KR20200048425A

KR20200048425A - 돌돔 인지질분해효소 유래의 항균 펩타이드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20200048425A
Application number: KR1020180130517A
Authority: KR
Inventors: 김동균; 김영옥; 남보혜; 공희정; 김주원; 박중연
Original assignee: 대한민국(관리부서:국립수산과학원)
Priority date: 2018-10-30
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2020-05-08
Also published as: KR102160484B1

Abstract

본 발명은 돌돔 인지질분해효소(CDP) 유래 항균 펩타이드에 관한 것으로 더 상세하게는 다양한 표지균주에 대해 높은 항균 활성을 나타내고 염분 및 열안정성도 우수한 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열(VKLX₁VKLVX₂X₃LIK)을 포함하는, 돌돔 인지질분해효소(CDP) 유래 항균 펩타이드를 제공한다.

Description

돌돔 인지질분해효소 유래의 항균 펩타이드 및 그의 용도{Antimicrobial peptide derived from the phospholipase of rock bream and uses thereof}

본 발명은 돌돔 인지질분해효소 유래의 항균 펩타이드에 관한 것으로서, 더 상세하게는 다양한 균주에 대해 항균활성이 우수한 돌돔 유래의 인지질분해효소 항균 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.

항생제(antibiotics)는 지난 백년간 인류가 세균성 질병으로부터 벗어나게 해주었고, 축·수산물의 생산성을 높여주는 등 인류에 매우 유용하게 사용되었다. 그러나 최근 항생제 체내잔류·축적 및 이를 통한 항생제 내성 균주 출현 등으로 인하여 그 사용이 매우 제한적이며, 축·수산물의 사료첨가제로 사용되는 항생제는 전면금지 되고 있다. 따라서 이러한 항생제를 대체할 수 있는 물질 개발이 요구되고 있으며, 이를 위한 다양한 대체소재 연구가 수행되고 있다. 다양한 대체소재 중 항균 펩타이드의 경우 생물이 만들어 내는 천연 항생제이자 내성 균주의 위험이 없으며, 다양한 미생물에 대한 넓은 항균 활성을 가지고 고상합성이나 미생물 배양 과정 등을 통한 등 제조가 쉬워 가장 주목받는 항생제 대체 소재이다.

항균 펩타이드(antimicrobial peptides, AMPs)는 1960년대 개구리의 표피 분비액에서 최초로 발견된 항균활성이 있는 약 100개 이하의 짧은 길이의 펩타이드로 라이신(lysine), 아르기닌(arginine) 및 히스티딘(histidine)과 같은 양전하의 아미노산을 다수 포함한다. 따라서 음전하를 띄는 미생물 세포막에 부착하여 미생물 세포막을 파괴함으로서 항균활성을 가지게 된다. 미생물에서 식물, 무척추동물, 척추동물 그리고 사람에 이르는 거의 모든 생명체가 생산한다고 알려졌으며, 박테리아, 진균류, 바이러스 및 기생충 등 넓은 범위의 미생물에 대한 독특한 항균 특성을 보인다. 항균 펩타이드는 짧은 시간에 다양한 외부 침입 미생물에 대한 방어체계를 담당하기 때문에 선천성 면역 시스템(innateve immune system)에서 가장 중요한 방어체로 밝혀졌으며, 이러한 항균 활성 이외에 항산화, 항염증, 항곤충 및 상처치유 활성 등의 다기능성 특성이 있다고 보고되었다. 또한 물리적인 항균 작용기작에 따른 내성 균주 출현 가능성이 낮고 크기가 작아 합성이 쉽다는 장점이 있다. 따라서 이러한 천연 생체방어물질인 항균 펩타이드는 최근 다양한 활용이 기대되는 물질이며, 특히 항생제 대체재, 각종 첨가제 및 의약품 개발 분야에서 주목 받고 있다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제1660258호는 돌돔 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 이의 용도에 대해 개시하고 있다.

그러나 상기 선행기술의 경우, 펩타이드의 분리 시 수율이 높지 않아 충분한 항균활성을 나타내지 않고 잠재적인 독성 등의 요인으로 균일한 효과를 기대하기 어렵다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 종래 항균 펩타이드와 달리 용혈활성은 감소되고 항균활성은 증가하여 다양한 지표균주에 대해 우수한 항균 활성 및 다기능성 효과를 나타내는 돌돔 인지질분해효소 유래의 항균 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열(VKLX₁VKLVX₂X₃LIK)을 포함하고 항균활성을 갖는 펩타이드가 제공된다.

(상기 아미노산 서열에서, X₁은 타이로신, 트립토판 또는 페닐알라닌이고, X₂는 트레오닌, 세린, 아르기닌, 히스티딘 또는 라이신이며, X₃는 프롤린, 류신, 메티오닌, 발린 또는 이소류신이다.)

