CN106674331B - 抗菌脂肽bacaucin及其制备方法与应用 - Google Patents

抗菌脂肽bacaucin及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗菌脂肽bacaucin及其制备方法与应用。本发明公开的抗菌脂肽bacaucin提取自保藏编号为CGMCC No.13463的枯草芽孢杆菌(CAU21)，本发明中的抗菌脂肽bacaucin对细菌尤其是革兰氏阳性菌具有很好的抗菌作用，最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)为2‑16μg/mL，且对多种耐药菌仍然具有很好的抗菌活性。

Description

抗菌脂肽bacaucin及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，抗菌脂肽bacaucin及其制备方法与应用。
背景技术
抗生素的大规模使用始于20世纪40年代，在治疗细菌感染中起到决定性作用，挽救了无数生命。由于低剂量抗生素对动物生长具有促进作用，一些抗生素被添加到饲料中用作抗菌促长剂(antibiotic growth promoter,AGP)在世界范围内广泛应用。在以规模化、集约化为特征的现代化养殖业中，抗生素在动物疫病防控中发挥着无可替代的作用，保障了充足的肉、蛋、奶等食品供应。特别是在我国养殖业管理水平偏低，集约化程度不高的情况下，抗生素在减少动物发病、降低死亡率、促进生产、减少病原菌排放和改善公共卫生等方面发挥了极其重要的作用。但是由于长期以来抗生素的大量使用，细菌耐药性问题日益突出，特别是近年来，面对一波又一波超级耐药菌的侵袭，人类逐渐到了面临细菌感染而无药可用的窘境。例如，2011年南亚发现能产生NDM-1的革兰氏阳性细菌和以前未见报道的致病菌志贺氏菌和霍乱弧菌，2011年北美发现与环境相关的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)和2015年中国发现携带MCR-1的大肠杆菌，这些超级耐药菌的不断出现对整个人类疾病的治疗和预防带来了巨大的挑战。正是由于迅速产生的细菌耐药性和新型抗生素研发的巨大投入，减少畜牧生产过程中抗生素使用量的呼声越来越高。为确保养殖业持续发展，新型抗生素或抗生素替代品的开发势在必行。目前用于畜牧业的抗生素替代品主要包括有机酸、酶制剂、低聚糖、中草药和微生态制剂等，但这些替代品不仅生产成本高，而且在实际生产中效果亦不是很理想。从上个世纪70年代开始，新型抗生素的的研发速度不断下降，这主要是相同来源的细菌能产生新型抗生素的比例逐渐减小。目前世界范围内都掀起了寻找新型抗菌物质的热潮，如开放式抗菌药物发现组织(CO-ADD)发起了全球搜寻新抗生素项目，邀请全球化学家提交自己的化合物，进行抗菌活性筛查，旨在与超级细菌的赛跑中早日寻找到下一代抗生素。
小分子多肽类化合物，因其良好的抗菌活性、独特的抗菌机制受到越来越多的关注。然而目前大多数的小分子多肽的抗菌性只局限于体外抗菌活性，对热或酸碱的稳定性较差，对蛋白酶的稳定性较差，大大限制了其在体内的活性和在疾病治疗领域的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何抑制细菌的生长。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种化合物，其名称为bacaucin，该化合物是一种脂肽，并且具有抑菌作用。所述化合物如式1所示：
Figure BDA0001191645880000021
为解决上述技术问题，本发明还提供了bacaucin的制备方法。
本发明所提供的bacaucin的制备方法，包括：破碎枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌体，得到菌体粗提物；从所述菌体粗提物中分离纯化得到bacaucin。
bacaucin的分子量为1035.8Da。
上述方法中，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)可为保藏编号为CGMCCNo.13463的枯草芽孢杆菌(CAU21)。
上述方法中，所述从所述菌体粗提物中分离纯化得到bacaucin可包括a)和b)：
a)将所述菌体粗提物进行凝胶过滤层析，采用甲醇进行洗脱，收集具有抗菌活性的洗脱峰；
b)将a)得到的洗脱峰进行反相高效液相色谱，采用乙腈和水进行梯度洗脱，收集具有抗菌活性的洗脱峰，即为bacaucin的洗脱峰。所述洗脱的流速可为1mL/min，波长可为219nm。所述洗脱可按照下表方式进行：
时间(min) 乙腈(％，体积百分比) 水(％，体积百分比)
0-4(不包括4) 1 99
4-4.01(不包括4.01) 75 25
4.01-15(不包括15) 95 5
15-18(不包括18) 95 5
18-20(不包括20) 1 99
上述方法中，步骤a)中所述凝胶过滤层析所用的层析介质的分离范围可包括1KD。
上述方法中，步骤a)中所述凝胶过滤层析的介质可为Sephadex LH-20。
上述方法中，步骤a)中所用的层析柱的柱长度和柱内径比可为30:1～70:1，如50:1。
为解决上述技术问题，本发明还提供了保藏编号为CGMCC No.13463的枯草芽孢杆菌(CAU21)。
为解决上述技术问题，本发明还提供了bacaucin或保藏编号为CGMCC No.13463的枯草芽孢杆菌(CAU21)的下述任一应用：
X1)在抑制细菌生长中的应用；
