JP2019523211A

JP2019523211A - 病原菌に対する抗生活性を有するペプチド及びこれを含む抗生ペプチド組成物

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Publication number: JP2019523211A
Application number: JP2017510404A
Authority: JP
Inventors: ヨンエキム; ジスンキム; ジホジョン
Original assignee: ハンククユニバーシティオブフォーリンスタディーズリサーチアンドビジネスファウンデーション
Priority date: 2016-04-26
Filing date: 2016-05-25
Publication date: 2019-08-22
Anticipated expiration: 2036-05-25
Also published as: US20180170965A1; JP6820251B2; KR20170122026A; US10150795B2; KR101847051B1; WO2017188498A1

Abstract

本発明の下記配列［一般式Ｉ］で表現される抗生ペプチド及びこれを含む抗生ペプチド組成物は、２３個のアミノ酸配列よりなる抗生能を有する野生型ＬＰｃｉｎ−Ｉに比べてグラム（＋）菌株及びグラム（−）菌株に対して顕著に高い抗菌活性を有する。また、野生型ＬＰｃｉｎ−Ｉに比べてアミノ酸の個数が少ないので、合成が容易であるだけなく、生産費用を節減するのに非常に有利である。［一般式Ｉ］［（Ｎ−末端）−ＮＫＶＫＥＷＸ１ＫＸ２ＬＫＸ３Ｘ４ＦＸ５−（Ｃ−末端）］ここで、Ｘ１はＩ又はＷであり、Ｘ１がＩであれば、Ｘ２はＹであり、Ｘ１がＷであれば、Ｘ２はＷであり、Ｘ３はＳ又はＫであり、Ｘ４はＬ又はＫであり、Ｘ５はＳ又はＫである。

Description

本出願は、２０１６年４月２６日に出願された韓国特許出願第１０−２０１６−００５１０７３号を優先権として主張し、前記明細書全体は、本出願の参考文献である。

本発明は、病原菌に対する抗生活性を有するペプチド及びこれを含む抗生ペプチド組成物に関し、より詳細には、抗生能を有するＬＰｃｉｎＩペプチドのうち一部のアミノ酸を欠失及び／又は置換し、抗生能力を顕著に増大させたＬＰｃｉｎＩペプチド由来の病原菌に対する抗生活性を有するペプチド及びこれを含む抗生ペプチド組成物に関する。

微生物の侵入に対する昆虫の防御機作に関する研究結果から、かいこの幼虫で新しいペプチド抗生剤であるセクロピンが発見されて以来、生理活性物質としてペプチドの重要性が大いに認識されている。最近、数年間の研究の結果、ほぼすべての高等生物が病原性微生物に対する防御手段として、免疫体系と別途の抗生ペプチドを体内に蓄積するか、又は分泌するものと知られている。現在まで約２，０００種以上のペプチド抗生剤が発見されており、これらペプチドは、発見された種ごとにそのアミノ酸組成が異なっているが、抗生作用機作は類似なものと知られている。代表的な抗生ペプチドとして、セクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）、マガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）、ボムビニン（ｂｏｍｂｉｎｉｎ）、ディフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）、タキプレシン（ｔａｃｈｙｐｌｅｓｉｎ）及びブホリン（ｂｕｆｏｒｉｎ）などが知られたが、これら抗生ペプチドは、共通に、１７〜２４個のアミノ酸で構成されており、グラム−陰性菌及びグラム−陽性菌だけでなく、原核生物又はかびなどに対しても抗生力を有し、一部は、癌細胞とウイルスにも効果があるものと知られている。

特に、前記ペプチド抗生剤のうちマガイニンは、両生類の表皮から分離した２３個のアミノ酸組成を有するペプチド（Ｚａｓｌｏｆｆ、Ｍ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、ｐｐ５４４９−５４５３、１９８７）であって、病原菌だけでなく、人体の肺癌細胞にも作用するものと報告された。また、抗生ペプチドの大部分は、特異的に細胞に作用して目的細胞を迅速に殺し、大部分広い範囲で活性スペクトルを示す（Ｐａｒｋ、Ｃ．Ｂ．ｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２１８、ｐｐ４０８−４１３、１９９６）。

