KR20100123272A - 강력한 항 감염성 활성을 갖는 사람-락토페리신 단백질 단편 생산 재조합 균주 및 그 균주를 이용한 사람-락토페리신 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람 초유에 함유 되어있는 락토페린 내에 존재하는 락토페리신 펩티드 유전인자를 Modified magainin intervening sequence(이하 MMIS) 유전인자와 융합시켜 재조합 DNA를 제작하는 것을 목적으로 한다. 융합 인자 MMIS를 연결시켜 줌으로써 일시적으로 사람 락토페리신의 독성을 낮추고 그에 따라 대장균(E. coli) 내에서 인간 펩티드인 락토페리신의 발현 및 과발현 할 수 있는 재조합 DNA를 제작하는 방법에 관한 것으로, 융합인자로 사용하는 MMIS는 아미노산 서열 중 음이온을 띄는 아스파테이트(aspartate, D), 글루타메이트(glutamate, E)를 각각 4개씩 갖고 있다. 반면, 락토페리신 아미노산 서열에는 아르기닌(arginine, R), 라이신(lysine, K)가 각각 8개,3개를 갖고 있다. 이러한 Cationic 성질을 MMIS의 음이온과 부분적으로 극성을 중화시켜 락토페리신의 펩티드 2차 구조를 변형시키고 그에 따라 락토페리신의 강력한 항 감염성 활성을 낮추게 된다. 따라서 숙주인 그람 음성균에 해당하는 대장균을 사멸시키지 않고 발현 또는 과발현할 수 있다. 그러므로 본 발명은 상기 재조합 벡터 시스템이 균주 내에 도입된 MMIS-사람 락토페리신 생산 재조합 균주를 이용하여, 사람락토페리신을 생산할 수 있는 뛰어난 효과를 나타낸다.

사람락토페리신, 재조합균주, 항감염성펩티드

Description

강력한 항 감염성 활성을 갖는 사람-락토페리신 단백질 단편 생산 재조합 균주 및 그 균주를 이용한 사람-락토페리신 생산방법 {Strain developement and production method of Human lactoferricin peptide production strain which produces strong anti-bacterial activity}

본 발명은 재조합벡터 시스템이 균주 내에 도입된 MMIS-사람 락토페리신 생산 재조합 균주를 이용하여 사람 락토페리신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

사람 유래-락토페리신(human lactoferricin, Lfcin H)은 사람 락토페린 중 항 감염성 활성을 갖는 단백질 도메인에 포함되어 있는 일부분으로서 147bp에 해당하며 펩티드 크기은 49개 아미노산으로 구성된다. 현재 발명된 시스템에 의해 발현되어지는 monomer MMIS-사람 락토페리신의 분자량은 10KDa에 해당한다. 사람 유래 락토페리신은 지금 까지 알려진 다른 동물 유래 락토페리신에 비해 항 감염성(항균성, 항 바이러스성) 활성이 매우 높은 것으로 확인 되었다.

한편, 항 감염성 펩타이드의 대표인 포유류 락토페리신은 그람 음성균(Gram-negative bacteria)의 외막을 가로질러 끼어들어가게 된다. 이는 음이온을 띄고있는 LPS(lipopolysaccharide)를

락토페리신이 인식하게 되면서 외막을 벌리게 된다. 한번 periplasmic space로 들어간 펩타이드는 cytoplasm membrane을 이동할 수 있게 된다. 결국 락토페리신은 그람음성균 종의 endotoxic shock를 유도하게 된다. 이러한 원리에 의해 락토페린 내의 락토페리신은 다양한 병원성 균들을 사멸시켜 포유류의 면역력 증진 작용을 하는 것으로 알려졌다.

현재, 락토페리신에 대한 연구 및 생산 방법에 있어서 사람 유래 락토페리신에 대한 연구는 매우 미미한 편이며, 지금까지 연구된 항 감염성 펩티드로는 소, 염소, 돼지 등 동물 유래 락토페리신의 형질 전환 균에서의 발현이었다. 그에 관련된 논문으로는 “Expression of the cationic antimicrobial peptide lactoferricin fused with the anionic peptide in Escherichia coli” (Appl Microbiol Biotechnol (2006) 72: 330.338)와 “Methylotrophic Yeast, Pichia pastoris에서 사람 락토페린의 발현 및 항균성 연구” (The Korean Journal of Microbiology, Vol. 40, N0. 4, December 2004, p. 348-354)가 있다. 선행 특허로는 소 유래 락토페리신과 관련되어서 미국특허 7,186,795에 개시된 ‘Lactoferricin gene and transformant expressing lactoferricin’이 있다.

그러나, 동물 유래 락토페린 및 락토페리신의 박테리아 내에서의 발현과 더불어 항 감염성 및 항염증 활성이 입증된 바 있으나 현재까지는 사람 락토페린 및 사람 락토페리신의 형질 전환 균(E.coli)내에서 발현 및 생산 방법에 대해서는 전혀 알려진 바 없다.

