JP2003500056A - 分子シャペロンを用いるタンパク質コンホメーションの調節方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、分子シャペロンを用いてタンパク質のコンホメーションを調節する方法を提供する。本発明のシャペロンは、誤った折りたたみおよび凝集を含む種々のタンパク質コンホメーションの問題に適用可能である。本発明の分子シャペロン系は、ＤｎａＫ系およびＣｌｐＢを含み、タンパク質コンホメーションを調節するための特に有効なツールを提供する。本発明のさらなる主題は、新規コシャペロンＣｌｐＳである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、タンパク質のコンホメーションの調節用の分子シャペロンの使用、
新規なシャペロン機構、およびコシャペロン（cochaperone ）に関する。全ての
特許、公開済み特許出願、および本明細書中の他の引例は、その全体が本明細書
中で参考として援用される。

【０００２】 タンパク質の機能的活性は、折りたたまれたタンパク質の低いコンホメーショ
ンの安定性によって達成される、構造安定性と可動性との間の均衡を必要とする
。この均衡に対する絶対性とは、正確および不正確な折りたたみならびに天然お
よび非天然構造が小さなエネルギー障壁のみによって頻繁に分離することであり
（JaenickeおよびSeckler 、1999）、アミノ酸配列または折りたたみ環境のわず
かな変化により、タンパク質の折りたたみおよび構造の完全性に劇的な影響を与
え得る。実際、タンパク質の誤った折りたたみ（misfold ）は、熱および酸化ス
トレスを含む種々のストレス状況の主要な損傷の結果である（Bukau 、1999）。
誤って折りたたまれた（misfolded ）タンパク質は、一般に、疎水性表面に暴露
されているので、細胞間凝集を起こす傾向があり、この過程は長い間インビボで
不可逆性であると考えられていた。タンパク質凝集は、生物医学的に重要であり
、アミロイドーシスおよびプリオン病を含むいくつかの環病態生理学的状態の原
因として示唆されている（Horwich およびWeissman、1997、Lindquist 、1997、
Prusiner、1997、Thomasら、1995、Wetzel、1996）。さらに、封入体の付随物と
の凝集は、宿主細胞中で過剰産生される組換えタンパク質の頻繁に起こる運命で
あるので、生物工学において非常に重要である（Lilie ら、1998、Mitraki およ
びKing、1989）。

【０００３】 タンパク質の誤った折りたたみおよび凝集についての１つの解決法には、誤っ
て折りたたまれたタンパク質の凝集を防止し、且つタンパク質再折りたたみを補
助するかまたは凝集の分解を促進するプロテアーゼと共同することができる分子
シャペロンが含まれる（Bukau 、1999、Hartl 、1996、Morimotoら、1994）。Ｈ
ｓｐ９０（ＨｔｐＧ）および小さなＨＳＰ（ＩｂｐＡおよびＩｂｐＢ）を含む多
くのシャペロンは機能的ネットワークを形成し、誤って折りたたまれたタンパク
質の凝集を防止するホルダーとして作用する（大腸菌ホモログを括弧内に示す）
。他のシャペロン（特に、それぞれコシャペロン（ＧｒｏＥＬについてはＧｒｏ
ＥＳ、ＤｎａＫの場合はＤｎａＪおよびＧｒｐＥ）を含むＨｓｐ６０（ＧｒｏＥ
Ｌ）およびＨｓｐ７０（ＤｎａＫ）熱ショックタンパク質）は、凝集を防止する
だけでなく再折りたたみを補助するフォルダーとして作用する（Buchbergerら、
1996、Ehrnsperger ら、1998、Freeman ら、1996、Johnson およびCraig 、1997
、Langerら、1992、Veinger ら、1998）。他のシャペロン（特に、真正細菌の誘
発因子）は、生合成中にリボゾームと会合して初期ポリペプチドと相互作用する
。インビボでのタンパク質折りたたみにおける誘発因子の役割は文献には記載さ
れていない。

【０００４】 シャペロンの活性に固有な特徴は、タンパク質折りたたみ中間体と反復して相
互作用し、シャペロンから基質を解離させて天然の状態に折りたたむか同一また
は別の型のシャペロンと再結合させる能力である。これらの基質相互作用サイク
ルにより、ＡＴＰ結合および加水分解によって多くのシャペロンが制御される。
細胞は限られたシャペロン活性能力しか有さないことが示されており（Craig お
よびGross 、1991、Tatsuta ら、1998、Tomoyasuら、1998）、これにより、シャ
ペロンによるタンパク質折りたたみ過程の補助が組換えタンパク質の過剰産生中
および細胞の病態生理学的ストレス下で律速となり得ることが示唆される。

【０００５】 シャペロン活性の多数の不明な局面は、既存のタンパク質凝集を解決し、再折
りたたみを媒介する潜在性がある。大腸菌のＤｎａＫシャペロンは、そのコシャ
ペロンと会合して、大腸菌の熱変性ＲＮＡポリメラーゼをゆっくりと離解する能
力を有する（Skowyra ら、1990、Ziemienowiczら、1993）。しかし、全ての他の
報告された例では、Ｈｓｐ７０ファミリーメンバーは離解活性を全く示さないか
わずかに示すのみであるので、この離解活性はＤｎａｋの異型であり、Ｈｓｐ７
０ファミリーの他のメンバーであるようである（例えば、Schroderら、1993）。
それに対して、S.cerevisiaeのＨｓｐ１００ファミリーメンバー（Ｈｓｐ１０４
熱ショックタンパク質）は、熱変性ホタルルシフェラーゼおよびβガラクトシダ
ーゼを離解することが示されているので、Ｈｓｐ７０シャペロン系はこれらの酵
素を再折りたたみ可能である（GloverおよびLindquist 、1998、Parsell ら、19
94）。

【０００６】 公開された証拠は、分子シャペロンの細胞系の非常に種々のタンパク質折りた
たみ過程を補助する高い潜在性を示す。しかし、タンパク質の凝集保護およびイ
ンビボでのタンパク質の離解および／または再折りたたみについての個々の細菌
のシャペロンの特定の役割について公表された知識ならびにタンパク質の離解お
よび再折りたたみにおける細菌シャペロンの一般的な活性についての情報は限ら
れている。

【０００７】 本発明は、凝集タンパク質の離解および再折りたたみならびに誤って折りたた
まれたタンパク質の再折りたたみを媒介する細胞タンパク質（集合的に分子シャ
ペロンと呼ぶ）の使用に関する。本発明は、さらに、広範な凝集タンパク質の有
効な離解および再折りたたみを媒介するための大腸菌の２つのシャペロン系（Ｃ
ｌｐＢ（Ｈｓｐ１００タンパク質）およびＤｎａｋ系（ＤｎａＫを含む、Ｈｓｐ
７０タンパク質））の組み合わせを特徴とする。シャペロンのこの組み合わせは
、大腸菌および他の宿主細胞における過剰産生の際の組換えタンパク質の凝集体
および封入体の形成の予防および逆行ならびに可溶性かつ活性な組換えタンパク
質の産生量の増加に有用である。これらのシャペロンをインビボ（特に、排他的
ではないが大腸菌）およびインビトロで使用することができる。本発明はまた、
例えば、本明細書中に開示の分子シャペロン系を使用した、タンパク質の誤った
折りたたみおよび凝集に起因する疾患の治療法を提供する。

【０００８】 従って、ある局面では、本発明は、標的タンパク質のコンホメーションを調節
するための標的タンパク質と少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそ
のホモログを含む第１のタンパク質および少なくともＨｓｐ７０タンパク質また
はそのホモログを含む第２のタンパク質との接触による、標的タンパク質のコン
ホメーションの調節方法である。

【０００９】 本発明は、組換え発現ベクター系を提供する。ある態様では、１つの組換え発
現ベクターは少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモログおよ
び少なくとも１つのＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログをコードする。発
現ベクターは、さらに、Ｈｓｐ１００およびＨｓｐ７０タンパク質ならびに目的
のタンパク質の一方また両方の１つまたは複数のシャペロンをコードすることが
できる。別の態様では、１つのベクターを使用して、分子シャペロン系の各タン
パク質成分を発現させる。

【００１０】 別の態様では、本発明は、ベクターまたはベクター系で形質転換された宿主細
胞を提供する。好ましい態様では、宿主細胞を、目的のタンパク質および上記の
分子シャペロン系を組換えによって発現するように操作する。本発明の実行では
、例えば、そのように操作された宿主細胞の使用によって、目的のタンパク質の
凝集および誤った折りたたみの阻害により、分子シャペロン系が組換えによって
発現しない細胞と比較して目的のタンパク質の活性コンホメーションの収量を増
加させることができる。

【００１１】 本発明の別の局面は、凝集タンパク質を、凝集タンパク質を離解させるための
少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモログおよびＨｓｐ７０
タンパク質またはそのホモログを含む分子シャペロン系と接触させることによる
、インビトロでの凝集タンパク質の離解法である。別の態様では、本発明は、組
換え発現タンパク質の可溶性を増大させるための、少なくとも１つのＨｓｐ１０
０タンパク質またはそのホモログおよび少なくとも１つのＨｓｐ７０タンパク質
またはそのホモログを含む分子シャペロン系の同時発現による組換え発現タンパ
ク質の可溶性の増大方法を提供する。

【００１２】 別の態様では、本発明は、タンパク質の誤った折りたたみまたは凝集を防止す
るための、治療有効量の少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホ
モログ（好ましくは原核生物ホモログ）およびＨｓｐ７０タンパク質またはその
ホモログ（好ましくは原核生物ホモログ）を有する分子シャペロン系を投与する
工程を含む、タンパク質の誤った折りたたみまたは凝集による細胞死の防止方法
である。

【００１３】 本発明はまた、少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモログ
およびＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログを有する分子シャペロン系の治
療有効量の投与により疾患を治療する、タンパク質の誤った折りたたみおよび凝
集による動物の疾患の治療法を提供する。本発明はまた、本明細書中に開示の分
子シャペロン系をコードするポリ核酸分子を使用した疾患を治療するための遺伝
子治療を提供する。

【００１４】 本発明のさらなる態様は、少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそ
のホモログ（好ましくは原核生物ホモログ）およびＨｓｐ７０タンパク質または
そのホモログ（好ましくは原核生物ホモログ）を含む分子シャペロン系の有効量
ならびに薬学的に許容されうるキャリアを含んでなる医薬組成物である。

【００１５】 本発明の別の態様は、インビトロでの折りたたみ効率を増大させるために、イ
ンビトロタンパク質合成系に、少なくとも１つのＨｓｐ７０タンパク質またはホ
モログ有りまたは無しで誘発因子を添加することにより、インビトロでタンパク
質の折りたたみ効率を増大する方法である。

【００１６】 別の局面では、本発明は、離解においてＨｓｐ１００タンパク質またはそのホ
モログを調節することができるＣｌｐＳタンパク質およびその誘導体をコードす
る単離されたポリヌクレオチドである。ある態様では、本発明は、離解において
Ｈｓｐ１００ホモログを調節することができるＣｌｐおよびその誘導体などのポ
リペプチドを提供する。さらなる態様は、離解におけるＨｓｐ１００タンパク質
またはそのホモログの調節方法を含む。

【００１７】 本発明はまた、少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモログ
の第１のタンパク質およびＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログの第２のタ
ンパク質を含むタンパク質コンホメーションを調節するための分子シャペロン系
を提供する。

【００１８】 発明の詳細な説明 定義 本発明をさらに説明する前に、便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許
請求の範囲において使用される所定の用語を集めて説明する。

【００１９】 「ＤＮＡ」は、一本鎖または二本鎖のデオキシリボ核酸をいう。

【００２０】 「相補ＤＮＡ」（ｃＤＮＡ）は、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の逆転
写によって得られた核酸配列を有するＤＮＡである。

【００２１】 「組換え遺伝子発現」（組換え、遺伝子組換え、または組換え発現ともいう）
は、宿主細胞が目的のポリペプチドをコードすることができるように目的のポリ
ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸分子を使用して宿主細胞を形質転換
する方法をいう。プラスミドまたはベクターを使用して、宿主細胞中に核酸分子
を移入することができる。プラスミドまたはベクターは、目的の遺伝子または核
酸配列に加えて、選択マーカーまたは表現型を発現する遺伝子および一定の条件
下で目的の遺伝子発現を調節（誘導または阻害）することができる遺伝子を含む
ことができるが、必要であるわけではない。

【００２２】 「タンパク質のコンホメーション」は、その折りたたみおよび機能を含むタン
パク質の構造をいう。正常なタンパク質は一般に、活性（すなわち、正常な機能
を発揮することができる）である。不活性タンパク質は、その正常な機能を発揮
することができないか正常な速度でその正常な機能を発揮することができない。
タンパク質の不活性は、誤った折りたたみを含む多数の要因の結果であり得る。
誤って折りたたまれたタンパク質は、凝集し得る。

【００２３】 「タンパク質凝集」は、繊維、無定形凝集塊、封入体、二量体、三量体、また
は少なくとも１つのタンパク質が誤って折りたたまれているかまたは不活化され
ている１つより多くのタンパク質の他のタンパク質形態である。

【００２４】 「可溶性タンパク質」は、凝集しないが誤って折りたたまれ得るタンパク質で
ある。

【００２５】 「分子シャペロン」は、タンパク質コンホメーションを調整、調節、または補
助するタンパク質である。分子シャペロンは、タンパク質を正確に折りたたむか
、再折りたたみするか、凝集を防止するか、タンパク質を離解することができる
タンパク質である。分子シャペロンの例は、ＤｎａＫであるが、多くの異なる種
類のシャペロンが種内、さらに種間のホモログに存在する。

【００２６】 「コシャペロン（cochaperone ）」は、コシャペロンがタンパク質コンホメー
ションにおいてその機能を発揮する能力を改良するタンパク質である。コシャペ
ロンの例には、ＣｌｐＳならびにＤｎａＫ機能を補助するＤｎａＪおよびＧｒｐ
Ｅが含まれるが、これらに限定されない。後者が共に本発明に好ましい。