前記抗生ペプチドは、第一に、広範囲な微生物に対して強力な抗生力を有する。第二に、宿主細胞は破壊せず、外部から侵入した病原菌にのみ作用し、人体に無害な抗生物質として作用する。第三に、微生物の耐性誘発が問題視されている従来の抗生剤とは全然異なる活性機作で抗生活性を示すので、耐性誘発の可能性が少ない。第四に、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）のような２次変形（ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）がないため、遺伝子組み換えを通じて大量生産できる。第五に、熱、酸又はアルカリなどに強い理化学的安定性を有している。そのため、製薬及び食品分野においての産業的利用性が非常に大きいという長所を有する。

現在まで報告された抗生ペプチドの作用機作は、大きく、二つに分類される。第一に、大部分の抗生ペプチドは、菌の細胞膜の透過性を増加させて、膜電位を破壊し、細胞代謝を中止させる作用機作を有する。第二に、その他の少数の抗生ペプチドは、菌細胞内に浸透し、ＤＮＡ又はＲＮＡと結合し、転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）又は翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を抑制する強力な作用機作を示す。

これら抗生ペプチドの活性に重要であると知られた構造的な要素としては、次のようなものなどがある。第一に、両親媒性螺旋構造（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃｈｅｌｉｘ）、第二に、前記螺旋構造を安定化させる残基の分布、第三に、塩基性残基の分布、第四に、疎水性残基の分布、第五に、電荷を帯びる残基と螺旋構造の双極子間の相互作用、及び第六に、反対電荷を帯びる残基間の塩橋が挙げられる。

なお、牛の牛乳に存在するラクトフォリシン（ＬＰｃｉｎ−Ｉ）は、２３個のアミノ酸残基を有する陽イオン、両親媒性ペプチドであって、ＰＰ３のカルボキシ末端１１３〜１３５領域である。ＬＰｃｉｎ−Ｉは、グラム−陽性菌とグラム−陰性菌の両方の成長を抑制するが、２００μＭ以下の濃度で溶血作用が現われない。ＬＰｃｉｎ−Ｉと反対に、ＰＰ３のアミノ酸１１９〜１３５領域に該当するＬＰｃｉｎ−ＩＩは、抗生機能がないと知られている。

ところが、抗生能があるものと知られたＬＰｃｉｎ−Ｉを商業化するために野生型ＬＰｃｉｎ−Ｉより高い抗生能及び製造コストを低減する必要があり、そのために、さらに短いアミノ酸配列よりなる抗生ペプチドを製造する技術開発がますます要求されている。

本発明は、前述した問題を解決するためになされたものであって、本発明の一番目に解決しようとする課題は、２３個のアミノ酸よりなる野生型ラクトフォリシン（ＬＰｃｉｎ−Ｉ）抗生ペプチドに比べて、アミノ酸配列の個数は少ないながらも、抗生力が顕著に向上した病原菌に対する抗生活性を有するペプチドを提供することにある。

本発明の二番目に解決しようとする課題は、本発明の抗生ペプチドを有効成分として含む抗生組成物を提供することにある。

本発明の一番目の課題を解決するために、本発明は、病原菌に対する抗生活性を有する下記配列一般式Ｉで表現されるペプチドを提供する。

［一般式Ｉ］
［（Ｎ−末端）−ＮＫＶＫＥＷＸ^１ＫＸ^２ＬＫＸ^３Ｘ^４ＦＸ^５−（Ｃ−末端）］

ここで、Ｘ^１はＩ又はＷであり、Ｘ^１がＩであれば、Ｘ^２はＹであり、Ｘ^１がＷであれば、Ｘ^２はＷであり、Ｘ^３はＳ又はＫであり、Ｘ^４はＬ又はＫであり、Ｘ^５はＳ又はＫである。

また、本発明は、病原菌に対する抗生活性を有する前記配列［一般式Ｉ］で表現されるペプチドの用途を提供する。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記ペプチドは、一般式ＩでＸ^３Ｘ^４ＦＸ^５又はＦＸ^５が欠失されたものであることができる。

