CN106883289B - 一种抗菌肽bv21 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗菌肽BV21。所述抗菌肽BV21的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明中的抗菌肽BV21具有分子量小、人工合成方便且成本低、杀菌作用强、细胞毒性低等优点，在畜禽饲料中应用能够显著提高畜禽的生长性能、改善畜禽肠道健康，提高断奶仔猪日增重和降低料重比。

Description

一种抗菌肽BV21

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种抗菌肽BV21。

背景技术

抗生素在动物生产中应用已经有60-70年历史，曾对畜禽养殖业的发展起到了非常大的推动作用。然而，随着抗生素在畜牧业的广泛使用，畜牧业中大量使用抗生素的潜在危害也日益突出。一方面抗生素大量使用引起的畜禽产品药物残留可对人体直接产生毒性及过敏作用；另一方面抗生素的大量应用使细菌耐药性增强、耐药菌增加，对人类安全产生严重威胁，近年来不断出现的“超级细菌”就是典型的例子。鉴于此，欧盟等发达国家已经开始禁止在畜禽饲料中使用抗生素，寻找替代抗生素的饲料添加剂、改善畜禽生产性能是当前研究的热点课题。抗菌肽是自然界生物中广泛存在的一种小分子活性多肽，是生物体免疫系统的重要组成部分，具有高效广谱的抗菌作用。且抗菌肽具有热稳定性好和不易产生耐药性等特点，在医药卫生和畜禽生产等领域具有广泛的应用前景，成为替代抗生素重要的潜在物质。大量天然来源的抗菌肽存在分子量大而存在免疫原性、抗菌活性不高、对动物细胞具有毒副作用或会导致溶血等缺陷，在一定程度上限制了抗菌肽的推广应用。通过分子设计和改造获得分子量小、抗菌活性高和对动物细胞无毒副作用的抗菌肽可克服天然来源抗菌肽的应用瓶颈。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的抗菌肽。

为实现上述目的，本发明提供一种抗菌肽BV21，其特征在于：所述抗菌肽BV21的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。具体为：IRVLGILGLLGKALSHL，分子量为1773.24Da，等电点为11.00。

本发明具有如下优点：本发明中的抗菌肽BV21具有分子量小、人工合成方便、杀菌作用强、细胞毒性低等优点，在畜禽饲料中应用能够显著提高畜禽的生长性能、改善畜禽肠道健康。

本发明的实施例通过测定抗菌肽BV21最小抑菌浓度(minimal inhibitoryconcentration,MIC)来反映其抗菌效果，最小抑菌浓度为检测不到细菌生长的最低样品浓度。结果表明本发明的抗菌肽BV21对大肠杆菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌均有非常强的杀伤作用。在细胞毒性实验上，即使在300ug/mL的浓度下，抗菌肽BV21对猪小肠上皮细胞IPEC-1也只存在很低(小于15％)的细胞毒副作用。抗菌肽BV21能够显著提高断奶仔猪的生长性能，提高断奶仔猪日增重和降低料重比，改善断奶仔猪肠道健康、降低断奶仔猪腹泻率。

附图说明

图1是抗菌肽BV21细胞毒性分析图；

图2抗菌肽BV21对24日龄断奶仔猪腹泻率的影响图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：抗菌肽BV21的制备

抗菌肽BV21化学合成方法：根据发明内容中所述氨基酸序列，用全自动多肽合成仪(ABI433)合成BV21全序列(湖南师范大学生命科学学院合成)，并通过HPLC反相柱层析脱盐纯化；

纯化的抗菌肽BV21分子量采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定,等电点使用等电聚焦电泳测定，氨基酸序列采用自动氨基酸序列测定仪进行解析。

抗菌肽BV21含有17个氨基酸残基，分子量为1773.24Da，等电点为11.00，氨基酸序列为IRVLGILGLLGKALSHL(SEQ ID NO:1)。

实施例2：抗菌肽BV21抑菌实验

通过测定抗菌肽BV21最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)来反映其抗菌效果，最小抑菌浓度为检测不到细菌生长的最低样品浓度。采用二倍稀释法，具体方法如下：