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항균 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항-스쿠치카충 방제용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항암용 조성물이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 다양한 지표균주에 대해 높은 항균 활성을 나타낼 뿐만 아니라 열과 염에도 안정적이고 항기생충 활성 등 다기능성 효과를 나타내며 용혈활성 등의 독성은 감소된 돌돔 인지질분해효소 유래 항균 펩타이드의 생산효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 돌돔 유전체 분석을 통하여 확보한 CDP(catalytic domain of phospholipase) 유래의 RB-CDP-I-N 항균 펩타이드 제조를 위한 RB-CDP-I-N 아미노산 서열, 이차구조 및 양친매성 특성을 나타내는 모식도이다.
도 2는 다양한 지표 균주에 대한 천연 형태의 RB-CDP-I-N 항균 펩타이드의 항균 활성을 분석한 사진이다.
도 3은 RB-CDP-I-N 항균펩타이드의 활성 증가를 위한 RB-CDP-I-A1과 RB-CDP-I-A2의 이차구조, 치환된 잔기 및 양친매성 특성에 대한 분석 결과이다.
도 4는 URDA 방법을 이용하여 다양한 지표균주에 대한 ① RB-CDP-I-N, ②RB-CDP-I-A1 및 ③ RB-CDP-I-A2 항균 펩타이드의 항균 활성을 분석한 사진이다. 항균 활성 평가에 사용된 지표균주들은 (A)B. cereus, (B)B. subtilis, (C)E. coli, (D)S. mutans, (E)C. albicans (F)P. aeruginosa, (G)V. alginolyticus, (H)V. parahaemolyticus (I)S. iniae, (J)S. aureus, (K)L. garvieae, (L)E. cloacae, (M)E. faecalis, (N)K. pneumoniae, (O)S. parauberis, (P)E. tarda, (Q)P. mirabilis, (R)P. stuartii를 사용하였다.
도 5는 URDA 방법을 이용하여 대표 지표균주의 ① RB-CDP-I-N, ②RB-CDP-I-A1 및 ③ RB-CDP-I-A2의 열과 염분에 대한 안정성을 분석한 사진이다. 각 샘플들은 (A) 1,000 ㎍/ml, (B) 100℃ 10분 가열, (C) 0.5% NaCl 처리, (D) 1% NaCl 처리, (E) 2% NaCl 처리 후 항균 활성의 안정성을 평가하였다.
도 6은 넙치의 적혈구 성분을 이용한 RB-CDP-I-N, RB-CDP-I-A1 그리고 RB-CDP-I-A2의 용혈활성을 비교·분석한 결과이다.
도 7은 항균활성 및 항기생충 활성 등의 기능성은 유지하되 용혈활성을 줄이기 위해 고안된 RB-CDP-I-A2 유도체들의 아미노산서열, 이차구조 및 양친매성을 분석한 결과이다.
도 8a는 URDA 방법을 이용하여 다양한 지표균주에 대한 RB-CDP-I-A2 및 용혈활성 저감형 항균 펩타이드 유도체들의 항균 활성을 분석한 사진이다:
A2: RB-CDP-I-A2;
1: RB-CDP-I-A2-R1;
2: RB-CDP-I-A2-R2;
3: RB-CDP-I-A2-R3;
4: RB-CDP-I-A2-R4; 및
5: RB-CDP-I-A2-R5.
도 8b는 URDA 방법을 이용하여 다양한 지표균주에 대한 RB-CDP-I-A2 및 용혈활성 저감형 항균 펩타이드 유도체들의 항균 활성을 분석한 사진이다.
도 8c는 URDA 방법을 이용하여 다양한 지표균주에 대한 RB-CDP-I-A2 및 용혈활성 저감형 항균 펩타이드 유도체들의 항균 활성을 분석한 사진이다.
도 9는 PCR 과정의 Taq DNA polymerase의 DNA 합성 저해능 분석을 통해 RB-CDP-I-A2 및 합성된 RB-CDP-I-A2 용혈활성 저감형 항균 펩타이드 유도체들의 항균 활성 기작을 분석한 사진이다:
M: DNA ladder;
(+): positive control;
A2: RB-CDP-I-A2;
R1: RB-CDP-I-A2-R1;
R2: RB-CDP-I-A2-R2;
R3: RB-CDP-I-A2-R3;
R4: RB-CDP-I-A2-R4;
R5: RB-CDP-I-A2-R5;
1: 2.5 ㎍,
2: 1.25 ㎍,
3: 0.62 ㎍,
4: 0.31 ㎍, 및
5: 0.15 ㎍.
도 10은 아가로즈 겔 전기영동(Agarose-gel electrophoresis)을 이용한 DNA-binding 활성을 평가한 결과로 RB-CDP-I-A2 및 용혈활성 저감형 항균 펩타이드 유도체들의 항균 활성 기작을 분석한 사진이다:
M: DNA ladder;
(+): positive control,
A2: RB-CDP-I-A2;
R1: RB-CDP-I-A2-R1;
R2: RB-CDP-I-A2-R2;
R3: RB-CDP-I-A2-R3;
R4: RB-CDP-I-A2-R4;
R5: RB-CDP-I-A2-R5;
1: 2.5 ㎍,
2: 1.25 ㎍,
3: 0.62 ㎍, 및
4: 0.31 ㎍.
도 11은 넙치의 적혈구 세포를 이용하여 RB-CDP-I-A2와 합성된 RB-CDP-I-A2 용혈활성 저감형 항균 펩타이드 유도체들의 용혈 활성을 비교·분석한 사진이다.
도 12는 본 발명의 RB-CDP-I-A2와 합성된 RB-CDP-I-A2 용혈활성 저감형 항균 펩타이드 유도체들의 항기생충 활성을 분석한 그래프이다.
도 13은 본 발명의 RB-CDP-I-A2와 합성된 RB-CDP-I-A2 용혈활성 저감형 항균 펩타이드 유도체들의 자궁암세포에 대한 항암활성을 분석한 그래프이다.
도 14는 본 발명의 RB-CDP-I-A2와 합성된 RB-CDP-I-A2 용혈활성 저감형 항균 펩타이드 유도체들의 폐암세포에 대한 항암활성을 분석한 그래프이다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어 "AMPs(Antimicrobial peptides)"는 항미생물성 펩타이드로, 다음의 특성이 알려져 있다. 지구상에 있는 수많은 생물체는 그들이 처해진 환경으로부터 스스로를 보호할 수 있는 면역체계를 가지고 있고, 침입하는 외부 물질에 대하여 그들 스스로를 보호하기 위해 대표적으로 생산하는 항균활성을 가지는 일차방어수단의 다양한 생리활성물질로 선천적 면역반응에 중요한 역할을 하며, 천연의 항생제로써 포유류에서 곤충, 식물까지 지구상 거의 모든 생물체에 존재한다고 보고되어있다(Zasloff, Nature 415:389-395, 2002). 항균 펩타이드는 1962년 개구리(Bombina variegate)의 표피 분비액에서 처음으로 발견되었으며(Kiss and Michl, Toxicon 1:33-39,1962;Monatshefte fㆌr Chemie-Chemical Monthly, 101:182-189.1970), 1971년 벌의 독소(bee venom) 등 여러 생물들로부터 다양한 항균 펩타이드가 동정되기 시작하여 그 후 특성 및 기능에 대한 많은 연구가 수행되고 있다. 지금까지 항균 펩타이드의 작용 기작 가설 중 가장 타당성 있게 제시되고 있는 것은 Shai-Matsuzaki-Huang(SMH) 모델로써, 체내에서 합성된 펩타이드는 소수성과 친수성의 부분으로 적당한 구조를 이루게 되고 양전하를 띤 친수성 부분이 음전하를 띤 박테리아의 세포막과 결합하게 된다(Matsuzaki, Biochimica et Biophysica Acta 1462:1-10. 1999; Shai,Biochimica et Biophysica Acta, 1462:55-70. 1999; Huang, Biochemistry 39:8347-8352. 2000; Yang et al.,Biophysical Journal, 79:2002-2009. 2000). 이 때 펩타이드와 세포막의 결합력은 일반적인 Ca²⁺, Mg²⁺ 등에 비해 약 2-3배 더 강한 것으로 알려져 있다. 그 후 세포막과 결합된 펩타이드의 소수성 부분이 세포막 인지질의 소수성 부분과 상호작용하며 구멍을 형성하게 되어 세포막의 투과도를 변화시키게 되고 결국 세포를 파괴시킨다(Christensen et al.,Proceeding of the National Academy of Sciences, 85:5072-5076. 1988).

