KR20150136834A

KR20150136834A - 비단멍게 유래 항균 펩타이드의 신규한 유사체 및 그 용도

Info

Publication number: KR20150136834A
Application number: KR1020140064369A
Authority: KR
Inventors: 이인희
Original assignee: 이인희
Priority date: 2014-05-28
Filing date: 2014-05-28
Publication date: 2015-12-08
Also published as: KR101653141B1; WO2015183002A2; WO2015183002A3

Abstract

본 발명은 항균 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비단멍게(halocynthia aurantium) 체액 세포로부터 분리한 항균 펩타이드인 할로시딘(halocodin)의 일부 아미노산을 변형시켜 단백질 분해 효소에 대한 저항성과 혈청내에서의 활성을 대폭적으로 개선시킨 변이체 항균 펩타이드 및 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균제에 관한 것이다. 본 발명의 항균 펩타이드는 그람 양성 및 그람 음성세균, 특히 항생제 내성균에 대한 저항성이 뛰어날 뿐만 아니라, 진균에 대해서도 강력한 항진균 활성을 지니고 있으며, 항균 펩타이드 실용화에 큰 걸림돌인 단백질 분해효소에 의한 가수분해와 혈청 단백질들과의 비특이적인 결합에 기인한 항균활성의 소실의 문제점을 극복한 항균 펩타이드로서 새로운 펩타이드 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

비단멍게 유래 항균 펩타이드의 신규한 유사체 및 그 용도{Novel analogues of antibacterial peptide derived from halocynthia aurantium and the use thereof}

본 발명은 항균 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비단멍게로부터 분리된 항균 펩타이드 유래로서, 단백질분해효소에 대한 저항성과 혈청이 존재하는 조건에서의 항-미생물(세균, 진균) 활성이 개선되어 혈액과 상처 삼출액이 존재하는 창상 감염에도 적용 가능한 항균 펩타이드에 관한 것이다.

미생물에 대한 살균력을 지닌 크기가 작은 단백질을 항균 펩타이드(antimicrobial peptide)라고 정의한다. 항균 펩타이드는 자연계의 거의 모든 생물체에 존재하며, 체내에서 중요한 생체방어(host defense) 역할을 하고 있다. 1980년 이전에 곤충의 혈림프와 토끼의 백혈구에서 최초로 발견된 후, 이제까지 다양한 종류의 생물들에서 1,500 종류에 달하는 항균 펩타이드가 분리된 바 있다.

항균 펩타이드는 주로 20 종류의 표준 아미노산들로 이루어진 작은 단백질로서 대개 12~50개의 아미노산 잔기들로 이루어져 있다. 종종 탄수화물이 conjugation된 항균 펩타이드도 보고된 바 있으나, 대부분의 경우 표준 아미노산들로만 구성되어 있다. 대부분의 항균 펩타이드들은 많은 양 전하 아미노산들(Arg, Lys)과 여러 개의 소수성 아미노산들을 지니는 것이 특징인데, 이 아미노산들은 항균 펩타이드가 2차 및 3차 구조에서 양극성(amphipathicity)을 나타내는 데에 기여한다. 항균 펩타이드의 이러한 구조적 특성으로 인해 항균 펩타이드들은 미생물의 인지질 막 표면에 결합된 후, 막으로 삽입되어 pore를 형성하게 된다. 이러한 항균 펩타이드들은 구조를 바탕으로 다음과 같이 분류할 수 있다.

① helical peptides (magainin, cecropin, LL-37 등)

② 특정 아미노산들을 집중적으로 포함하는 peptides (PR39, indolicidin 등)

③ 분자 내 cysteine 잔기들 간에 이황화 결합(S-S 결합)을 지닌 β-sheet 구조의 peptide (defensin, tachyplesin, protegrin 등)

이제까지 발견된 대부분의 항균 펩타이드들은 위의 범주에 속하는 구조들을 지니는데, 구조자체가 trypsin 같은 단백질 분해효소에 매우 취약한 단점이 있다. 즉, 항균 펩타이드가 항균활성을 발휘하는 데에 있어 중요한 염기성 아미노산인 Lys과 Arg은 바로 trypsin의 작용부위가 되는 것이다. 이제까지 이러한 문제를 극복하기 위해 D-form의 아미노산 치환[Stromstedt AA, Pasupuleti M, Schmidtchen A, Malmsten M (2009) Evaluation of strategies for improving proteolytic resistance of antimicrobial peptides by using variants of EFK17, an internal segment of LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 53(2):593-602.], 아미노산 잔기의 modification [Meng H, Kumar K (2007) Antimicrobial activity and protease stability of peptides containing fluorinated amino acids. J Am Chem Soc. 129(50):15615-15622.], 1차 구조에 Cys 아미노산을 더한 후 이량체(dimer)화[Dalla Serra M, Cirioni O, Vitale RM, Renzone G, Coraiola M, Giacometti A, Potrich C, Baroni E, Guella G, Sanseverino M, De Luca S, Scalise G, Amodeo P, Scaloni A (2008) Structural features of distinctin affecting peptide biological and biochemical properties. Biochemistry. 47(30):7888-7899.] 혹은 원형(circular form)펩타이드로의 변환[Rozek A, Powers JP, Friedrich CL, Hancock RE (2003) Structure-based design of an indolicidin peptide analogue with increased protease stability. Biochemistry. 42(48):14130-14138.] 등 여러 방법의 시도가 있었으나, 구조변환에 따른 활성저하 혹은 합성 수율 및 원가 상승 등의 문제가 생겨났다. 그러므로 단백질 분해효소에 저항성을 지닌 천연 항균 펩타이드를 기본 구조로 하여 고안된 항균 펩타이드가 가장 유력한 항생제 후보물질이 될 것으로 간주되어 왔다. 이제까지 알려진 항균 펩타이드의 작용 상의 특성을 요약하면 다음과 같다.

