JPH119274A - シャペロン発現プラスミド - Google Patents
シャペロン発現プラスミドInfo
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- JPH119274A JPH119274A JP9180558A JP18055897A JPH119274A JP H119274 A JPH119274 A JP H119274A JP 9180558 A JP9180558 A JP 9180558A JP 18055897 A JP18055897 A JP 18055897A JP H119274 A JPH119274 A JP H119274A
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】大腸菌の菌体内で外来蛋白質を安定化かつ可溶
化させて発現するために用いられるシャペロンをコード
するオペロン、該オペロンを有する発現プラスミド、該
プラスミドを外来蛋白質発現ベクターと共に大腸菌に導
入して得られる共形質転換菌および該共形質転換菌を用
いる外来蛋白質の製造方法を提供すること。 【解決手段】ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥのシャ
ペロンをコードする人工オペロン、該人工オペロンを有
し、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを発現するプラ
スミド、該プラスミドを外来蛋白質発現ベクターと共に
大腸菌に導入して得られる共形質転換菌および該共形質
転換菌を用いることを特徴とする外来蛋白質の製造方
法。
化させて発現するために用いられるシャペロンをコード
するオペロン、該オペロンを有する発現プラスミド、該
プラスミドを外来蛋白質発現ベクターと共に大腸菌に導
入して得られる共形質転換菌および該共形質転換菌を用
いる外来蛋白質の製造方法を提供すること。 【解決手段】ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥのシャ
ペロンをコードする人工オペロン、該人工オペロンを有
し、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを発現するプラ
スミド、該プラスミドを外来蛋白質発現ベクターと共に
大腸菌に導入して得られる共形質転換菌および該共形質
転換菌を用いることを特徴とする外来蛋白質の製造方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、シャペロン発現プ
ラスミドに関する。さらに詳しくは、ＤｎａＫ、Ｄｎａ
ＪおよびＧｒｐＥのシャペロンをコードするオペロン、
該オペロンを有する発現プラスミド、該プラスミドを外
来蛋白質発現ベクターと共に大腸菌に導入して得られる
共形質転換菌および該共形質転換菌を用いる外来蛋白質
の製造方法に関する。
ラスミドに関する。さらに詳しくは、ＤｎａＫ、Ｄｎａ
ＪおよびＧｒｐＥのシャペロンをコードするオペロン、
該オペロンを有する発現プラスミド、該プラスミドを外
来蛋白質発現ベクターと共に大腸菌に導入して得られる
共形質転換菌および該共形質転換菌を用いる外来蛋白質
の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】大腸菌は容易に高密度に増殖し、しかも
宿主ベクター系の研究が最も進んでおり、多くの高発現
ベクターが開発されるなど、異種蛋白質を安価にかつ収
率よく生産するための宿主として最適であることから、
大腸菌の宿主ベクター系は異種遺伝子の発現系として最
も広く利用されている。
宿主ベクター系の研究が最も進んでおり、多くの高発現
ベクターが開発されるなど、異種蛋白質を安価にかつ収
率よく生産するための宿主として最適であることから、
大腸菌の宿主ベクター系は異種遺伝子の発現系として最
も広く利用されている。
【０００３】しかし、多くの異種蛋白質、特に真核生物
蛋白質は大腸菌内で高発現させると、細胞質内で会合し
生物学的に不活性な不溶性の封入体と呼ばれるアグリゲ
ートを形成する。封入体の形成は、発現蛋白質を宿主菌
体内の蛋白質分解酵素による分解から保護し、また遠心
分離により菌体から容易に分離することを可能ならしめ
るという利点を持つが、目的である生物学的に活性な蛋
白質を得るためには、封入体を変性可溶化した後、再生
（リフォールディング）する必要がある。この可溶化・
再生の操作は、個々の蛋白質ごとに試行錯誤を繰り返し
経験的に行われているが、満足な回収率が得られないこ
とが多いばかりか、必ずしも再生できるとは限らない。
また、大腸菌でプロテアーゼにより分解を受けて、高い
発現量に達しない異種蛋白質も少なくない。このような
発現産物の不溶化や分解に対する解決手段はまだ十分に
確立されたとは言い難く、大腸菌で生物学的に活性な蛋
白質を大量に生産することには必ずしも成功していない
のが現状である。この問題を解決するために、シャペロ
ン等を共発現させることが試みられており、いくつかの
報告がなされている。
蛋白質は大腸菌内で高発現させると、細胞質内で会合し
生物学的に不活性な不溶性の封入体と呼ばれるアグリゲ