【００２７】 「分子シャペロン系」は、分子シャペロンおよびコシャペロンまたは第２のシ
ャペロンのいずれかを含む。Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ１００タンパク質は、Lind
quist に付与された米国特許第5,827,685 号に詳細に記載されている。本明細書
中で使用される、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ１００の「ホモログ」は、一般に、種
々の種に存在し、例えば、大腸菌に見出すことができる。適切な原核生物ホモロ
グは、ＣｌｐＡ、ＣｌｐＢ、およびＣｌｐｘＸである。例えば、ＣｌｐＢは大腸
菌Ｈｓｐ１００タンパク質ホモログであり、これは特に本発明に好ましく、より
詳細には、Ｈｓｐ１０４に対応する。ＤｎａＫは大腸菌のＨｓｐ７０タンパク質
である。ＤｎａＪおよびＧｒｐＥは大腸菌のＤｎａＫコシャペロンであり、その
ホモログは単原核生物およびさらに真核生物に存在する。

【００２８】 本発明のタンパク質および核酸分子に言及する場合、用語「ファミリー」は、
共通の構造ドメインおよび本明細書中で定義の十分なアミノ酸またはヌクレオチ
ド配列相同性を有する２つまたはそれ以上のタンパク質または核酸分子を意味す
ることを意図する。このようなファミリーメンバーは天然に存在し、且つ同一ま
たは異なる種のいずれか由来であり得る。例えば、ファミリーにはヒト起源の第
１のタンパク質ならびにヒト起源の別のタンパク質を含み得るか、非ヒト起源の
ホモログを含み得る。ファミリーメンバーはまた、共通の機能特徴を有し得る。

【００２９】 「ＤｎａＫ系」は、ＤｎａＫならびにコシャペロンＤｎａＪおよびＧｒｐＥを
いう。

【００３０】 「ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ系」は、Ｇｓｏ６０タンパク質（ＧｒｏＥＬ）およ
びそのコシャペロン（ＧｒｏＥＳ）である。

【００３１】 「目的のタンパク質」、「標的タンパク質」、および「基質」は、交換可能に
使用され、任意のタンパク質またはポリペプチドをいうという点で同一の意味を
共有する。インビボ、インビトロ、単離、または精製された組換え発現タンパク
質をいう場合に「目的のタンパク質」をしばしば使用するが、特記しない限り任
意のタンパク質またはポリペプチドをいう。組換え発現または合成の際に作用す
べき任意のタンパク質をいう場合に「標的タンパク質」をしばしば使用するが、
特記しない限り任意のタンパク質またはポリペプチドをいう。作用すべき任意の
タンパク質またはポリペプチドをいう場合に「基質」をしばしば使用するが、特
記しない限り任意のタンパク質またはポリペプチドをいう。

【００３２】 「ベクター系」は、組換え発現ベクター系である。１つの例では、組換え発現
ベクターは、１つまたはそれ以上の目的のタンパク質をコードすることができる
。別の例では、ベクターは、１つ、２つ、３つなどのタンパク質を発現すること
ができる。宿主細胞を、１つまたは複数のベクター系で形質転換することができ
る。好ましいベクター系は、Bujardおよびcoworkers （LutzおよびBujard、1997
）によって開発されたカセット様プラスミド系であり、これを使用して組換えベ
クター系を配置する。

【００３３】 本明細書中で使用される、「ポリペプチド誘導体／タンパク質誘導体」は、ア
ミノ酸配列に記載されているか公知の配列または配列を含まない方法における配
列またはその両方と異なり、ポリペプチドまたはタンパク質活性が保存されてい
るポリペプチド／タンパク質配列をいう。１つまたは複数のアミノ酸が異なる天
然のアミノ酸、アミノ酸誘導体、または非天然アミノ酸と置換された場合、アミ
ノ酸配列の誘導体が産生される。特に好ましい態様は、配列が１つまたは複数の
保存的アミノ酸置換によって野生型配列と異なり、典型的なタンパク質もしくは
ペプチドの二次構造および疎水性への影響が最小の天然に存在するポリペプチド
もしくはタンパク質または生物学的に活性なフラグメントを含む。誘導体はまた
、ポリペプチドまたはタンパク質の生物活性を破壊しない１つまたはそれ以上の
非保存的アミノ酸置換、欠失、または挿入によって異なる配列を有し得る。保存
的置換（置換基）は、典型的には、１つのアミノ酸と以下の群内の置換などの類
似の特徴を有する別のアミノ酸との置換が含まれる：バリン、グリシン；グリシ
ン、アラニン；バリン、イソロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパ
ラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニ
ルアラニン、チロシン。無極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、
イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、および
メチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン
、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正電荷
（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる。
負電荷（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。

【００３４】 他の保存的置換を表１に記載することができるが、さらに他の置換がDayhoffi
n のthe Atlas of Protein Sequence and Structure （1988）に記載されている
。

【００３５】

【表１】

【００３６】 本発明の他の誘導体は、ペプチド安定性を増大させる修飾を有するものである
。このような誘導体は、例えば、ペプチド配列中に１つまたはそれ以上の非ペプ
チド結合（ペプチド結合に代わる）を含み得る。天然に存在するＬ型アミノ酸以
外の残基（Ｄ型アミノ酸など）または非天然もしくは合成アミノ酸（βまたはα
アミノ酸および環状誘導体など）を含む誘導体もまた含まれる。ポリペプチドへ
のＬ型アミノ酸のかわりのＤ型アミノ酸の組み込みにより、プロテアーゼ耐性が
増加し得る。米国特許第5,219,990 号を参照のこと。

【００３７】 変化によりその使用に一定の利益を得ることができる場合に、本発明のポリペ
プチドおよびタンパク質を、保存的または非保存的な挿入、欠失、およびＢ置換
などの種々の変化によって修飾することもできる。

【００３８】 別の態様では、電荷、コンホメーション、および他の生物学的性質の変化によ
る低保存的アミノ酸置換誘導体により所望の誘導体を得ることもできる。このよ
うな置換には、 例えば、親水性残基の疎水性残基への置換、システインまたはプ
ロリンの別の残基への置換、小さな側鎖を有する残基の大きな側鎖を有する残基
への置換、または正味の正電荷を有する残基の正味の負電荷を有する残基への置
換が含まれる。所与の置換の結果が確実に予測できない場合、誘導体を本明細書
中に開示の方法によって迅速にアッセイして、所望の特徴の有無を同定すること
ができる。

【００３９】 本発明の範囲内にある誘導体には、本明細書中に記載のポリペプチドおよびタ
ンパク質と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質
およびペプチドが含まれる。より好ましくは、配列相同性は少なくとも９０％、
さらにより好ましくは少なくとも９５％である。

【００４０】 骨格の置換基を置換することが可能であるように、骨格を装飾する官能基を類
似の特徴によって特徴づけられる基と置換することが可能である。このような置
換は、 最初は保存的である。すなわち、置換基は、元の基とほぼ同一のサイズ、
形、疎水性、および電荷を有する。非配列修飾には、例えば、天然に存在するポ
リペプチドまたはタンパク質の一部のインビボまたはインビトロ化学的誘導体、
ならびにアセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化、またはグリコシル
化が含まれる。

【００４１】 さらなる態様では、活性が保存される化学修飾によってタンパク質を修飾する
。例えば、タンパク質を、アミド化、硫酸化、単数または多数のハロゲン化、ア
ルキル化、カルボキシル化、またはリン酸化することができる。タンパク質の１
つまたは複数をアセチル基、ファルネシル基、または飽和、一不飽和または多不
飽和可能な脂肪酸などでアシル化することもできる。脂肪酸の１つまたは複数を
フッ化することができる。本発明はまた、タンパク質のメチオニンアナログ（例
えば、メチオニンスルホンおよびメチオニンスルホキシドアナログ）を含む。本
発明はまた、タンパク質の塩（アルキルまたはアリールアンモニウム塩を含むア
ンモニウム塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩
、チオ硫酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、安息香酸塩、スルホン酸塩、チオスルホン
酸塩、メシレート、エチルスルホン酸塩、およびベンゼンスルホン酸塩など）を
含む。

【００４２】 ポリペプチドおよびタンパク質の誘導体には、ペプチド模倣物も含まれ得る。
このような化合物は当業者に周知であり、例えば、非生理学的、非天然の置換を
含むタンパク質中の一定のＲ基またはアミノ酸の置換によって産生された化合物
が含まれる。このような置換により、天然に存在する化合物を超えてかかる化合
物の安定性が増大し得る。

【００４３】 組換え ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクタ
ーを、周知の方法を用いて調製することができる。発現ベクターには、哺乳動物
、細菌、ウイルス、または昆虫遺伝子由来の適切な転写または翻訳調節ヌクレオ
チド配列に作動可能に連結されるＤＮＡ配列が含まれる。調節配列の例には、転
写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボゾーム結合
部位、および転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。
調節配列が目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列に関連
する場合、ヌクレオチド配列は、「作動可能に連結されている」。例えば、プロ
モーターのヌクレオチド配列が目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写
を調節する場合、プロモーターのヌクレオチド配列は目的のタンパク質またはポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。複製起点およ
び形質転換体が同定される選択遺伝子によって通常付与される所望の宿主細胞に
おける複製能力を、発現ベクターに付加的に組み込むことができる。

【００４４】 さらに、天然にはポリペプチドまたはタンパク質に会合しない適切なシグナル
ペプチドをコードする配列を、発現ベクターに組み込むことができる。例えば、
シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を、目的のタンパク質がシグナ
ルペプチドを含む融合タンパクとして最初に翻訳されるように目的のＤＮＡ配列
にインフレームで融合させることができる。意図する宿主細胞中で機能的なシグ
ナルペプチドにより、目的のポリペプチドまたはタンパク質の細胞外分泌が向上
する。細胞由来のポリペプチドまたはタンパク質の分泌の際に、シグナルペプチ
ドをポリペプチドまたはタンパク質から切断することができる。

【００４５】 適切な発現用宿主細胞には、原核生物、酵母、または高等真核生物細胞が含ま
れる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主用の適切なクローニングベク
ターおよび発現ベクターは、例えば、Pouwels ら、「クローニングベクター：実
験マニュアル（Cloning Vectors: A Laboratory Manual）」、Elsevier、New Yo
rk、1985に記載されている。本明細書中に開示のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使
用した無細胞翻訳系を使用して、ポリペプチドまたはタンパク質を産生させるこ
ともできる。

【００４６】 原核生物（原核生物もまた）は、グラム陰性またはグラム陽性生物（例えば、
大腸菌またはBacilli ）が含まれる。適切な形質転換用原核生物宿主細胞には、
例えば、大腸菌、Bacillus subtilis 、Salmonella typhimurium、ならびにPseu
domonas 属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種々の他の種を含む
。原核生物宿主細胞（大腸菌など）では、ポリペプチドまたはタンパク質は、原
核生物宿主細胞中の組換えポリペプチド発現を容易にするＮ末端メチオニン残基
を含み得る。Ｎ末端Ｍｅｔを、発現ポリペプチドまたはタンパク質から切断する
ことができる。

【００４７】 原核生物宿主細胞で使用するための発現ベクターは、一般に、１つまたはそれ
以上の表現型選択マーカー遺伝子を含む。表現型選択マーカー遺伝子は、例えば
、抗生物質耐性を付与するか独立栄養要求性を供給するタンパク質をコードする
遺伝子である。原核生物宿主細胞用の有用な発現ベクターの例には、市販のプラ
スミド由来のものが含まれる（クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３
７０１７）など）。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性
遺伝子を含むので、簡便な形質転換細胞の同定手段が得られる。ｐＢ３２２を使
用して発現ベクターを構築するために、プロモーターおよびポリペプチドまたは
タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ｐＢＲ３２２ベクターに挿入する。他の
市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals、
Uppsala 、 Sweden）およびｐＧＥＭＩ（Promega Biotec、 Madison 、 Wis.、 USA
）が含まれる。

【００４８】 組換え原核細胞発現ベクターに一般的に使用されるプロモーター配列には、１
３−ラクタマーゼ（Penicillinase ）、ラクトースプロモーター系（Chang ら、
Nature、275 ：615 、1978およびGoeddel ら、Nature、281 、544 、1979）、ト
リプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel ら、Nucl.Acids Res. 、8 ：
4057、1980、および欧州特許出願第36776 号）、およびｔａｃプロモーター（Ma
niatis、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual）」、Cold Spring Harbor Laboratory 、p412、1982）が含まれる。
特に有用な原核生物宿主細胞発現系には、ファージＬＰＬプロモーターおよびｃ
Ｉ８５７ｔｓ熱不安定性リプレッサー配列を使用する。ＬＰＬプロモーターの誘
導体を組み込んだAmerican Type Culture Collectionから利用可能なプラスミド
ベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌 ＪＭＢ９株（ＡＴＣＣ３７０９
２）に存在）およびｐＰＬｃ２８（大腸菌 ＲＲ１株（ＡＴＣＣ５３０８２）に
存在）が含まれる。例えば、カセット様プラスミド系について考察されている発
明の例示に記載の以下の実施例６を参照のこと。