本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記ペプチドは、配列番号１〜１０の中から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列を含むことができる。

本発明の二番目の課題を解決するために、本発明の抗生ペプチドを有効成分として含む抗生ペプチド組成物を提供する。

また、本発明は、前記抗生ペプチドを有効成分として含む抗生ペプチド組成物の用途を提供する。

本発明の好ましいさらに他の一実施例によれば、前記抗生活性は、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）よりなる群から選択されるいずれか一つ以上の菌に対する抗生活性であることができる。

本発明の抗生ペプチド及びこれを含む抗生ペプチド組成物は、２３個のアミノ酸配列よりなる抗生能を有する野生型ＬＰｃｉｎ−Ｉに比べてグラム（＋）菌株及びグラム（−）菌株に対して顕著に高い抗菌活性を有する。また、抗生ペプチドは、薬物伝達過程でアミノ酸の長さが短いほど生体内で消化されず、必要な所まで運搬されることが容易である。ひいては、野生型ＬＰｃｉｎ−Ｉに比べてアミノ酸の個数が少ないので、合成が容易であるだけでなく、生産費用を節減するのに非常に有利である。

一つのグラム−陽性菌（ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＡＴＣＣ６５３８）と二つのグラム−陰性菌（ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＡＴＣＣ１９４３０及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫＣＴＣ１６８２）で構成される３種の微生物に対して抗生活性試験を行った結果を示す写真である。二つのグラム−陽性菌（ＬｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａＭＣ２ＫＣＴＣ３６５８ａｎｄＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＡＴＣＣ６５３８）と三つのグラム−陰性菌（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＡＴＣＣ２７８５３、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＡＴＣＣ１９４３０、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫＣＴＣ１６８２）に対する最小抑制濃度を測定したグラフ及び図表である。

以下、本発明をより詳しく説明する。
前述したように、牛の牛乳に存在するラクトフォリシン（ＬＰｃｉｎ−Ｉ）は、２３個のアミノ酸残基を有する陽イオン、両親媒性ペプチドであって、ＰＰ３のカルボキシ末端１１３〜１３５領域である。ＬＰｃｉｎ−Ｉは、グラム−陽性菌とグラム−陰性菌の両方の成長を抑制するが、２００μＭ以下の濃度で溶血作用が現われない。ところが、抗生能があるものと知られたＬＰｃｉｎ−Ｉを商業化するために、野生型ＬＰｃｉｎ−Ｉより高い抗生能及び製造コストを低減する必要があり、そのために、さらに短いアミノ酸配列よりなる抗生ペプチドを製造する技術開発がますます要請されている。

これより、本発明の一実施例による本発明の一番目の課題を解決するために、本発明は、病原菌に対する抗生活性を有する下記配列一般式Ｉで表現されるペプチドを提供し、前述した問題の解決をはかった。これを通じて、本発明の抗生ペプチド及びこれを含む抗生ペプチド組成物は、２３個のアミノ酸配列よりなる抗生能を有する野生型ＬＰｃｉｎ−Ｉに比べて、グラム（＋）菌株及びグラム（−）菌株に対して顕著に高い抗菌活性を有する。また、野生型ＬＰｃｉｎ−Ｉに比べてアミノ酸の個数が少ないので、合成が容易であるだけなく、生産費用を節減するのに非常に有利である。

本発明で使用されたアミノ酸配列は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法によって次のように略語で記載した。

アラニンＡ、アルギニンＲ、アスパラギンＮ、アスパルト酸Ｄ、システインＣ、グルタミン酸Ｅ、グルタミンＱ、グリシンＧ、ヒスチジンＨ、イソロイシンＩ、ロイシンＬ、リシンＫ、メチオニンＭ、フェニルアラニンＦ、プロリンＰ、セリンＳ、スレオニンＴ、トリプトファンＷ、チロシンＹ、バリンＶ。