X2)在制备抑制细菌生长产品中的应用；
X3)在治疗和/或预防细菌所致疾病中的应用；
X4)在制备治疗和/或预防细菌所致疾病产品中的应用；
X5)在防止细菌引起的腐败中的应用；
X6)在制备防止细菌引起的腐败产品中的应用；
X7)在制备抗菌肽中的应用。
上述应用中，所述抗菌肽抑制的病原菌可为细菌。所述细菌均可为革兰氏阳性菌。
为解决上述技术问题，本发明还提供了含有bacaucin或保藏编号为CGMCCNo.13463的枯草芽孢杆菌(CAU21)的产品，所述产品为下述任一产品：
Y1)抑制细菌生长产品；
Y2)治疗和/或预防细菌所致疾病产品；
Y3)防止细菌引起的腐败产品。
上述产品中，所述细菌均可为革兰氏阳性菌。
本发明中，所述预防和/或治疗细菌引起的疾病的产品均可为药物或疫苗。所述防止细菌引起腐败的产品均可为防腐剂。
本发明中，所述细菌可为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。所述革兰氏阳性菌可为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和/或肠球菌。所述肠球菌可为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)(如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)VRE A4、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)1F-1或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)2F-7(optrA))或屎肠球菌(Enterococcus faecium)(如屎肠球菌(Enterococcus faecium)5F-10或屎肠球菌(Enterococcus faecium)4W-9(optrA+cfr))。所述金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)可为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MRSA T144、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MRSA 115、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MRSA W7、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MRSA 417(cfr)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MRSA 1518(cfr)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MRSA 1530(cfr)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)215(LZDR+cfr)。
所述革兰氏阴性菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonellaenterica)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(如绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1)或奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)。
其中，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)2F-7(optrA)携带有耐药基因optrA，屎肠球菌(Enterococcus faecium)4W-9(optrA+cfr)携带有耐药基因optrA和cfr，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MRSA 417(cfr)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)MRSA 1518(cfr)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MRSA 1530(cfr)均携带有耐药基因cfr，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)215(LZDR+cfr)携带有耐药基因cfr且利奈唑胺耐药，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)VRE A4为万古霉素的耐药菌株。
实验证明，本发明中的抗菌脂肽bacaucin对细菌尤其是革兰氏阳性菌具有很好的抗菌作用，最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)为2-16μg/mL，且对多种耐药菌仍然具有很好的抗菌活性。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
生物材料的菌株编号：CAU21
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2016年12月16日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.13463
