CN116121221A - 一种蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蜡样芽孢杆菌DEAD‑boxRNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16，其氨基酸序列为RKLLQFAKKLGIVFTK，抗菌肽DB16的分子量为1890.337道尔顿。本发明抗菌肽DB16对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用，可作为制备预防或抑制副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌感染的药物、食品防腐剂或饲料添加剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16及其应用。
背景技术
近年来，细菌污染所引起的致病性微生物严重影响人类健康和食品安全，由食源性致病微生物引起的食物中毒已成为食品安全问题之一。
金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病菌，广泛存在于空气、灰尘、水资源等自然界和食品加工环境中。其可以利用食物中的蛋白质、糖、脂肪和维生素等营养物质，进行繁殖和代谢活动，导致食品的营养价值和品质下降、保质期缩短、腐败变质等。此外，在适当的条件下，金黄色葡萄球菌会产生耐热性肠毒素，人体摄入由金黄色葡萄球菌或肠毒素污染的食品后，可引发恶心、呕吐、腹痛、休克、虚脱、体温过低等食物中毒症状。
副溶血性弧菌是变形菌门的一种游动的、非孢子形成的、杆状革兰氏阴性菌，有嗜盐和嗜温的特性，由其引起的食物中毒事件占水产食物中毒的60％以上。该菌通过侵入宿主细胞(肠上皮细胞)，在体内释放大量毒力因子，导致宿主细胞死亡，进而引起肠胃炎等疾病。
抗生素用于细菌性疾病的治疗是人类医疗史上的一大重要进步，但由于抗生素滥用，导致细菌对抗生素的耐药性越来越严重，对人类健康造成重大威胁。抗菌肽又称宿主防御肽，是生物机体在外界刺激诱导下产生，由特定基因编码合成，具有广谱抗菌活性或免疫调节功能的小分子多肽。与抗生素相比，抗菌肽具有广谱、快速、高选择性、低毒性的特点，且其存在多种作用靶点，使细菌很难产生耐药性。因此，抗菌肽被认为是抗生素的一种良好替代。
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种革兰氏阳性、杆状并且能够形成孢子的兼性厌氧菌，经常在土壤、水、动物肠道中被发现，它可以产生毒素导致不同类型胃肠道疾病或其它疾病的致病菌。芽孢杆菌也可通过抗菌、营养竞争、位点排斥、寄生或诱导的方法对真菌病原体产生拮抗作用，同时其也能够产生多种活性物质，例如低分子多肽、脂肽类抗生素和抗菌蛋白等可以有效抑制多种病原微生物的生长，具有良好的研究和应用价值。DEAD-box解旋酶家族是一类存在于宿主细胞中的功能蛋白，是一大类依赖于ATP的RNA解旋酶，通过和RNA结合并相互作用促进RNA折叠和/或构象重排它们在转录、剪接、mRNA的合成和翻译等多种细胞过程中起着关键作用。该家族成员拥有识别RNA的能力以及参与多个细胞过程，所以它们可以以多种方式影响病毒感染宿主细胞后引起的天然免疫应答。因此，从DEAD-box解旋酶中寻找具有抗菌活性的抗菌肽，并探究其抑菌机理，是本领域亟需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种蜡样芽孢杆菌DEAD-boxRNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16及其应用，解决了上述背景技术中的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：提供了一种蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：
RKLLQFAKKLGIVFTK
所述蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16的分子量为1890.337道尔顿，所带正电荷为+5，总疏水性比为50％，通过APD3预测该肽可能形成α螺旋。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：提供了一种蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16在制备抗菌药物中的应用，该抗菌药物用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：提供了一种抗菌药物，其有效成分包括蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16，所述抗菌肽DB16的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
在本发明一较佳实施例中，所述抗菌药物的有效成分为蜡样芽孢杆菌DEAD-boxRNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16，所述抗菌肽DB16的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