本発明の一般式Ｉで、Ｘ^１は、Ｉ、Ｗ又は無極性アミノ酸であることができ、Ｘ^１がＩであれば、Ｘ^２はＹであり、Ｘ^１がＷであれば、Ｘ^２はＷである。

なお、本発明において無極性アミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）で構成される。極性アミノ酸は、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）で構成される。酸性アミノ酸は、アスパルト酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）で構成され、塩基性アミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）で構成される。

なお、本発明の好ましい一実施例によれば、前記ペプチドは、Ｃ−末端からＸ^３Ｘ^４ＦＸ^５又はＦＸ^５が欠失されたものであることができる。具体的に、本発明の配列番号９〜１１で表示される抗菌ペプチドは、ＦＸ^５が欠失された抗菌ペプチドであり、配列番号１２で表示される抗菌ペプチドは、Ｘ^３Ｘ^４ＦＸ^５が欠失された抗菌ペプチドである。これら配列番号１〜１２よりなる抗菌ペプチドは、野生型ＬＰｃｉｎ−Ｉ（配列番号１３）に比べて顕著に優れた抗菌活性を示す（実験例２参照）。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記ペプチドは、配列番号１〜１０の中から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列を含むことが、製作コストを節減し、優れた抗菌活性を示すのに非常に有利である（実験例１参照）。最も好ましくは、本発明において優れた抗菌活性を示す抗菌ペプチドは、ＹＫ５（配列番号３）、ＹＫ８（配列番号６）及びＹＫ１１ペプチド（配列番号９）であることができる。

本発明の抗菌ペプチドＹＫ５、ＹＫ８及びＹＫ１１は、ＹＫ３と比べてさらに低い濃度で言及した前記５種の菌株を効果的に抑制できるので、さらに経済的である。また、ＹＫ１１は、アミノ酸配列がＹＫ３より２ｍｅｒ少なく含まれていて、商業的に製造するのに経済的な利点がある。

なお、本発明の好ましい一実施例によれば、前記配列番号１３で表示される２３個のアミノ酸よりなるＬＰｃｉｎ−Ｉペプチドは、通常のペプチド合成方法を通じて製作され得る。具体的に、自動ペプチド合成器を通じて製作されるか、又は組換え発現ベクターを製作し、これを精製して製作され得る。組換え発現ベクターを通じてＬＰｃｉｎ−Ｉ抗生ペプチドを合成する方法に関する韓国特許出願第２００８−１３０５９３号は、本発明に参照として挿入される。

また、Ｆｍｏｃ（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）をアミノ基保護用基として利用するメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）の液相固相法を用いて合成できる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、ＲＢ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５、２１４９、１９６３）。

また、本発明の好ましい一実施例によれば、配列番号１〜１０でアミノ酸配列で表示される抗生ペプチドは、配列番号１３の抗生ペプチドの製作と同様に、通常の方法によって製作できる。これを通じて製作された本発明の抗生ペプチドは、グラム（＋）菌株、グラム（−）菌株などに対して高い抗生活性を有し、これらの代表的な菌株である二つのグラム−陽性菌（ＬｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａＭＣ２ＫＣＴＣ３６５８及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＡＴＣＣ６５３８）と三つのグラム−陰性菌（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＡＴＣＣ２７８５３、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＡＴＣＣ１９４３０、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫＣＴＣ１６８２）に対して高い抗生活性を有するが、これに制限されるものではない。

また、本発明は、前記抗生ペプチドを有効成分として含有する抗生組成物に関する。本発明の抗生ペプチドを有効成分として含有する抗生剤は、抗生剤、抗真菌剤、食品防腐剤、化粧品保存剤、外傷治療剤、目薬及び医薬品保存剤の添加剤などに有用に使用され得る。

本発明の抗生ペプチドは、臨床投与時に非経口で投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態で使用され得る。本発明の抗生ペプチドは、実際に非経口のさまざまな剤形で投与されることができ、製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使用して調剤できる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用され得る。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用され得る。