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CAU21的16s rRNA细菌鉴定图。
图2为抗菌脂肽Bacaucin的分离纯化。其中，A：粗提取物的凝胶过滤层析图；B：洗脱液2的反相高效液相色谱图；C为精提物的纯度鉴定结果。下面加黑线部分表明该峰对应的洗脱液具有抗菌活性。
图3为抗菌脂肽Bacaucin的结构鉴定。(A)Bacaucin的紫外光谱图(200-400nm)。(B)Bacaucin的傅里叶红外光谱图(400-600cm-1)。(C)Bacaucin分子离子的二级质谱扫描图(Mass/Mass)。(D)Bacaucin的1H核磁共振图(D2O作为溶剂)。
图4为抗菌脂肽bacaucin衍生物的序列相关信息。
图5为抗菌脂肽bacaucin衍生物的抗菌谱(MIC,μg/mL)。
图6为Bacaucin-1的热稳定性和酸碱稳定性。(A)Bacaucin-1于20-121℃处理1h后抗菌活性的变化；(B)Bacaucin-1于pH(2-12)处理1h后抗菌活性的变化。
图7为Bacaucin-1对红细胞，哺乳动物细胞系和斑马鱼胚胎的安全性评价。(A)Bacaucin-1对羊血红细胞的溶血性。(B)Bacaucin-1处理后Vero，HEp-2和A549细胞的细胞存活率。(C)细胞培养液(1，阴性对照)、不同浓度Bacaucin-1(2,10μg/mL；3,20μg/mL；4,40μg/mL)和10μg/mL替米考星(5，阳性对照)处理后96h的斑马鱼胚胎。箭头表示替米考星所引起的致畸性和脊柱弯曲。
图8为Bacaucin的溶血性和细胞毒性试验。其中，A为溶血性结果，B为细胞毒性结果。
图9为Bacaucin-1在食物腐败模型和两种小鼠感染模型中的应用。(A)S.aureusATCC29213所致的肌肉腐败模型单次给予Bacaucin-1处理后细菌数的变化；(B)MRSA T144引起的中性粒细胞缺失小鼠大腿感染模型单次腹腔注射Bacaucin-1治疗后细菌数的变化；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，P值采用单因素方差分析进行测定。(C)MRSA T144引起的小鼠菌血症模型(n＝6)单次给予Bacaucin-1和万古霉素治疗后小鼠存活率情况，0表示MRSA感染组；(D)小鼠菌血症模型给予Bacaucin-1治疗后细菌数的变化情况，-表示MRSA感染组，+表示bacaucin-1浓度为20mg/kg bacaucin-1治疗组。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的BALB/c雌性小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品。
实施例1、抗菌脂肽bacaucin的制备及其抗菌活性
本发明从土壤中分离得到一株菌，利用在16S rRNA的两端设计的引物对AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(序列1)与ACGGCTACCTTGTTACGACTT(序列2))对该菌株的16S rRNA进行PCR扩增，扩增产物的16S rRNA的序列如序列表中序列3所示，该菌株16S rRNA的序列分析结果如图1所示，经序列比对发现该16S rRNA的序列表明该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，将该菌命名为枯草芽孢杆菌(CAU21)。
枯草芽孢杆菌(CAU21)，细胞呈杆状，直径0.6μm～1.0μm，长1.5μm～2.0μm，芽孢中生，椭圆，孢囊不膨大，革兰氏反应阳性。在锰营养琼脂平板上37℃培养36h形成的菌落为圆形，直径3.0mm～10.0mm，淡黄色，中间色深，表面平整不光滑，无光泽，边缘不整齐。
枯草芽孢杆菌(CAU21)已于2016年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.13463。
一、抗菌脂肽bacaucin的制备
(1)甲醇提取：枯草芽孢杆菌(CAU21)接种于大豆琼脂平板(Sigma公司)上于37℃培养10天后。刮取菌落置于1mL甲醇中，80℃下水浴30min。待甲醇挥发完全后，用0.5mL甲醇复溶，充分涡动混匀后，13000g离心3min，弃沉淀，收集上清液，将上清液利用N2吹干，得到菌体粗提物；将菌体粗提物用500μL甲醇复溶，得到粗提取液，保存于4℃。
(2)纯化：将步骤(1)得到的粗提取液上样于Sephadex LH-20凝胶过滤层析柱(该层析柱的填料为Sephadex LH-20，Sephadex LH-20为GE公司产品)(1.6×80cm(直径×高度))，采用甲醇以0.8mL/min的流速对层析住进行等度洗脱，收集6h内的洗脱液。利用多功能酶标仪SpectraMax M5测定洗脱液的吸光值(214nm)，绘制对应的吸收曲线，得到三个特征吸收峰(图2中A)，将三个吸收峰对应的洗脱液分别称为洗脱液1、洗脱液2和洗脱液3。对洗脱液1、洗脱液2和洗脱液3利用肉汤稀释法(CLSI(Clinical and Laboratory StandardsInstitute)2015)进行金黄色葡萄球菌(ATCC29213)抗菌活性测试，发现对应于2号峰的洗脱液2具有最高的抗菌活性。