【００４９】 あるいは、本発明のポリペプチドおよびタンパク質を、好ましくはサッカロマ
イセス（Saccharomyces ）属（例えば、セレビシエ(S.cerevisiae ）由来の酵母
宿主細胞で発現させることができる。他の酵母属（ピチア（Pichia）、クラクテ
ィス（Klactis ）、またはクライレロマイセス（Klayreromyces)）を使用するこ
ともできる。酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製起点、
自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化配列、転写終結配
列、および選択マーカー遺伝子を含む。酵母ベクター用の適切なプロモーター配
列には、例えば、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzem
anら，J.Biol.Chem.、255 、2073、1980）、または他の解糖酵素（Hessら、J.Ad
v.Enzyme Reg. 、7 、149 、1968およびHolland ら、Biochem.、17、4900、1978
）（エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキ
ナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース
−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナ
ーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、および
グルコキナーゼなど）のプロモーターが含まれる。酵母発現用の他の適切なベク
ターおよびプロモーターは、Hitzeman、欧州特許出願第73657 号、またはFleer
ら、Gene、107 、285 〜195 、1991、およびvan den Bergら、Bio/Technology、
8 、135 〜139 、1990にさらに記載されている。別の選択しとしては、Russell
ら、J.Biol.Chem.、258 、2674、1982およびBeier ら、Nature、300 、724 、19
82に記載のグルコース抑制ＡＤＨ２プロモーターである。酵母および大腸菌で共
に複製可能シャトルベクターを、上記の酵母ベクターへの大腸菌での選択および
複製用のｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子および複製起点）の挿
入によって構築することができる。

【００５０】 酵母α因子リーダー配列を使用して、ポリペプチドまたはタンパク質の分泌を
指向することができる。α因子リーダー配列は、しばしばプロモーター配列と構
造遺伝子配列との間に挿入される。例えば、Kurjanら、Cell、30、933 、1982、
Bitterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81、5330、1984、米国特許第4,546,082 号
、および欧州特許324,274 号を参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプチド
の分泌の促進に適切な他のリーダー配列は、当業者に公知である。１つまたは複
数の制限部位を含むように、リーダー配列をその３’末端付近で修飾することが
できる。これにより、構造遺伝子へのリーダー配列の融合が容易になる。

【００５１】 酵母形質転換プロトコールは、当業者に公知である。このようなプロトコール
の１つは、Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、75、1929、1978に記載されてい
る。Hinnenらのプロトコールでは、０．６７％酵母窒素源、０．５％カザミノ酸
、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニン、および２０μｇ／ｍｌウラシルか
らなる選択培地中でＴｒｐ＋形質転換体を選択する。

【００５２】 「富化」培地中での発現誘導用に、ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクター
によって形質転換された酵母宿主細胞を増殖させることができる。富化培地の例
は、８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを補充した１％酵母
抽出物、２％ペプトン、および１％グルコース含むものである。グルコースが培
地から枯渇すると、ＡＤＨ２プロモーターが抑制解除される。

【００５３】 哺乳動物または昆虫宿主細胞を使用して、本発明のポリペプチドまたはタンパ
ク質を発現させることもできる。昆虫細胞中での異種タンパク質産生用のバキュ
ロウイルスは、LuckowおよびSummers 、Bio/Technology、6 、47、1988に概説さ
れている。哺乳動物起源の確立された細胞株を使用することもできる。適切な哺
乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１
６５１）（Gluzman ら、Cell、23、175 、1981）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ
３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、および
McMahan ら、EMBO J. 、10、2821、1991に記載のアフリカミドリザル腎臓細胞株
ＣＶＩ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来ｊのＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞株が含
まれる。

【００５４】 哺乳動物宿主細胞発現ベクター用の転写および翻訳調節配列を、ウイルスゲノ
ムから切り出すことができる。一般的に使用されるプロモーター配列およびエン
ハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４
０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイル
スゲノム由来のＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０複製起点、初期および後期プロモ
ーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位）を使用して哺乳
動物宿主細胞中で構造遺伝子配列発現用の遺伝子エレメントを得ることができる
。ウイルス初期および後期プロモーターはウイルスの複製起点も含み得るフラグ
メントとしてウイルスゲノムから容易にえることができるので、特に有用である
（Fiers ら、Nature、273 、113 、1978）。ＨｉｎｄＩＩＩ部位からＳＶ４０に
存在するＢｇＩ部位に向かって伸長する約２５０ｂｐ配列が含まれる場合、小さ
なまたは大きなＳＶ４０フラグメントを使用することもできる。

【００５５】 Okayama およびBerg、Mol.Cell.Biol.、3 、280 、1983に開示の哺乳動物宿主
細胞用の例示的発現ベクターを構築することができる。Ｃ１２７マウス乳房上皮
細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定な高レベル発現用の有用な系を、Cosmanら
、Mol.Immunol.、23. 、935 、1986に記載のように十分に構築することができる
。Cosmanら、Nature、312 、768 、1984に記載の有用な高発現ベクターＰＭＬＳ
Ｖ Ｎ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ３９８９０として寄託されている。さらに有用な哺
乳動物発現ベクターは、欧州特許出願0367566 に記載されている。ベクターはレ
トロウイルス由来であり得る。天然のシグナル配列の代わりに、異種シグナル配
列（例えば、米国特許第4,965,195 号に記載のＩＬ−７のシグナル配列、Cosman
ら、Nature、312 、768 、1984に記載のＩＬ−２レセプターのシグナル配列、欧
州特許第0367566 号に記載のＩＬ−４シグナルペプチド、米国特許第4,968,607
号に記載のＩ型ＩＬ−１レセプターシグナルペプチド、および欧州特許第0 460
846 号に記載のＩＩ型ＩＬ−１レセプターシグナルペプチド）を添加することが
できる。

【００５６】 精製法および単離法 本発明の単離および精製されたポリペプチドまたはタンパク質を、上記の組換
え発現系によって産生させるか、天然に存在する細胞から精製することができる
。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析において単
一バンドのタンパク質で表示されるように、ポリペプチドまたはタンパク質を実
質的に精製することができる。本発明のポリペプチドまたはタンパク質産生法の
１つは、ポリペプチドまたはタンパク質の発現を促進するのに十分な条件下でポ
リペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質
転換された宿主細胞を培養する工程を包含する。ついで、使用した発現形に依存
して、ポリペプチドまたはタンパク質を培養培地または細胞抽出物から回収する
。当業者に公知のように、組換えタンパク質の精製手順は、使用した宿主細胞の
型および組換えタンパク質が培養培地中に分泌されるかどうかなどの要因によっ
て変化する。例えば、組換えタンパク質を分泌する発現系を使用する場合、概要
培地を最初に市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、AmiconまたはMillipor
e Pellicon限外濾過ユニット）を使用して濃縮することができる。濃縮後、濃縮
物をゲル濾過媒体などの精製マトリックスに適用することができる。

【００５７】 あるいは、陰イオン交換樹脂（例えば、付随した（pendant ）ジエチルアミノ
エチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基質）を使用することができ
る。マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、
またはタンパク質精製に一般的に使用される他の型であり得る。あるいは、陽イ
オン交換工程を使用することができる。適切な陽イオン交換体には、スルホプロ
ピル基またはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性担体が含まれる。スルホプ
ロピル基が好ましい。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ手段（例えば、付随したメ
チルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲル）を使用する１つまたは複数の逆相
高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して、ポリペプチドまた
はタンパク質をさらに精製することができる。いくつかまたは全ての上記精製工
程の組み合わせは周知であり、これを使用して、単離および精製された組換えタ
ンパク質を得ることができる。

【００５８】 発現ポリペプチドまたはタンパク質を親和性精製するために、本発明のポリペ
プチドまたはタンパク質に特異的な結合タンパク質を含むアフィニティーカラム
が利用可能である。ポリペプチドまたはタンパク質を、従来技術（例えば、高塩
濃度溶出緩衝液での溶出後、使用する低塩濃度緩衝液で透析するか利用したアフ
ィニティーマトリックスに依存してｐＨまたは他の成分を変化させる）を使用し
てアフィニティーカラムから回収することができる。

【００５９】 細菌培養物中に産生された組換えタンパク質を、通常、最初に宿主細胞の破壊
、遠心分離、不溶性ポリペプチドの場合は細胞ペレットからの抽出または可溶性
ポリペプチドの場合は上清からの抽出、続いて１回または複数回の遠心分離、塩
析、イオン交換、アフィニティー精製、またはサイズ排除クロマトグラフィー工
程によって単離する。最後に、最終精製工程としてＲＰ−ＨＰＬＣを行うことが
できる。細菌細胞を任意の従来の方法（凍結融解サイクル、超音波処理、機械的
破壊、または細胞溶解剤の使用を含む）によって破壊することができる。

【００６０】 精製を単純化するために、形質転換酵母宿主細胞を使用して分泌ポリペプチド
としてポリペプチドまたはタンパク質を発現させることができる。酵母宿主細胞
発酵物由来の分泌組換えポリペプチドを、Urdal ら、J.Chromatog.、296 、171
、1984に記載の方法と類似の方法によって精製することができる。Urdal らは分
離用ＨＰＬＣカラムによる組換えヒトＩＬ−１２の精製用の２つの連続した逆相
ＨＰＬＣ工程を記載している。

【００６１】 核酸 本発明にしたがって、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする標的
ｍＲＮＡ配列（二重らせんの形成）または二本鎖ＤＮＡへリックス（三重らせん
の形成）に結合することができる一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれ
か）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを作製することができ
る。本発明によれば、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、ｃＤＮ
Ａ領域をコードするポリペプチドまたはタンパク質のフラグメントを含む。この
ようなフラグメントは、一般に、少なくとも１４個のヌクレオチド、好ましくは
約１４〜３０個のヌクレオチドを含む。所与のタンパク質のｃＤＮＡ配列に基づ
いてアンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチドを作製する能力は、例えば、
Stein およびCohen 、Cancer Res. 、48、2659、1988およびvan der Krolら、Bi
oTechniques 、6 、958 、1988に記載されている。

【００６２】 標的核酸配列へのアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合により
、いくつかの手段（二重らせん分解の増強、転写もしくは翻訳の未熟な終結、ま
たは他の手段を含む）のうちの１つによる翻訳（ＲＮＡ）または転写（ＤＮＡ）
をブロックする複合体が形成される。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを使用して、本発明のポリペプチドまたはタンパク質の発現を妨害すること
ができる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、さらに、修飾糖ホ
スホジエステル骨格（または他の糖結合（WO91/06629に記載の結合））を有し、
このような糖結合が内因性ヌクレアーゼに耐性を示すオリゴヌクレオチドを含む
。耐性糖結合を有するこのようなオリゴヌクレオチドはインビボで安定であるが
（すなわち、酵素分解に耐性を示し得る）、標的ヌクレオチド配列に結合可能な
配列特異性を保持している。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他
の例には、有機部分（WO90/10448に記載）および標的核酸配列（ポリ（Ｌ−リジ
ン）など）のオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の部分に共有結合する
オリゴヌクレオチドが含まれる。さらに、標的ヌクレオチド配列のアンチセンス
またはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を改変するために、インターカレ
ート剤（エリプチシン）およびアルキル化剤または金属複合体をセンスまたはア
ンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させることができる。

【００６３】 アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを、任意の遺伝子導入法（例え
ば、ＣａＰＯ₄ 媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含
む）またはエプスタインバーウイルスなどの遺伝子導入ベクターの使用により標
的核酸配列を含む細胞に導入することができる。アンチセンスまたはセンスオリ
ゴヌクレオチドを、適切なレトロウイルスベクターへのアンチセンスまたはセン
スオリゴヌクレオチドの挿入、次いで細胞を挿入配列を含むレトロウイルスベク
ターとインビボまたはエキソビボで接触させることによって標的核酸配列を含む
細胞に移入することが好ましい。適切なレトロウイルスベクターには、マウスレ
トロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス）、また
はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ、およびＤＣＴ５Ｃと呼ばれる二重コピーベクターが
含まれるが、これらに限定されない。

【００６４】 WO91/04753に記載のようにリガンド結合分子とのコンジュゲートの形成によっ
て、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的ヌクレオチド配列を含
む細胞に導入することもできる。適切なリガンド結合分子には、細胞表面レセプ
ター、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面レセプターに結合する他の
リガンドが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子
のコンジュゲーションは、リガンド結合分子のその対応する分子もしくはレセプ
ターに結合する能力またはセンスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまた
はその結合バージョンの細胞への侵入妨害能力を実質的に干渉しない。

【００６５】 あるいは、WO90/10448に記載のようにオリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成
によって、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的核酸配列を含む
細胞に導入することができる。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−
脂質複合体は、内因性リパーゼによって細胞内で解離することが好ましい。

【００６６】 本発明は、ストリンジェントな条件下、特に高ストリンジェントな条件下で、
本明細書中に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌ
クレオチドを含む。高ストリンジェントな条件には、例えば、６５℃で０．２×
ＳＳＣが含まれ、ストリンジェントな条件には、例えば、６５℃で４×ＳＳＣま
たは５０％ホルムアミドおよび４２℃で４×ＳＳＣが含まれる。好ましくは、こ
のようなハイブリダイズするヌクレオチドは、ハイブリダイズする本発明のポリ
ペプチドと少なくとも７０％同一（より好ましくは少なくとも８０％同一、さら
により好ましくは８５％、９０％、または９５％同一）である。

【００６７】 本発明はまた、開示のポリヌクレオチドまたはタンパク質の対立遺伝子バリア
ント（すなわち、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質と
同一、ホモログ、または関連するタンパク質もコードする単離ポリヌクレオチド
の天然に存在するか天然に存在しない代替形態）を含む。

【００６８】 相同性または同一性 ２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一％を決定するために、最適な
比較のために配列を整列させる（例えば、最適な整列のために第１および第２の
アミノ酸または核酸配列の一方あるいは両方にギャップを挿入することができ、
比較のために非相同配列を無視することができる）。好ましい態様では、比較目
的で整列させた基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、好まし
くは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましく
は少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、ま
たは９５％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置での
アミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置を第２の配列の
対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドで占める場合、分子はそ
の位置で同一である（本明細書中で使用されるアミノ酸または核酸「同一性」は
、アミノ酸または核酸「相同性」に等価である）。２つの配列間の同一％は、２
つの配列の最適な整列のために導入する必要があるギャップ数、各ギャップの長
さを考慮した、配列が共有する同一の位置数の関数である。