이에 본 발명은 상기 종래의 문제점을 해결하기 위해 고안된 것으로, 음이온 융합인자를 이용하여 사람 유래 락토페리신을 생산할 수 있는 균주를 제작하는 방법에 대한 설명과 더불어 균주 내에서 발현된 음이온 융합인자(MMIS)와 융합된 사람 유래 락토페리신을 수용성 상태의 펩티드로 생산하기위한 유도방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 항균성 펩티드인 사람 락토페리신이 양이온을 띄고 있어 생기는 항 감염성 활성으로 그동안 산업적으로 이용가치가 높았던 박테리아 내에서의 발현 자체가 어려웠기에 양이온을 중성화 시켜줄 음이온 단백질의 유전자를 사람 락토페리신 유전자와 융합시켰다. 상기 발명에서는 사람 락토페리신 유전자와 융합인자로 사용된 MMIS(modified magainin intervening sequence) 유전자(gene)에 의해 일시적으로 형질 전환 균체 내에서 단백질이 독성을 지니지 않은 채 발현 할 수 있도록 발명한 재조합 플라스미드를 전이 시킨 균주를 제공한다.

현재 사람 유래 락토페리신 유전자를 재조합 기술을 이용하여 대장균 내에 삽입한 다음 이를 정상적으로 발현시킨 사례는 보고되고 있지 않다. 락토페린만 보더라도 산업적으로 이용되고 있는 항 감염성 락토페린은 모두 소나 그 외 다른 포유류로부터 얻은 락토페린 유전인자를 벡터에 재조합하여 넣은 재조합 균주가 전부이며, 사람 락토페린의 경우 곤충세포와 효모내에서 발현 할 수 있는 시스템은 구축되어있지만 아직 산업적으로 이용하는데 많은 어려움을 격고 있다. 뿐만아니라 락토페린보다 10배 강력한 항 감염성 활성을 갖는 락토페리신의 대장균 내 발현은 현재까지 불가능 할 것으로 보였다. 따라서 상기 발명을 도입하여 사람 유래 락토페리신을 대장균에서 제작할 수 있음으로서 최소비용으로 사람에게 가장 효과적으로 작용할 수 있는 항 감염성 펩티드 제재 약물 제작, 식품첨가물 등 산업적 이용 가치가 매우 높다고 본다.

<도면2>에서 보면, 기존 실험자에 의해 제작된 사람 락토페린 전체 유전자를 클로닝 한 벡터를 확보하였다. 이를 이용하여 (a)와 같이 각각 forward primer와 backward primer를 제작하였다. (1)과 같이 backward primer는 사람 락토페린 유전자 중에서 사람 락토페리신 유전자를 포함하는 뒷부분과 특이적으로 결합하도록 하였으며 후에 pRSETB 벡터에 클로닝하기 위하여 끝에는 제한효소 AlwNI 염기서열을 덧붙였다. (2)Forward primer를 제작하는데 있어서 forward primer 앞부분에는 융합인자인 MMIS의 염기서열 뒷부분을 제공하였고 뒷부분에 사람 락토페리신 앞부분과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 제공한다. (a)에서와 같이 제작된 primer를 이용하여 PCR을 수행하게 되면 (b)와 같은 모식도의 PCR 생산물을 얻을 수 있게 된다. 이때, backward primer는 기존에 제작하였던 (1)번과 같은 primer를 사용한다. 대신 융합인자인 MMIS의 염기서열 앞부분과 함께 pRSETB 벡터에 클로닝하기 위하여 제한효소인 BamHI 염기서열을 포함하여 primer를 제작하였다. (3)이 두 번째 forward primer와 기존(1)backward primer를 이용하여 PCR을 수행하게 되면, 최종적으로 MMIS 전체 유전자와 사람 락토페리신 유전자가 융합된 PCR 산물을 얻을 수 있다.

이와 같은 방법으로, 음이온 융합인자인 MMIS유전자와 양이온을 띄는 사람 락토페리신 유전자의 혼합시킨다. 이에 따라 사람 락토페리신의 양이온으로 인한 그람음성균 외막을 공격하던 강력한 항 감염성 활성이 일시적으로 사라지게 되고 숙주세포인 대장균(E. coli)내에서의 발현을 조절 할 수 있게 된다.