对洗脱液2进行富集浓缩后，进一步采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对其进行分离，固定相为C18(Waters公司)，流动相为乙腈和水，流速为1mL/min，采用梯度洗脱的方法对其进行进一步的分离和纯化，具体方法如下：
色谱柱：C18色谱柱(4.6×250nm)
上样量：20μL
流动相：乙腈、水
程序：见下表
时间(min) 乙腈(％，体积百分比) 水(％，体积百分比)
0-4(不包括4) 1 99
4-4.01(不包括4.01) 75 25
4.01-15(不包括15) 95 5
15-18(不包括18) 95 5
18-20(不包括20) 1 99
柱温：40℃
检测器：紫外检测器，219.2nm
流速：1.0mL/min
结果得到四个色谱峰(图2中B)，1号峰、2号峰、3号峰和4号峰，对应的洗脱液分别为洗脱液A、洗脱液B、洗脱液C和洗脱液D，将这四个洗脱液利用肉汤稀释法(CLSI(Clinicaland Laboratory Standards Institute)2015)进行金黄色葡萄球菌(ATCC29213)进行抗菌活性测定，发现保留时间为7.88min的1号峰具有最高的抗菌活性，收集1号峰的洗脱液(洗脱液A)，N2吹干，得到精提物，-20℃保存。将精提物以相同的色谱条件进行纯度鉴定发现，其纯度大于98％，如图2中C所示，结果显示精提物为单一组分，纯度达到化学结构测定的要求。
(3)结构鉴定：采用紫外色谱(UV)、红外光谱(FTIR)、超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)和核磁共振氢谱(1H NMR)对其分子结构进行鉴定。
紫外吸收光谱(UV)：将上述步骤(2)得到的精提物极微量溶于超纯水中，用PDA检测器(waters)在200nm～400nm波长范围内以超纯水为空白对照进行全波长扫描，自动形成紫外吸收图谱(图3)。紫外光谱结果表明该精提物的最大吸收波长为219.2nm。
红外光谱(FTIR)：用Spotlight 200 Micro-Infrared spectrometer(PE)进行400cm-1-4000cm-1区域内扫描。结果显示，该精提物具有酰胺键特征吸收峰(图3)。图3中，N-H伸缩振动(3217cm-1)和N-H弯曲振动(1545cm-1),伸缩振动of C＝O and C-N chemicalbonds(1639cm-1and 1397cm-1),说明bacaucin中含有酰胺键，即肽键。
紫外吸收光谱与红外光谱的结果表明该精提物是由氨基酸组成的多肽类化合物。
超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)：采用Waters；条件：雾化器,28；毛细管电压,3200V；脱溶剂温度,350℃；，源温：100℃，scan range：50～1037Da，syringe pump：0.3ml/min，数据分析软件为masslynx v4.1。一级质谱表明该精提物的分子量为1035.8Da。
核磁共振氢谱(1H NMR)：以D2O为溶剂，室温下测定。采用Bruker Avance III400MHz NMR spectrometer(Bruker)，进行氢谱(1HNMR)的测定，共振频率为400MHZ。
二级质谱和核磁共振氢谱结果(图3)表明该精提物是由7个氨基酸残基和β-羟基脂肪酸链组成的环肽类化合物，其化学结构式如式1所示，将其命名为抗菌脂肽bacaucin。
Figure BDA0001191645880000081
二、抗菌脂肽bacaucin的抗菌活性
试验菌株包括革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌和奇异变形杆菌)，菌株信息如表1所示，采取肉汤稀释法(CLSI(Clinical and LaboratoryStandards Institute)2015)对其抗菌谱及最小抑菌浓度进行测定，测定温度为37℃，pH为7.0。
表1、本发明所使用的菌株及其编号
Figure BDA0001191645880000082
其中，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)2F-7(optrA)携带有耐药基因optrA，屎肠球菌(Enterococcus faecium)4W-9(optrA+cfr)携带有耐药基因optrA和cfr，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MRSA 417(cfr)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)MRSA 1518(cfr)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MRSA 1530(cfr)均携带有耐药基因cfr，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)215(LZDR+cfr)携带有耐药基因cfr且利奈唑胺耐药，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)VRE A4为万古霉素的耐药菌株。
文献1：王政。耐药基因optrA在养猪场环境源和人源肠球菌中的流行特征，硕士学位论文，中国农业大学，2016。
文献2：D.Li,C.Wu,Y.Wang,R.Fan,S.Schwarz,S.Zhang,Antimicrob.Agents.Chemother.2015,59,3641.