また、本発明の抗生ペプチドは、生理食塩水又は有機溶媒のように、薬剤として許容された様々な伝達体（ｃａｒｒｉｅｒ）と混合して使用でき、安定性や吸水性を増加させるために、グルコース、スクロース又はデキストランのようなカーボーハイドレート、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ）又はグルタチオンのような抗酸化剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）、キレート物質（ｃｈｅｌａｔｉｎｇａｇｅｎｔｓ）、低分子タンパク質又は他の安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ）を薬剤として使用できる。

本発明の抗生ペプチドの有効容量は、０．１〜３ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは０．５〜１ｍｇ／ｋｇであり、一日に１〜３回投与され得る。

本発明の抗生ペプチドを有効成分として含有する抗生剤は、巨丸（ｂｏｌｕｓ）形態あるいは相対的に短い期間の間に拡散（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）などによって単一投与量（ｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅ）で患者に投与されることができ、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅ）が長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与され得る。

本発明の抗生ペプチドの投与濃度は、薬の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢及び健康状態など多様な要因を考慮して患者の有効投与量が決定されるので、このような点を考慮するとき、この分野における通常の知識を有する者であれば、適切な有効投与量を決定できる。

また、本発明の好ましい一実施例によれば、本発明の抗生ペプチドを有効成分として含有する飼料組成物を提供する。この場合、有効容量は、飼料１ｋｇに対して０．０１〜１００ｍｇが含有されることができ、一日に１〜３回投与され得る。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明だろう。

［実施例１］
新規な抗菌ペプチドの製造
自動ペプチド合成器（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ９０５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）を利用して下記表１に記載した配列のペプチドを合成し、これら合成されたペプチドをｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ逆相高分解能液体クロマトグラフィー（ＳｈｉｓｅｉｄｏｃａｐｃｅｌｌｐａｋＣ１８ｃｏｌｕｍｎを使用したＳｈｉｍａｄｚｕＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅＨＰＬＣ）を利用して純粋分離した。

下記表１で、配列番号１１番は、２３個のアミノ酸配列を有する野生型ＬＰｃｉｎ−Ｉ抗生ペプチドである。また、配列番号１番〜６番は、１５個のアミノ酸配列を有する抗生ペプチド配列である。また、配列番号７番〜９番は、１３個のアミノ酸配列を有する抗生ペプチド配列である。また、配列番号１０番は、１１個のアミノ酸配列を有する抗生ペプチド配列である。

［実施例２］
抗菌活性測定実験
前記実施例１で合成した１〜１１番の１１個のペプチドに対して抗生活性を測定した。具体的に、微生物に対する抗生活性は、ブレインハートインフュージョン（Ｂｒａｉｎｈｅａｒｔｉｎｆｕｓｉｏｎ）ａｇａｒ（ＢａｃｔｏＴＭ）を使用して行った。二つのグラム−陽性菌（ＬｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａＭＣ２ＫＣＴＣ３６５８及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＡＴＣＣ６５３８）と三つのグラム−陰性菌（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＡＴＣＣ２７８５３、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＡＴＣＣ１９４３０、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫＣＴＣ１６８２）の五つの微生物に対して寒天ディスク拡散（ａｇａｒｄｉｓｃｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）テストを基礎にした。接種源は、３７℃、３．７％ブレインハートインフュージョン（Ｂｒａｉｎｈｅａｒｔｉｎｆｕｓｉｏｎ）５ｍｌでバクテリアを一晩培養するものを準備した。懸濁液の混濁程度は、６００ｎｍで分光光度計で０．０５標準濁度液（１ｘ１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）のように最終濃度を調節した。２０ｍｌのブレインハートインフュージョン（Ｂｒａｉｎｈｅａｒｔｉｎｆｕｓｉｏｎ）寒天をφ９０ｍｍの細胞培養プレートに塗布した。寒天（Ａｇａｒ）プレートに滅菌されたスプレッダー（ｓｐｒｅａｄｅｒ）を使用して３０ｕｌのバクテリア懸濁液を接種させた。接種された寒天プレートは、３０分間常温で乾燥した。寒天プレートの表面に滅菌された６ｍｍのろ紙（ＷｈａｔｍａｎＮｏ．１）を位置させ、抗生ペプチドは、１０ｍＭの濃度で滅菌物にとかして、２０ｕｌの溶液をろ紙に接種させた。常温で３０分間ｐｒｅ−ｄｉｆｆｕｓｉｏｎをさせた後、プレートを３７℃で２４時間培養した。２４時間が経過した後、ろ紙周辺のバクテリア群の成長抑制直径を測定することによって、バクテリア群に対する抗生ペプチドの敏感度は、バクテリア生長を抑制する領域のサイズと除去した程度によって決定した。測定は、２回繰り返して行われた。