【００６９】 配列の比較および２つの配列間の同一％の決定を、数理的アルゴリズムを使用
して達成することができる。好ましい態様では、２つのアミノ酸配列間の同一％
を、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、１６、
１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４
、５、または６のレングスウェイトを使用した、ＧＣＧソフトウェアパッケージ
（http://www.gcg.comから利用可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれたNeed
leman およびWunsch（J.Mol.Biol. 、48、444 〜453 、1970）アルゴリズムを使
用して同定する。さらに好ましい別の態様では、２つのヌクレオチド配列間の同
一％を、ＮＷＳgapdna. ＣＭＰマトリックス、４０、５０、６０、７０、または
８０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６のレングスウェイ
トを使用した、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comから利用可
能）中のＧＡＰプログラムを使用して同定する。別の態様では、２つのアミノ酸
またはヌクレオチド配列間の同一％を、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル、１
２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用した、Ａ
ＬＵＧＮプログラム（http://vega.jgh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi で利用可
能）に組み込まれたE.MeyersおよびW.Miller、CABIOS、4 、11〜17、1989のアル
ゴリズムを使用して同定する。

【００７０】 本発明の核酸およびタンパク質配列を、さらに公的なデータベースでの検索を
行うための「検索配列」として使用して、例えば、他のファミリーメンバーまた
は関連配列を同定することができる。このような検索を、 Altschulら、1990、J.
Mol.Biol. 、215 、403 〜10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムを使
用して行うことができる。本発明のＭＳＰ−１８核酸分子に相同なヌクレオチド
配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、文字列長さ＝１
２）を用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行うことができる。本発明のＭＳＰ
−１８タンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログ
ラム（スコア＝５０、文字列長さ＝３）を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を行
うことができる。比較用のギャップアラインメントを得るために、Altschulら、
1997、Nucleic Acid Res. 、25（17）、3389〜3402に記載のギャップＢＬＡＳＴ
を利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを利
用する場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよ
びＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov を参
照のこと。さらに、「Clustal 」法（Higgins およびSharp 、Gene、73、237 〜
44、1988）および「Megalign」プログラム（Clewley およびArnold、Methods Mo
l.Biol. 、70、119 〜29、1997）を使用して配列を整列させて、類似性、同一性
、または相同性を同定することができる。以下の本発明の例示の実施例１０を参
照のこと。

【００７１】 遺伝子治療 本発明の核酸分子をベクターに挿入して、遺伝子治療用ベクターとして使用す
ることができる。遺伝子治療用ベクターを、例えば、静脈内注射、局所投与（米
国特許第5,328,470 号を参照のこと）、または定位固定注射（例えば、Chenら、
1994、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91、3054〜3057を参照のこと）によって被験体
に送達させることができる。遺伝子治療用ベクターの医薬調製物は、許容されう
る希釈剤中の遺伝子治療用ベクターまたは遺伝子送達体が組み込まれた徐放マト
リックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達用ベクターを組換え細胞から
インタクトに産生することができ（例えば、レトロウイルスベクター）、医薬調
製物は遺伝子送達系をもたらす１つまたは複数の細胞を含み得る。医薬組成物を
、投与説明書と共に容器、パッケージ、またはディスペンサーに含めることがで
きる。

【００７２】 本発明は、標的タンパク質のコンホメーションを制御するため、標的タンパク
質と、少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモログの第１のタ
ンパク質およびＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログの第２のタンパク質を
有する分子シャペロン系との接触による、標的タンパク質のコンホメーションの
制御法を開示する。好ましい態様では、第１のタンパク質はＨｓｐ１００タンパ
ク質の原核生物ホモログを含み、より好ましくは、ホモログはＣｌｐホモログで
ある。Ｃｌｐホモログは、好ましくはＣｌｐＡ、ＣｌｐＸ、より好ましくはＣｌ
ｐＢである。より好ましい態様では、第２のタンパク質はＨｓｐ７０タンパク質
の原核生物ホモログである。より好ましくは、原核生物ホモログはＤｎａＫであ
る。さらに好ましい態様では、分子シャペロン系は、少なくとも１つのコシャペ
ロン(cochaperone) をさらに有する。好ましいコシャペロンはＤｎａＪ、Ｇｒｐ
Ｅ、またはＣｌｐＳであり、より好ましくはＤｎａＪおよびＧｒｐＥである。特
に好ましいコシャペロンは、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥである。

【００７３】 さらなる態様では、標的タンパク質は宿主細胞中で組換え発現され、宿主細胞
中での過剰発現のために標的タンパク質が凝集し得る。さらに好ましい態様では
、第１（Ｈｓｐ１００タンパク質）および第２（Ｈｓｐ７０タンパク質）は、宿
主細胞中で組換え発現される。宿主細胞は、好ましくは、大腸菌（E.coli）、Ｓ
．セレビシエ（S.Cerevisiae）、枯草菌（B.Subtilis）、植物細胞、昆虫細胞、
酵母細胞、または哺乳動物細胞である。より好ましくは、宿主細胞は大腸菌であ
る。

【００７４】 本発明によれば、組換え発現ベクター系が得られる。１つの態様では、１つの
組換え発現ベクターは少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモ
ログおよび少なくとも１つのＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログをコード
する。発現ベクターは、さらに、目的のタンパク質とともに、Ｈｓｐ１００およ
びＨｓｐ７０タンパク質の一方または両方の１つまたは複数のシャペロンをコー
ドすることができる。別の態様では、１つのベクターを使用して、分子シャペロ
ン系の各タンパク質成分を発現させる。別の態様では、ベクターは１つ、２つ、
３つなどのＨｓｐ１００タンパク質はまた、同様に１つ、２つ、３つなどのＨｓ
ｐ７０タンパク質、ならびにその間のシャペロンおよびコシャペロンタンパク質
との全ての組み合わせを発現することができる。宿主細胞を、系の１つまたは複
数のベクターで形質転換することができる。好ましい態様では、Bujardら（Lutz
およびBujard、1997）によって開発されたカセット様プラスミド系を使用して、
組換えベクター系を配置(deploy)する。より好ましくは、ベクター系は、さらに
、ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ系もしくはそのホモログ、その各タンパク質もしくは
そのホモログ、誘発因子(TriggerFactor) もしくはそのホモログを組換え発現す
ることができる。ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ系の考察は、Bukau およびHorwich 、
Cell、1998に見出すことができる。

【００７５】 本発明では、標的タンパク質を凝集または誤折りたたむ(misfold) することが
できる。ストレス条件（熱ストレス、酸化ストレスなど）、過剰発現、変異、ま
たは疾患によって、標的タンパク質が凝集し得る。好ましい態様では、標的タン
パク質はインビトロで離解する。

【００７６】 本発明は、さらに、少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモロ
グおよび少なくとも１つのＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログを含む分子
シャペロン系をコードするベクター系を提供する。ベクター系は、刺激の有無に
よって発現を調節することができるように、誘導プロモーターを含むことができ
る。

【００７７】 ベクター系を使用して、細胞を形質転換することができる。好ましい態様では
、細胞はプロテアーゼ欠損である。より好ましくは、プロテアーゼ欠損はｒｐｏ
Ｈ遺伝子における変異により引き起こされ、より好ましくは、変異はＧｒｏＥＬ
−ＧｒｏＥＳオペロンのプロモーター領域中にＩＳエレメントをさらに有する細
胞中のｒｐｏＨ遺伝子中の染色体欠失であり、それにより細胞増殖が可能である
。

【００７８】 本発明の１つの態様では、宿主細胞は、目的のタンパク質を組換え発現するこ
とができる。目的のタンパク質は、おそらく、分子シャペロン系の組換え発現の
非存在下で誤って折りたたまれるかまたは凝集する。別の態様では、発現分子シ
ャペロン系は、目的のタンパク質の凝集または誤った折りたたみを阻害する。好
ましい態様では、目的のタンパク質の凝集および誤った折りたたみは、分子シャ
ペロン系を組換え発現しない細胞と比較して、目的のタンパク質の活性コンホメ
ーションの収量の増加を阻害する。別の態様では、分子シャペロン系は、凝集タ
ンパク質を離解および再折りたたみする。好ましい態様では、目的のタンパク質
は、マレートデヒドロゲナーゼである。本発明によれば、細胞は任意の原核細胞
または真核細胞であり得るが、より好ましくは、細胞は大腸菌.S.Cerevisiae 、
B.Subtilis、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞である。

【００７９】 本発明は、さらに、凝集タンパク質を離解させるための、凝集タンパク質と、
少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモログおよびＨｓｐ７０
タンパク質またはそのホモログを有する分子シャペロン系との接触による、イン
ビトロでの凝集タンパク質の離解法を提供する。好ましい態様では、この方法は
、離解タンパク質の活性形態への折りたたみ工程を包含する。

【００８０】 別の態様では、本発明は、組換え発現タンパク質の安定性を増大させるための
、少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモログおよびＨｓｐ７
０タンパク質またはそのホモログを有する分子シャペロン系の同時発現による組
換え発現タンパク質の安定性の増大法を提供する。

【００８１】 さらに別の態様では、本発明は、タンパク質の誤った折りたたみおよび凝集を
防止するための、少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモログ
およびＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログを有する分子シャペロン系の治
療有効量の投与による、タンパク質の誤った折りたたみおよび凝集による細胞死
の防止法である。

【００８２】 本発明はまた、少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモログ
およびＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログを有する分子シャペロン系の治
療有効投薬量の投与により疾患を治療する、タンパク質の誤った折りたたみおよ
び凝集による動物の疾患の治療法を提供する。好ましい態様では、動物は、ヒト
、齧歯類、ネコ、またはイヌなどの哺乳動物である。本発明によって治療するこ
とができる疾患には、クロイツフェルト−ヤコブ病、アルツハイマー病、ハンチ
ントン病、運動失調１型、嚢胞性線維症、および癌が含まれる。薬学的に許容さ
れうるキャリアと共に治療有効投薬量を送達させることが好ましい。より好まし
くは、薬学的に許容されうるキャリアは、誤って折りたたまれたタンパク質を標
的化することができる。さらに、本発明は、上記のような分子シャペロン系をコ
ードするポリ核酸分子による遺伝子治療の実行に有用な遺伝子治療法および組成
物を提供する。

【００８３】 本発明のさらなる態様は、少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそ
のホモログおよびＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログを有する分子シャペ
ロン系の有効投薬量ならびに薬学的に許容されうるキャリアを含む医薬組成物で
ある。

【００８４】 本発明の別の態様は、インビトロでの折りたたみ効率を増大させるための、少
なくとも１つのＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログを含むか含まない誘発
因子のインビトロタンパク質合成系への添加による、インビトロでのタンパク質
の折りたたみ効率の増大法である。好ましい態様では、誘発因子に加えて、少な
くとも１つのＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログを含む分子シャペロン系
をインビトロ合成系に添加する。少なくとも１つのＨｓｐ７０タンパク質または
そのホモログを含むか含まない誘発因子の細胞中における組換え発現によって細
胞中のタンパク質の折りたたみ効率を増大させることができ、それにより、細胞
中の折りたたみ効率を増大させることができる。細胞は、原核細胞または真核細
胞であり得る。好ましい態様では、誘発因子に加えて、少なくとも１つのＨｓｐ
７０タンパク質またはそのホモログを含む分子シャペロン系を組換え発現させる
。

【００８５】 本発明は、配列番号：１のポリヌクレオチド配列に関連するポリ核酸分子を提
供する。１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１のヌクレオチド配列を
含むポリヌクレオチド、（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにアンチセンスなポリ
ヌクレオチド、（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに８０％同一なポ
リヌクレオチド、（ｄ）配列番号：２のタンパク質をコードするポリヌクレオチ
ド、（ｅ）配列番号：２のタンパク質に８０％同一のポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド、（ｆ）Ｈｓｐ１００タンパク質またはそのホモログの離解活
性を制御することができるタンパク質をコードする（ａ）〜 （ｅ）の核酸と８
０％同一のポリヌクレオチド、および（ｇ）ストリンジェントな条件下で（ａ）
〜（ｆ）に特定するポリヌクレオチドの任意の１つとハイブリッド形成するポリ
ヌクレオチドからなる群から選択される単離ポリ核酸分子を提供する。好ましい
態様では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：１のアミノ酸配列と少なく
とも７０％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、さらにより好ましくは
８５％、９０％、または９５％同一である。

【００８６】 本発明は、配列番号：２に関連するポリペプチドおよびタンパク質をさらに提
供する。１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む
ポリペプチド、（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列に８０％同一のポリペプチド
、（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列のポリペプチド変異型、（ｄ）Ｈｓｐ１０
０タンパク質またはそのホモログの離解活性を制御することができる配列番号：
２のアミノ酸配列のポリペプチド変異型、（ｅ）ＣｌｐＡを介助しうる(capable
of cochaperoning)配列番号：２のアミノ酸配列のポリペプチド変異型、（ｆ）
配列番号：１のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、（ｇ）配
列番号：１の配列に８０％同一のポリヌクレオチドによってコードされるポリペ
プチド、および（ｈ）ストリンジェントな条件下で配列番号：１の配列を有する
ポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドによってコードされ
るポリペプチドからなる群から選択される単離ポリペプチドを提供する。１つの
態様では、変異型および誘導体は挿入、欠失、または置換の変異型または誘導体
である。好ましい態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸
配列と少なくとも７０％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、さらによ
り好ましくは８５％、９０％、または９５％同一である。

【００８７】 さらに、分子シャペロン系は、少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質もし
くはそのホモログの第１のタンパク質および少なくとも１つのＨｓｐ７０タンパ
ク質またはそのホモログの第２のタンパク質を有するタンパク質のコンホメーシ
ョンを制御するために提供される。

【００８８】 さらなる態様は、Ｈｓｐ１００タンパク質の活性を制御するためのＣｌｐＳま
たはそのホモログもしくは誘導体の使用である。好ましい態様では、Ｈｓｐ１０
０タンパク質はＣｌｐＡ、ＣｌｐＢ、またはＣｌｐＸである。より好ましい態様
では、Ｈｓｐ１００タンパク質はＣｌｐＡである。