ートを形成する。封入体の形成は、発現蛋白質を宿主菌
体内の蛋白質分解酵素による分解から保護し、また遠心
分離により菌体から容易に分離することを可能ならしめ
るという利点を持つが、目的である生物学的に活性な蛋
白質を得るためには、封入体を変性可溶化した後、再生
（リフォールディング）する必要がある。この可溶化・
再生の操作は、個々の蛋白質ごとに試行錯誤を繰り返し
経験的に行われているが、満足な回収率が得られないこ
とが多いばかりか、必ずしも再生できるとは限らない。
また、大腸菌でプロテアーゼにより分解を受けて、高い
発現量に達しない異種蛋白質も少なくない。このような
発現産物の不溶化や分解に対する解決手段はまだ十分に
確立されたとは言い難く、大腸菌で生物学的に活性な蛋
白質を大量に生産することには必ずしも成功していない
のが現状である。この問題を解決するために、シャペロ
ン等を共発現させることが試みられており、いくつかの
報告がなされている。
【０００４】ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥは、蛋
白質の折り畳み（フォールディング）に協調して働くシ
ャペロンである。まず、ＤｎａＪが、基質である折り畳
まれていない蛋白質に結合すると、ＤｎａＫ上のＡＴＰ
が加水分解され、折り畳まれていない蛋白質−ＤｎａＪ
−ＤｎａＫ（ＡＤＰ結合型）複合体を形成し、次に、Ｇ
ｒｐＥによって、ＡＤＰ／ＡＴＰ交換が起こり、基質蛋
白質が複合体から遊離すると考えられている[Szabo, A.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10345-1034
9(1994)]。
白質の折り畳み（フォールディング）に協調して働くシ
ャペロンである。まず、ＤｎａＪが、基質である折り畳
まれていない蛋白質に結合すると、ＤｎａＫ上のＡＴＰ
が加水分解され、折り畳まれていない蛋白質−ＤｎａＪ
−ＤｎａＫ（ＡＤＰ結合型）複合体を形成し、次に、Ｇ
ｒｐＥによって、ＡＤＰ／ＡＴＰ交換が起こり、基質蛋
白質が複合体から遊離すると考えられている[Szabo, A.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10345-1034
9(1994)]。
【０００５】大腸菌染色体上では、ｄｎａＫおよびｄｎ
ａＪ遺伝子は同一オペロン上にあるが、ｇｒｐＥ遺伝子
は離れて存在する。これまで、ＤｎａＫ単独またはＤｎ
ａＫおよびＤｎａＪを目的蛋白質と共発現させた例[Blu
m, P. et al., BioTechnol.10, 301-304(1992); Perez-
Perez, J. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.210,
524-529(1995)]、ＤｎａＪ単独を目的蛋白質と共発現さ
せた例（特開平８−３０８５６４号公報）、ＤｎａＫお
よびＤｎａＪとＧｒｐＥとをそれぞれ別のプラスミドか
ら発現させた例[Caspers, P. et al., Cell. Mol. Bio
l. 40,635-644(1994)] ならびに同一プラスミドからＤ
ｎａＫおよびＤｎａＪとＧｒｐＥとを同じプロモーター
を用いて独立に発現させる例[Stieger, M. & Caspers,
P., Immunology Methods Manual, 39-44(1997)] が知ら
れてるが、これらの方法にはそれぞれ次のような問題点
がある。
ａＪ遺伝子は同一オペロン上にあるが、ｇｒｐＥ遺伝子
は離れて存在する。これまで、ＤｎａＫ単独またはＤｎ
ａＫおよびＤｎａＪを目的蛋白質と共発現させた例[Blu
m, P. et al., BioTechnol.10, 301-304(1992); Perez-
Perez, J. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.210,
524-529(1995)]、ＤｎａＪ単独を目的蛋白質と共発現さ
せた例（特開平８−３０８５６４号公報）、ＤｎａＫお
よびＤｎａＪとＧｒｐＥとをそれぞれ別のプラスミドか
ら発現させた例[Caspers, P. et al., Cell. Mol. Bio
l. 40,635-644(1994)] ならびに同一プラスミドからＤ
ｎａＫおよびＤｎａＪとＧｒｐＥとを同じプロモーター
を用いて独立に発現させる例[Stieger, M. & Caspers,
P., Immunology Methods Manual, 39-44(1997)] が知ら
れてるが、これらの方法にはそれぞれ次のような問題点
がある。
【０００６】すなわち、互いに協調的に働くＤｎａＫ、
ＤｎａＪおよびＧｒｐＥは、同時に共発現させた方が効
果が大きいと考えられ、ＤｎａＫ単独またはＤｎａＫお
よびＤｎａＪだけを発現させても本来もっているシャペ
ロン機能を十分に発揮させていない可能性が高い。ま
た、ＤｎａＫおよびＤｎａＪとＧｒｐＥとを別のプラス
ミドから発現させる方法では、目的蛋白質の発現プラス
ミドとあわせて計３つのプラスミドを大腸菌内に共存さ
せることが難しいことから、ＧｒｐＥと目的蛋白質の遺