図１は、２４時間が経過した後に観察した寒天ディスク拡散（ａｇａｒｄｉｓｃｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）テスト結果を示す写真である。このうち、ＹＫ３は、韓国特許出願第２０１１−００４９５３８号に記載した方法によって抗生活性を有するペプチドであって、新しいペプチドとの比較のために実施された。

［実施例３］
細胞毒性実験
ＣｙｔｏＸＴＭｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙａｓｓａｙｋｉｔ（ＬＰＳｓｏｌｕｔｉｏｎ）試験法を利用して細胞毒性実験を実施した。９６−ウェル細胞培養プレートは、ｃｏｒｎｉｎｇ社から購入し、哺乳細胞株は、ＡＴＣＣから購入した。また、ＣｙｔｏＸＴＭ細胞可視分析キットは、ＬＰＳｓｏｌｕｔｉｏｎから購入した。

実験方法としては、凍結保管した細胞を解凍し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ１６４０培地に培養した後、細胞の密度が８０〜９０％に到逹するとき、２〜３日間隔で継代培養を実施した。実験のために、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを処理し、細胞を取り外した後、細胞の個数が１０，０００個になるように、９６−ウェルに分注した。その後、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。準備したペプチドをＤＭＳＯに希釈し、１０、１、０．１、０．０１、０．００１ｍＭの濃度で準備した後、それぞれのウェルにＤＭＳＯ又は用意したペプチドを１μｌずつ添加することによって、１／１００倍希釈して処理されるようにした。その後、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。細胞毒性を測定するために、ＣｙｔｏＸＴＭ細胞可視分析キット（ＬＰＳｓｏｌｕｔｉｏｎ）に準備したペプチドを１０μｌでそれぞれのウェルに添加した。３７℃のＣＯ_２インキュベーターで１〜４時間培養した後、マイクロプレートリーダー機を利用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。その後、得られた結果をＤＭＳＯに対して測定値のパーセント値を求め、ＧｒａｐｈＰａｄｐｒｉｓｍ５でグラフを描いた後、ＩＣ５０値を求めた。

４種のペプチド（ＹＫ３、ＹＫ５、ＹＫ８及びＹＫ１１）に対する多様な哺乳動物細胞株においてＩＣ５０値は、下記表２に記載した通りである。４種のペプチドによるＩＣ５０がそれぞれの細胞株において１０μＭ以上であれば、一般細胞毒性がないものと判断され、下記４種のペプチドは、一般細胞毒性に対して安全なものと確認された。

特に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株に４種のペプチドを処理したとき、ＹＫ３ペプチドは、５６．２ｕＭでＩＣ５０値を示したが、ＹＫ５、ＹＫ８及びＹＫ１１ペプチドは、これより高い値である５７．０、７１．９及び８６．８ｕＭのＩＣ５０値を示した。すなわち、ＹＫ５、ＹＫ８及びＹＫ１１ペプチドがＹＫ３ペプチドよりさらに低い細胞毒性を呈するものと確認された。

［実施例４］
最小抑制濃度測定実験
抗菌アッセイは、標準ブロス微量希釈法（ｂｒｏｔｈｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）を利用して最小抑制濃度（ｍｉｎｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＭＩＣ）値を測定することによって行った。各ペプチドの抗菌活性は、二つのグラム−陽性菌（ＬｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａＭＣ２ＫＣＴＣ３６５８及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＡＴＣＣ６５３８）と三つのグラム−陰性菌（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＡＴＣＣ２７８５３、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＡＴＣＣ１９４３０、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫＣＴＣ１６８２）を利用して行った。この５種の菌を５０μｌで準備した後、５ｍｌの３．７％ＢＨＩに混合し、一晩３７℃、２４０ｒｐｍ条件で培養した。その後、培養された菌５０μｌを５ｍｌの３．７％ＢＨＩに混合し、２時間、３７℃、２４０ｒｐｍ条件で培養した。培養した菌は、０．０３７％ＢＨＩ溶液で希釈し、１×１０^８ＣＦＵ／ｍｌの濃度で準備した。