① 기존 항생제와는 다른 작용방식: 내성균에의 작용효과

② 광범위한 작용 spectrum

③ 신속한 작용 mechanism

④ LPS 및 LTA와 같은 병원균 표면분자에의 결합: 내독성 제어효과

⑤ Target 선택성(사람세포와 미생물을 구분하는 능력)

⑥ 다양한 면역반응 조절활성: immuno-modulatory activity

항균 펩타이드를 기초로 한 신규 의약품의 임상 적용 질환은 주로 상피감염(topical infection) 치료를 위한 외용 항생제(당뇨병 족부감염증, 암 환자의 구강점막 감염증 등의 치료를 위한 외용제)였는데, 주사제로서는 여러 독성이 나타난 반면, 외용제로서는 이제까지 어떠한 독성도 관찰되지 않았기 때문이었다. 그러나 모든 경우에 있어 2차 혹은 3차 임상시험에서 탈락되었는데, 이는 실제 치료부위에 항균 펩타이드를 적용했을 경우, 치료효과가 유의성 있게 나타나지 않았기 때문이었다. 따라서 항균 펩타이드를 치료제로서 사용하기에는 활성적 혹은 구조적인 측면에서 여러 문제들이 존재하고 있음을 알 수 있다. 새로운 외용 항생제로 개발되기에 부적합한 항균 펩타이드의 결정적인 한계는 다음 두 가지로 요약될 수 있다.

① 많은 AMP들은 생리적 환경 즉, NaCl의 농도가 높거나 2가 양이온들(Ca²⁺, Mg²⁺ 등)이 존재하는 환경에서 활성을 잃는다.

② 병원체나 사람 상피조직에서 유래한 protease들에 의해 분해되어 활성을 잃는다.

그러므로 in vitro 상에서 항생제로서의 충분한 활성을 보였다고 해도 실제 임상적용 시에는 유효성 있는 치료효과가 관찰되지 않았던 것이다. 특히, 단백질 분해 효소들(trypsin-, chymotrypsin-like proteases와 matrix metalloproteases)에 대한 불안정성의 문제는 해결하기가 매우 어려운 것으로서, 이에 대처하기 위해 많은 연구자들은 항균 펩타이드 구성 아미노산들을 unusual 혹은 modified 아미노산들로 치환하는 방법을 통해 새로운 항균 펩타이드를 고안하려 시도하고 있다. 그러나 이럴 경우 표준 아미노산들로 구성된 항균 펩타이드에 비해 활성이 약화되거나 작용방식이 달라지며, 약물동력(pharmacokinetics) 혹은 독성 상에 예기치 않은 문제가 발생할 수 있게 된다.

최근, 앞에서 기술한 범주에 속하지 않은 새로운 종류의 네 개의 항균 펩타이드들이 보고되었는데, 항균 펩타이드 서열 내에 하나의 Cys 아미노산을 지닌 것으로서 분자 간 이황화 결합(S-S)을 통해 이량체 형태(dimer form)를 취하고 있는 것으로 개구리에서 발견된 distinctin [Batista CV, Scaloni A, Rigden DJ, Silva LR, Rodrigues Romero A, Dukor R, Sebben A, Talamo F, Bloch C (2001) A novel heterodimeric antimicrobial peptide from the tree-frog Phyllomedusa distincta. FEBS Lett. 494(1-2):85-89.], 쥐의 소장 Paneth cell에서 합성 분비되는 CRS peptide (Cryptidin-Related Sequence) [Hornef MW, PK, Karlsson J, Refai E, Andersson M (2004) Increased diversity of intestinal antimicrobial peptides by covalent dimer formation. Nat Immunol. 5(8):836-843.], 멍게의 체액세포에서 발견된 dicynthaurin [Lee IH, Lee YS, Kim CH, Kim CR, Hong T, Menzel L, Boo LM, Pohl J, Sherman MA, Waring A, Lehrer RI (2001) Dicynthaurin: an antimicrobial peptide from hemocytes of the solitary tunicate, Halocynthia aurantium. Biochim Biophys Acta. 1527(3):141-148.]과 halocidin [Jang WS, Kim KN, Lee YS, Nam MH, Lee IH (2002) Halocidin: a new antimicrobial peptide from hemocytes of the solitary tunicate, Halocynthia aurantium. FEBS Lett. 521(1-3):81-86.]등이 있다.