结果显示，本发明中的抗菌脂肽bacaucin对革兰氏阳性菌具有很好的抗菌作用，最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)为2-16μg/mL，且对包括粪肠球菌(E.faecalis)VRE A4、粪肠球菌(E.faecalis)2F-7(optrA)、屎肠球菌(E.faecium)4W-9(optrA+cfr)、金黄色葡萄球菌MRSA 1518(cfr)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)215(LZDR+cfr)在内的耐药菌仍然具有很好的抗菌活性，抗菌脂肽bacaucin的抗菌谱见表2和图5。
表2、抗菌脂肽bacaucin的抗菌谱(MIC,μg/mL)
Figure BDA0001191645880000091
实施例2、抗菌脂肽bacaucin衍生物的制备及其抗菌活性
对实施例1的抗菌脂肽bacaucin进行优化，得到多种bacaucin衍生物(bacaucinDerivatives)，即Bacaucin-1～Bacaucin-16，Bacaucin-1为小分子多肽，Bacaucin其他衍生物Bacaucin-2～Bacaucin-16均为多肽，其中Bacaucin-8为环状多肽，Bacaucin-10的第5位为鸟氨酸(Orn)残基，Bacaucin-12的N端由Ac修饰，Bacaucin-1～Bacaucin-16的氨基酸序列分别为序列表中序列4-19，具体信息如图4所示，其中1至16分别表示Bacaucin-1～Bacaucin-16。
由上海吉尔生化有限公司合成Bacaucin-1～Bacaucin-16，合成后利用高效液相色谱法(HPLC)和超高效液相-串联质谱对这几种bacaucin衍生物的纯度和分子量进行测定，结果表明Bacaucin-1～Bacaucin-16的纯度均大于95％，具体信息如表3所示。
表3、抗菌脂肽bacaucin衍生物的结构信息和纯度
Figure BDA0001191645880000101
1、抗菌脂肽bacaucin衍生物的抗菌谱及最小抑菌浓度的测定
试验菌株包括革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌和奇异变形杆菌)，采取肉汤稀释法(CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)2015)对抗菌脂肽bacaucin衍生物抗菌谱及最小抑菌浓度进行测定，测定温度为37℃，pH为7.0。将实施例1的bacaucin作为对照。
结果表明，小分子多肽Bacaucin-1对金黄色葡萄球菌，包括金黄色葡萄球菌(MRSA)T144,金黄色葡萄球菌MRSA 1518(cfr),金黄色葡萄球菌(S.aureus)215(LZDR+cfr)携带耐药基因的金黄色葡萄球菌具有特异性的抑制作用，其最小抑菌浓度为2-4μg/mL，其他Bacaucin衍生物的抑菌作用能力均小于Bacaucin-1，结果如表4和图5所示，图5中1至16分别表示Bacaucin-1～Bacaucin-16，金黄色葡萄球菌29213表示金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 29213。
表4、小分子多肽Bacaucin-1的抗菌谱(MIC,μg/mL)
Figure BDA0001191645880000111
2、小分子多肽Bacaucin-1的热稳定性和酸碱稳定性
利用金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC 29213)在Bacaucin-1的最小抑菌浓度下测定其热稳定性和酸碱稳定性。
将Bacaucin-1分别在20-121℃的温度范围内以及pH2-pH12的pH范围分别孵育1h，检测Bacaucin-1的MIC值，计算剩余抗菌活性，剩余抗菌活性＝37℃、pH为7.0下的MIC值/待测条件下的MIC值×100％。热稳定性和酸碱稳定性，温度取值分别为25℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、100℃和121℃，pH的取值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10和12。在测定Bacaucin-1的热稳定性时，pH为7.0；在测定Bacaucin-1的酸碱稳定性时，先将Bacaucin-1溶于PBS溶液中，调节pH至相应的pH值，孵育1h后，调节pH回至7.0，测定温度为37℃。