溶解させた合成ペプチドを９６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅでＢＨＩＢで２倍ずつ段階希釈した。多様な濃度の合成ペプチド１００μｌと希釈して準備したそれぞれの菌５μｌを９６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ（ｍｉｃｒｏｒｅａｄｅｒｐｌａｔｅ）で混合した後、３７℃で１２時間振とう培養した。培養後、ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＲｅａｄｅｒＭｕｌｔｉｓｋａｎＦＣ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して６００ｎｍで吸光度の変化を測定し、ＭＩＣの範囲は、細菌の成長が抑制され始めるペプチドの最も低い濃度にした。ＭＩＣだけでなく、対照群と比較して細菌の成長が５０％になる半数抑制濃度（ＨａｌｆｍａｘｉｍａｌＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＩＣ５０）を確認した。溶媒対照群としてペプチドを含まないＢＨＩＢ溶液１００μｌを菌５μｌと混合し、実験群と同一の方法で行った。実験の正確性のために、本実験は３回繰り返して行った。

その結果、下記図２に示されたように、実験に使用された病原菌に対してすべてのペプチドが抗菌活性を示した。特に、ＹＫ３ペプチドよりＹＫ５、ＹＫ８及びＹＫ１１ペプチドがより低い濃度で効果的に５種の菌に対して抗菌活性を示した。

以上説明したように、本発明で製造した抗生ペプチドは、グラム−陽性菌及びグラム−陰性菌の両方で優れた抗菌作用を示し、人体に安全であるため、飼料添加剤、食品防腐剤、化粧品及び医薬品保存剤、傷治療促進剤、外傷治療剤、口腔清浄剤及び目薬などの用途に有用に使用され得る。

Claims

病原菌に対する抗生活性を有する下記配列［一般式Ｉ］で表現されるペプチド：
［一般式Ｉ］
［（Ｎ−末端）−ＮＫＶＫＥＷＸ^１ＫＸ^２ＬＫＸ^３Ｘ^４ＦＸ^５−（Ｃ−末端）］
ここで、Ｘ^１はＩ又はＷであり；Ｘ^１がＩであれば、Ｘ^２はＹであり、Ｘ^１がＷであれば、Ｘ^２はＷであり；Ｘ^３はＳ又はＫであり；Ｘ^４はＬ又はＫであり；Ｘ^５はＳ又はＫである。
前記ペプチドは、一般式ＩでＸ^３Ｘ^４ＦＸ^５又はＦＸ^５が欠失されたことを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、配列番号１〜１０の中から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
請求項１〜３のいずれかに記載の抗生ペプチドを有効成分として含有する抗生ペプチド組成物。
前記抗生活性は、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）よりなる群から選択されるいずれか一つ以上の菌に対する抗生活性であることを特徴とする請求項４に記載の抗生ペプチド組成物。
病原菌に対する抗生活性を有する下記配列［一般式Ｉ］で表現されるペプチドの用途：
［一般式Ｉ］
［（Ｎ−末端）−ＮＫＶＫＥＷＸ^１ＫＸ^２ＬＫＸ^３Ｘ^４ＦＸ^５−（Ｃ−末端）］
ここで、Ｘ^１はＩ又はＷであり；Ｘ^１がＩであれば、Ｘ^２はＹであり、Ｘ^１がＷであれば、Ｘ^２はＷであり；Ｘ^３はＳ又はＫであり；Ｘ^４はＬ又はＫであり；Ｘ^５はＳ又はＫである。
請求項６に記載の抗生ペプチドを有効成分として含有する抗生ペプチド組成物の用途。