이러한 이량체 구조의 항균 펩타이드는 단백질 분해효소에 대해 저항성을 지닐 수 있다는 사실이 보고되었다[Hornef MW, Putsep K, Karlsson J, Refai E, Andersson M (2004) Increased diversity of intestinal antimicrobial peptides by covalent dimer formation. Nat Immunol. 5(8):836-843., Lehrer RI (2004) Paradise lost and paradigm found. Nat Immunol. 5(8):775-776.]. 위 네 개의 항균 펩타이드들 중 halocidin은 크기가 가장 작은 것으로서 본 발명자들이 10년 전 동해산 비단멍게의 체액세포로부터 정제한 항균 펩타이드이다[Jang WS, Kim KN, Lee YS, Nam MH, Lee IH (2002) Halocidin: a new antimicrobial peptide from hemocytes of the solitary tunicate, Halocynthia aurantium. FEBS Lett. 521(1-3):81-86.]. 'Halocidin'의 기본구조를 바탕으로 하여 아미노산을 치환, 삽입, 절단하여 다양한 유도체를 만들었으며, 이들 유도체들의 비교 연구를 통하여 최적의 활성을 갖는 유도체를 도출하기 위한 노력을 수년간 지속 해왔다. 그 결과, 광범위한 항-미생물(세균, 진균) 활성을 지니면서도[Jang WS, Kim KN, Lee YS, Nam MH, Lee IH (2002) Halocidin: a new antimicrobial peptide from hemocytes of the solitary tunicate, Halocynthia aurantium. FEBS Lett. 521(1-3):81-86., Jang WS, Kim CH, Kim KN, Park SY, Lee JH, Son SM, Lee IH (2003) Biological activities of synthetic analogs of halocidin, an antimicrobial peptide from the tunicate Halocynthia aurantium. Antimicrob Agents Chemother. 47(8):2481-2486., Jang WS, Kim HK, Lee KY, Kim SA, Han YS, Lee SH, Lee IH (2006) Antifungal activity of synthetic peptide derived from halocidin, antimicrobial peptide from the tunicate, Halocynthia aurantiu. FEBS Lett. 580:1490-1496.], 항균 펩타이드 실용화 연구에 가장 큰 난관으로 여겨지는 단백질 분해효소에 대한 저항성을 확보한 유도체를 고안하였으며[Shin YP, Park HJ, Shin SH, Lee YS, Park S, Jo S, Lee YH, Lee IH (2010) Antimicrobial activity of a halocidin-derived peptide resistant to attacks by proteases. Antimicrob Agents Chemother. 54(7):2855-2866.], 이를 HG1 (Di-K19Hc)으로 명명하고 구강점막염 치료용 의약품으로의 개발을 진행 중에 있다.

HG1은 항균 활성 측면과 단백질 분해효소에 대한 저항성 측면에서 우수한 유도체이나 사람의 혈청 단백질들과의 비특이적 결합에 의해 활성을 소실하는 문제점으로 인하여 활용범위에 한계가 있다. 즉, 창상이나 욕창과 같이 혈액의 혈장 성분이 삼출되는 감염증에서는 활성을 소실하여 치료효과를 발휘할 수가 없기 때문에 혈액성분이 존재하지 않는 감염성 질환에만 사용할 수 있다는 점에서 외용제로 개발 시 확장성의 문제가 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 비단멍게(halocynthia aurantium) 유래 항균 펩타이드의 문제점을 개선하기 위해 안출된 것으로, 항균 펩타이드인 할로시딘(halocodin)을 구성하는 일부 아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 치환시킴으로써, 종래 할로시딘 펩타이드 유도체(HG1)가 갖고 있던 혈액 내에서의 항-미생물 활성 소실의 문제점을 대폭적으로 개선한 변이체 항균 펩타이드 및 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항-세균, 항-진균제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 항균 펩타이드는, 서열번호1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 3번째 아미노산에 위치한 루신(Leucine, L)이 글루타민(Glutamine, Q)으로 치환되고, C-말단으로부터 1번째 아미노산에 위치한 알라닌(Alanine, A)이 리신(Lysine, K)으로 치환된 것이다.

여기서, 상기 펩타이드는 서열번호2의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.

그리고, 본 발명은 상기 서열번호2로 기재된 아미노산 서열의 시스테인(Cysteine, C) 잔기가 이황화 결합으로 연결되어 다이머 형태를 갖는 하기 화학식1로 표시되는 항균 펩타이드인 것도 가능하다.

[화학식 1]

또한, 상기 펩타이드는 그람 음성균 및 그람 양성균에 대하여 항균 활성을 가질 수 있다.

또한, 상기 펩타이드는 단백질 분해효소에 대하여 저항성을 갖는 것이 가능하다.

또한, 상기 펩타이드는 인간 혈청 내에서 항균 활성을 갖는 것이 바람직하다.

또한, 상기 펩타이드는 인간 상처 삼출액(Human wound fluid, HWF) 내에서 항균 활성을 갖는 것이 더욱 바람직하다.

한편, 본 발명의 다른 실시형태는, 상기한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 또는 방부용 조성물이다.

그리고, 본 발명은 상기한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항생용 약학적 조성물인 것도 가능하다.

또한, 본 발명은 상기한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항생용 식품 첨가제일 수 있다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

이러한 본 발명은 비단멍게 체액 세포로부터 분리한 항균 펩타이드인 할로시딘의 일부 아미노산을 변형시켜 단백질 분해 효소에 대한 저항성과 혈청내에서의 활성을 대폭적으로 개선시킨 변이체 항균 펩타이드 및 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균제를 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 항균 펩타이드는 그람 양성 및 그람 음성세균, 특히 항생제 내성균에 대한 저항성이 뛰어날 뿐만 아니라, 진균에 대해서도 강력한 항진균 활성을 지니고 있으며, 항균 펩타이드 실용화에 큰 걸림돌인 단백질 분해효소에 의한 가수분해와 혈청 단백질들과의 비특이적인 결합에 기인한 항균활성의 소실의 문제점을 극복한 항균 펩타이드로서 새로운 펩타이드 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 HG1과 HG1 유도체의 용혈독성을 나타내는 그래프 일례이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 HG1과 HG1 유도체의 인간혈청 내에서의 항균활성을 나타내는 그래프 일례이다.
도 3은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 할로가난의 역상 HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) 수행 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 할로가난의 용혈독성을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 할로가난의 단백질 분해효소 농도에 따른 저항성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 할로가난의 단백질 분해효소와의 반응시간에 따른 저항성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 할로가난의 인간 혈청 내에서의 항균 활성을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 할로가난의 인간 상처 삼출액(HWF) 내에서의 항균 활성을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 발명에 따른 항균 펩타이드는, 서열번호1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 3번째 아미노산에 위치한 루신(Leucine, L)이 글루타민(Glutamine, Q)으로 치환되고, C-말단으로부터 1번째 아미노산에 위치한 알라닌(Alanine, A)이 리신(Lysine, K)으로 치환된 것이다.