본 문서에서 사용되는 용어 "인지질분해효소(phospholipase)"은 세포막에 존재하는 인지질을 분해시키는 지질대사효소로서 지질의 리모델링 및 인지질 이외의 다른 지질분자들의 합성 그리고 세포내 다양한 신호전달에 관여하는 단백질이다. 인지질분해효소에 의해 생성된 지질 유래 산물들은 세포내 이차 신호전달 물질로 작용하여 세포내 다양한 생리현상을 조절한다.

발명의 상세한 설명:

상기 항균 펩타이드에 있어서, C-말단이 아미드화될 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항균 조성물이 제공된다.

상기 항균 조성물에 있어서, 그람 음성균, 그람 양성균 또는 진균에 대한 항균활성을 가질 수 있다.

상기 항균 조성물에 있어서, 상기 그람 양성균은 B. cereus, B. subtilis, S. mutans, S. iniae, S. aureus, L. garvieae, S. vestibularis, E. faecalis, 또는 S. parauberis일 수 있고 상기 S. aureus는 S. aureus 0203, S. aureus 0204, S. pyogenes 0206, 또는 S. aureus 3795일 수 있다.

상기 항균 조성물에 있어서, 상기 그람 음성균은 E. coli, E. cloacae, P. aeruginosa, V. alginoalyticus, V. anguillarum, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. harveyi, K. pneumoniae, E. tarda, P. mirabilis, P. stuartii, S. typhimurium , K. oxytoca 0248, K. aerogenes 0249, 또는 E. cloacae 0252일 수 있고 상기 E. coli는 E. coli ML35p, E. coli 0238 또는 E. coli 1A814일 수 있으며 상기 P. aeruginosa는 P. aeruginosa 0225일 수 있고 상기 S. thypimurium는 S. typhimurium 0240일 수 있으며 상기 진균은 C. albicans일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항-스쿠치카충 방제용 조성물이 제공된다.