伝子を１つのプラスミドにのせており、個々の目的蛋白
質に応じて、発現プラスミドを構築しなければならな
い。しかも、ＧｒｐＥと目的蛋白質の発現に同じプロモ
ーターを利用していることから、目的蛋白質の発現量を
十分に高められないという欠点もある。さらに、同一プ
ラスミドからＤｎａＫおよびＤｎａＪとＧｒｐＥとを同
じプロモーターを用いて独立に発現させる方法は、同じ
プロモーターが２個重複して存在していることから、プ
ラスミドの安定性にも問題がある。
ＤｎａＪおよびＧｒｐＥは、同時に共発現させた方が効
果が大きいと考えられ、ＤｎａＫ単独またはＤｎａＫお
よびＤｎａＪだけを発現させても本来もっているシャペ
ロン機能を十分に発揮させていない可能性が高い。ま
た、ＤｎａＫおよびＤｎａＪとＧｒｐＥとを別のプラス
ミドから発現させる方法では、目的蛋白質の発現プラス
ミドとあわせて計３つのプラスミドを大腸菌内に共存さ
せることが難しいことから、ＧｒｐＥと目的蛋白質の遺
伝子を１つのプラスミドにのせており、個々の目的蛋白
質に応じて、発現プラスミドを構築しなければならな
い。しかも、ＧｒｐＥと目的蛋白質の発現に同じプロモ
ーターを利用していることから、目的蛋白質の発現量を
十分に高められないという欠点もある。さらに、同一プ
ラスミドからＤｎａＫおよびＤｎａＪとＧｒｐＥとを同
じプロモーターを用いて独立に発現させる方法は、同じ
プロモーターが２個重複して存在していることから、プ
ラスミドの安定性にも問題がある。
【０００７】大腸菌内で外来蛋白質の分解を低減させる
ために、プロテアーゼ変異株を宿主大腸菌として用いる
ことが知られており、例えば、Ｌｏｎプロテアーゼの欠
失変異株等が好んで用いられる。さらに、Ｌｏｎおよび
Ｃｌｐプロテアーゼの発現誘導は、ｒｐｏＨ遺伝子がコ
ードするσ32により制御されていることから、かかるプ
ロテアーゼ活性を抑制するため、ｒｐｏＨ変異株を用い
る発現方法が知られている（特表昭６１−５０１３０７
号公報、国際公開第８５／０３９４９号パンフレッ
ト）。また、ｃｌｐＰＸ遺伝子およびｌｏｎ遺伝子の二
重変異株を用いる外来蛋白質の安定発現方法も知られて
いる（特開平８−１４０６７１号公報）。
ために、プロテアーゼ変異株を宿主大腸菌として用いる
ことが知られており、例えば、Ｌｏｎプロテアーゼの欠
失変異株等が好んで用いられる。さらに、Ｌｏｎおよび
Ｃｌｐプロテアーゼの発現誘導は、ｒｐｏＨ遺伝子がコ
ードするσ32により制御されていることから、かかるプ
ロテアーゼ活性を抑制するため、ｒｐｏＨ変異株を用い
る発現方法が知られている（特表昭６１−５０１３０７
号公報、国際公開第８５／０３９４９号パンフレッ
ト）。また、ｃｌｐＰＸ遺伝子およびｌｏｎ遺伝子の二
重変異株を用いる外来蛋白質の安定発現方法も知られて
いる（特開平８−１４０６７１号公報）。
【０００８】しかし、σ32は、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、Ｇ
ｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ等のシャペロンの
発現誘導も制御している。ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ
が大腸菌の生育に必須で、ｒｐｏＨ欠失変異株は２０℃
を越える温度では増殖できないことから、従来、ｒｐｏ
Ｈ変異株（ｈｔｐＲ変異株）としては、ミスセンス変異
が用いられてきた。しかし、より完全にＬｏｎおよびＣ
ｌｐ等の種々のプロテアーゼの発現誘導を抑えるために
は、ｒｐｏＨ欠失変異株を用いることが望まれる。
ｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ等のシャペロンの
発現誘導も制御している。ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ
が大腸菌の生育に必須で、ｒｐｏＨ欠失変異株は２０℃
を越える温度では増殖できないことから、従来、ｒｐｏ
Ｈ変異株（ｈｔｐＲ変異株）としては、ミスセンス変異
が用いられてきた。しかし、より完全にＬｏｎおよびＣ
ｌｐ等の種々のプロテアーゼの発現誘導を抑えるために
は、ｒｐｏＨ欠失変異株を用いることが望まれる。
【０００９】大腸菌内で不溶化する外来蛋白質を可溶化
するために、外来蛋白質をＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ
と共発現させることにより、可溶化することに成功した
例が多く知られている。例えば、チロシンキナーゼ[Cas
pers, P. et al., Cell Mol.Biol. 40,635-644(1994);A
mrein, K. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA92,
1048-1052(1995)] 、グルタミン酸ラセマーゼ[Ashiuch
i, M. et al., J. Biochem. 117,495-498(1995)]、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素[Dale, G. E. et al., Protein. Eng.