융합인자 MMIS 아미노산 서열	PLCDAEAVGPEAFADEDLDECPLM
사람 락토페리신 아미노산서열	GRRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQA

또한, 본 발명은 특허 청구 범위 제3항의 재조합 균주로부터 생산된 MMIS-사람 유래 락토페리신 융합 단백질의 inclusion body를 최소화 하고 물에 녹기 쉬운 형태로 생산할 수 있도록 하는 MMIS-사람 유래 락토페리신 생산을 유도하기 위한 배양조건 및 유도체 농도 조건은 제4항의 방법으로 하는 것을 특징으로 하는 MMIS-사람 유래 락토페리신 융합 단백질 생산방법을 제공한다. 본래 사람 유래 단백질을 대장균과 같은 박테리아 내에서 발현 시키는데 가장 중요한 점은 수용성과 단백질의 folding 단계에서 folding이 잘못 이루어지는 경우가 발생한다는 점이다. 상기 발명에서는 이와 같은 문제점을 최소화시키기 위해 MMIS-사람 락토페리신 유전자를 포함한 재조합 DNA를 유입시킨 균체를 다양한 배양 조건과 유도(induction) 조건을 제공하였고 그 결과 배양 온도 20°C, 배양 시간 9시간, IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 농도 0.1mM에서 최적의 단백질 수용성(solubility)을 나타내는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명은 특허 청구 범위 제3항의 재조합 균주를 배양하면서 MMIS-사람 유래 락토페리신 융합 단백질을 유도하여 균체를 회수하는 단계(가) 회수된 균체로부터 MMIS-사람 유래 락토페리신을 분리하는 단계(나) 및 정제된 MMIS-사람 유래 락토페리신을 다른 펩티드들로부터 정제하는 단계(다)를 포함하는 것을 특징으로 하는 MMIS-사람 유래 락토페리신 융합 단백질 생산 방법을 제공한다.

음이온 융합 인자 MMIS와 사람 유래 락토페리신의 유전자가 융합된 것을 설명하면 다음과 같은데, 현재 사람 유래 락토페리신을 대장균 호스트 내에서 발현 시키고자 하는 데 있어서 중요한 요소는 사람 유래 락토페리신의 양이온성으로 인하여 호스트로부터 발현된 사람 락토페리신이 호스트인 그람음성균(E. coli)의 외막을 공격함으로써 필요이상 발현량에 도달하기도 전에 이미 호스트 사멸에 이르렀던 문제점을 보완하는 것이다. 따라서 상기 발명은 위의 문제점을 해결하기에 뛰어난 효과를 발휘한다. 또한, MMIS-사람 유래 락토페리신이 융합된 유전인자를 발현 벡터에 클로닝 하여 이를 pRSET-MMhLfcin 라 명명하였다.

도면1은 사람 락토페리신과 같은 양이온을 띄는 단백질이 갖는 항 감염성 활성의 주요한 기작을 간단하게 그림으로 나타낸 것이다.

도면2는 음이온을 갖는 융합인자 MMIS 유전자와 사람 락토페리신 유전자 사이에 융합체를 만들기 위한 클로닝 방법을 도식화 하여 나타낸 것이다.

도면3은 제작된 MMIS-사람 락토페리신 재조합 DNA를 BL21(DE3)pLysS(대장균 strain) 균체에 도입한 뒤 수용성을 가장 높일 수 있는 조건을 확인하는 단계로 western blot을 수행한 결과이다. 배양시간 9시간, 배양 온도 20°C, IPTG농도 0.1mM일 때 가장 수용성이 높은 것으로 확인된다.

도면4는 MMIS-사람 유래 락토페리신이 융합된 유전인자를 pRSET.B벡터에 클로닝한 재조합 벡터를 도식화 하여 나타낸 것이다.

Claims (5)

1. 대장균을 숙주로 하는 발현 시스템을 이용하여,사람의 락토페린 단백질 내 포함된 강력한 항 감염성 활성을 지닌 락토페리신 펩티드를 발현 또는 과발현하는 시스템이 균주 내에 도입된 사람락토페리신 펩티드 생산 재조합 균주
2. 제1항에 있어서 상기 발현 또는 과 발현 시스템은,

   사람 락토페리신 펩티드를 발현 또는 과 발현시킬 수 있도록 락토페리신 펩티드에 의한 숙주의 사멸을 막기 위하여 락토페리신 펩티드의 독성을 일시적으로 중화시켜주는 역할을 하는 MMIS유전자가 융합인자로 사용된 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는 사람 락토페리신 단백질 단편 생산 재조합 균주
3. 제3항의 재조합 균주를 배양할 때

   MMIS 융합 사람 락토페리신 펩티드의 inclusion body 생성을 막거나 정상 발현 유도를 위하여 20℃ 이하에서0.1mM IPTG를 첨가하여 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 MMIS-사람락토페리신 단백질 단편 생산방법
4. 제1항의 재조합 균주를 배양하면서 융합된 단백질의 발현을 유도하는 단계(제3항)와 균체를 회수하는 단계(가)와 순수 사람 유래 락토페리신 펩타이드를 얻기 위한 정제단계(나)를 포함하는 것을 특징으로 하는 MMIS-사람 락토페리신 생산방법
5. 제1항에 있어서 상기 재조합 균주는,

   대장균인 것을 특징으로 하는 사람 락토페리신 펩티드 생산 재조합 균주

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