상기 항암용 조성물에 있어서, 상기 암은 자궁암 또는 폐암일 수 있다.

본 발명의 항균 펩타이드의 유효량은 환자의 환부의 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01㎍/kg/day 내지 10 mg/kg/day일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.

본 발명의 항균 펩타이드는, 조성물 총 중량에 대하여 0.1-100 중량%로 함유될 수 있고 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth),젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.

본 발명의 항균 펩타이드는 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판;Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15^th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.

본 발명의 항균 펩타이드는 경구 또는 비경구로 투여되는 것이 가능하며, 바람직하게는 비경구 투여로 정맥내 주입, 피하 주입, 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 근육내 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명자들은 항균활성에 기반을 둔 생물고유의 항균 펩타이드 연구가 각 과정에서 목적물질의 순수분리, 분리한 분획들의 항균활성 확인, 번역 후 수식과정 및 말단서열분석 등 다양한 분석과정이 필요하고 순수 분리 및 서열분석의 어려움이 존재하고 있음에 주목하고 기존의 분석방법을 해결하고자 예의노력한 결과 유전체 분석 정보를 활용한 돌돔 인지질분해효소 촉매 도메인 서열 기반의 항균 펩타이드 연구를 수행하여 다양한 항균 펩타이드 후보들을 확보하였다. 상기 후보군 중에서 우수한 항균 활성을 나타내는 돌돔 유래의 항균 펩타이드의 탁월한 항균 활성 및 특성을 분석하여 종래 펩타이드와 달리 용혈활성는 감소되었으나 항균, 항기생충 및 항암활성은 유지되거나 향상된 본 발명의 항균 펩타이드를 개발하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 유전체 분석

본 발명의 일 실시예에 따라 유전체 분석 정보를 활용한 서열 기반의 항균 펩타이드 연구를 수행하여 다양한 항균 펩타이드 후보들을 확보하였다. 상기 돌돔(Oplegnathus fasciatus) 유전체 분석 결과를 활용하여 번역 후 단백질 서열을 기반으로 항균 펩타이드의 특성인 helix 이차구조, 2~50개 이하의 짧은 일차서열, 양전하의 아미노산을 다수 포함, 소수성과 친수성을 모두 갖는 양친매성, 낮은 보먼 값(boman index) 등을 만족하는 짧은 단백질 서열을 프로그램을 통하여 분석한 결과, 일부 짧은 펩타이드 서열들을 항균 펩타이드 후보로 획득하였다. 상기 확보한 유전체 데이터 내의 염기서열 기반의 아미노산 서열 중에서 20점 이상의 다양한 항균 펩타이드 후보 서열을 확보하였고 그 중에서 돌돔의 인지질분해효소(phospholipase)의 촉매 도메인(catalytic domain) phospholipase D superfamily 서열 내 펩타이드의 특성이 2~50개 사이의 아미노산 갯수, helix 구조, 전하값, 보우먼 값(boman index) 등을 만족하고 항균 펩타이드 특성에 가장 적합한 서열을 분석한 결과, 상기 펩타이드 후보 중 RHVKLWVKLVTPLIKNFF의 18개 아미노산 서열 중 VKLWVKLVTPLIK인 13개의 아미노산 서열부분(서열번호 2)이 항균 펩타이드의 특성에 가장 부합하는 값을 갖는다는 것을 확인하였다(표 1 및 도 1). 상기 돌돔 CDP 유전자 유래 항균 펩타이드 후보에 관한 정보를 하기 표 1에 나타내었다.

돌돔 CDP 유전자 유래 항균 펩타이드 후보에 관한 정보

서열 번호	펩타이드 명칭	서열	M.W.	p.I.	순전하	소수성(kcal/mol)	보만 지수(kcal/mol)
2	RB-CDP-I-N	VKLWVKLVTPLIK-NH₂	1536.9	10.3	+3	-0.07	-1.14
3	RB-CDP-I-A1	VKLWVKLVKPLIK-NH₂	1564	10.48	+4	0.78	-0.91
4	RB-CDP-I-A2	VKLWVKLVKLLIK-NH₂	1580.1	10.48	+4	-0.23	-1.29