7,925-931(1994)] 等が挙げられる。さらに、ＤｎａＫ
の共発現でヒト成長ホルモンの溶解性が向上した例[Blu
m, P. et al., Biotechnol. 10,301-304(1992)] やＤｎ
ａＪの共発現でトランスグルタミナーゼが可溶化した例
[ 特開平８−３０８６５４号公報] 、ＤｎａＫ、Ｄｎａ
ＪおよびＧｒｐＥの共発現によりチロシンキナーゼが可
溶化した例[Caspers, P. et al., Cell Mol. Biol. 40,
635-644(1994)]が知られている。しかし、どの外来蛋白
質に対してどのシャペロンをどの程度共発現させればよ
いかということを予測することはできない。
するために、外来蛋白質をＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ
と共発現させることにより、可溶化することに成功した
例が多く知られている。例えば、チロシンキナーゼ[Cas
pers, P. et al., Cell Mol.Biol. 40,635-644(1994);A
mrein, K. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA92,
1048-1052(1995)] 、グルタミン酸ラセマーゼ[Ashiuch
i, M. et al., J. Biochem. 117,495-498(1995)]、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素[Dale, G. E. et al., Protein. Eng.
7,925-931(1994)] 等が挙げられる。さらに、ＤｎａＫ
の共発現でヒト成長ホルモンの溶解性が向上した例[Blu
m, P. et al., Biotechnol. 10,301-304(1992)] やＤｎ
ａＪの共発現でトランスグルタミナーゼが可溶化した例
[ 特開平８−３０８６５４号公報] 、ＤｎａＫ、Ｄｎａ
ＪおよびＧｒｐＥの共発現によりチロシンキナーゼが可
溶化した例[Caspers, P. et al., Cell Mol. Biol. 40,
635-644(1994)]が知られている。しかし、どの外来蛋白
質に対してどのシャペロンをどの程度共発現させればよ
いかということを予測することはできない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記従来技
術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、大腸
菌の菌体内で外来蛋白質を安定化かつ可溶化させて発現
するために用いられるシャペロンをコードするオペロン
を提供することにある。本発明の他の目的は、かかるオ
ペロンを有する発現プラスミドを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、かかるプラスミドを外来蛋
白質発現ベクターと共に大腸菌に導入して得られる共形
質転換菌を提供することにある。本発明のさらに他の目
的は、かかる共形質転換菌を用いる外来蛋白質の製造方
法を提供することにある。
術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、大腸
菌の菌体内で外来蛋白質を安定化かつ可溶化させて発現
するために用いられるシャペロンをコードするオペロン
を提供することにある。本発明の他の目的は、かかるオ
ペロンを有する発現プラスミドを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、かかるプラスミドを外来蛋
白質発現ベクターと共に大腸菌に導入して得られる共形
質転換菌を提供することにある。本発明のさらに他の目
的は、かかる共形質転換菌を用いる外来蛋白質の製造方
法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記従来
技術に鑑みて鋭意検討を重ねた結果、ｄｎａＫｄｎａＪ
遺伝子とｇｒｐＥ遺伝子とを連結し、１つのオペロンと
して１つのプロモーターの制御下に発現させるプラスミ
ドを構築した。そして、かかるプラスミドを用いて、大
腸菌においてＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを発現
させることにより、ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥシャ
ペロンシステムによる蛋白質のフォールディングをより
効率化することに成功した。さらに、ｇｒｏＥＳｇｒｏ
ＥＬ遺伝子を別のプロモーターの制御下に前記と同一の
プラスミド中に挿入し、プロテアーゼ変異株やｒｐｏＨ
変異株を含む大腸菌において発現させることにより、大
腸菌における主要なシャペロンシステムであるＤｎａＫ
／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥシステムとＧｒｏＥＬ／ＥＳシス
テムの両方を強化し、目的蛋白質のフォールディングを
いっそう効率化することに成功した。特に、ｒｐｏＨ変
異株の増殖にも必要なＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを補
い、適切な量のＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを共
発現させることが可能となり、その結果、目的蛋白質を
安定化させかつ可溶化させることに成功した。
技術に鑑みて鋭意検討を重ねた結果、ｄｎａＫｄｎａＪ
遺伝子とｇｒｐＥ遺伝子とを連結し、１つのオペロンと
して１つのプロモーターの制御下に発現させるプラスミ
ドを構築した。そして、かかるプラスミドを用いて、大
腸菌においてＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを発現
