多细胞的形态发生变化，有的细胞内凹，出现瘪态，致病菌细胞膜破损更加严重，并出现细胞质外漏(或外溢)；有的致病菌细胞表面出现丝状物，甚至很多菌体细胞已经裂解为大量的碎片，即显示出细菌素对致病菌的杀伤作用。这些结果揭示了菌体细胞表面“孔洞”形成是造成致病菌细胞裂解、死亡(杀死)的主要原因，也是细菌素杀死致病菌的主要方式和作用机理。

实施例5枯草芽孢杆菌H-4产蛋白酶能力验证

芽孢杆菌种子培养基(％)：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCI 0.5％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，CaCl₂ 0.02％，pH 7.0，121℃灭菌20min，下文中称为“种子培养基”。

将初筛得到的菌株接种到种子培养基，180rpm、35℃培养18h进行活化。活化后的菌种按2％接种量接种到发酵培养基，180rpm、37℃培养48h。取发酵液，4℃、10000rpm离心10min后吸取上清。用Folin-酚法测定上清液中蛋白酶的活性。Folin-酚法参照《GBT23527-2009蛋白酶制剂》附录B酶活力测定方法的福林法进行。

结果表明，各菌株在含豆粕粉蛋白的培养基中都能良好地生长，培养48h后发酵上清液中蛋白酶活性测定结果见表7。

表7不同枯草芽孢杆菌菌株培养液中蛋白酶活力比较

酶活U：由公式U＝4×A×n×k/10计算得到，定义为1mL液体酶，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以μ/mL表示。其中常数k＝94.267，通过标准曲线得到。因稀释倍数不同，吸光度值之间没有可比性。同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P＜0.01)。从表7中可以看出H-4的产蛋白酶能力明显优于其它各菌株。

实施例6枯草芽孢杆菌发酵生产胞外多糖

本发明经过大量试验，反复优化配方后发现，枯草芽孢杆菌H-4发酵阐述胞外多糖的最适发酵培养基含有蔗糖6％，大豆蛋白胨1％；硫酸锰0.05％，磷酸氢二钠0.15％，磷酸二氢钾0.15％，葡萄糖1％，余量为水。

1、发酵培养基初始pH对EPS产量的影响

将发酵培养基初始pH(未灭菌前)用HCI和NaOH分别调整到5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，32℃下培养36h，测定其发酵液EPS产量，确定发酵EPS产量的最佳发酵培养基初始pH。本发明所述的枯草芽孢杆菌最佳发酵培养基初始pH为7.0。

2、溶氧量对EPS产量的影响

将H-4种子液接种在1.5L发酵罐中进行发酵，设置三个处理组，每组3个重复，第一个处理组接种后不做其他处理，第二个处理组经过调整通气量，使其溶氧量保持在20％。第三个处理组调整通气量，使其溶氧量保持在25％，三个处理组均在初始pH为7.0、温度32℃，180rpm转速下发酵36h。发酵结束后测定三组EPS产量。

本发明所述的枯草芽孢杆菌在溶氧量保持25％时，EPS产量能达到8203.64mg/L，溶氧量保持20％时，EPS产量能达到7547.37mg/L，在不保持溶氧的条件下，EPS产量为6340.35mg/L。

实施例7枯草芽孢杆菌H-4发酵液FJY-H4对LPS的中和消解作用

脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)又称内毒素，是革兰氏阴性细菌外膜的一种主要成分，其脂酰链嵌入于细菌的外膜，其糖链暴露于细菌的表面，其单糖组成较特殊，包括D-葡萄糖D-半乳糖及D-甘露糖的3，6位脱氧衍生物及一些辛醛糖。致病菌细胞外膜蛋白嵌合在LPS和磷脂层外膜上。

LPS是含糖和脂质的化合物,在组成上糖的分量多于脂,故名脂多糖，可直接诱发炎症反应。一些研究表明，LPS通常由致病性大肠杆菌、沙门氏杆菌、布氏杆菌、变形杆菌和副猪嗜血杆菌等革兰氏阴性菌的细胞在代谢和死亡崩解时释放的细胞壁成分，能诱发多种机体促炎细胞因子的释放，如TNF-α、IL-6和IL-1β等。从细菌细胞壁上释放的LPS不断聚集会加重炎症反应甚至导致全身性炎症反应综合征(Botwinski,2001)，轻则引起动物发热、厌食、体内能量过度消耗、体组织分解，免疫力和生产性能下降，重则可能导致畜禽死亡(Botwinski,2001；Zinner,1999)。

细菌素是微生物源抗菌肽，一般来说，抗菌肽分子中的疏水性和阳离子数有助于其与细胞膜上的受体结合，以发挥其抗炎及免疫功能(Li et al.,2014)。同时，在抗菌肽发挥LPS中和活性时，首先通过静电作用与LPS结合，然后通过碱性氨基酸破坏其磷酸基团，进而中和LPS,从而发挥抗炎作用(Nan et al.,2012)。抗菌肽合理的两亲性有利于获得抗炎、免疫活性。