실시예 2: 항균 펩타이드 제조

본 발명자들은 항균활성이 향상된 항균 펩타이드 제조를 위해 상기 표 1의 서열을 이용하여 단백질 이차구조인 helix wheel을 분석한 뒤 일부 아미노산 잔기를 치환하였다. 항균 펩타이드의 양친매성 특성에 맞게 치환된 돌돔 CDP 단백질 내 13개의 아미노산 서열로부터 펩타이드(서열번호 3)를 제조하였고, 이를 RB-CDP-I-A1이라고 명명하였다(표 1, 도 3). 상기 디자인한 펩타이드는 펩타이드 합성 전문 기업인 엔솔바이오 사이언스(EnsolBioscience, Inc.)에서 고상 합성을 의뢰하여 확보하였다. 또한 13개의 아미노산 서열의 이차구조를 분석하여 항균 활성이 증가된 항균 펩타이드를 제조하기 위하여 helix 구조에서 연속된 앞, 뒤 아미노산의 서열과 위, 아래 아미노산의 구조와 잔기의 특성을 분석하고 helix 구조의 양친매성을 평가하여 일부 아미노산을 항균 펩타이드의 특성에 부합하는 다른 아미노산 잔기로 치환하였다. 구체적으로 상기 RB-CDP-I-A1 펩타이드의 열번째 아미노산(프롤린)을 류신으로 치환시킨 펩타이드를 제조하였고 이를 RB-CDP-I-A2(서열번호 4)로 명명하였다(표 1). 아울러, 상기 펩타이드들의 구조적 안정성과 항균활성을 높이기 위하여 카복실기 말단(C-term)을 NH₂로 아미드화한 펩타이드를 디자인하였고 이를 펩타이드 합성 전문 기업인 엔솔바이오 사이언스(EnsolBioscience, Inc.)에서 고상 합성을 의뢰하여 확보하였다.

실시예 3: 항균 활성 측정 분석(URDA)

본 발명의 일 실시예에 따라 확보한 RB-CDP-I-N과 RB-CDP-I-A2 항균 펩타이드를 1,000~31.3 ㎍/ml 농도의 0.01% 아세트산(acetic acid) 용액으로 녹여 진균류 1종, 그람양성균 9종, 그람음성균 16종 및 항생제 내성 균주 등, 총 35종의 다양한 병원성 미생물에 대한 항균 활성 측정 분석을 수행하였다.

먼저, 각 지표균주들의 최적 생육 배지를 이용, 적정 배양 온도에서 18시간 동안 배양한 뒤 OD₆₀₀=0.1에 해당하는 박테리아 10⁸ CFU/ml 또는 효모 10⁶ CFU/ml가 되도록 동일 배지로 희석하였다. 그 후, 각각에 대하여 0.01%의 배양배지, 1% 아가로즈 및 10 mM 인산완충액(phosphate buffer, pH 6.5)이 포함된 under-lay gel 9.5 ml에 희석된 균주 배양액 0.5 ml를 넣고 혼합 후 플레이트(plate)에 분주하여 고체화하였다. 상기 굳은 under-lay gel에 직경 2.2 mm 구멍을 뚫은 후, 0.01% 아세트산(acetic acid) 10 ㎕에 녹인 상기 펩타이드를 각각 주입하였다. 또한, 2%의 배양배지, 1% 아가로즈 및 10 mM의 인산완충액 (pH 6.5)이 포함된 over-lay gel 10 ml을 under-lay gel 위에 분주하여 고체화하였고 지표균주들의 최적 배양 온도에서 18시간 동안 배양하였다. 그 후 각각의 샘플 주위에 생긴 투명환의 크기를 측정하여 항균 활성을 확인하였다.

그 결과, RB-CDP-I-N의 일부 아미노산을 치환시켜 항균 활성을 증가시킨RB-CDP-I-A2 항균 펩타이드는 다양한 지표균주에 대한 항균 활성을 나타내었으나 RB-CDP-I-N 항균 펩타이드의 경우, Vibrio alginolyticus, V. parahaemolyticus, Streptococcus iniae, Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis, Providencia stuartii 균주에는 활성이 매우 약하였다(도 2). 또한, 상기 RB-CDP-I-A2 항균 펩타이드는 Staphylococcus haemolyticus 균주를 제외한 총 34균주에 대한 항균활성을 다양한 농도범위에서 관찰하였다(도 4).

일부 항균 펩타이드의 경우 그람양성 또는 음성 균에만 활성이 있거나 진균류에는 항균 활성이 전혀 없는 경우가 종종 보고되었으나 RB-CDP-I-A2 항균 펩타이드는 진균류뿐만 아니라 그람양성 및 음성 균주 모두에 항균활성을 나타내었고, 일부 항생제 내성 균주들에도 높은 항균 활성을 보였으며 활성은 종에 따라 약간의 유의적인 활성 차이를 나타내었다. 또한 상기 결과를 통하여 RB-CDP-I-A2 항균 펩타이드의 각 균주에 대한 최소효과농도(minimal effective concentration, MEC)를 분석하였다. 상기 항균 활성 분석에 사용된 지표균주 목록 및 최소효과농도(㎍/ml)를 하기 표 2에 나타내었다.

지표균주 목록 및 최소효과농도(㎍/ml)

미생물의 종류	MIC (㎍/ml)	미생물의 종류	MIC (㎍/ml)
효모
Candida albicans KCCM 11282	3.3
그람양성균
Bacillus cereus KCTC 1012	5.3	Bacillus subtilis KCTC 1021	1.4
Enterococcus faecalis KCTC 3206	4.9	Lactococcus garvieae KCTC 3772	2.3
Staphylocuccus aureus KCCM 11335	3.5	Streptococcus mutans KCTC 3065	5.0
Streptococcus parauberis KCTC 3651	0.8	Streptococcus iniae KCTC 3657	9.5
그람음성균
Enterobacter cloacae CCARM 0252	1.7	Enterobacter cloacae KCTC 2361	1.7
Escherichia coli ACTT 8739	1.6	Klebsiella pneumonia KCTC 12385	0.5
Providencia stuartii KCTC 2569	16	Proteus mirabilis KCTC 2510	2.3
Pseudomonas aeruginosa KCTC 1636	3.5	Vibrio alginolyticus KCTC 2472	9.3
Vibrio parahaemolyticus KCCM 41664	7.2