させることにより、ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥシャ
ペロンシステムによる蛋白質のフォールディングをより
効率化することに成功した。さらに、ｇｒｏＥＳｇｒｏ
ＥＬ遺伝子を別のプロモーターの制御下に前記と同一の
プラスミド中に挿入し、プロテアーゼ変異株やｒｐｏＨ
変異株を含む大腸菌において発現させることにより、大
腸菌における主要なシャペロンシステムであるＤｎａＫ
／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥシステムとＧｒｏＥＬ／ＥＳシス
テムの両方を強化し、目的蛋白質のフォールディングを
いっそう効率化することに成功した。特に、ｒｐｏＨ変
異株の増殖にも必要なＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを補
い、適切な量のＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを共
発現させることが可能となり、その結果、目的蛋白質を
安定化させかつ可溶化させることに成功した。
【００１２】本発明の要旨は、（１） ＤｎａＫ、Ｄｎ
ａＪおよびＧｒｐＥのシャペロンをコードする人工オペ
ロン、（２） 誘導可能なプロモーターを含む前記
（１）記載の人工オペロン、（３） 誘導可能なプロモ
ーターが、ｌａｃ、ｔｒｐ、ａｒａＢおよびＰｚｔ−１
からなる群より選ばれた前記（２）記載の人工オペロ
ン、（４） 前記（１）〜（３）いずれか記載の人工オ
ペロンを有し、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを発
現するプラスミド、（５） 誘導可能なプロモーターに
接続したｇｒｏＥオペロンをさらに含んでなり、Ｄｎａ
Ｋ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ
を発現する前記（４）記載のプラスミド、（６） ｇｒ
ｏＥオペロンに接続している誘導可能なプロモーター
が、ｌａｃ、ｔｒｐ、ａｒａＢおよびＰｚｔ−１からな
る群より選ばれた前記（５）記載のプラスミド、（７）
前記（４）〜（６）いずれか記載のプラスミドを、外
来蛋白質発現ベクターと共に大腸菌に導入して得られる
共形質転換菌、（８） 大腸菌が、プロテアーゼ変異株
である前記（７）記載の共形質転換菌、（９） プロテ
アーゼ変異株が、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重変異株ま
たはｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ三重変異株
である前記（８）記載の共形質転換菌、（１０） 大腸
菌が、ｐｌｓＸ変異株である前記（７）記載の共形質転
換菌、（１１） 大腸菌が、ｒｐｏＨ変異株である前記
（７）記載の共形質転換菌、（１２） ｒｐｏＨ変異株
が、ｒｐｏＨ欠失変異株である前記（１１）記載の共形
質転換菌、（１３） 外来蛋白質が、インターフェロ
ン、インターロイキン、インターロイキン受容体、イン
ターロイキン受容体拮抗物質、顆粒球コロニー刺激因
子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロフ
ァージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボ
ポエチン、白血病抑制因子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死
因子、成長ホルモン、プロインスリン、インスリン様成
長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、ト
ランスフォーミング成長因子、肝細胞成長因子、骨形成
因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経
栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロ
フィン、プロウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアク
チベーター、血液凝固因子、プロテインＣ、グルコセレ
ブロシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、レニ
ン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシン、トリプシン
インヒビター、エラスターゼインヒビター、リポコルチ
ン、レプチン、免疫グロブリン、１本鎖抗体、補体成
分、血清アルブミン、スギ花粉抗原、低酸素誘導性スト
レス蛋白質、プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン
産物、転写調節因子およびウイルス構成蛋白質からなる
群より選ばれた前記（７）〜（１２）いずれか記載の共
形質転換菌、（１４） 前記（７）〜（１３）いずれか
記載の共形質転換菌を用いることを特徴とする、外来蛋
白質の製造方法、（１５） ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよび
ＧｒｐＥの発現量とＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳの発現
量が外来蛋白質の安定化および／または可溶化に適した
シャペロンの誘導条件下で、共形質転換菌の培養を行う
前記（１４）記載の製造方法、に関する。
ａＪおよびＧｒｐＥのシャペロンをコードする人工オペ
ロン、（２） 誘導可能なプロモーターを含む前記
（１）記載の人工オペロン、（３） 誘導可能なプロモ