【００８９】 さらなる態様は、細胞質基質(cytosolic) シャペロンの変異によって変化した
成分(mutationally altered content)（例えば、調節遺伝子ｒｐｏＨを欠く変異
体におけるもの）を用いた大腸菌ならびにインビトロタンパク質合成系における
タンパク質の折りたたみ効率の増大法である。

【００９０】 これに関して、ＤｎａＫ（Ｈｓｐ７０タンパク質）シャペロン系（ＤｎａＫ、
ＤｎａＪ、ＧｒｐＥからなる）と組み合わせた誘発因子（ＴＦ）は、タンパク質
折りたたみに重要であり、これら２つのシャペロン系の細胞基質を同定した。

【００９１】 さらに、ＤｎａＫ系と組み合わせたＣｌｐＢ（Ｈｓｐ１００タンパク質）はタ
ンパク質折りたたみに重要であり、凝集後３０℃で再折りたたみが行われる。Ｄ
ｎａＫ系はＣｌｐＢと共に厳しい熱ショック条件での大腸菌の生存率の増大にさ
らに適切である。

【００９２】 さらに、ＤｎａＫ系およびＧｒｏＥＬ系は、新規に合成されたタンパク質の折
りたたみの補助において連続的様式で主に作用するのではなく、かなり異なる基
質集団の折りたたみを補助する。

【００９３】 本発明の別の結果は、ＬｏｎおよびＣｌｐＸＰがシャペロン遺伝子変異体に蓄
積する凝集タンパク質を排出することができる主要な細胞質基質プロテアーゼで
あることである。

【００９４】 所見を証明するために行なった実験では、２つの株を使用した。第１に、イン
デューサーＩＰＴＧによって発現が調節可能な人工オペロンと置換されたｄｎａ
Ｋ ｄｎａＪオペロンをさらに有する、ＴＦを欠くｔｉｇ：：ｋａｎ株 （Deue
rling ら、1999）。第２に、ＴＦを除く全ての主要な細胞質基質シャペロンおよ
びプロテアーゼの発現を担う熱ショック転写因子σ３２を欠くｒｐｏＨ株。この
公表された株（KusukawaおよびYura、1988）は、抑制因子の変異により高レベル
のＧｒｏＥＬの構成的発現が可能であるので３０℃および３７℃で生存可能であ
る。これらの株および新規に構築したこれらの誘導体を使用した所見を以下に示
す。

【００９５】 全細胞質基質タンパク質の約１０％は、３７℃でＤｎａＫが欠失したｔｉｇ：
：ｋａｎ細胞（ＴＦを欠く）中の不溶性ペレット中に見出される。凝集タンパク
質の量は、３０℃でより少量（１．２％）であるので、これはＤｎａＫ／ＴＦ要
件が温度依存性であることを示す。これの所見は、大腸菌におけるタンパク質の
効率的な折りたたみについて、ＴＦおよびＤｎａＫ系はより高い増殖温度でより
重要となることを示す。これらにより、より高い温度で合成が行われる場合、大
腸菌ベースのインビボおよびインビトロ系で合成された組換えタンパク質の折り
たたみ効率をＴＦおよび／またはＤｎａＫ系の補足によって向上させることがで
きることも示唆される。

【００９６】 さらに、二次元ゲル電気泳動および続く質量分析によるＤｎａＫが枯渇した３
７℃で同定した凝集タンパク質のｔｉｇ：：ｋａｎ細胞中での大規模同定を行っ
た。転写、翻訳、および代謝を含む種々の基本的細胞過程に関与する９２個を超
えるタンパク質が同定された。共通の顕著な特徴は、全分子範囲（すなわち、数
Ｄａ〜数百ｋＤａ）を対象とし得るこの種のタンパク質のサイズ依存性である。
複数のドメインによって形成された特に高分子量のタンパク質は、生産的に折り
たたむためにＴＦおよび／またはＤｎａＫの補助を必要とする。異種タンパク質
と同様に、同定された大腸菌タンパク質について、生物工学への適用における高
レベル産生条件下で天然の組換えタンパク質の収量の増加にＴＦおよびＤｎａＫ
系の過剰産生が推奨される。凝集傾向タンパク質と呼ばれる適切なタンパク質の
例は、グルタミン酸シンターゼ（分子量約１６７ｋＤａ）、ＲＮＡポリメラーゼ
（約１５０〜１６０ｋＤＡ）、Ｔｈｒ−ｔＲＮＡシンテターゼ（約７５ｋＤａ）
である。

【００９７】 大腸菌細胞中で新規に合成されたタンパク質の折りたたみ補助において、Ｄｎ
ａＫ系と、ＧｒｏＥＬ系（ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳからなる）と、ＴＦとの
間に機能的関連が存在する。この関連を、独立したまたは組み合わせたシャペロ
ンの細胞レベルの変化およびシャペロン特異的抗体を用いた同時免疫沈降による
シャペロン−基質相互作用の分析によって調査した。

【００９８】 以前に公開された実験で、ＴＦおよびＤｎａＫ系が共同してタンパク質折りた
たみを行っていることが既に示されている（Deuerling ら、1999、Teter ら、19
99）。ＩＰＴＧで制御可能なｄｎａＫ ｄｎａＪオペロンを有する株における（
ｉ）ＤｎａＫ遺伝子の欠失または（ｉｉ）ＤｎａＫおよびＤｎａＪの欠失は野生
型細胞と比較してタンパク質凝集の増加に十分であることを見出した。これらの
所見は、他の細胞シャペロンの存在によって代償することができないタンパク質
折りたたみへのＤｎａＫ系の別の寄与が既に存在することを示す。しかし、より
以前の所見（Deuerling ら、1999）と一致して、ＤｎａＫおよびＤｎａＪが欠失
したｔｉｇ細胞でより強力なタンパク質凝集が起こった。

【００９９】 ＤｎａＫとＧｒｏＥＬとの間の機能的関連を分析するために、ＧｒｏＥＬを発
現可能な抑制変異を含むｒｐｏＨ変異株を使用した。この株では、全可溶性細胞
タンパク質の約５％が３０℃で凝集することが見出された。多コピープラスミド
由来のＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのＩＰＴＧ制御過剰産生により、凝集タンパ
ク質の量は有意に減少しなかった。それに対して、ＤｎａＫ系のＩＰＴＧ誘導過
剰産生は、ほとんど全ての凝集傾向タンパク質の凝集の効率的な抑制に十分であ
った。ＤｎａＫ系およびＣｌｐＢ両方の付随的産生は、４２℃および５０℃での
熱ショック後と同様に３０℃でのタンパク質凝集の抑制にさらにより効率的であ
った。

【０１００】 さらに、異なるレベルのプラスミドコードＤｎａＫ系を含むｒｐｏＨ細胞にお
けるＧｒｏＥＬおよびＤｎａＫに関連するインビボ基質集団を同定した。Ｇｒｏ
ＥＬまたはＤｎａＫ特異的抗血清を使用した放射性標識細胞タンパク質の同時免
疫沈降によってこの同定を行った。結果は、ＤｎａＫおよびＧｒｏＥＬの基質集
団は有意に異なるにもかかわらずこれらの集団の重複を排除することができない
ことであった。したがって、より以前の所見（Deuerling ら、1999、Ewalt ら、
1997）では、ＧｒｏＥＬは約６５ｋＤａの基質上限サイズを有する。それに対し
て、ＤｎａＫと相互作用するタンパク質は、高分子量（＞６０ｋＤａ）のタンパ
ク質が多い(enriched)。さらに、ＧｒｏＥＬと一過性に相互作用するタンパク質
の量は、ＴＦが存在するか存在しないＤｎａＫレベルの変化に影響されなかった
。したがって、ＧｒｏＥＬへの基質の負荷にはＤｎａＫ系およびＴＦの存在は必
要ない。これらの所見は、大腸菌中に新規に合成されたタンパク質の別の折りた
たみ経路の存在を示す。いくつかのタンパク質はＤｎａＫ（おそらくＣｌｐＢ）
と相互作用する（凝集した場合）一方で、他のタンパク質はＧｒｏＥＬ系と相互
作用する。リボゾーム関連シャペロンとしての誘発因子はまた、両集団型の折り
たたみに必須の役割を果たす。

【０１０１】 前述のΔｒｐｏＨ株を使用した熱ストレス条件での細胞の生存におけるシャペ
ロンの役割は本質的に重要である。この株は、高い熱感受性を示した（図１５）
。ＣｌｐＢでのＤｎａＫ系の発現は、熱ショック温度での細胞死滅の抑制に最も
有効であり（図１５）、細胞タンパク質の凝集を有効に防止および逆行（図１５
）ならびに熱不安定レポーター酵素（ホタルルシフェラーゼ、図１５）の再活性
化が可能である。ＤｎａＫ系およびＣｌｐＢならびにそのホモログの産生の増加
は、大腸菌のΔｒｐｏＨ株だけでなく野生型の熱ストレスでの生存および熱スト
レスからの回復を含むストレス耐性の増大に有用である。したがって、ＤｎａＫ
系およびＣｌｐＢホモログの過剰産生はまた、他の原核生物および真核生物細胞
のストレス耐性の増加に適切である。

【０１０２】 本発明の別の結果は、ＬｏｎおよびＣｌｐＸＰが、ｒｐｏＨ変異細胞中に蓄積
される凝集傾向タンパク質の排除を担う主要な細胞質基質プロテアーゼであるこ
とである。したがって、組換えタンパク質産生用の大腸菌株または大腸菌ベース
のインビトロタンパク質合成系の設計に有用である。特に、これらのプロテアー
ゼの削除により不安定な凝集傾向組換えタンパク質の収量が増加する。

【０１０３】 以下の実施例は、例示目的で示されており、本発明の範囲または以下の特許請
求の範囲を制限することを意図せず、且つそう解釈すべきではない。

【０１０４】 発明の例示 大腸菌の細胞質基質シャペロンがタンパク質を天然の構造に折りたたむ可能性
、熱変性タンパク質の凝集を防止および逆行(reverse) させる可能性、およびこ
れらの基質の再折りたたみを補助する可能性について調査を行った。タンパク質
の熱変性および凝集についての分析は、細胞のストレス処理中にも起こるタンパ
ク質の誤った折りたたみを研究するための十分に確立された実験アプローチであ
る。シャペロンの役割に関して、タンパク質の温度誘導凝集は、細菌の過剰産生
の際に頻繁に発生する組換えタンパク質の凝集および封入体形成に類似している
。さらに、熱変性タンパク質（例えば、マレートデヒドロゲナーゼ、ＭＤＨ）の
凝集によりコンゴ−レッド（アミロイド線維の表示に広範に使用されるマーカー
色素）での染色が増加することが認められた。特にコンゴ−レッドは、線維形成
に関連する抗平行βシート構造と反応する（Turnell およびFinch 、1992）。し
たがって、熱変性タンパク質の凝集により抗平行βシート成分が増加し、この二
次構造の変化をアミロイドおよびプリオン形成タンパク質が共有する。したがっ
て、熱変性タンパク質の分析は、アミロイドおよびプリオン代謝の研究に関連す
ると考えられる。

【０１０５】 大腸菌用に、組換えタンパク質をコードする遺伝子およびＣｌｐＢおよびＤｎ
ａＫ系をコードする遺伝子の発現を独立して制御可能な一組の適合性(compatibl
e)プラスミドを構築した。インビボでの可溶性タンパク質の収量の増加にも有用
であり得るさらなるシャペロン遺伝子（特に、ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ系および
誘発因子）をコードするプラスミドもまた構築した。

【０１０６】 さらに、不安定性組換えタンパク質の高レベル産生用の大腸菌株を構築した。
この株は、上記のプラスミドを保有し、さらに、ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳオペロ
ンのプロモーター領域中にＩＳエレメントをさらに有し、それにより増殖が可能
な細胞中の主要な細胞質基質プロテアーゼ活性の欠如をもたらす調節ｒｐｏＨ遺
伝子の染色体の欠失を有する。

【０１０７】 実施例１：ＤｎａＫシャペロン系はタンパク質凝集の防止に有効である この実験では、ＤｎａＫシャペロン系が他のシャペロン／シャペロン系と比較
したタンパク質凝集防止能力をアッセイした。ＤｎａＫ系は、熱ショックタンパ
ク質ＤｎａＫ（Ｈｓｐ７０）、コシャペロンＤｎａＪ（Ｈｓｐ４０）、およびコ
シャペロンＧｒｐＥを含む。ＧｒｐＥコシャペロンは、ＤｎａＫのＡＴＰアーゼ
活性を制御するので、ＤｎａＫのタンパク質基質の再折りたたみを補助する（Bu
kau およびHorwich 、1998）。

【０１０８】 実験アプローチは、公表された手順（HesterkampおよびBukau 、EMBO J. 、17
、4818〜4828）に従い、遠心分離による凝集タンパク質の同定に依存する。³⁵Ｓ
−メチオニン標識された大腸菌野生型細胞の可溶性抽出物（４ｍｇ／ｍｌ）を、
細胞質基質シャペロンの非存在下または存在下で３０℃で５分間予備インキュベ
ートした。ＡＴＰ（１０ｍＭ）を熱ショックの２分前に添加した。次いで、サン
プルを１５分間で４５℃にシフトさせた。遠心分離により、可溶性および不溶性
タンパク質物質を分離した。凝集タンパク質を、４℃、１５０００ｇ、１５分間
の遠心分離によってペレット化した。ペレットを氷冷切断緩衝液で２回洗浄し、
一次元および二次元ゲル電気泳動によって分析した。