如图6所示，80℃及以下，pH(4-7)之间，bacaucin-1可以100％的保持其抗菌活性，有较好的热稳定性和酸碱稳定性。
3、小分子多肽Bacaucin-1的毒性评价
对步骤1的各抗菌脂肽bacaucin衍生物的细胞毒性、溶血性和斑马鱼胚胎毒性进行评价，细胞毒性试验将选择Vero，HEp-2和A549作为受试细胞；利用羊血红细胞研究其溶血性，以判断其与组织的相容性；以斑马鱼作为模式动物，研究其对斑马鱼胚胎的毒性。
3.1细胞毒性
采用WST-1测定bacaucin和bacaucin-1细胞毒性：
96孔板先加入100μL含1％的青霉素和链霉素的MEM培养基，加入bacaucin，bacaucin的浓度如下1024μg/mL、512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL和2μg/mL，每种浓度三个复孔；然后向每孔中加入一层Vero细胞，每孔细胞数为104；37℃孵育24h后，弃去100μL液体，每孔加入10μL的WST-1，孵育1h后测定其450nm。
bacaucin-1细胞毒性的测定同上述方法。
3.2溶血性
96孔板先加入100μL PBS，加入bacaucin，bacaucin的浓度如下1024μg/mL、512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL和2μg/mL，每种浓度三个复孔；然后向每孔中加入一层100μL 8％红细胞悬浮液(脱纤维羊血3000g，离心10min后去除血清，PBS清洗两次后制备成100％红细胞悬浮液，将8mL该悬浮液与92mL的PBS混合得到8％红细胞悬浮液)，37℃孵育1h后，离心，吸取上清液100μL，测定其OD576nm。利用PBS和Triton X-100分别作为阴性对照(N)和阳性对照(P)。溶血率＝(待测液体OD值-阴性对照OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)×100％。
bacaucin-1溶血性的测定同上述方法。
3.3斑马鱼胚胎毒性
向胚胎培养液(称取0.8g NaCl、0.04 KCl、0.00358g Na2HPO4、0.006g KH2PO4、0.144g CaCl2、0.246g MgSO4·7H2O、0.35g NaHCO3、0.06g青霉素、0.1g链霉素加入含有800mL灭菌水的1L烧杯中，搅拌至完全溶解，再用灭菌水定容至1L得到胚胎培养液。)中加入Bacaucin-1，得到Bacaucin-1分别为10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL的Bacaucin-1溶液；向细胞培养液中加入替米考星得到替米考星浓度为10μg/mL的替米考星溶液。利用Bacaucin-1溶液处理斑马鱼胚胎，并将细胞培养液作为阴性对照，替米考星溶液作为阳性对照，具体步骤如下：受精后6h的胚胎中加入不同浓度的bacaucin-1溶液或替米考星溶液，置于28℃培养箱中培养，96h后取出利用SZM 76立体显微镜(重庆澳浦光电技术有限公司)观察斑马鱼的形态学变化。
结果(图7)表明，小分子多肽Bacaucin-1对受试细胞Vero，HEp-2和A549无任何细胞毒性作用，对羊血红细胞没有溶血性，对模式动物斑马鱼的胚胎也无毒性作用。而Bacaucin不仅对Vero、HEp-2细胞表现出一定的细胞毒性，而且具有溶血性(图8)。
4、小分子多肽Bacaucin-1在食品防腐中的应用
将市场上买来的鸡脯肉平均分成24份，每份约5g，随机分成6组，每组4份。各组分别为：PBS组、金黄色葡萄球菌污染组、污染防腐组1、污染防腐组2、污染防腐组3和污染防腐组4。
将金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC 29213)悬浮于PBS中，得到浓度为6.3×104CFU/mL的菌悬液；将Bacaucin-1溶于PBS中，分别得到浓度为200、500、1000和2000μg/mL的Bacaucin-1溶液。
PBS组鸡脯肉按照如下方式利用PBS进行处理：向每份肉块表面滴加100μL的PBS，随后滴加100μL的PBS缓冲液，作为对照。
金黄色葡萄球菌污染组鸡脯肉按照如下方式处理：向每份肉块表面滴加100μL的菌悬液，随后滴加100μL的PBS缓冲液，得到0mg/kg Bacaucin-1处理的肉块。
污染防腐组1鸡脯肉按照如下方式处理：向每份肉块表面滴加100μL的菌悬液，随后滴加100μL的200μg/mL的bacaucin-1溶液，得到4mg/kg Bacaucin-1处理的肉块。