ーターが、ｌａｃ、ｔｒｐ、ａｒａＢおよびＰｚｔ−１
からなる群より選ばれた前記（２）記載の人工オペロ
ン、（４） 前記（１）〜（３）いずれか記載の人工オ
ペロンを有し、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを発
現するプラスミド、（５） 誘導可能なプロモーターに
接続したｇｒｏＥオペロンをさらに含んでなり、Ｄｎａ
Ｋ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ
を発現する前記（４）記載のプラスミド、（６） ｇｒ
ｏＥオペロンに接続している誘導可能なプロモーター
が、ｌａｃ、ｔｒｐ、ａｒａＢおよびＰｚｔ−１からな
る群より選ばれた前記（５）記載のプラスミド、（７）
前記（４）〜（６）いずれか記載のプラスミドを、外
来蛋白質発現ベクターと共に大腸菌に導入して得られる
共形質転換菌、（８） 大腸菌が、プロテアーゼ変異株
である前記（７）記載の共形質転換菌、（９） プロテ
アーゼ変異株が、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重変異株ま
たはｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ三重変異株
である前記（８）記載の共形質転換菌、（１０） 大腸
菌が、ｐｌｓＸ変異株である前記（７）記載の共形質転
換菌、（１１） 大腸菌が、ｒｐｏＨ変異株である前記
（７）記載の共形質転換菌、（１２） ｒｐｏＨ変異株
が、ｒｐｏＨ欠失変異株である前記（１１）記載の共形
質転換菌、（１３） 外来蛋白質が、インターフェロ
ン、インターロイキン、インターロイキン受容体、イン
ターロイキン受容体拮抗物質、顆粒球コロニー刺激因
子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロフ
ァージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボ
ポエチン、白血病抑制因子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死
因子、成長ホルモン、プロインスリン、インスリン様成
長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、ト
ランスフォーミング成長因子、肝細胞成長因子、骨形成
因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経
栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロ
フィン、プロウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアク
チベーター、血液凝固因子、プロテインＣ、グルコセレ
ブロシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、レニ
ン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシン、トリプシン
インヒビター、エラスターゼインヒビター、リポコルチ
ン、レプチン、免疫グロブリン、１本鎖抗体、補体成
分、血清アルブミン、スギ花粉抗原、低酸素誘導性スト
レス蛋白質、プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン
産物、転写調節因子およびウイルス構成蛋白質からなる
群より選ばれた前記（７）〜（１２）いずれか記載の共
形質転換菌、（１４） 前記（７）〜（１３）いずれか
記載の共形質転換菌を用いることを特徴とする、外来蛋
白質の製造方法、（１５） ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよび
ＧｒｐＥの発現量とＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳの発現
量が外来蛋白質の安定化および／または可溶化に適した
シャペロンの誘導条件下で、共形質転換菌の培養を行う
前記（１４）記載の製造方法、に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明において、シャペロンと
は、蛋白質のフォールディングに関与する蛋白質であれ
ばいかなる蛋白質でも構わない。本発明においては、大
腸菌由来のシャペロンが好ましく、例えば、ＤｎａＫ、
ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、Ｈｓｃ
Ａ／Ｈｓｃ６６、ＣｂｐＡ、ＨｔｐＧ等が挙げられる。
大腸菌において外来蛋白質を安定化かつ可溶化させて発
現させるという観点から、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、Ｇｒｐ
Ｅ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳがさらに好ましく、かかる
シャペロンが協調して作用するという観点から、Ｄｎａ
Ｋ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥシャペロンシステムおよびＧｒ
ｏＥＬ／ＧｒｏＥＳシャペロンシステムを組み合わせて
用いることが特に好ましい。
は、蛋白質のフォールディングに関与する蛋白質であれ
ばいかなる蛋白質でも構わない。本発明においては、大
腸菌由来のシャペロンが好ましく、例えば、ＤｎａＫ、
ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、Ｈｓｃ
Ａ／Ｈｓｃ６６、ＣｂｐＡ、ＨｔｐＧ等が挙げられる。
大腸菌において外来蛋白質を安定化かつ可溶化させて発
現させるという観点から、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、Ｇｒｐ