在本实施例中，枯草芽孢杆菌H-4发酵液，经3000rpm离心10min去除大颗粒成分，获得发酵液FJY-H4。然后利用无热源内毒素LPS检查中和消解作用，用无菌水将FJY-H4稀释0，2，4，8，16不同倍数，同时用无菌水作空白对照，制备成不同浓度的溶液FJY0、FJY2、FJY4、FJY8、FJY16分别取100μL的上述各浓度的发酵液与LPS(1EU/mL)混合。37℃孵育30min后，采用显色机制鲎试剂盒(通用的、公用方法)检测不同稀释倍数的发酵液对LPS的中和率。

结果如表8所示，不同稀释倍数的发酵液具有不同的LPS中和消解能力，且随着稀释倍数的增加其中和LPS的活性明显降低。

表8不同稀释倍数的枯草芽孢杆菌H-4发酵液对LPS的中和率

前人大量研究也表明，枯草芽孢杆菌家族普遍产生脂肪酶。综合实施例2-6的结果，由于枯草芽孢杆菌H-4的发酵液中含有多种细菌素、多糖、蛋白酶、脂肪酶等，从而对致病菌的细胞膜(如实施例4中的图10的电镜图所示)造成很大破坏，再加之脂肪酶、蛋白酶对其细胞膜进一步作用，从而破坏了LPS，也就是产生了对LPS的中和、消解作用。

本实施例中，枯草芽孢杆菌H-4发酵液具有中和消解LPS的作用，也就说明间接说明其具有抗炎功效，而细菌素的抗菌作用如同抗生素的类似作用，也具有抗炎功能。即枯草芽孢杆菌H-4发酵液具有中和消解LPS的作用就是具有抗炎作用。

实施例8枯草芽孢杆菌的安全性评价

选取体重为18-22g的SPF级KM小鼠40只，随机分成4组：空白对照组(灌胃无菌生理盐水)、低浓度枯草芽孢杆菌(有效活菌数2×10⁵CFU/ml)灌胃组、中浓度枯草芽孢杆菌(有效活菌数2×10⁶CFU/ml)灌胃组和高浓度枯草芽孢杆菌(有效活菌数2×10⁷CFU/ml)灌胃组，其中高浓度枯草芽孢杆菌素为最大给药浓度。雌雄各半。饲喂同种饲料，每只小鼠灌胃0.4ml的生理盐水或不同浓度的枯草芽孢杆菌溶液，共灌胃15天。试验结束后称量小鼠体重，通过眼球采血法收集小鼠血液，用于测定小鼠的血液生化指标(总胆红素T-BIL、谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST、碱性磷酸酶ALP、肌酸激酶CK、乳酸脱氢酶LDH、尿酸UA、肌酐CRE)，结果见表9。

采血结束后，解剖小鼠，肉眼观察有无病变器官，剥离心、肝、脾、肾等脂肪和筋膜后，称重记录并计算脏器系数，脏器系数＝脏器重量/体重×100％，结果见表10。

肉眼观察。灌胃结束后的14天内，各组小鼠均正常生长且未表现出任何中毒症状。将小鼠解剖后观察主要器官，如心、肝、脾、肺、肾、胃、肠道、肾上腺、胰腺等的位置、形态、色泽、大小等，试验组小鼠均未出现任何病变、肿胀或者充血。

表9枯草芽孢杆菌H-4对小鼠血液生化指标的影响

表10枯草芽孢杆菌H-4对小鼠脏器的影响

表9、表10各组数据之间无显著性差异(P>0.05)。

从毒性试验结果看，高浓度的枯草芽孢杆菌H-4对小鼠的生长代谢功能没有造成损害，在试验期间，小鼠生长健康正常，病理解剖无异常，说明枯草芽孢杆菌H-4对动物无毒副作用，安全可靠，可以作为生物饲料及饲料添加剂的使用。

实施例9枯草芽孢杆菌在养殖业上的应用

以麦芽糊精为载体采用蔗糖6％，大豆蛋白胨1％；硫酸锰0.05％，磷酸氢二钠0.15％，磷酸二氢钾0.15％，葡萄糖1％，Ph7.0，溶氧25％，32℃下180rpm发酵36h。将发酵菌液直接喷雾干燥形成芽孢杆菌菌粉，活菌含量为1010cfu/g。

216只一日龄体重相似(47.46±0.22g)罗斯308肉鸡被随机分配到3个试验组，每个试验组6个重复，每个重复12只鸡。试验组分别为：空白对照组(基础日粮)；抗生素组(基础日粮+金霉素150mg/kg日粮)；BB组(基础日粮+枯草芽孢杆菌H-4干粉，5×10⁸CFU/kg日粮)。

鸡只饲养在装有饮水器和饲料槽点金属网笼中，1-11天一个试验组的鸡只均匀分配到2个饲养笼中，第12天分成均匀分成6笼。进鸡温度为33℃，1～7d每天降低0.5℃，8～30d每天降低0.3℃，降至22℃为止。鸡舍内相对湿度1～14d维持在60％～70％，15d后维持在50％。整个试验期内采用24h连续光照程序，试验期间鸡只自由采食和饮水。试验期42天。