受试细菌接种于LB固体培养基上，然后于37℃培养箱中倒置培养。待菌落长出后，用一次性接种环挑取各受试细菌单菌落至LB液体培养基中，37℃培养箱中震荡培养至对数生长期。紫外分光光度计上检测菌液OD600，根据1OD600＝1×10⁹CFU/mL将受试菌菌液用液体LB培养基稀释至2×10⁵CFU/mL。然后在无菌96孔板各孔中加入100μL LB液体培养基，然后在A1孔中加入100μL稀释到一定浓度的抗菌肽BV21样品(抗菌肽样品加入前用0.22μm微孔滤膜过滤除菌)，混匀后取100μL加入A2孔，A2孔混匀后再取100μL加入A3孔，依次倍比稀释，最后从A12孔吸出100μL弃去，至此抗菌肽BV21二倍浓度梯度样制成。向预先加入抗菌肽BV21的各孔中再依次加入已稀释好的菌液100μL混匀，于37℃缓慢震荡培养16h，然后测定600nm处吸光值。结果计算：取检测不到细菌生长的孔和与之相邻的有细菌生长的孔中抗菌肽BV21浓度之和的平均值作为抗菌肽BV21最小抑菌浓度。测试结果见表1所示。从表1中可以看出抗菌肽BV21对大肠杆菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌(中国科学院亚热带农业生态研究所提供)均有非常强的杀伤作用。

表1：抗菌肽BV21对各菌的最小抑菌浓度表

受试菌种	BV21 MIC(ug/mL)
		大肠杆菌	17.52
沙门氏菌	4.7
		枯草芽孢杆菌	9.83

注：1)其中BV21 MIC：即抗菌肽BV21的最小抑菌浓度。

2)所述结果为五次独立重复实验结果的平均值。

实施例3：抗菌肽BV21的细胞毒性实验

猪小肠上皮细胞IPEC-1(中国科学院亚热带农业生态研究所提供)培养于含有5％太牛血清、200U/mL双抗(青霉素和链霉素各100U/mL)，5ug/L表皮生长因子(EGF)的HAM’S/F12培养基中培养至对数期，用磷酸盐缓冲液(HyClone)清洗三遍后，加入0.25％(2.5g/L)的胰蛋白酶消化至单个细胞，加入HAM’S/F12培养基后400g离心4分钟，弃上清后用新鲜的HAM’S/F12培养基悬浮细胞，调整至细胞密度为1×10⁶个/mL，然后往96孔细胞培养板每孔中加入200uL，待细胞贴壁后加入不同浓度抗菌肽BV21，置于二氧化碳培养箱(37℃、5％CO₂)培养24小时后，每孔中加入20uL CCK-8(碧云天)CCK-8溶液，继续培养2小时，然后用酶标仪检测450nm波长的吸光值。检测结果如图1所示(其中BV21-300为300ug/mL抗菌肽BV21；BV21-150为150ug/mL抗菌肽BV21；PBS：磷酸盐缓冲液为对照组，所述实验结果为六次独立实验结果的平均值)，从图1中可以看出，即使在300ug/mL的浓度下，抗菌肽BV21对猪小肠上皮细胞IPEC-1仍然存在很低(小于15％)的细胞毒副作用。。

实施例4：抗菌肽BV21对断奶仔猪(24日龄)大肠杆菌攻毒实验

选取24日龄杜洛克×长白×大白断奶仔猪_200头，采用单因子试验设计，按体重和性别随机分到2个处理组，对照组不添加抗菌肽BV21，实验组添加50mg/kg抗菌肽BV21，每组10个重复，每个重复10头猪，试验期14天。抗菌肽BV21对断奶仔猪生产性能和腹泻率的影响见表2和图2。从表2的实验结果可以看出抗菌肽PD22可显著提高断奶仔猪日增重和降低料重比；显著提高断奶仔猪的生长性能。从图2的实验结果可以看出抗菌肽BV21可改善断奶仔猪肠道健康、降低断奶仔猪腹泻率。

表2：抗菌肽BV21对断奶仔猪(24日龄)生长性能的影响表

项目	对照组	BV21
			日增重(g/d)	279.6	324.7
日采食量(g/d)	371.9	386.4
			料肉比	1.33	1.19

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (2)

1.一种抗菌肽BV21，其特征在于：所述抗菌肽BV21的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；其分子量为1773.24Da，等电点为11.00；

制备方法的步骤包括:

1)按SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，用全自动多肽合成仪合成抗菌肽全序列，并通过HPLC反相柱层析脱盐纯化；

2)纯化的抗菌肽分子量采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定，等电点使用等电聚焦电泳测定，氨基酸序列采用自动氨基酸序列测定仪进行解析。

2.一种如权利要求1所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)按SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，用全自动多肽合成仪合成抗菌肽全序列，并通过HPLC反相柱层析脱盐纯化；

2)纯化的抗菌肽分子量采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定，等电点使用等电聚焦电泳测定，氨基酸序列采用自动氨基酸序列测定仪进行解析。

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