Ｅ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳがさらに好ましく、かかる
シャペロンが協調して作用するという観点から、Ｄｎａ
Ｋ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥシャペロンシステムおよびＧｒ
ｏＥＬ／ＧｒｏＥＳシャペロンシステムを組み合わせて
用いることが特に好ましい。
【００１４】本発明は、前記シャペロンをコードするオ
ぺロンを提供する。本発明でオぺロンとは、前記シャペ
ロンをコードする遺伝子が、１つのプロモーターの制御
下に支配されている転写単位を形成している遺伝子群を
いい、天然のオペロンのみならず、人工オぺロンも含ま
れる。本発明においては、大腸菌由来のＤｎａＫ、Ｄｎ
ａＪおよびＧｒｐＥをコードする人工オペロン（ｄｎａ
Ｋ／ｄｎａＪ／ｇｒｐＥオぺロンと称する）が好まし
く、また、大腸菌の増殖にも必要なＧｒｏＥＬおよびＧ
ｒｏＥＳをコードするオぺロン（ｇｒｏＥオペロンと称
する）と組み合わせて用いることがさらに好ましい。
ぺロンを提供する。本発明でオぺロンとは、前記シャペ
ロンをコードする遺伝子が、１つのプロモーターの制御
下に支配されている転写単位を形成している遺伝子群を
いい、天然のオペロンのみならず、人工オぺロンも含ま
れる。本発明においては、大腸菌由来のＤｎａＫ、Ｄｎ
ａＪおよびＧｒｐＥをコードする人工オペロン（ｄｎａ
Ｋ／ｄｎａＪ／ｇｒｐＥオぺロンと称する）が好まし
く、また、大腸菌の増殖にも必要なＧｒｏＥＬおよびＧ
ｒｏＥＳをコードするオぺロン（ｇｒｏＥオペロンと称
する）と組み合わせて用いることがさらに好ましい。
【００１５】本発明のｄｎａＫ／ｄｎａＪ／ｇｒｐＥオ
ぺロンは、公知のｄｎａＫ／ｄｎａＪオぺロンよりも発
現するシャペロン機能をより効果的に発揮させることが
可能である。外来蛋白質としてプロウロキナーゼを用い
た具体例が、後述されている。
ぺロンは、公知のｄｎａＫ／ｄｎａＪオぺロンよりも発
現するシャペロン機能をより効果的に発揮させることが
可能である。外来蛋白質としてプロウロキナーゼを用い
た具体例が、後述されている。
【００１６】前記オペロンの転写を制御するプロモータ
ーは、本発明のシャペロンの発現量を調節するという観
点から、誘導可能なプロモーターであることが好まし
い。誘導可能なプロモーターとしては、例えば、ｌａ
ｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒａＢ、Ｐｚｔ−１、
λＰL が挙げられる。ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｃは、
いずれもイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノ
シド（ＩＰＴＧ）を用いて、ｔｒｐ、ａｒａＢおよびＰ
ｚｔ−１は、それぞれ、３−インドールアクリル酸（Ｉ
ＡＡ）、Ｌ−アラビノース、テトラサイクリンを用い
て、λＰL は高温（４２℃）で誘導することができる。
また、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって特異的にかつ強
力に転写されるＴ７プロモーターも使用できる。この場
合、ｌａｃプロモーター下流に連結したＴ７ＲＮＡポリ
メラーゼ遺伝子をもつλファージを溶原化した大腸菌を
用いることにより、ＩＰＴＧで誘導が可能である。
ーは、本発明のシャペロンの発現量を調節するという観
点から、誘導可能なプロモーターであることが好まし
い。誘導可能なプロモーターとしては、例えば、ｌａ
ｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒａＢ、Ｐｚｔ−１、
λＰL が挙げられる。ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｃは、
いずれもイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノ
シド（ＩＰＴＧ）を用いて、ｔｒｐ、ａｒａＢおよびＰ
ｚｔ−１は、それぞれ、３−インドールアクリル酸（Ｉ
ＡＡ）、Ｌ−アラビノース、テトラサイクリンを用い
て、λＰL は高温（４２℃）で誘導することができる。
また、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって特異的にかつ強
力に転写されるＴ７プロモーターも使用できる。この場
合、ｌａｃプロモーター下流に連結したＴ７ＲＮＡポリ
メラーゼ遺伝子をもつλファージを溶原化した大腸菌を
用いることにより、ＩＰＴＧで誘導が可能である。
【００１７】前記プロモーターは、公知のベクターに含
まれており、制限酵素等を用いてベクターから適宜切り
出して用いることができる。
まれており、制限酵素等を用いてベクターから適宜切り
出して用いることができる。
【００１８】本発明のプラスミドとは、前記オペロンを
有し、かつ大腸菌に導入された後前記シャペロンを発現
するものである。すなわち、ｄｎａＫ／ｄｎａＪ／ｇｒ
ｐＥオぺロンを有するプラスミドが好ましく、さらに好
ましくは、ｄｎａＫ／ｄｎａＪ／ｇｒｐＥオぺロンおよ
びｇｒｏＥオペロンを同時に有するプラスミドが望まし
い。
有し、かつ大腸菌に導入された後前記シャペロンを発現
するものである。すなわち、ｄｎａＫ／ｄｎａＪ／ｇｒ
ｐＥオぺロンを有するプラスミドが好ましく、さらに好
ましくは、ｄｎａＫ／ｄｎａＪ／ｇｒｐＥオぺロンおよ
びｇｒｏＥオペロンを同時に有するプラスミドが望まし
い。
【００１９】前記プラスミドは、前記したように、誘導
可能なプロモーターにより本発明のシャペロン、すなわ
ち、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを発現すること