在本发明一较佳实施例中，所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：提供了一种蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16在制备食品防腐剂中的应用，该食品防腐剂用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之五是：提供了一种食品防腐剂，其有效成分包括蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16，所述抗菌肽DB16的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
在本发明一较佳实施例中，所述食品防腐剂的有效成分为蜡样芽孢杆菌DEAD-boxRNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16，所述抗菌肽DB16的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
在本发明一较佳实施例中，所述食品防腐剂用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之六是：提供了一种蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16在制备水产饲料添加剂中的应用，该水产饲料添加剂用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之七是：提供了一种水产饲料添加剂，其有效成分包括蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16，所述抗菌肽DB16的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
在本发明一较佳实施例中，所述水产饲料添加剂的有效成分为蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16，所述抗菌肽DB16的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
在本发明一较佳实施例中，所述水产饲料添加剂用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
本发明利用APD3、Pymol2.0、SWISS-MODEL等软件及网站以蜡样芽孢杆菌中与免疫相关的DEAD-box RNA解旋酶蛋白的蛋白序列为对象进行生物信息学预测，得到一个新的氨基酸序列的多肽DB16。研究多肽DB16对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性；并以副溶血性弧菌为例，利用流式细胞术、PI染色观察DB16对细菌细胞膜的破坏程度；同时提取副溶血性弧菌的基因组DNA，验证其对细菌DNA的影响作用。实验结果表明，该肽对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用。
它的抑菌机理是作用于细胞膜使其发生变形和萎缩，增强细胞膜通透性使肽能够穿过细菌细胞膜，与细菌DNA结合，抑制DNA的复制合成等功能，从而达到使细菌失活的作用。
本发明的抗菌肽可以采用本领域技术人员已知的方法合成，例如固相合成，并采用本领域技术人员已知的方法进行纯化，例如高效液相色谱法。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明抗菌肽DB16对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用。本发明抗菌肽DB16可被制成抗菌药物、食品防腐剂或水产饲料添加剂用于预防或治疗副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌感染引起的疾病。
附图说明
图1为抗菌肽DB16的结构示意图。
图2为抗菌肽DB16对副溶血性弧菌最低杀菌浓度(MBC)测定对照图。其中，图A-I抗菌肽DB16浓度分别为0μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.625μg/mL、7.813μg/mL和3.9μg/mL。
图3为抗菌肽DB16对金黄色葡萄球菌最低杀菌浓度(MBC)测定对照图。其中，图A-I抗菌肽DB16浓度分别为0μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.625μg/mL、7.813μg/mL和3.9μg/mL。
图4为抗菌肽DB16对副溶血性弧菌的时间杀灭动力学曲线。
图5为抗菌肽DB16对金黄色葡萄球菌的时间杀灭动力学曲线。
图6为抗菌肽DB16对副溶血性弧菌细胞膜通透性的影响(蛋白质泄露)图。
图7为抗菌肽DB16对副溶血性弧菌细胞膜通透性的影响图。
图8为不同条件下抗菌肽DB16的圆二色谱变化图。
图9为抗菌肽DB16与副溶血性弧菌基因组DNA凝胶电泳图。
其中条带1-10：抗菌肽DB16/DNA质量比为25/4、25/6、25/10、25/12、25/14、25/16、25/18、25/20、25/22、25/25、条带11为对照组DNA。
图10为抗菌肽DB16与副溶血性弧菌基因组DNA结合后的圆二色谱变化图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1抗菌肽DB16的筛选