본 발명의 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열은 비단멍게(halocynthia aurantium)에서 유래한 항균 펩타이드인 할로시딘(halocodin)에 일부 아미노산 잔기를 추가 및/또는 치환하여 제조할 수 있고, 구체적으로는 당업계에 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법에 의해 제조가 가능하며, 제조 방법이 특별히 한정되지 않는다.

일반적으로, 비단 멍게의 체액세포에서 분리한 천연 항균 펩타이드인 할로시딘은 서열 내부에 시스테인(Cysteine, C) 아미노산을 포함하고 있는 18 개의 아미노산 서열의 긴 사슬과 15개의 아미노산 서열의 짧은 사슬이 시스테인 아미노산에 의한 이황화 결합으로 형성한 이형 이량체구조(hetero dimer)의 펩타이드이며, C-말단은 아미드화(C-terminal amidation) 되어 있다(하기 표 1 참조).

그리고, 할로시딘의 18개 아미노산 서열을 갖는 긴 사슬의 N-말단에 1개의 양이온(cationic) 아미노산인 리신(Lysine, K)을 추가한 사슬을 동형 이량체(homo-dimer)화 하여 고안한 펩타이드가 Di-K19Hc (이후 HG1으로 개명)로 항-미생물 활성, 단백질 분해 효소에 대한 저항성을 대폭 개선한 펩타이드이나 상기한 바와 같이 혈청 내에서의 항-미생물 활성을 소실하는 문제점을 갖고 있다. 이와 같은 문제점을 개선한 것이 본 발명의 할로가난(haloganan) 펩타이드이다.

또한, 본 발명에 따른 할로가난은 할로시딘의 긴 사슬의 N-말단에 1개의 아미노산을 추가, 서열 내부의 아미노산 2개를 치환한 펩타이드의 동형 이량체 펩타이드이다. 자세히는 할로시딘 긴 사슬(18mer)의 N-말단에 양이온성 아미노산 리신(K)을 추가하고, N-말단 측의 첫 번째 루신(Leucine, L) 아미노산을 글루타민(Glutamine, Q) 아미노산으로 치환, C-말단의 알라닌(Alanine, A) 아미노산을 리신(K)아미노산으로 치환한 19 mer 펩타이드의 동형 이량체 형태이다.

할로가난의 아미노산 서열을 상기와 같이 고안 한 이유는 다음과 같다. 앞서 언급한 내용과 같이 할로시딘은 동해산 멍게(tunicate)의 체액세포에서 발견된 항균 펩타이드로 18 개 아마노산 사슬과 15 개 아미노산 사슬이 이황화 결합으로 연결된 이형-이량체(hetero-dimer)이다.

초기 연구에서 할로시딘의 활성을 증가시키기 위하여 18 개 아미노산 사슬의 N-말단에 리신(K) 잔기를 추가한 19 mer 펩타이드를 합성하였고, 19 잔기의 동형-이량체 형태인 HG1을 개발하였다. 양이온 아미노산인 리신(K) 은 항균 펩타이드의 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데[Hancock RE, Diamond G (2000) The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8(9):402-410.], 특히 아미노산 트립토판(Tryptophan, W)으로 N-말단을 시작하는 항균 펩타이드의 경우 트립토판(W) 앞에 리신(K)을 추가하면 활성이 더욱 증가된다는 보고가 있다. 곤충의 대표적인 항균 펩타이드 세크로핀(cecropin)이 그러한데[Moore AJ, Beazley WD, Bibby MC, Devine DA (1996) Antimicrobial activity of cecropins. J Antimicrob Chemother. 37(6):1077-1089.], 세크로핀 펩타이드 그룹 가운데 D-type은 트립토판(W)으로 N-말단을 시작하지만 A, B-type은 N-말단 서열에 리신(K) 아미노산이 더 추가된 형태(K-W)로서, D-type 세크로핀 보다 항균 활성이 더 높은 것으로 알려져 있다[Hultmark D, EngstrA, Bennich H, Kapur R, Boman HG (1982) Insect immunity: isolation and structure of cecropin D and four minor antibacterial components from Cecropia pupae. Eur J Biochem. 127(1):207-217.].

이러한 이유로 본 연구자들은 트립토판(W)으로 시작하는 18 잔기에 리신(K) 잔기를 추가하여 19 잔기를 합성한 것이다. 이렇게 합성된 HG1은 미생물뿐만 아니라 진균에 대해서도 강한 항균 활성을 보유하고 있다. 그런데, HG1은 높은 독성과 함께 인간 혈청(human serum)의 어떤 성분과 결합하여 활성을 잃어버리는 문제점이 있다. 따라서 이를 보완하기 위하여 새로운 펩타이드인 본 발명에 따른 할로가난(haloganan)을 합성하였다.

본 발명자들은 HG1과 같은 항균 펩타이드에서 아미노산의 이온성에 주목하였다. 즉, 항균 펩타이드의 활성에 있어서 양이온 아미노산과 함께 중요한 역할을 하는 것이 소수성(hydrophobic) 아미노산인데, 소수성 아미노산은 활성뿐만 아니라 인간 체액(human body fluid)에서 펩타이드의 solubility에도 영향을 미친다.