【０１０９】 凝集タンパク質の量を、シンチレーションカウンティングによって測定した。
図１は、異なるシャペロンの大腸菌細胞抽出物におけるタンパク質凝集の防止能
力を比較している。図１に示すように、ＤｎａＫ系は細胞抽出物中の熱変性大腸
菌タンパク質の凝集の防止用の有効な細胞質基質シャペロン系であり、細胞抽出
物中で約等モル濃度のシャペロンおよび熱不安定性タンパク質基質条件下での凝
集防止について細胞質基質シャペロンＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ、ＨｔｐＧ（Ｈｓ
ｐ９０）、ＣｌｐＢ、およびＩｂｐＢより有効である。

【０１１０】 この実験結果は、組換えタンパク質の溶解性の増加に対する技術的アプローチ
におけるエレメントとしてのＤｎａＫ系の使用を示した。

【０１１１】 実施例２：ＤｎａＫ系によってその凝集が防止される熱感受性タンパク質の同定 ＤｎａＫ系によって温度誘導凝集が防止される６０を超える熱感受性大腸菌タ
ンパク質を同定するために、インビボ実験を行った。このようにして同定された
タンパク質を、表２に示す。非許容的熱ショック温度（４２℃）にシフト後のΔ
ｄｎａＫ変異体に蓄積する凝集タンパク質の分析によってタンパク質を同定した
。大腸菌野生型およびｄｎａＫ変異体細胞を、３０℃でＬＢ倍地中で指数関数的
に増殖させ、４２℃で６０分間の熱ショックを与えた。不溶性細胞画分（膜タン
パク質を含む）を調製し、標準的なプロトコールにしたがった二次元ゲル電気泳
動によって分析した。図２は、野生型およびｄｎａＫ^- 細胞のペレット画分の二
次元ゲル電気泳動後にクーマシー染色スポットとしての凝集タンパク質を示す。

【０１１２】

【表２】

【０１１３】 図２は、高温でのタンパク質凝集は、インビボでのｄｎａＫヌル変異体で非常
に促進されることを示す。この所見および報告された野生型細胞におけるＤｎａ
Ｋ系の能力の限界（Tomoyasuら、1998）により、ＤｎａＫ系が同時に過剰産生さ
れた場合、生物工学的適用において、例えば大腸菌中の過剰産生後のこれらのタ
ンパク質の可溶性配座異性体の収量が増加することが示唆される。

【０１１４】 実施例３：種々のシャペロンのインビトロで凝集タンパク質を離解および再折り
たたみする相対的能力（ＤｎａＫ系およびＣｌｐＢの組み合わせ作用）の同定 種々のシャペロンの凝集タンパク質を離解および再折りたたみする能力を同定
するためにインビトロ実験を行った。一対の実験では、大腸菌野生型細胞の全可
溶性抽出物を、３０℃で５分間予備インキュベートし、４５℃で１５分間熱ショ
ックを与えた。可溶性および不溶性画分を遠心分離で分離し、標準的なプロトコ
ールにしたがって二次元ゲル電気泳動によって分析した。図３に示すように、熱
ショック処理によって、５０を超える異なるタンパク質種を含む、溶解物中の約
１０〜２０％のタンパク質の凝集が増加した。

【０１１５】 大腸菌野生型細胞の³⁵Ｓメチオニン標識可溶性抽出物を３０℃で５分間予備イ
ンキュベートし、４５℃で１５分間熱ショックを与えた。遠心分離によって凝集
タンパク質を単離し、反応緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、１５
０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ）中に再懸濁した。ＤｎａＫ系（Ｄｎａ
Ｋ、ＤｎａＪ、およびＧｒｐＥからなる）、ＧｒｏＥＬ系（ＧｒｏＥＬおよびＧ
ｒｏＥＳからなる）、ＩｂｐＢ、ＨｔｐＧ、およびＣｌｐＢ（最終濃度は２μＭ
）、およびＡＴＰ再生系を種々の条件下で添加し、３０℃で４時間インキュベー
トした。可溶性および不溶性タンパク質物質を、遠心分離によって分離した。可
溶性および不溶性画分の量を、シンチレーションカウンティングによって決定し
た。図４に示すように、個別に添加した場合、凝集タンパク質に高濃度添加した
場合でさえこれらのシャペロンは４時間以内に凝集タンパク質を歌謡化する潜在
性を有さなかった。それに対して、最終濃度２μＭでＣｌｐＢおよびＤｎａＫ系
と共に添加した場合、約５０％の凝集大腸菌タンパク質が、３０℃で４時間以内
に可溶化した（図４）。

【０１１６】 大腸菌野生型細胞の可溶性抽出物を、３０℃で５分間予備インキュベートし、
４５℃で１５分間熱ショックを与えた。遠心分離によって凝集タンパク質を単離
し、ピペッティングによって反応緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）
、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ）中に再懸濁した。ＡＴＰ再生系
と共に、ＣｌｐＢ（２μｌ）およびＤｎａＫ（２μＭ）、ＤｎａＪ （０．４μ
Ｍ）、およびＧｒｐＥ（０．２μＭ）からなるＤｎａＫ系を添加した。３０℃で
４時間のインキュベーション後、可溶性および不溶性画分を遠心分離によって分
離し、標準的なプロトコールにしたがった二次元電気泳動によって分析した。図
５に示すように、ＣｌｐＢおよびＤｎａＫ系とのインキュベーション後に少なく
とも７０％の異なる凝集タンパク質種が可溶性の増加を示した（図５）。

【０１１７】 実施例４：ＤｎａＫ系／ＣｌｐＢの組み合わせにより熱感受性タンパク質がイン
ビトロで離解および再折りたたみする 種々のシャペロンの熱感受性試験タンパク質（マレートデヒドロゲナーゼ （
ＭＤＨ）およびホタルルシフェラーゼを含む）を離解および再折りたたみする能
力を分析するために一対の実験を行った。試験した全てのタンパク質で定性的に
類似の結果が得られ、ＭＤＨについての結果を図６および表３にまとめ、以下に
より詳細に記載する。

【０１１８】 ４７℃でのＭＤＨのインキュベーションにより、酵素活性の損失から判断した
ところ大きな凝集物が不活化および形成され、タンパク質溶液の光散乱（濁度）
が増加し、凝集物が顕微鏡で検出された。これを図６Ａに記載し、これは、４７
℃でのシャペロンを含まず、ＤＴＴ（１０ｍＭ）の存在下でのミトコンドリアＭ
ＤＨ（７２０ｎＭ）の時間依存性不活化および凝集（５５０ｎｍでの濁度の増加
）を示す。表３および図６Ａに示すように、ＡＴＰを含むか含まないＣｌｐＢお
よびＤｎａＫ系単独のいずれもＭＤＨの離解および再折りたたみに活性ではない
。それに対して、表３および図６Ｂに示すように（上記の熱処理であるがそれぞ
れ５００、１０００、２００、および１００ｎＭの濃度のＣｌｐＢ、ＤｎａＫ、
ＤｎａＪ、およびＧｒｐＥを補足した熱処理によって凝集されたＭＤＨの２５℃
での時間依存性凝集および再活性化を示す）、ＣｌｐＢおよびＤｎａＫ系の組み
合わせたＡＴＰ依存性活性により３０分以内に完全に可溶化され、３〜４時間以
内に３μＭ ＭＤＨまでがほとんど完全に再活性化された。

【０１１９】

【表３】

【０１２０】 表３の説明：ｔ＝０’（ｔ₀ ）またはｔ＝４５’（ｔ₄₅）のいずれかで凝集速度
を測定した。ほかで示さない限り、濃度を以下であった：ＭＤＨ．agg 、０．７
２μＭ；ＣｌｐＢ、０．５μＭ；ＤｎａＫ、１μＭ；ＤｎａＪ、０．２μＭ；Ｇ
ｒｐＥ、０．１μＭ；ＧｒｏＥＬ、４μＭ；ＧｒｏＥＳ、４μＭ；ｈｐｔＧ、１
μＭ。^* ＣｌｐＢおよびＡＴＰにより、離解よりもむしろさらに凝集した。表で
は、ＢはＣｌｐＢをいい、ＫＪＥはＤｎａＫ系（ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、およびＧ
ｒｐＥ）をいい、ＬＳはＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳをいい、ＨｓｃＡ／ＢはＨｓｃ
ＡおよびＨｓｃＢ（それぞれＤｎａＫおよびＤｎａＪのホモログ）をいう。

【０１２１】 実施例３および実施例４は、ＣｌｐＢおよびＤｎａＫ系がインビトロでの広範
な凝集タンパク質の可溶化および再活性化に非常に有効な共同シャペロンネット
ワークを形成することを示す。

【０１２２】 実施例５：ＤｎａＫ系−ＣｌｐＢ組み合わせのインビボ活性 ＤｎａＫ系およびＣｌｐＢの組み合わせが大腸菌におけるタンパク質凝集の形
成の逆行に有効であるかどうかを決定するために、インビボ実験を行った。野生
型細胞のタンパク質離解可能性を、ｃｌｐＢ（Squires ら、1991）またはｄｎａ
Ｋ（PaekおよびWalker、1987）のいずれかが欠失した変異株の可能性と比較した
。大腸菌野生型、ｄｎａＫ、およびｃｐｌＢ変異細胞を３０℃で指数関数的に増
殖させ、４５℃の熱ショックを与えてタンパク質の誤った折りたたみを誘導した
。熱ショック前および熱ショック後の図７（Ａ）に表示の時間の不溶性細胞画分
（膜タンパク質を含む）を遠心分離によって調製した。熱不安定性タンパク質を
、クーマシー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図７Ａ）、その後
免疫ブロッティング（図７ＢおよびＣ）によって視覚化し、同定した。野生型細
胞では、温度上昇により、凝集タンパク質はわずかで且つ一過性に蓄積されただ
けであった。ΔｄｎａＫ変異細胞では、上記で詳細に概説するように、多数およ
び大量の異なるタンパク質が不可逆的に凝集した。ΔｃｌｐＢ変異細胞では、図
７に示すように、温度上昇後少量の異なるタンパク質が凝集したが、３時間以内
では凝集しなかった。免疫検出を使用したＲＮＡポリメラーゼおよびＭｅｔＥタ
ンパク質のサブユニットについての細胞性タンパク質のこの凝集挙動を図７Ｃに
より詳細に記載する。

【０１２３】 これらの所見に基づいて、４５℃でのΔｄｎａＫ変異細胞中のタンパク質の広
範な凝集をその後のＣｌｐＢおよび／またはＤｎａＫ系の過剰産生によって逆行
することができるかどうかを同定するために、インビボ実験を行った。この目的
のために、培養培地へのＩＰＴＧの添加により各遺伝子の発現を誘導できるよう
にプラスミドを構築した。したがって、ｄｎａＫ遺伝子を欠き（ΔｄｎａＫ５２
）、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、およびｃｌｐＢを過剰発現するプラスミド（ｐｄｎａ
Ｋ／ｄｎａＪ／ｃｌｐＢ）を有する大腸菌変異細胞を３０℃で指数関数的に増殖
させた。細胞に、４５℃で３０分間熱ショックを与え、３０℃に２時間再び移し
た。ＩＰＴＧ（１ｍＭ）の添加によって、シャペロン合成の誘導を行った。ＩＰ
ＴＧの非存在下でのさらなるインキュベーションを、ネガティブコントロールと
して使用した。不溶性細胞画分（膜タンパク質を含む）を調製し、標準的なプロ
トコールにしたがった二次元ゲル電気泳動によって分析した（図８）。図８に示
すように、ｃｌｐＢ、ならびにｄｎａＫ、ｄｎａＪ、およびｇｒｐＥの発現誘導
により、３０℃で２時間以内に７０〜８０％の凝集タンパク質が有効に可溶化さ
れた。これらの所見は、ＣｌｐＢおよびＤｎａＫ系の共過剰発現によりインビボ
で広範な凝集タンパク質を可溶化しうることを示す。

【０１２４】 実施例６：ＣｌｐＢ、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、およびＧｒｐＥのプラスミドベース
の発現ならびにＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳシャペロン系 図９Ａおよび図９Ｂは、ＣｌｐＢ、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、およびｇｒｐＥを含
む組換えタンパク質の大腸菌における独立性同時過剰産生が可能なプラスミドベ
ースの発現ならびにＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳシャペロン系の略図を示す。Ｃｌｐ
Ｂ、ＤｎａＫ系、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ系、および組換え標的タンパク質系を
コードする遺伝子の発現を独立して調節可能な一対の共通プラスミド構築した。
この系は、Bujardおよび共同研究者（LutzおよびBujard、1997）によって開発さ
れたカセット様プラスミドのエレメントおよび修飾されたアラビノース制御発現
ベクター（Mayer 、1995）に基づく。

【０１２５】 カセット系を使用して、各シャペロンタンパク質の化学量論を野生型大腸菌細
胞で見出される正常な化学量論に調整するようにシャペロン遺伝子を発現させる
。この調整により、至適シャペロン活性が得られる（Packschiesら、1997）（未
公開の所見）。カセット系により、複製起点（例えば、ｃｏｌＥｌ、ｐｌ５Ａ、
ｐＳＣ１０１）が交換され、それにより約５／細胞〜５０／細胞のプラスミドコ
ピー数が交換される。シャペロン遺伝子の発現を、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター
Ｐａｌｌ１ａによって駆動させる（Lanzer、1998、LutzらBujard、1997）。抗生
物質耐性カセットにより、異なる耐性遺伝子（例えば、Ａｐ、Ｋｍ、Ｃｍ、Ｓｐ
）を選択する。アラビノース調節ベクターにより、アラビノース誘導性ＰｇＡＤ
プロモーター由来の組換え標的タンパク質の遺伝子を発現可能である（Mayer 、
1995）。適切な制限部位により、特定の用途による耐性遺伝子および複製起点の
交換が可能である。

【０１２６】 実施例の発現系は、シャペロンおよび標的タンパク質の同時過剰産生の１つの
可能性に過ぎない。当業者は、多くの異なるベクター系ならびに染色体に組み込
んだ発現系を容易に利用可能である。