利用APD3、Pymol2.0、SWISS-MODEL等软件及网站以蜡样芽孢杆菌中与免疫相关的DEAD-box RNA解旋酶蛋白的蛋白序列为对象进行生物信息学预测，氨基酸序列利用APD3分析其电荷、疏水性(表1)，利用Pymol2.0、Swiss-Model预测三维结构(如图1所示)，最终筛选出最具有将抗菌性能的氨基酸序列RKLLQFAKKLGIVFTK化学合成(由北京中科亚光生物科技有限公司合成)，并进行抑菌活性验证。
表1：蜡样芽孢杆菌中抗菌肽的预测分析
实施例2抗菌肽DB16的最低杀菌浓度(MBC)测定
将副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌(副溶血性弧菌ATCC17802、金黄色葡萄球菌ATCC27217均为本实验室保存菌株)在37℃培养12h至对数生长期，在0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液中稀释至105-6CFU/mL。将抗菌肽DB16溶于磷酸盐缓冲中，37℃等体积与菌混合后进行孵育2h。最低抑菌浓度(MBC)是指在37℃孵育后，能够杀灭细菌的抗菌肽最低浓度。如图2、3所示，抗菌肽DB16对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度(MBC)分别为7.8125μg/mL和3.90625μg/mL。
实施例3抗菌肽DB16的时间-杀菌曲线(Time kill)测定
将副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌在37℃培养12h至对数生长期，在0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液中稀释至105-6CFU/mL。取1×MBC浓度抗菌肽DB16在37℃等体积与菌混合后分别进行孵育，每隔30分钟取样涂平板，37℃培养过夜后记录菌落总数。如图4、5所示，抗菌肽DB16可在1.5小时内杀死将副溶血性弧菌，0.5h内杀死金黄色葡萄球菌。
实施例4抗菌肽DB16对副溶血性弧菌细胞膜通透性的影响
蛋白质泄漏：取-20℃保存的副溶血性弧菌菌株200μL接种至LB培养基中，37℃、200r/h摇床培养10h至细菌的对数生长期。制备0.01M磷酸盐缓冲液的菌体悬浊液后，将其与1×MBC、2×MBC浓度的抗菌肽DB16等比例混合，使用多功能酶标仪每隔10min在0-2h之间测定其OD280nm考察菌体的蛋白质泄漏量。本实验以等量0.01M磷酸盐缓冲液与细菌等比例混合作为空白对照(图6)。
280nm处吸光度的检测可用于估计从细胞质泄漏的蛋白质的量。如图6所示，随着抗菌肽DB16浓度的增加，经抗菌肽DB16处理后的培养液中蛋白质量呈剂量依赖式上升。
流式细胞术：将副溶血性弧菌在37℃培养12h至对数生长期，取1mL菌液于1.5mL离心管中12000r/min离心1min，除去上清液，重悬至1mL无菌0.01M磷酸盐缓冲液，重复3次。配置好0.01M磷酸盐缓冲液的菌体悬浊液后，将浓度为1×MBC、2×MBC的抗菌肽DB16与菌液等比例混合后(大于200μL)放入生化培养箱37℃，孵育2h，使用0.01M磷酸盐缓冲液作为空白对照组。使用碘化吡啶(PI)作为荧光染料，孵育完成后向混合液中加入等体积浓度为50μg/mL的PI染料，4℃条件下孵育15min后，上样至流式细胞仪进行检测。检测每管设定为至少获取104个细菌细胞。设置数据收集分析方案，通过检测散射光信号(SC)以及碘化丙啶荧光信号(PI)对样本进行分析(图7)。
如图7所示，对照组的副溶血性弧菌死亡率仅为11.7％，说明细胞膜结构完整，PI无法穿过细胞膜进入细胞内部，细菌死亡率较低；加入1×MBC浓度抗菌肽DB16的副溶血性弧菌死亡率明显升高，达到94.1％；加入2×MBC浓度抗菌肽的实验组中副溶血性弧菌死亡率相较于1×MBC略微上升，达到98.9％。可看出抗菌肽DB16浓度与副溶血性弧菌死亡率呈正相关，呈剂量依赖式上升。
实施例5圆二色谱测定抗菌肽DB16二级结构
用Jasco810光谱偏振仪(Jasco，东京)CD在25℃下以100nm/min的扫描速度测定了抗菌肽DB16的平均残基摩尔椭圆度。将抗菌肽DB16分别溶于0.01M PBS和25mM十二烷基硫酸钠(SDS)中，使其最终浓度为0.20mg/mL，用两次扫描从180～280nm扫描其光谱。
如图8所示，在PBS环境下，抗菌肽DB16在198nm处出现负峰，在220nm处出现负峰，这说明抗菌肽DB16在PBS环境下其二级构象主要为无规卷曲。在SDS环境中，在193nm处存在正峰，在218nm、220nm出现两处负峰，这说明在SDS环境下其二级构象主要是α-螺旋，该抗菌肽在接触细菌细胞膜时可能出现结构转换的情况。
实施例6抗菌肽DB16与细菌DNA的相互作用
采用DNA凝胶阻滞法研究了抗菌肽DB16与副溶血性弧菌基因组DNA的相互作用。将副溶血性弧菌在37℃的50mL营养肉汤培养基中培养12h，用细菌260和280nm的光密度比(OD260/OD280≥1.90)评价提取的基因组DNA的纯度。接下来，将10μL DNA(20ng/μL)与抗菌肽DB16在25℃下混合，使抗菌肽DB16/DNA质量比分别为25/4、25/6、25/10、25/12、25/14、25/16、25/18、25/20、25/22、25/25、0，混匀后置于37℃孵育1.5h。然后各取8μL在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用GelDoc XR凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)在紫外线照射下观察凝胶阻滞。