污染防腐组2鸡脯肉按照如下方式处理：向肉块表面滴加100μL的菌悬液，随后滴加100μL的500μg/mL的bacaucin-1溶液，得到10mg/kg Bacaucin-1处理的肉块。
污染防腐组3鸡脯肉按照如下方式处理：向肉块表面滴加100μL的菌悬液，随后滴加100μL的1000μg/mL的bacaucin-1溶液，得到20mg/kg Bacaucin-1处理的肉块。
污染防腐组4鸡脯肉按照如下方式处理：向肉块表面滴加100μL的菌悬液，随后滴加100μL的2000μg/mL的bacaucin-1溶液，得到40mg/kg Bacaucin-1处理的肉块。
将各组鸡脯肉按照相应的方式处理后，于37度培养24h，然后鉴定各组的肉块菌落总数，并用形态学和HE染色观察肉块组织结构。
将肉块匀浆、混匀，使用金黄色葡萄球菌显色培养基测定细菌数：将肉块研磨液倍比稀释多个梯度后，分别加入9cm平皿中，倾注15mL的金黄色葡萄球菌显色培养基，于37℃下培养24h，选择平板上红色的菌为30-300个之间的进行计数。
结果(图9中A)表明，加入bacaucin-1后的肉块中的细菌数显著降低，并且细菌数随bacaucin-1浓度的增加而降低。形态学和HE染色的结果表明，加入bacaucin-1后，肉块的组织结构和风味得到了较好的保持。表明，bacaucin-1具有很好的防腐作用。
5、小分子多肽Bacaucin-1在治疗小鼠大腿细菌感染和菌血症中的应用
5.1治疗小鼠大腿感染
将30只BALB/c雌性小鼠(18g)，平均分成5组，每组6只小鼠。各组分别为：PBS组，不同浓度bacaucin-1治疗组。细菌感染前1天腹腔注射200mg/kg环磷酰胺以构建小鼠的中性粒细胞缺失模型，防止体内中性粒细胞影响后续试验。
将金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC 29213)悬浮于PBS中，得到浓度为1.5×106CFU/mL的金黄色葡萄球菌悬浮液；将Bacaucin-1溶于PBS中，分别得到浓度为360，900，1800，3600μg/mL的Bacaucin-1溶液。
环磷酰胺注射1天后于小鼠右侧大腿肌肉注射0.1mL的金黄色葡萄球菌悬浮液后，2h后腹腔注射分别给予PBS(即Bacaucin-1浓度为0),360，900，1800和3600μg/mL的Bacaucin-1溶液，注射体积均为0.2mL，即给药剂量分别为0,4,10,20和40mg/kg，每组注射一种浓度的Bacaucin-1溶液或注射PBS。24h后，将所有小鼠安乐死，取右侧大腿肌肉，将肉块匀浆、混匀，按照步骤4中的金黄色葡萄球菌鉴别培养基测定菌含量方法测定细菌数。
结果(图9中B)表明，Bacaucin-1能有效的降低小鼠大腿感染模型中大腿细菌数，并且细菌数随Bacaucin-1浓度的增加而降低。
5.2治疗菌血症
将48只BALB/c雌性小鼠，平均分成8组，每组6只小鼠，平均体重为18g。各组分别为：PBS组、MRSA感染组、不同浓度bacaucin-1治疗组(4组)及不同浓度万古霉素治疗组(2组，作为阳性对照)。
将金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC 29213)悬浮于PBS中，得到浓度为1.5×109CFU/mL的MRSA悬浮液；将Bacaucin-1溶于PBS中，分别得到浓度为360，900，1800，3600μg/mL的Bacaucin-1溶液；将万古霉素溶于PBS中，分别得到浓度为180和1800μg/mL的万古霉素溶液。
PBS组：腹腔注射0.5mL PBS 1h后，腹腔注射0.2mL PBS。
MRSA感染组：腹腔注射0.5mL MRSA悬浮液1h后，腹腔注射0.2mL PBS，给药剂量为0mg/kg。
不同浓度bacaucin-1治疗组：腹腔注射0.5mL MRSA悬浮液1h后，腹腔注射0.2mLBacaucin-1溶液进行治疗，每组一种Bacaucin-1溶液，给药剂量分别为0,4,10,20和40mg/kg。
不同浓度万古霉素治疗组：腹腔注射0.5mL MRSA悬浮液1h后，腹腔注射0.2mL万古霉素溶液进行治疗，每组一种万古霉素溶液，给药剂量分别为2和20mg/kg。
48h后观察每组小鼠的存活率，检测小鼠的心、肝、脾、肺和肾中致病菌的细菌数，按照步骤4中的金黄色葡萄球菌鉴别培养基测定菌含量方法进行，对药效进行评价。
结果(图9中C和D)表明，48小时后与MRSA感染组相比，使用bacaucin-1和万古霉素进行治疗后，小鼠存活率得到显著提升，并且使用bacaucin-1进行治疗的小鼠存活率与万古霉素相当，bacaucin-1的治疗效果随着浓度的升高而增加。其次，治疗组小鼠的心、肝、脾、肺和肾中致病菌的菌落总数也显著降低。