不含抗生素和益生菌的基础日粮根据NRC(1994)饲养标准进行配制，分前期(1-21天)和后期(22-42天)日粮，如表11所示：

表11基础日粮配方及营养成分

(1)在试验的第21天和42天，以每个重复为单位称鸡空腹(前一天晚停料不停水)重和耗料量，计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)，饲料转化率(FCR)。

结果如表12所示，枯草芽孢杆菌组与空白组相比显著提高了肉鸡的日增重和饲料转化率(P>0.05)。与抗生素组没有显著性差异(P<0.05)，显示出明显的畜禽抗生素替代潜力和应用前景。

表12肉鸡生长性能的影响

(2)胴体指标测定，在宰后30min内完成(参照家禽生产性能名词术语和度量统计方法进行测定，NY/T 823-2004)。

胴体性能计算：

1)屠宰率(％)＝屠体重/宰前体重×100％

2)全净膛率(％)＝全净膛重/宰前体重×100％

3)半净膛率(％)＝半净膛重/宰前体重×100％

4)腹脂率(％)＝腹脂重/全净膛重×100％

5)胸肌率(％)＝(左侧胸肌重×2/全净膛重)×100％

6)腿肌率(％)＝(左侧大小腿净肌肉重×2/全净膛重)×100％

结果如表13所示，枯草芽孢杆菌H-4能显著提高肉鸡的腿肌率和胸肌率(P>0.05)。

表13肉鸡胴体性状的影响

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一株高产免疫多糖和细菌素的多效枯草芽孢杆菌及应用

<130> KHP201114517.2

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Val Gln Ser Pro Asn Gly Asn Phe Ala Ala Ser Phe Val Leu Asp

1 5 10 15

Gly Thr Lys

<210> 2

<211> 94

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Phe Lys Lys Val Leu Thr Gly Ser Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Leu Met Ser Ala Ala Pro Ala Phe Ala Ala Ser Pro Thr Ala Ser Ala

20 25 30

Ser Val Glu Asn Ser Pro Ile Ser Thr Lys Ala Asp Ala Gly Ile Asn

35 40 45

Ala Ile Lys Leu Val Gln Ser Pro Asn Gly Asn Phe Ala Ala Ser Phe

50 55 60

Val Leu Asp Gly Thr Lys Trp Ile Phe Lys Ser Lys Tyr Tyr Asp Ser

65 70 75 80

Ser Lys Gly Tyr Trp Val Gly Ile Tyr Glu Ser Val Asp Lys

85 90

<210> 3

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Ile Lys Leu Val Gln Ser Pro Asn Gly Asn Phe Ala Ala Ser Phe

1 5 10 15

Val Leu Asp Gly Thr Lys Trp Ile Phe Lys Ser Lys Tyr Tyr Asp Ser

20 25 30

Ser Lys Gly Tyr Trp Val Gly Ile Tyr Glu Val Trp Asp Arg Lys

35 40 45

<210> 4

<211> 94

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Lys Phe Lys Lys Val Leu Thr Gly Ser Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Leu Met Ser Ala Ala Pro Ala Phe Ala Ala Ser Pro Thr Ala Ser Ala

20 25 30

Ser Ala Glu Asn Ser Pro Ile Ser Thr Lys Ala Asp Ala Gly Ile Asn

35 40 45

Ala Ile Lys Leu Val Gln Ser Pro Asn Gly Asn Phe Ala Ala Ser Phe

50 55 60

Val Leu Asp Gly Thr Thr Trp Ile Phe Lys Ser Lys Tyr Tyr Asp Ser

65 70 75 80

Ser Lys Gly Tyr Trp Val Gly Ile Tyr Glu Ser Val Asp Lys

85 90

Claims

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20463。

2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其发酵产物。

3.一种产品，其特征在于，含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其发酵产物，所述产品为药物、食品、保健品、饲料、或饲料添加剂。

4.如权利要求3所述的产品，其特征在于，所述药物为抑制或杀灭细菌的药物，优选所述细菌为沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、藤黄八叠球菌、链球菌、产气荚膜梭菌。

5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其发酵产物，或权利要求2所述的菌剂在消解内毒素、促进动物生长、或提高饲料转化率中的应用。

6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其发酵产物，或权利要求2所述的菌剂在制备胞外多糖或细菌素中的应用。

7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其发酵产物，或权利要求2所述的菌剂在制备药品、食品、保健品、化妆品、饲料、或饲料添加剂中的应用。

8.一种发酵生产胞外多糖的方法，其特征在于，将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种于发酵培养基中发酵制得胞外多糖。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中含有蔗糖、和/或大豆蛋白胨、和/或锰离子。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有蔗糖1-10％，大豆蛋白胨0.5-3％；硫酸锰0.01-0.3％，磷酸氢二钠0.05-0.5％，磷酸二氢钾0.05-0.5％，葡萄糖0-3％。