HG1은 19 잔기에 5개의 루신(L) 잔기를 갖고 있는 Leucine-rich 항균 펩타이드이다. 따라서 HG1에서 주된 소수성 아미노산이 루신(L) 잔기일 것이라 가정했으며, 루신(L) 잔기가 HG1의 항균 활성뿐만 아니라 혈청 단백질과의 비특이적 결합(serum binding)에도 기여할 것이라고 생각하였다. 이에, 루신(L) 잔기를 글루타민(Q)으로 치환하였다. 글루타민은 전하를 띄지 않는(non-charged) 극성(polar) 아미노산으로 혈청에 결합하는 문제를 해결해 줄 것이며, 또한 우리 몸에 가장 많이 존재하는 아미노산이므로 독성을 감소 시켜 줄 것이라 생각하였다.

그래서, 5개의 루신(L)을 각각 글루타민(Q)으로 치환 하였다. 그 결과는 도 1 및 도 2, 그리고 하기 표 2 내지 표 4에 나타난 바와 같다.

상기 표 2는 HG1과 HG1 유도체의 염기 서열 및 각 펩타이드의 특징을 나타내고 있고, 표 3은 HG1과 HG1 유도체의 항-세균 활성을 나타내며, 표 4는 HG1과 HG1 유도체의 항-진균 활성을 나타내고 있다. 여기에 나타난 바와 같이, 3번째 루신(L)을 글루타민(Q)으로 치환 하였을 때 미생물에 대한 활성은 그대로 유지하면서도 독성은 낮아지는 것은 물론, 혈청 단백질과의 비특이적 결합에 의한 활성 소실의 문제점도 개선되었다. 다만, 진균에 대한 항-진균 활성이 낮아지는 것이 확인되었다.

이에 따라, 본 발명자들은 진균에 대한 활성을 증가시키기 위하여 C-말단에 존재하는 알라닌(A)을 리신(K) 아미노산으로 치환하였다. C-말단에 존재하는 리신(K)은 활성을 증가 시킬 뿐만 아니라 단백질 분해효소에 의한 가수분해에도 안정하기 때문이다.

이에 따른 본 발명은 상기 서열번호2로 기재된 아미노산 서열의 시스테인(Cysteine, C) 잔기가 이황화 결합으로 연결되어 다이머 형태를 갖는 하기 화학식1로 표시되는 항균 펩타이드인 것도 가능하다.

[화학식 1]

그 결과, 상기와 같이 변형된 본 발명에 따른 할로가난은 혈청을 포함한 인간 체액 성분들과의 비특이적 결합에 의한 활성 소실을 일으키지 않으며, 세균 및 진균에 대한 활성이 향상되는 것을 확인하였다.

이러한 본 발명은 비단멍게 체액 세포로부터 분리한 항균 펩타이드인 할로시딘의 일부 아미노산을 변형시킴으로서, 단백질 분해 효소에 대한 저항성과 혈청내에서의 활성을 대폭적으로 개선시킨 변이체 항균 펩타이드 및 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균제를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 그람 양성 및 그람 음성세균, 특히 항생제 내성균에 대한 저항성이 뛰어날 뿐만 아니라, 진균에 대해서도 강력한 항진균 활성을 지니고 있으며, 항균 펩타이드 실용화에 큰 걸림돌인 단백질 분해효소에 의한 가수분해와 혈청 단백질들과의 비특이적인 결합에 기인한 항균활성의 소실의 문제점을 극복한 항균 펩타이드로서 새로운 펩타이드 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 본 발명은 상기한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 또는 방부용 조성물이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 세포독성이 없고, 그람 음성균 및 그람 양성균 뿐만 아니라 진균에 대해서도 우수한 항균 활성을 가지므로, 미생물이 증식할 수 있는 모든 물질 및 식품에 있어서 방부용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다. 상기 용도는 식품의 방부용 조성물에 한정되지 않으며, 화장품 보존제, 의약품 보존제 등 항균 활성이 필요한 모든 물질에 미생물의 증식을 억제하는 보존제 등으로 사용이 가능하다.

또한 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 병원성 세균 감염의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 그람 음성 및 그람 양성균 뿐만 아니라 진균에 대해서도 우수한 항균 활성을 가지고, 세포독성이 없으며, 항균 펩타이드 실용화에 큰 걸림돌인 단백질 분해효소에 의한 가수분해와 혈청 단백질들과의 비특이적인 결합에 기인한 항균활성의 소실의 문제점을 극복할 수 있어서, 항생용 약학적 조성물 또는 병원성 세균 감염의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

상기 본 발명의 항균 펩타이드를 포함하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 항균 펩타이드를 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 국소 투여가 더 바람직하며, 항균 펩타이드의 특성(물질의 크기, 안정성, 최적의 효력)을 고려할 때, 국소적 외용제로 투여하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 항균 펩타이드의 유효용량은 1∼2 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.5∼1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제는 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 항균 펩타이드의 투여 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 그람 음성 및 그람 양성균 뿐만 아니라 진균에 대해서도 우수한 항균 활성을 가지고, 세포독성이 없어서, 항생용 식품첨가제로 유용하게 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 항균 펩타이드는 식품첨가제뿐만 아니라 이를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제로도 유용하게 이용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 항균 펩타이드는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 중의 상기 항균 펩타이드의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 항균 펩타이드를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 항균 펩타이드는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 항균 펩타이드는 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 항균 펩타이드 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 : 할로가난(Haloganan)의 합성

먼저, 자동 고체상 펩타이드 합성기를 사용하여 단량체 펩타이드를 합성하였으며, C18 역상 고압 액체 크로마토그래피(reverse-phase high-pressure liquid chromatography, RP-HPLC)를 사용하여 정확히 합성된 19 mer의 단량체 펩타이드를 정제하였다. 정제한 단량체 펩타이드는 0.1 M 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate) 수용액에 혼합하고, 그 혼합액을 72시간 이상 상온에서 반응시켜 동형-이량체로 합성하였다. 반응 후, RP-HPLC로 동형 이량체로 합성된 할로가난을 재 정제하였다(도 3).