<110> 中国农业大学
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
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acggctacct tgttacgact t 21
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aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc 120
ccacgctttc gctcctcagc gtcagttaca gaccagagag tcgccttcgc cactggtgtt 180
cctccacatc tctacgcatt tcaccgctac acgtggaatt ccactctcct cttctgcact 240
caagttcccc agtttccaat gaccctcccc ggttgagccg ggggctttca catcagactt 300
aaggaaccgc ctgcgagccc tttacgccca ataattccgg acaacgcttg ccacctacgt 360
attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc gtggctttct ggttaggtac cgtcaaggta 420
ccgccctatt cgaacggtac ttgttcttcc ctaacaacag agctttacga tccgaaaacc 480
ttcatcactc acgcggcgtt gctccgtcag actttcgtcc attgcggaag attccctact 540
gtgggccctc ccga 554
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Leu Leu Ser Arg Val
1 5

Claims (9)

1.式1所示化合物：
Figure FDA0002310272380000011
2.权利要求1所述化合物的制备方法，包括：破碎枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌体，得到菌体粗提物；从所述菌体粗提物中分离纯化得到所述化合物；
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为保藏编号为CGMCC No.13463的枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述从所述菌体粗提物中分离纯化得到所述化合物包括a)和b)：
a)将所述菌体粗提物进行凝胶过滤层析，采用甲醇进行洗脱，收集具有抗菌活性的洗脱峰；
b)将a)得到的洗脱峰进行反相高效液相色谱，采用乙腈和水进行洗脱，收集具有抗菌活性的洗脱峰，即为所述化合物的洗脱峰。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤a)中所述凝胶过滤层析所用的层析介质的分离范围包括1KD；
和/或，
步骤a)中所述凝胶过滤层析的介质为Sephadex LH-20。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤a)中所用的层析柱的柱长度和柱内径比为30:1～70:1。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤a)中所用的层析柱的柱长度和柱内径比为50:1。
7.保藏编号为CGMCC No.13463的枯草芽孢杆菌。
8.权利要求1所述化合物或保藏编号为CGMCC No.13463的枯草芽孢杆菌的下述任一应用：
X1)在制备抑制革兰氏阳性菌生长产品中的应用；
X2)在制备治疗和/或预防革兰氏阳性菌所致疾病产品中的应用；
X3)在防止革兰氏阳性菌引起的腐败中的应用；
X4)在制备防止革兰氏阳性菌引起的腐败产品中的应用；
X5)在制备抗菌肽中的应用。
9.含有权利要求1所述化合物或保藏编号为CGMCC No.13463的枯草芽孢杆菌的产品，所述产品为下述任一产品：
Y1)抑制革兰氏阳性菌生长产品；
Y2)治疗和/或预防革兰氏阳性菌所致疾病产品；
Y3)防止革兰氏阳性菌引起的腐败产品。
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