【０１２７】 実施例７：高レベルの組換えタンパク質の産生に有用なプロテアーゼ欠損組換え
分子シャペロン系大腸菌産生株 大腸菌中で不安定な組換えタンパク質を高レベルで産生させるために、プロテ
アーゼ産生に影響を与える公開された染色体の利点を利用する特定の産生株を設
計した。この株は、転写アクチベーターδ³²をコードするｒｐｏＨ遺伝子の欠失
のために主要な細胞質基質プロテアーゼを欠損している（KusukawaおよびYura、
1988）。同時に、これは、挿入エレメントによるｇｒｏＥＳ ｇｒｏＥＬオペロ
ンの転写活性化によって、高レベルのＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを構成的に産
生する。この株をプラスミドベースのｃｌｐＢ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥ
、ｇｒｏＥＳ、およびｇｒｏＥＬならびに組換えタンパク質をコードする遺伝子
の調節過剰発現と組み合わせた。プロテアーゼ欠損とシャペロン過剰産生とのこ
の組み合わせにより、この株は多くの生物工学適用における産生株として非常に
有用になる。

【０１２８】 実施例８：タンパク質機能障害に関連する疾患の治療におけるシャペロンの用途 シャペロンは、アミロイドーシスおよびプリオン疾患に関連するタンパク質凝
集の防止および逆行に有用である。クロイツフェルト−ヤコブ病およびアルツハ
イマー病などのいくつかの神経退行性疾患および年齢関連性疾患は、しばしば細
胞傷害性を示すアミロイドプラークの形態の誤って折りたたまれたタンパク質の
蓄積に起因する。同様に、熱ショックなどの環境ストレスは、細胞死をまねく不
可逆的タンパク質凝集を誘導し得る。上記の実施例により、大腸菌ＣｌｐＢとＤ
ｎａＫシャペロンとの組み合わせを含む分子シャペロン系はインビトロならびに
インビボでの凝集タンパク質の活性離解および再活性化を媒介することが示され
る。この新規の組み合わせにより、タンパク質後折りたたみおよびプリオン疾患
、特に神経病理学的アミロイド疾患に対するヒトおよび他の動物の新規の方の細
胞内防御機構を特徴づけることができる研究の基礎が得られる。したがって、本
発明は、例えば、プリオン媒介疾患および年齢関連性アミロイド疾患を含む多数
の疾患用の治療設計ストラテジーとしてのヒトにおけるＨｓｐ７０系およびＣｌ
ｐＢまたはＨｓｐ１００同族体の対の作用を意図する。

【０１２９】 実施例９：初期タンパク質折りたたみに有用な誘発因子とＤｎａＫ系の組み合わ
せ ＤｎａＫ系および誘発因子のいずれも大腸菌の新規の合成タンパク質の初期折
りたたみに必須ではない（HesterkampおよびBukau 、1998、未発表データ）。図
１０Ａは、天然のδ³²プロモーター、またはｔｉｇ⁺ およびΔｔｉｇ：：ｋａｎ
背景の人工ＩＰＴＧ誘導プロモーターＰＡ １／ｌａｃＯによって調節される染
色体上のｄｎａＫ、ｄｎａＪオペロンの概略図である。野生型、Δｔｉｇ：：ｋ
ａｎ、およびＤｎａＫｉＤｎａＪ調節性Δｔｉｇ：：ｋａｎおよびｔｉｇ⁺ 細胞
培養物を、１ｍＭ ＩＰＴＧを含むか含まないＬＢプレート上に異なる希釈度（
１０⁵ 、１０⁴ 、１０³ 、１０² ｃｆｕ／ｍｌ、１０μｌ／スポット）でアプラ
イした。細胞を、３０℃、３７℃、および４２℃で２４時間ならびに１５℃で９
６時間インキュベートした。図１０Ｂは、誘発因子およびＤｎａＫの欠失は大腸
菌に致命的であることを示す。ＤｎａＫ／ＤｎａＪ欠失ｔｉｇ⁺ およびΔｔｉｇ
：：ｋａｎ細胞の培養物を、Ｍ９最少培地中で中間の対数期（ＯＤ６００＝０．
６）まで増殖させ、³⁵Ｓ−メチオニン（１５μＣｉ／ｍｌ最終濃度）で１５秒間
パルスした。同量の全タンパク質（１．２ｍｌの２ｍｇ／ｍｌ全タンパク質溶解
物）を遠心分離して不溶性タンパク質を単離し、標準的なプロトコールにしたが
って二次元ゲル電気泳動によって分析した（図１１ＡおよびＢ）。ホタルルシフ
ェラーゼ（レポータータンパク質）を標的タンパク質として使用した図１１は、
誘発因子を欠き（ｔｉｇ遺伝子の欠失のため）、ＤｎａＫを欠失し（ｄｎａＫの
発現のＩＰＴＧ調節遮断による）株において、レポータータンパク質（ホタルル
シフェラーゼ）は折りたたみ効率を減少させ、多数および大量の細胞性タンパク
質が天然の状態に到達できず、凝集できないことを示す。したがって、両シャペ
ロン系の組み合わせ作用は、大腸菌中に新規に合成されたタンパク質の折りたた
みに非常に有意である。さらに、広範な種々の真正細菌中の誘発因子およびＤｎ
ａＫホモログの存在は、これらの２つのシャペロン間の共同が原核生物の細胞質
基質におけるタンパク質折りたたみに一般的に重要であることを示唆する。

【０１３０】 この知識は、誘発因子のおそらくＤｎａＫ系と必要としない過剰産生による原
核生物の折りたたみ効率の改良に有用である。さらに、例えばゲノムの機能的分
析用に現在開発されているインビトロタンパク質合成系（インビトロ翻訳系）へ
の誘発因子の添加により、タンパク質産物の折りたたみ効率を増加させることが
できる。

【０１３１】 実施例１０：ＣｌｐＳ−新規のＨｓｐ１００ファミリーコシャペロンをコードす
る大腸菌遺伝子の同定 ｙｌｊＡ−ｃｌｐＡオペロン中の第１の遺伝子である大腸菌遺伝子「ｙｌｊＡ
」を、標準的なプロトコールを使用してクローン化した。ｙｌｊＡ遺伝子は、３
１８ｂｐ長であり、「ＣｌｉｐＳ」と呼ばれる１０６アミノ酸のタンパク質をコ
ードする。図１２は、ｙｌｊＡのＤＮＡ配列（配列番号：１）およびＣｌｐＳタ
ンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。これらを表４に同定し、
図１３はＣｌｐＳホモログ（配列番号：３〜配列番号：９）のアミノ酸配列アラ
インメントを示す。表４で同定したタンパク質はＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ検
索の結果ならびに代表的な推定ＣｌｐＳホモログである。大腸菌でそうであるよ
うに、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori ）（ＨＰ００３２）ホモ
ログがＣｌｐＡホモログを有するオペロン中に出現することに留意することは興
味深い。全タンパク質と３３％相同性であるにもかかわらず、ＨＰ００３２は配
列同一性および位置に基づくとＣｌｐＳホモログであると考えられる。

【０１３２】 表５および表６は、それぞれ、ＣｌｐＳホモログの全配列類似性、Ｈ−ＢＯＸ
領域における配列類似性（図１３を参照のこと）、ＣｌｐＳホモログにおける進
化を通して保存された領域を示す。図１３中の配列は、「Clustal 」法（Higgin
s およびSharp 、Gene、15、237 〜44、1988）によって整列させ、表５および表
６中の配列類似性を、「Megalign」プログラム（Clewley およびArnold、Method
s Mol.Biol.70 ：119 〜29、1997）を用いて計算した。

【０１３３】

【表４】

【０１３４】

【表５】

【０１３５】

【表６】

【０１３６】 実施例１１：ＣｌｐＳを、ＣｌｐＡのコシャペロンとして確立する マレートデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）（０．９μＭ）を、シャペロンの非存在
下で、４７℃で３０分間のインキュベーションによって凝集させた。図１４に関
して、凝集後、シャペロンの非存在下（黒塗りの三角）、０．５μＭ ＣｌｐＳ
（黒塗りのひし形）、０．５μＭ ＣｌｐＡ（白抜きの三角）、または０．５μ
Ｍ ＣｌｐＡ＋０．５μＭ ＣｌｐＳ（黒塗りの丸）の存在下のＭＤＨ活性を監
視した。図１４に示すように、シャペロンの非存在下またはＣｌｐＳのみの存在
下では、ＭＤＨは有意な活性を回復しなかった。ＣｌｐＡのみの存在下では、３
００分後に３０％までのＭＤＨ活性が得られた。ＣｌｐＳをＣｌｐＡに補足した
場合、ＭＤＨ活性の割合および量の両方が２倍以上に増大した。したがって、Ｃ
ｌｐＳは、ＣｌｐＡの強力なコシャペロンとして確立される。

【０１３７】 実施例１２：ＤｎａＫ／ＤｎａＪ枯渇条件下で、プロテアーゼ欠失細胞は凝集タ
ンパク質を蓄積する この実験は、プロテアーゼＬｏｎおよびＣｌｐＸＰは低シャペロン含有率 （
ＤｎａＫ／ＤｎａＪ）での大腸菌細胞におけるタンパク質凝集体の排除に重要で
あることを示す。したがって、大腸菌産生株またはインビトロ翻訳系で産生され
た組換えタンパク質の収量を、ＣｌｐＸＰおよびＬｏｎを欠く変異体の使用によ
って改良することができる。

【０１３８】 Ａ．ＢＢ７３４９株（ＰＡ１／ｌａｃＯ−１ ｄｎａＫ、ｄｎａＪ ｌａｃＩ
ｑ）、ＢＢ７３５３株（ＰＡ１／ｌａｃＯ−１ ｄｎａＫ、ｄｎａＪ ｌａｃＩ
ｑ ｈｓｌＶＵ）、ＢＢ７３５７（ＰＡ１／ｌａｃＯ−１ ｄｎａＫ、ｄｎａＪ
ｌａｃＩｑ ｃｌｐＰＸ−ｌｏｎ）、ＢＢ７３６１（ＰＡ１／ｌａｃＯ−１
ｄｎａＫ、ｄｎａＪ ｌａｃＩｑ ΔｈｓｌＶＵ ｃｌｐＰＸ−ｌｏｎ）の細胞
を、１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ培地中で３０℃で一晩増殖させた。予備培養物
を５００ｍＭ ＩＰＴＧを含むか含まないＬＢ培地で１０００倍に希釈し、後期
対数期（約ＯＤ６００＝１）までさらに培養した。８ｍｌの培養物から凝集タン
パク質を単離し、ＮＰ４０での洗浄によって膜タンパク質を取り除いた。３．２
ｍｌの培養物／ＯＤ６００由来の凝集タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびク
ーマシーブリリアントブルーでの染色によって分析した。全細胞溶解物および凝
集タンパク質画分のアリコートを、ブラッドフォードアッセイによって定量した
。ＰＡ／ｌａｃＯ−１ Ｋ、Ｊ；ＢＢ７３４９、ΔＶＵ；ＢＢ７３５３、ΔＸＰ
ｌｏｎ；ＢＢ７３５７、ΔＸＰ ｌｏｎ ΔＶＵ；ＢＢ７３６１、＋；５００
ｍＭ ＩＰＴＧの存在下での培養、−；ＩＰＴＧなしでの培養。

【０１３９】 Ｂ．１０００倍希釈の培養物を、いくつかの濃度のＩＰＴＧ（０、５０、５０
０ｍＭ）を含むＬＢ中で中間の対数期（約ＯＤ＝０．５）までさらに培養し、４
２℃で２時間さらに培養した。上記のように８ｍｌの培養物から凝集タンパク質
を単離し、膜タンパク質を取り除いた。上記のように、１．６ｍｌの培養物／Ｏ
Ｄ６００由来の凝集タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、定量した。全タン
パク質％を凝集タンパク質の量を細胞中の全タンパク質の量で割ることによって
計算した。

【０１４０】 実施例１３：Ｃｌｐ３およびＤｎａｋ系の過剰産生は、ｒｐｏＨおよび野生型細
胞の熱耐性およびルシフェラーゼ再折りたたみを改良する この実験（図１５）では、ＣｌｐＢとＤｎａＫ系が共同して、（ｉ）致死的熱
ショック温度での細胞の生存度（ｒｐｏＨ変異体）および（ｉｉ）致死的熱ショ
ック温度への一過性暴露に供したｒｐｏＨおよび野生型細胞における熱不安定性
レポーター酵素（ホタルルシフェラーゼ）の再活性化を改良するように作用する
ことを示す。

【０１４１】 Ａ．（ΔｒｐｏＨ細胞）；ＣｌｐＢ（プラスミドから過剰産生したＣｌｐＢを
含むΔｒｐｏＨ細胞）；ＫＪＥ（プラスミドから過剰産生したＤｎａＫ、Ｄｎａ
Ｊ、ＧｒｐＥを含むΔｒｐｏＨ細胞）；ＫＪＥ，ＣｌｐＢ（プラスミドから過剰
産生したＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、およびＣｌｐＢを含むΔｒｐｏＨ細胞
）を、ＣｌｐＢ、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥをコードするプラスミドの発現
を誘導する２５０ｍＭ ＩＰＴＧを補足したＬＢ培地中、３０℃で増殖させた。
細胞を表示の測定点で５０℃で処理し、２５０ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天プ
レート上にプレートした。４８時間のインキュベーション後、コロニー数を計数
し、生存度を同定した。コントロールとして、非熱処理細胞を１００％とした。

【０１４２】 Ｂ．アラビノース誘導性ルシフェラーゼを含むＷＴ（野生型細胞）；（Δｒｐ
ｏＨ細胞）；ＣｌｐＢ（過剰産生したＣｌｐＢを含むｒｐｏＨ細胞）；ＫＪＥ（
過剰産生したＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥを含むΔｒｐｏＨ細胞）；ＫＪＥ，
ＣｌｐＢ（過剰産生したＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、およびＣｌｐＢを含む
ΔｒｐｏＨ細胞）；およびＥＳＬ（過剰産生したＧｒｏＥＳＬを含むΔｒｐｏＨ
細胞）を、２５０ｍＭ ＩＰＴＧを補足したＬＢ培地中で増殖させ、アラビノー
ス（０．４％）の存在下で３０分間ルシフェラーゼを誘導した。アリコート（同
一のＯＤ、１００ｍｌ）を、テトラサイクリン（１００ｍｇ／ｍｌ）およびグル
コース（１％）の存在下、５０℃で０、２．５、５、７．５分間インキュベート
した後、３０℃で１０分間さらにインキュベートした。回収率（％）を、非熱処
理細胞のルシフェラーゼ活性（１００％）と比較して計算した。

【０１４３】 本発明の上記の記載は、例示および説明の目的で示している。本明細書中で先
に記載の好ましい態様は、当業者が本発明を種種の態様で、本発明の特定の適用
または用途に適合させた種々の修正を伴って利用可能であることが意図される。

【０１４４】 さらに、本記載は、本明細書中に開示の形態に本発明を制限することを意図し
ない。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書中に記載の特定の態様
の多くの均等物を認識または確認することができる。このような均等物は、以下
の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

【０１４５】 参考文献 Buchberger, A., Schroder, H., Hesterkamp, T., Schonfeld, H.-J., および B
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pB、およびHtpGとの比較. J. Bacteriology 180(19):5165-5172. Tomoyasu, T., Ogura, T., Tatsuta, T.,および Bukau, B. (1998). DnaK およ
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復の緊縮調節を提供する. Mol. Microbiol. 30, 567-581. Turnell, W. G., および Finch, J. T. (1992). アミロイドタンパク質ブタイン
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性に対する異なる機構. J. Biol. Chem. 268, 25425-25431.