실시예 4: 열 및 염에 대한 안정성 평가

본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 RB-CDP-I-A2 항균 펩타이드를 이용하여 열 및 염분에 대한 안정성을 평가하였다. 일부 항균 펩타이드의 경우 100℃에서 가열한 뒤 항균 활성이 사라지거나, 육상생물에서 분리한 항균 펩타이드의 경우 해양환경에 존재하는 NaCl에 의해서 활성이 저해되고 사라지는 보고가 있어 본 발명자들은 항균 펩타이드의 열안정성과 NaCl에 대한 염안정성을 평가하기 위하여 RB-CDP-I-A2 항균 펩타이드를 100℃에서 10분간 가열 및 0.5~2% NaCl 조건에서 항균 활성을 평가하였다.

그 결과, 본 발명의 RB-CDP-I-A2 항균 펩타이드는 열과 NaCl에 대해 영향을 받지 않고 안정적인 항균 활성을 나타내었다(도 5).

실시예 5: 넙치적혈구 세포에 대한 용혈 활성 평가

본 발명자들은 본 발명의 항균 펩타이드 RB-CDP-I-N, RB-CDP-I-A1 및 RB-CDP-I-A2의 용혈활성을 분석하였다. 구체적으로, 넙치에서 분리한 혈액에 동량의 150 mM NaCl이 포함된 50 mM sodium phosphate buffer(PBS, pH 7.4)를 첨가하여 혼합한 뒤 4℃에서 5,000 rpm으로 1분간 원심분리를 통해 침전물을 수득하였다. 동일한 세척과정을 3회 반복하여 수득한 적혈구를 3% 혼합용액이 되도록 PBS를 첨가한 후 사용하였다. 그 후 3% 적혈구 혼합물 90μl와 농도별 항균 펩타이드들을 10μl씩 섞은 후 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 상기 반응액을 원심분리 후 상층액의 적혈구 유출 정도를 분광광도계로 측정하였고(405 nm) 양성 대조구로 1% Triton X-100을 사용하였으며, 음성 대조구로 0.01% 아세트산(acetic acid)과 PBS를 사용하여 하기의 수식으로 용혈활성을 평가하였다.

% 용혈활성=[(ABS_405nm 펩타이드 흡광도 - ABS_405nm 버퍼 흡광도)/(ABS_405nm 1% Triton X-100 흡광도 - ABS_405nm 버퍼 흡광도)] × 100

그 결과 RB-CDP-I-N과 RB-CDP-I-A1은 용혈활성이 매우 낮았으나 RB-CDP-I-A2의 경우 용혈활성이 높은 것으로 나타났다(도 6).

실시예 6: 용혈활성 저감형 유도체 항균 펩타이드 제조 및 활성 평가

본 발명자들은 항균 펩타이드 RB-CDP-I-A2의 높은 항균활성은 유지하되 용혈활성은 감소한 항균 펩타이드 유도체를 제조하였고 이에 대한 기능성을 분석하였다. 구체적으로 용혈활성을 유발하는 잔기인 10번째 류신(Leucine, Leu, L) 잔기를 메티오닌(Methioninie, Met, M), 라이신(Lysine, Lys, K), 발린(Valine, Val, V), 이소류신(Isoleucine, Ile, I)으로 치환하였고, 네 번째 잔기인 트립토판 (Tryptophan, Trp, W)만 페닐알라닌(Phenylalanine, Phe, F)으로 치환된 유도체들을 제조하였다(표 3. 도 7). 상기 제조한 유도체의 정보를 하기 표 3에 요약하였다.

RB-CDP-I-A2 항균 펩타이드 유도체의 서열 정보

서열번호	펩타이드 명칭	펩타이드 서열
5	RB-CDP-I-A2-R1	VKLWVKLVKMLIK-NH₂
6	RB-CDP-I-A2-R2	VKLWVKLVKKLIK-NH₂
7	RB-CDP-I-A2-R3	VKLWVKLVKVLIK-NH₂
8	RB-CDP-I-A2-R4	VKLWVKLVKILIK-NH₂
9	RB-CDP-I-A2-R5	VKLFVKLVKLLIK-NH₂

그 결과, 용혈활성 감소를 위해 제조한 용혈활성 저감형 유도체들의 항균 활성은 RB-CDP-I-A2와 유사(RB-CDP-I-A2-R3, 또는 -R4) 또는 활성이 더욱 증가하였고(RB-CDP-I-A2-R1, 또는 -R2), 특히 RB-CDP-I-A2-R5의 경우 S. iniae 균주에 대해 감소된 황균 활성을 나타내었다(도 8a 내지 8c).