如图9所示，比例为25/4、25/6、25/8、25/12时，DNA条带并未跑出，当比例分别为25/14、25/16、25/18、25/20、25/22、25/25时，条带清晰度和亮度随着比例的增大而明显上升；对照组副溶血性弧菌基因组DNA的凝胶电泳图则呈现为最明亮且清晰的条带。表明当抗菌肽BaD9/DNA质量比为：25/4、25/6、25/8、25/12时，DNA被阻滞破坏，条带并未跑出，而随着抗菌肽浓度降低，条带逐渐清晰跑出。
实施例7抗菌肽DB16与细菌DNA作用对其二级结构的影响
再次利用Jasco810光谱偏振仪(Jasco，东京)CD在25℃下以100nm/min的扫描速度测定了抗菌肽DB16的平均残基摩尔椭圆度。将抗菌肽DB16溶于25mM十二烷基硫酸钠(SDS)中，使其最终浓度为0.20mg/mL，将副溶血性弧菌DNA(20ng/μL)与抗菌肽DB16在25℃下混合孵育2h后，用两次扫描从180～280nm扫描其光谱(图10)。
DNA与抗菌肽DB16孵育后，193nm的正峰和218nm、220nm的负峰仍然存在，但抗菌肽DB16的谱图整体扩大，表明抗菌肽DB16与副溶血性弧菌基因组DNA存在相互作用关系。
综上，本发明提供了一种全新的抗菌肽DB16，抗菌肽DB16对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度(MBC)分别为7.8125μg/mL、3.90625μg/mL，说明其对副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌具有强烈的抑制作用。经研究发现，本发明抗菌肽DB16作用于细胞膜使其发生变形和萎缩，增强细胞膜通透性使其能够穿过细菌细胞膜，与细菌DNA结合，抑制DNA的复制合成等功能，从而达到使细菌失活的作用。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (13)
1.一种蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16，其氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。
2.如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
3.一种抗菌药物，其特征在于：其有效成分为蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16，所述抗菌肽DB16的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
4.如权利要求3所述的抗菌药物，其特征在于：其有效成分为蜡样芽孢杆菌DEAD-boxRNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16，所述抗菌肽DB16的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
5.如权利要求3或4任一项所述的抗菌药物，其特征在于：所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16在制备食品防腐剂中的应用，其特征在于：所述食品防腐剂用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
7.一种食品防腐剂，其特征在于：其有效成分包括蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16，所述抗菌肽DB16的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
8.如权利要求7所述的食品防腐剂，其特征在于：其有效成分为蜡样芽孢杆菌DEAD-boxRNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16，所述抗菌肽DB16的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
9.如权利要求7或8任一项所述的食品防腐剂，其特征在于：所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
10.如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16在制备水产饲料添加剂中的应用，其特征在于：所述水产饲料添加剂用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
11.一种水产饲料添加剂，其特征在于：其有效成分包括蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16，所述抗菌肽DB16的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
12.如权利要求11所述的水产饲料添加剂，其特征在于：其有效成分为蜡样芽孢杆菌DEAD-box RNA解旋酶蛋白抗菌肽DB16，所述抗菌肽DB16的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
13.如权利要求11或12任一项所述的水产饲料添加剂，其特征在于：所述水产饲料添加剂用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
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