할로가난은 완전 건조 상태에서는 백색 또는 거의 백색의 분말이며, 특별한 결정다형이 존재하지 않는다. 1 mg/mL의 농도로 물, DMF, DMSO, 1%(V/V) 초산, 또는 삼불화초산, 10% 이상의 아세토니트릴 수용액에 용해된다.

MALDI 질량분석기로 분자량을 측정하여 할로가난 펩타이드가 정확히 합성이 되었는지 여부를 확인하였으며, 그 결과, 할로가난의 예상 질량과 MALDI를 통해 측정된 질량이 일치함을 확인하였다(표 5).

실험예 1: 할로가난의 항-세균 활성

할로가난의 항-세균활성 분석은 미국 CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute)에서 규정한 M7-A7의 방법[Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 7th ed. Approved standard M7-A7. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. 2006.]을 변형시킨 마이크로브로스(microbroth) 희석 분석 방법을 통하여 다양한 병원성 세균에 대해 측정하였다. 이를 위하여, 먼저 세균을 MHB (Mueller-Hilton broth)를 이용하여 37℃, 200 rpm에서 밤새 배양하여 정지기(stationary phase)로 만들었다. 상기 배양물을 새로운 MHB로 희석하여 최종 농도가 2×10⁴ 내지 10⁵ 콜로니 형성 단위(CFU)/㎖가 되도록 하였다. 각 펩타이드의 스톡 용액을 0.01% 아세트산에서 640 ㎍/㎖의 농도로 준비하였다. 이후, 상기 펩타이드 용액을 10 ㎍/㎖의 농도가 될 때까지 0.01% 아세트산으로 2배씩 순차적으로 희석하였다. 100 ㎕ 당량의 세균 부유물을 96-웰 플레이트(Costar 3790, Corning, USA)의 각 웰에 분주한 후, 11 ㎕의 펩타이드 용액을 첨가하였다. 37℃에서 18시간동안 배양한 후, 각 웰의 탁도를 확인함으로써 펩타이드의 항균 활성을 평가하였다. 최소발육농도(minimum inhibitory concentration, MIC)는 시험 세균의 성장을 완전하게 억제시키는 최소 농도를 가리킨다.

시험에 사용한 대조 물질은 이전에 항생제로 개발하기 위하여 시도되었던 잘 알려진 항균 펩타이드 2종(MSI-78 [Jacob, L. and Zasloff, M. Potential therapeutic applications of magainins and other antimicrobial agents of animal origin. Ciba Found Symp. 1994. 186: 197-223.], LL-37 [Gudmundsson, G. H., Agerberth, B., Odeberg, J., Bergman, T., Olsson, B. and Salcedo, R. The human gene FALL39 and processing of the cathelin precursor to the antibacterial peptide LL-37 in granulocytes. Eur. J. Biochem. 1996. 238(2): 325-332.])과 현재 임상에서 사용 중인 4종의 상용항생제(Ceftazidine, Teicoplanin, Aztreonam, Ceftriaxone)를 사용하였다.

시험에 사용한 세균들은 서울 여자대학교 항생제 내성균주 은행(Culture Collection of Antimicrobial Resistance Microbes :CCARM)과 미생물자원센터(KCTC, Korean Collection for Type Cultures)에서 분양받은 균주이며, 그람 양성 세균인 메티실린 저항성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin resistant staphylococcus aureus CCARM 3696 : MRSA), 바실러스 서브틸리스(Bacilus subtilis KCTC 2213 : B.s), 마이크로코코스 루테우스(Micrococus luteus KCTC 9341 : M.l), 반코마이신 저항성 장내구균(vancomycin-resistant Enterococcus faecium CCARM 5028 : VRE), 리스테리아 모노시토겐스(Listeria monocytogens ATCC 19111 : L.m)와 그람 음성 세균인 다제내성 녹농균(multidrug resistance pseudomonas aeruginosa CCARM 2161 : MDRPA), 대장균(Escherichia coli KCTC 1039 : E.c), 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca KCTC 1686 : K.o), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii KCTC 2359: C.f), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica KCTC 2930 : C.f)를 사용하였다.

상기 표 6에서 나타난 바와 같이 본 발명의 할로가난은 시험에 사용한 세균들을 4 ㎍/㎖ 농도에서 제어하는 항-세균 할성으로 대조군으로 사용한 항균 펩타이드들과 항생제들 보다 강력한 항균 활성을 나타내었다. 특징적인 것은 현재 병원에서 환자들에게 사용되고 있는 네 종류의 상용 항생제는 특정 병원균에만 편향된 활성을 보였으며, 특히 반코마이신 저항성 장내구균(VRE)에는 네 종류 항생제 모두 실험에 사용된 최대 농도(64 ㎍/㎖)에서도 활성을 나타내지 못하였다. 반면에 본 발명의 할로가난은 시험에 사용한 항생제 저항성 균주들(MRAS, VRE, MDRPA)에 대해서도 고른 항-세균 활성을 나타내었다.

실험예 2 : 할로가난의 항-진균 활성

할로가난의 항-진균활성 분석은 상기의 마이크로브로스(microbroth) 희석 분석 방법과 동일하게 수행되었다. 시험 대상 균주는 인체의 점막이나 피부에 빈번히 감염되는 대표적 피부 진균증 유발 균주인 칸디다 종(Candida spp.)을 사용하였다. 시험 균주는 서울 여자대학교 항생제 내성균주 은행으로부터 임상적으로 분리된 항진균제 저항성 진균들((Candida albicans, CCARM 14024), (Candida albicans, CCARM 50651), (Candida albicans, CCARM 50582), (Candida glabrata, CCARM 50701), (Candida krusei, CCARM 50633))을 분양받아 사용하였다. 균주의 배양은 sabouraud dextrose broth (SDB; Difco, USA) 배지를 사용하여, 30℃, 200 rpm 조건에서 18시간 배양한 후 hemocytometer로 계수하여 2×10³ 콜로니 형성 단위(CFU)/㎖가 되도록 하였다. 이후 시험과정은 상기의 항-세균 시험법과 동일하게 진행되었다.