실시예 7: 항균 펩타이드 유도체의 항균활성 평가 1(중합효소저해반응)

본 발명의 항균 펩타이드 RB-CDP-I-A2 및 용혈활성 저감형 유도체들의 항균 활성 기작 중 중합효소(Taq polymerase)의 유전자 증폭활성 저해능 평가를 통한 항균활성을 분석하였다. 구체적으로 유전자 증폭반응 시 각각의 제조한 항균 펩타이드들을 첨가하여 DNA 증폭반응 저해를 통한 항균활성을 평가하였다. 그 결과, 모든 유도체들은 RB-CDP-I-A2 항균 펩타이드와 비슷한 효소 저해반응을 나타내었다(도 9).

실시예 8: 항균 펩타이드 유도체의 항균 활성 평가 2(DNA 부착능 평가)

본 발명의 항균 펩타이드 RB-CDP-I-A2 및 용혈활성 저감형 유도체들의 항균 활성 기작 중 DNA 부착을 통한 항균 활성을 분석하였다. 구체적으로 DNA 마커를 아가로즈 전기영동을 통하여 분리·전개되는 과정에서 각각의 항균 펩타이드들을 첨가 후 전기영동 시 DNA에 부착하여 방해하는 활성을 측정하였다.

그 결과, RB-CDP-I-A2-R3 및 -R4가 0.31 μg에서 줄어든 부착능을 보이는 결과를 제외하고 모든 유도체가 RB-CDP-I-A2와 유사한 DNA 부착활성을 나타내었다 (도 10).

실시예 9: 항균 펩타이드 유도체의 용혈 활성 평가

본 발명의 항균 펩타이드 RB-CDP-I-A2 및 용혈활성 저감형 유도체들의 넙치 적혈구에 대한 용혈활성을 평가하였다. 평가방법은 상기 실시예 5에서 수행한 동일한 방법으로 농도별 용혈활성 정도를 평가하였다.

그 결과, 고농도인 100 μg/ml에서는 유사한 용혈활성을 나타내었으나 RB-CDP-I-A2-R2는 50 μg/ml 농도에서부터 50% 이상 용혈활성이 감소하여 20 μg/ml이하에서는 용혈활성이 현저히 감소하였고 RB-CDP-I-A2-R1과 -R4을 제외하고는 용혈활성이 RB-CDP-I-A2에 비하여 매우 감소하였음을 농도별로 확인하였으며, RB-CDP-I-A2-R1과 R-4는 RB-CDP-I-A2와 비교하여 12.5 μg/ml 농도에서부터 50% 이상 용혈활성이 감소하였다(도 11).

실시예 10: 스쿠치카 기생충 사멸 활성 평가

본 발명의 항균 펩타이드 RB-CDP-I-A2 및 용혈활성 저감형 유도체들의 다기능성을 평가하기 위해 항기생충 활성을 분석하였다. 구체적으로, 스쿠치카(scutica)충의 비율이 1x10⁶ cells/100 ㎕이 되도록 배지에 희석한 후 96웰 플레이트(well plate)에 100 ㎕씩 분주(웰 당 50% 정도)하였고 상기 샘플을 배지에 섞어서 100 ㎕ 농도별로 만든 후 100 ㎕의 기생충이 포함된 웰에 분주하였다(샘플 100 ㎕ + 기생충 100 ㎕=총 200 ㎕). 그 후, 20℃의 조건으로 24시간 배양하였고 현미경으로 스쿠치카충의 형태적 변화와 운동성 변화를 촬영하였다. 반응이 끝난 후, Premix WST-1을 웰당 20 ㎕씩 첨가하였고 다양한 반응시간(0.5, 1, 2, 3, 4 및 5시간)에서 ELISA 판독기를 이용하여 흡광도(450nm)를 반복 측정 후 최적 반응시간을 결정하였다. 0.01% 아세트산 처리 시 스쿠치카충의 생존율을 100% 기준으로 하여 25~200 ㎍/ml의 항균 펩타이드 농도에 따른 스쿠치카충의 생존율(viability)을 측정하였다. 상기 실험조건과 생존율에 대한 공식을 정리하면 하기와 같다:

*Blank = 배지 (L-15) + 0.01% 아세트산

대조군 = 스쿠치카 + 0.01% 아세트산

시료처리군 = 스쿠치카 + 펩타이드(1, 5, 10, 15 ㎍/ml)

(sample - blank / 대조군- blank) x 100 = 생존율.

그 결과, RB-CDP-I-A2 및 RB-CDP-I-A2-R1은 항균 활성 외에도 10 ㎍/ml 농도까지 스쿠치카충에 대한 항기생충 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 그러나 10 ㎍/ml 이상의 농도에서는 약 80% 이상의 스쿠치카충에 대한 사멸활성을 나타내었으나 5 ㎍/ml 이하의 농도에서는 약 20%의 사멸율을 기록하였다. 또한 유도체들은 RB-CDP-I-A2-R1을 제외하고 RB-CDP-I-A2보다 낮은 항기생충 활성을 보였으나 RB-CDP-I-A2-R4와 -R5의 경우 15 ㎍/ml 이상의 농도에서 70% 이상의 항기생충 활성을 기록하였다(도 12).