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、細胞抽出物中の細胞質基質シャペロン系による熱誘導性
タンパク質凝集の防止を示す図である。

【図２】 図２は、４２℃での熱ショック後の野生型およびＤｎａＫ変異細
胞におけるタンパク質凝集を示す図である。

【図３】 図３は、細胞抽出物中の熱不安定性タンパク質の凝集を示す図で
ある。

【図４】 図４は、他の分子シャペロンと比較したＤｎａＫ系とＣｌｐＢと
を組み合わせた分子シャペロン系によるインビトロでのタンパク質凝集の離解を
示す図である。

【図５】 図５は、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、およびＣｌｐＢによる
インビトロでのタンパク質凝集の離解を示すゲル電気泳動を示す図である。

【図６】 図６は、熱不活化マレートデヒドロゲナーゼのＣｌｐＢおよびＤ
ｎａＫ媒介性離解および再活性化を示す図である。

【図７】 図７は、大腸菌野生型ならびにｄｎａｋおよびｃｌｐＢヌル変異
細胞におけるインビボでの熱ショック後の凝集タンパク質の離解を示す図である
。

【図８】 図８は、インビボでのＤｎａＫ、ＤｎａＪ、およびＣｌｐＢによ
るタンパク質凝集体の離解を示す図である。

【図９】 図９は、大腸菌におけるシャペロン過剰産生系の模式図である。

【図１０】 図１０は、ＤｎａＫ／ＤｎａＪ欠失Ａｔｉｇ：：ｋａｎ細胞の
合成死滅率を示す図である。

【図１１】 図１１は、既存および新規合成タンパク質の不溶性を示す図で
ある。

【図１２】 図１２は、ＹｌｊＡタンパク質の核酸配列（配列番号：１）お
よび推定アミノ酸配列（配列番号：２）を示す図である。

【図１３】 図１３は、ＣｌｐＳホモログのアミノ酸配列アラインメントを
示す図である。

【図１４】 図１４は、ＣｌｐＡ／ＣｌｐＳ系がマレートデヒドロゲナーゼ
を再活性化することを示す図である。

【図１５】 図１５は、ＣｌｐＢおよびＤｎａＫ系の過剰産生がｒｐｏＨお
よび野生型細胞の熱耐性およびルシフェラーゼ再折りたたみを改良することを示
す図である。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１２月４日（２００１．１２．４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｐ 25/02 ４Ｈ０４５ 48/00 25/14 Ａ６１Ｐ 25/02 25/28 25/14 35/00 25/28 43/00 １０５ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/00 43/00 １０５ 14/245 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 14/245 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 15/00 ＺＮＡＡ 1/21 5/00 Ａ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ゴロービノフ，ピエール イスラエル国 エルサレム 93855 ハド レフ ストリート 429／２ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA08 BA80 CA02 DA01 DA02 DA06 DA07 DA12 EA04 GA11 4B065 AA19X AA26X AA26Y AA41X AA46X AA50X AA53X AA77X AA80X AA88X AA90X AA91X AA93X AB01 AC14 BA02 CA24 CA28 CA31 CA43 CA44 4C084 AA07 AA13 BA44 CA04 DC50 MA02 NA14 ZA161 ZA221 ZB211 ZB261 ZC411 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 MA10 NA14 ZA16 ZA22 ZB21 ZB26 ZC41 4C087 AA01 AA02 BC34 BC83 CA12 MA02 NA14 ZA16 ZA22 ZB21 ZB26 ZC41 4H045 AA10 AA30 BA10 CA11 DA89 EA20 EA21 EA28 FA72 FA73 FA74

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標的タンパク質を、少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク
   質またはそのホモログからなる群から選択された第１のタンパク質および少なく
   とも１つのＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログからなる群より選択された
   第２のタンパク質を含有する分子シャペロン系と接触させる工程を含み、それに
   より標的タンパク質のコンホメーションを調節する、標的タンパク質のコンホメ
   ーションの調節方法。
2. 【請求項２】 第１のタンパク質がＣｌｐホモログを含む、請求項１記載の
   方法。
3. 【請求項３】 ＣｌｐホモログがＣｌｐＡ、ＣｌｐＢまたはＣｌｐＸである
   、請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 第２のタンパク質が、原核生物のホモログを含むＤｎａＫで
   ある、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 ＤｎａＫシャペロン系と組み合わせてＣｌｐＢが使用される
   、請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 分子シャペロン系が少なくとも１つのコシャペロンをさらに
   含む、請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 標的タンパク質が宿主細胞において組換え発現される、請求
   項１記載の方法。
8. 【請求項８】 第１および第２のタンパク質が宿主細胞において組換え発現
   される、請求項１記載の方法。
9. 【請求項９】 宿主細胞が、大腸菌、Ｓ．セレビシエ、枯草菌、植物、昆虫
   、酵母または哺乳動物の細胞である、請求項１記載の方法。
10. 【請求項１０】 第１および第２のタンパク質をコードし、かつＧｒｏＥＬ
    −ＧｒｏＥＳ系もしくはそのホモログ、ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ系タンパク質も
    しくはそのホモログ、または誘発因子もしくはそのホモログを組換え発現しうる
    ベクターで宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることにより、第１お
    よび第２のタンパク質が組換え発現される、請求項８記載の方法。
11. 【請求項１１】 標的タンパク質がインビトロで凝集または離解される、請
    求項１記載の方法。
12. 【請求項１２】 少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモ
    ログおよび少なくとも１つのＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログをコード
    してなる組換え発現ベクター。
13. 【請求項１３】 誘導性組換え発現ベクターである、請求項１２記載のベク
    ター。
14. 【請求項１４】 少なくとも１つのＨｓｐ７０タンパク質コシャペロンをさ
    らにコードしてなる、請求項１２記載のベクター。
15. 【請求項１５】 目的のタンパク質をさらにコードしてなる、請求項１２記
    載のベクター。
16. 【請求項１６】 請求項１２記載のベクターで形質転換されてなる細胞。
17. 【請求項１７】 細胞が、プロテアーゼ欠損した原核細胞または真核細胞で
    ある、請求項１６記載の細胞。
18. 【請求項１８】 プロテアーゼ欠損が、ｒｐｏＨ遺伝子中の変異により引き
    起こされたものである、請求項１７記載の細胞。
19. 【請求項１９】 変異がｒｐｏＨ遺伝子の染色体欠失である、請求項１８記
    載の細胞。
20. 【請求項２０】 細胞が目的のタンパク質を組換え発現するものである、請
    求項１６記載の細胞。
21. 【請求項２１】 目的のタンパク質がマレートデヒドロゲナーゼである、請
    求項２０記載の細胞。
22. 【請求項２２】 凝集したタンパク質を、少なくとも１つのＨｓｐ１００タ
    ンパク質またはそのホモログおよび少なくとも１つのＨｓｐ７０タンパク質また
    はそのホモログを含有する分子シャペロン系と接触させる工程を含み、それによ
    り凝集したタンパク質を離解させる、凝集したタンパク質のインビトロでの離解
    方法。
23. 【請求項２３】 少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモ
    ログおよび少なくとも１つのＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログを含有す
    る分子シャペロン系を共発現させる工程を含み、それにより組換え発現タンパク
    質の溶解性を増大させる、組換え発現タンパク質の溶解性の増大方法。
24. 【請求項２４】 タンパク質の誤った折り畳みおよび凝集を防ぐために、少
    なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモログおよび少なくとも１
    つのＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログを含有する分子シャペロン系の治
    療有効量を投与する工程を含み、それにより細胞死を防止する、タンパク質の誤
    った折り畳みおよび凝集により引き起こされる細胞死の防止方法。
25. 【請求項２５】 少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモ
    ログおよび少なくとも１つのＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログを含有す
    る分子シャペロン系の治療有効量を投与する工程を含み、それにより疾患を治療
    する、タンパク質の誤った折り畳みおよび凝集により引き起こされる動物の疾患
    の治療方法。
26. 【請求項２６】 疾患が、クロイツフェルト−ヤコブ病、アルツハイマー病
    、ハンティングトン病、運動失調１型、嚢胞性線維症または癌である、請求項２
    ５記載の方法。
27. 【請求項２７】 少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモ
    ログおよび少なくとも１つのＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモログを含有し
    てなる分子シャペロン系の有効用量ならびに薬学的に許容されるキャリアを含有
    してなる医薬組成物。
28. 【請求項２８】 誘発因子をインビトロタンパク質合成系に添加する工程を
    含み、それによりインビトロでタンパク質の折り畳み効率を増大させる、インビ
    トロでの標的タンパク質の折り畳み効率の増大方法。
29. 【請求項２９】 少なくとも１つのＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモロ
    グを含有する分子シャペロン系をインビトロ合成系に添加する工程をさらに含む
    、請求項２８記載の方法。
30. 【請求項３０】 細胞において誘発因子を組換え発現させ、それにより細胞
    においてタンパク質の折り畳み効率を増大させる工程を含む、細胞におけるタン
    パク質の折り畳み効率の増大方法。
31. 【請求項３１】 少なくとも１つのＨｓｐ７０タンパク質またはそのホモロ
    グを含有する分子シャペロン系を組換え発現させる工程をさらに含む、請求項３
    ０記載の方法。
32. 【請求項３２】 （ａ）配列番号：１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレ
    オチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリヌクレオチド
    ； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して８０％の同一性を有して
    なるポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号：２のタンパク質をコードしてなるポリヌクレオチド； （ｅ）配列番号：２のタンパク質に対して８０％の同一性を有してなるポリペプ
    チドをコードするポリヌクレオチド； （ｆ）離解において、Ｈｓｐ１００タンパク質またはそのホモログの活性を調節
    しうるタンパク質をコードしてなる（ａ）〜（ｅ）のポリペプチドに対して８０
    ％の同一性を有してなるポリヌクレオチド；および （ｇ）（ａ）〜（ｆ）に記載されるポリヌクレオチドのいずれか１つにストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、 からなる群から選択されてなる単離されたポリ核酸分子。
33. 【請求項３３】 （ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるポリペプ
    チド； （ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して８０％の同一性を有してなるポリペ
    プチド； （ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列のポリペプチドバリアント； （ｄ）離解において、Ｈｓｐ１００タンパク質またはそのホモログの活性を調節
    しうる配列番号：２のアミノ酸配列のポリペプチドバリアント； （ｅ）ＣｌｐＡを介助しうる配列番号：２のアミノ酸配列のポリペプチドバリア
    ント； （ｆ）配列番号：１の配列を有してなるポリヌクレオチドによりコードされるポ
    リペプチド； （ｇ）配列番号：１の配列に対して８０％の同一性を有してなるポリヌクレオチ
    ドによりコードされるポリペプチド；および （ｈ）配列番号：１の配列を有するポリヌクレオチドに対してストリンジェント
    な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチ
    ド、 からなる群より選択されてなる単離されたポリペプチド。
34. 【請求項３４】 バリアントが、挿入バリアント、欠失バリアント、または
    置換バリアントである、請求項３３記載のポリペプチド。
35. 【請求項３５】 少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモ
    ログからなる群より選択された第１のタンパク質、および少なくとも１つのＨｓ
    ｐ７０タンパク質またはそのホモログからなる群より選択された第２のタンパク
    質を含有してなる分子シャペロン系をコードする遺伝子治療ベクターを含有して
    なる医薬組成物を投与する工程を含む、疾患を治療するための遺伝子治療。
36. 【請求項３６】 少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモ
    ログからなる群より選択された第１のタンパク質、および少なくとも１つのＨｓ
    ｐ７０タンパク質またはそのホモログからなる群より選択された第２のタンパク
    質をコードする遺伝治療ベクターを含有してなる、請求項３５記載の遺伝子治療
    のための組成物。
37. 【請求項３７】 少なくとも１つのＨｓｐ１００タンパク質またはそのホモ
    ログからなる群より選択された第１のタンパク質、および少なくとも１つのＨｓ
    ｐ７０タンパク質またはそのホモログからなる群より選択された第２のタンパク
    質を含有してなる単離された分子シャペロン系。
38. 【請求項３８】 Ｈｓｐ１００タンパク質を請求項３３記載のポリペプチド
    と接触させる工程を含む、Ｈｓｐ１００タンパク質またはそのホモログの活性の
    調節方法。