시험 결과, 하기 표 7에서 나타난 바와 같이 두 대조군 펩타이드들은 항-진균 활성이 약하거나(MSI-78), 거의 없는 반면에(LL-37), 본 발명의 할로가난은 강력한 항-진균 활성을 갖는 것으로 보고 된, 다른 할로시딘 유도체인 HG1 펩타이드와 동등한 항-진균 활성을 보였다.

실험예 3 : 할로가난의 용혈독성

본 발명의 항균 펩타이드의 적혈구 용혈활성을 분석하기 위하여, 소정 농도로 희석한 펩타이드 100 ㎕ 및 10% (v/v) 인간 적혈구 부유액 100 ㎕를 PBS (phosphate-buffered saline)에 혼합하였다. 상기 혼합액을 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 각 튜브에 600 ㎕의 PBS를 첨가하였다. 상기 용액을 10,000g에서 3분 동안 원심분리하여 상층액을 분리한 후, 이를 540 nm에서 흡광도를 측정하였고, 아래의 계산식에 따라 용혈활성(%)을 계산하였다.

이때, 1%의 트리톤-X100을 100% 용혈활성에 대한 양성 대조군으로 사용하였고, 0.01% 아세트산을 용액을 0% 용혈활성에 대한 음성 대조군으로 사용하였다.

적혈구에 대한 용혈 독성은 시험 펩타이드들을 200 ㎍/㎖ 농도부터 2배씩 희석된 농도에서 측정하였다. 시험 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군으로 사용한 HG1은 약 100%에 근접하는 수준의 용혈 독성을 나타내었으나, 본 발명의 할로가난은 시험에 사용한 최대 농도(200 ㎍/㎖)에서도 30% 정도의 용혈 활성을 나타내었다.

실험예 4 : 할로가난의 단백질 분해 효소에 대한 저항성

병원성 미생물에 의한 감염조직은 병원체나 사람 상피조직에서 유래한 다양한 단백질 분해효소들이 존재하며, 이러한 단백질 분해 효소들에 대한 저항성을 확보하지 못한 항균 펩타이드들은 임상에서 치료 효과를 기대할 수 없다. 이에, 본 발명의 할로가난의 단백질 분해 효소에 대한 저항성 분석 시험은 대표적인 단백질 가수분해 효소인 트립신(trypsin)과 키모트립신(chymotrypsin)을 대상으로 수행되었다.

트립신은 400 nM, 키모트립신은 1200 nM을 최대 농도로 하여 2배씩 순차적으로 희석한 용액 50 ㎍ 와 20 ㎍/㎖ 농도로 희석한 펩타이드 용액 40 ㎍를 혼합하고 37℃ 조건에서 10분간 반응 시킨 후, 혼합액에 10⁸ CFU/㎖ 농도의 세균(MRSA)용액 10㎕를 첨가하였다. 37℃ 에서 10분간 반응 시킨 후, 반응액의 일부를 평판 배지에 도말 하였다. 도말된 평판배지는 37℃ 에서 18시간 배양 후 성장한 세균의 집락을 계수하여 단백질 분해 효소에 대한 펩타이드의 영향을 분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 대조군으로 사용한 MSI-78 펩타이드는 급격한 항균 활성의 소실을 나타내는데 반해, HG1과 할로가난 펩타이드는 시험에 사용한 트립신의 최대농도(200 nM)에서만 일부 활성의 소실을 나타냈을 뿐, 거의 원래의 활성을 유지하였다. 이에, 단백질 분해효소와의 반응 시간에 따른 펩타이드들의 저항성 분석을 위하여, 앞서 시험한 방법을 일부 변형하여 추가 시험을 진행하였다. 자세히는, 일정농도의 단백질 분해효소(트립신은 50 nM, 키모트립신은 200 nM)와 펩타이드(8㎍/㎖)를 혼합하고, 37℃ 조건에서에서 정해진 시간(5, 10, 20, 30 그리고 60 분) 동안 반응 하였다. 그런 뒤, 10⁸ CFU/㎖ 농도의 세균(MRSA)용액 10㎕를 가하고, 37℃ 조건에서 10분간 반응 시킨 후, 반응액의 일부를 평판 배지에 도말 하였다. 도말된 평판배지는 37℃ 에서 18시간 배양 후 성장한 세균의 집락을 계수하여 단백질 분해 효소와의 반응시간에 따른 펩타이다드의 영향을 분석하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 대조군으로 사용한 MSI-78 펩타이드는 트립신과는 반응 10분 후부터, 키모트립신과는 5 분 후부터 급격한 활성의 소실을 나타내는데 반해, HG1과 할로가난 펩타이드는 60분간 반응 후에도 본래의 활성을 유지하였다.

실험예 5 : 할로가난의 혈청내에서의 항균활성 분석

사람의 혈청 단백질 결합에 의한 항균 펩타이드의 항균 활성 저하에 대한 실험은 아래와 같이 수행하였다.

항균 펩타이드들은 200 ㎍/㎖에서 6.25 ㎍/㎖까지 두 배씩 희석된 농도가 되도록 PBS (Phosphate-buffered saline)완충 용액을 사용하여 제조하였으며, 펩타이드 용액 100 ㎕를 인간 혈청 100 ㎕와 혼합하여, 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 시료 혼합액은 4℃에서 10분간 10,000g로 원심분리 후에, 상등액 5㎕ 를 반경 확산 분석 방법으로 항균 활성을 측정함으로써, 항균 펩타이드와 인간 혈청 단백질들의 결합 활성을 분석하였다.