실시예 11: 항암 활성 분석

본 발명의 RB-CDP-I-A2 항균 펩타이드와 용혈활성 저감형 유도체들의 다기능성을 평가하기 위해 항암 활성을 분석하였다. 다기능성 효과 중 항암 효과를 관찰하기 위하여 상기 실시예 10과 동일한 방법으로 자궁암 세포(HeLa), 폐암 세포(A549) 및 대장암 세포(HCT116)에 RB-CDP-I-A2 항균 펩타이드를 농도별(0~50 ㎍/ml)로 처리하고 생존율을 분석하였다.

그 결과, 대장암 세포(HCT116)에서는 낮은 항암 활성을 나타내었으나 자궁암 세포(HeLa)와 폐암 세포(A549)에서는 RB-CDP-I-A2와 유도체 RB-CDP-I-A2-R1, -R2가 우수한 항암 활성을 나타냄을 확인하였다(도 13 및 14).

결론적으로, 돌돔 유전체 분석 결과를 활용하여 번역 후 인지질분해효소 촉매 도매인 서열을 기반으로 제조한 본 발명의 항균 펩타이드들은 다양한 표지균주에 대해 높은 항균 활성을 가지고 있을 뿐만 아니라 항기생충 활성을 나타내었고, 염분과 열처리 후에도 안정성도 증명되어 다양한 병원성 균주 및 유해균주의 제어를 위한 항생제 대체 소재로 활용가능하다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> Republic of Korea represented by National Fisheries Research & Development Institute <120> Antimicrobial peptide derived from the phospholipase of rock bream and uses thereof <130> PD18-5663 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antimicrobial peptide <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> Xaa is Tyr, Trp or Phe. <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> Xaa is Thr, Ser, Arg, His or Lys. <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> Xaa is Pro, Leu, Met or Ile. <400> 1 Val Lys Leu Xaa Val Lys Leu Val Xaa Xaa Leu Ile Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RB-CDP-I-N <400> 2 Val Lys Leu Trp Val Lys Leu Val Thr Pro Leu Ile Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RB-CDP-I-A1 <400> 3 Val Lys Leu Trp Val Lys Leu Val Lys Pro Leu Ile Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RB-CDP-I-A2 <400> 4 Val Lys Leu Trp Val Lys Leu Val Lys Leu Leu Ile Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RB-CDP-I-A2-R1 <400> 5 Val Lys Leu Trp Val Lys Leu Val Lys Met Leu Ile Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RB-CDP-I-A2-R2 <400> 6 Val Lys Leu Trp Val Lys Leu Val Lys Lys Leu Ile Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RB-CDP-I-A2-R3 <400> 7 Val Lys Leu Trp Val Lys Leu Val Lys Val Leu Ile Lys 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RB-CDP-I-A2-R4 <400> 8 Val Lys Leu Trp Val Lys Leu Val Lys Ile Leu Ile Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RB-CDP-I-A2-R5 <400> 9 Val Lys Leu Phe Val Lys Leu Val Lys Leu Leu Ile Lys 1 5 10

Claims

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열(VKLX₁VKLVX₂X₃LIK)을 포함하고 항균활성을 갖는 펩타이드.
(상기 아미노산 서열에서, X₁은 타이로신, 트립토판 또는 페닐알라닌이고, X₂는 트레오닌, 세린, 아르기닌, 히스티딘 또는 라이신이며, X₃는 프롤린, 류신, 메티오닌, 발린 또는 이소류신이다.)
제1항에 있어서,
C-말단이 아미드화된, 펩타이드.
제1항 또는 제2항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항균 조성물.
제3항에 있어서,
그람 음성균, 그람 양성균 또는 진균에 대한 항균활성을 갖는, 항균 조성물.
제4항에 있어서,
상기 그람 양성균은 B. cereus, B. subtilis, S. mutans, S. iniae, S. aureus, L. garvieae, S. vestibularis, E. faecalis, 또는 S. parauberis인, 항균 조성물.
제5항에 있어서,
상기 S. aureus는 S. aureus 0203, S. aureus 0204, S. pyogenes 0206, 또는 S. aureus 3795인, 항균 조성물.
제4항에 있어서,
상기 그람 음성균은 E. coli, E. cloacae, P. aeruginosa, V. alginoalyticus, V. anguillarum, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. harveyi, K. pneumoniae, E. tarda, P. mirabilis, P. stuartii, S. typhimurium , K. oxytoca 0248, K. aerogenes 0249, 또는 E. cloacae 0252인, 항균 조성물.
제7항에 있어서,
상기 E. coli는 E. coli ML35p, E. coli 0238 또는 E. coli 1A814인, 항균 조성물.
제7항에 있어서,
상기 P. aeruginosa는 P. aeruginosa 0225인, 항균 조성물.
제7항에 있어서,
상기 S. thypimurium는 S. typhimurium 0240인, 항균 조성물.
제4항에 있어서,
상기 진균은 C. albicans인, 항균 조성물.
제1항 또는 제2항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제.
제1항 또는 제2항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항-스쿠치카충 방제용 조성물.
제1항 또는 제2항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항암용 조성물.
제14항에 있어서,
상기 암은 자궁암 또는 폐암인, 항암용 조성물.