인간 혈청 대신에 동량의 PBS 완충용액을 혼합한 시료를 양성대조군으로 하였으며, 세균이 성장하지 못한 명확한 영역(clear zone)의 직경을 units로 표현하였다(0.1 mm = 1 units).

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 비교군인 HG1 펩타이드의 경우에는 혈청내에서 항균활성을 잃은 반면에 본 발명의 할로가난 펩타이드는 혈청내에서도 뛰어난 항균활성을 유지하고 있었다. 따라서, HG1 펩타이드의 항균활성은 매우 우수하지만, 상기 시험결과에서와 같이 HG1 펩타이드는 인간의 혈청 단백질과 결합함으로써 항균활성을 완전히 소실하여 실제 임상에 적용시 혈액 성분이 없는 환부에만 사용 가능하다는 한계를 가지고 있다. 반면에, 본 발명의 할로가난 펩타이드는 그러한 혈청 단백질들과의 비특이적인 결합 반응이 일어나지 않으므로 임상에서 보다 다양한 환부에 적용할 수 있음을 확인하였다.

실험예 6 : 할로가난의 인간 상처 삼출액내에서의 항균활성 분석

인간 상처 삼출액(Human wound fluid, HWF)은 혈청종이 원인으로 발생한 개방성 창상 환자 4명으로부터 얻었으며, 상처 삼출액의 혈구와 같은 부유물은 원심분리(12,000g, 10분)방법으로 제거 후 사용하였다. 시험은 사람 상처 삼출액에 펩타이드와 세균을 혼합하여 살아남은 세균의 수를 계측하는 방법으로 진행 하였으며, 자세히는 다음과 같다.

사람 상처 삼출액 50 ㎕ 를 250 ㎍/㎖ 농도의 펩타이드 용액 40 ㎕와 혼합하고, 1 X 10⁸cfu/ml 농도의 MRSA 세균 10 ㎕를 가하여, 37℃ 조건에서 10분 반응 시킨 후, 반응액 가운데 50 ㎕를 평판 배지에 도말 하였다. 도말된 평판배지는 37℃ 에서 18시간 배양 후 성장한 세균의 집락을 계수하여 사람 상처 삼출액에 대한 펩타이드의 영향을 분석하였다. 본 시험에서는 대조군은 펩타이드를 넣지 않고 완충용액을 가한 시료를 음성 대조군으로 하였으며, HG1 펩타이드와 MSI-78 펩타이드를 대조 펩타이드로 사용하였다.

4명의 환자로부터 얻은 상처 삼출액(HWF)은 각각 개별적으로 시험되었으며, 그 결과는 도 8에 나타난 바와 같다. 앞선 혈청내에서의 항균 활성시험과 유사하게 비교군인 HG1 펩타이드와 MSI-78 펩타이드의 경우에는 항균활성을 거의 나타내지 못한 반면에 본 발명의 할로가난 펩타이드는 사람 상처 삼출액이 존재하는 조건에서도 뛰어난 항균활성을 유지하고 있었다.

<제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 정제(직접 가압)

항균 펩타이드 5.0mg을 체로 친 후, 락토스 14.1mg, 크로스포비돈 USNF 0.8mg 및 마그네슘 스테아레이트 0.1mg을 혼합하고 가압하여 정제로 제조하였다.

<1-2> 정제(습식 조립)

항균 펩타이드 5.0mg을 체로 친 후, 락토스 16.0mg과 녹말 4.0mg을 섞었다. 폴리솔베이트80 0.3mg을 순수한 물에 녹인 후 이 용액의 적당량을 첨가한 다음, 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후 콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7mg 및 마그네슘 스테아레이트 2.0mg 과 섞었다. 미립을 가압하여 정제로 제조하였다.

<1-3> 분말과 캡슐제

항균 펩타이드 5.0mg을 체로 친 후에, 락토스 14.8mg, 폴리비닐 피롤리돈 10.0mg , 마그네슘 스테아레이트0.2mg 와 함께 혼합하였다. 상기 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.

<1-4> 주사제

항균 펩타이드 100mg을 함유시키고, 그 밖에도 만니톨 180mg, Na2HPO412H2O 26mg 및 증류수 2974mg를 함유시켜 주사제를 제조하였다.

<제조예 2> 식품의 제조

<2-2> 항균용 식품의 제조

항균 펩타이드 100 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 항균용 식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 항균용 식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<2-2> 항균용 보조음료의 제조

항균 펩타이드 100 ㎎

구연산 100 ㎎

올리고당 100 ㎎

매실농축액 2 ㎎

타우린 100 ㎎

정제수를 가하여 전체 500 ㎖

통상의 보조음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 1 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

Claims

서열번호1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 3번째 아미노산에 위치한 루신(Leucine, L)이 글루타민(Glutamine, Q)으로 치환되고, C-말단으로부터 1번째 아미노산에 위치한 알라닌(Alanine, A)이 리신(Lysine, K)으로 치환된 항균 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 서열번호2의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드.
제2항의 서열번호2로 기재된 아미노산 서열의 시스테인(Cysteine, C) 잔기가 이황화 결합으로 연결되어 다이머 형태를 갖는 하기 화학식1로 표시되는 항균 펩타이드.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 그람 음성균 및 그람 양성균에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 단백질 분해효소에 대하여 저항성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 인간 혈청 내에서 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 인간 상처 삼출액(Human wound fluid, HWF) 내에서 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 또는 방부용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항생용 약학적 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항생용 식품 첨가제.