が好ましく、さらに好ましくは、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、
ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを発現すること
が望ましい。
可能なプロモーターにより本発明のシャペロン、すなわ
ち、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを発現すること
が好ましく、さらに好ましくは、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、
ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを発現すること
が望ましい。
【００２０】目的蛋白質の発現レベルを低下させず、前
記シャペロンの発現量や発現時期を最適化するために、
シャペロンの発現と目的蛋白質の発現は独立して制御で
きる方が有利であり、シャペロンの発現に用いる誘導可
能なプロモーターとしては、目的蛋白質の発現に用いら
れるプロモーターと異なるものが好ましい。ｄｎａＫ／
ｄｎａＪ／ｇｒｐＥオぺロン発現のためのプロモーター
とｇｒｏＥオペロン発現のためのプロモーターに同じプ
ロモーターを使用しても構わないが、それぞれ別のプロ
モーターを用いることにより、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよ
びＧｒｐＥとＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳの発現量や発
現時期を別々に調節することができる。例えば、ａｒａ
Ｂプロモーター−ｄｎａＫ／ｄｎａＪ／ｇｒｐＥオぺロ
ンおよびＰｚｔ−１プロモーター−ｇｒｏＥオペロンか
らなるプラスミドｐＧ−ＫＪＥ６（図１）が好適に使用
される。
記シャペロンの発現量や発現時期を最適化するために、
シャペロンの発現と目的蛋白質の発現は独立して制御で
きる方が有利であり、シャペロンの発現に用いる誘導可
能なプロモーターとしては、目的蛋白質の発現に用いら
れるプロモーターと異なるものが好ましい。ｄｎａＫ／
ｄｎａＪ／ｇｒｐＥオぺロン発現のためのプロモーター
とｇｒｏＥオペロン発現のためのプロモーターに同じプ
ロモーターを使用しても構わないが、それぞれ別のプロ
モーターを用いることにより、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよ
びＧｒｐＥとＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳの発現量や発
現時期を別々に調節することができる。例えば、ａｒａ
Ｂプロモーター−ｄｎａＫ／ｄｎａＪ／ｇｒｐＥオぺロ
ンおよびＰｚｔ−１プロモーター−ｇｒｏＥオペロンか
らなるプラスミドｐＧ−ＫＪＥ６（図１）が好適に使用
される。
【００２１】ｐＧ−ＫＪＥ６は、ｐＡＣＹＣベクター[C
hang, A. C. Y. and Cohen, S. N.,J. Bacteriol. 134,
1141-1156(1978)]を基に構築されたプラスミドであり、
図１に記載のように、ｐＡＣＹＣベクター由来ｏｒｉ、
Ｃｍ耐性遺伝子、ａｒａＢプロモーター−ｄｎａＫ／ｄ
ｎａＪ／ｇｒｐＥオぺロン、およびＰｚｔ−１プロモー
ター−ｇｒｏＥオペロンからなる構造を有している。Ｄ
ｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥをＬ−アラビノースに
より、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳをテトラサイクリン
により発現誘導させる。Ｌ−アラビノースおよびテトラ
サイクリンを同時に添加したり、別々に時間差をつけて
添加したり、濃度を変えて添加することにより、これら
２つのグループのシャペロンを同時に発現させたり、別
々に時間差発現させたり、発現させるシャペロンの量を
必要に応じて変えることが可能である。
hang, A. C. Y. and Cohen, S. N.,J. Bacteriol. 134,
1141-1156(1978)]を基に構築されたプラスミドであり、
図１に記載のように、ｐＡＣＹＣベクター由来ｏｒｉ、
Ｃｍ耐性遺伝子、ａｒａＢプロモーター−ｄｎａＫ／ｄ
ｎａＪ／ｇｒｐＥオぺロン、およびＰｚｔ−１プロモー
ター−ｇｒｏＥオペロンからなる構造を有している。Ｄ
ｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥをＬ−アラビノースに
より、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳをテトラサイクリン
により発現誘導させる。Ｌ−アラビノースおよびテトラ
サイクリンを同時に添加したり、別々に時間差をつけて
添加したり、濃度を変えて添加することにより、これら
２つのグループのシャペロンを同時に発現させたり、別
々に時間差発現させたり、発現させるシャペロンの量を
必要に応じて変えることが可能である。
【００２２】通常、同一宿主に近縁の２種のプラスミド
は安定に共存できない。この現象を不和合性という。本
発明のプラスミドは、大腸菌内で目的蛋白質の発現ベク
ターと不和合性を示さないレプリコンを有するものであ
れば使用可能である。例えば、目的蛋白質の発現ベクタ
ーとしてｐＢＲ３２２等ＣｏｌＥ１レプリコンをもつも
のを用いる場合、本発明のプラスミドには、ｐＡＣＹＣ
ベクターに存在するｐ１５Ａレプリコンを使用すること
ができる。
は安定に共存できない。この現象を不和合性という。本
発明のプラスミドは、大腸菌内で目的蛋白質の発現ベク
ターと不和合性を示さないレプリコンを有するものであ
れば使用可能である。例えば、目的蛋白質の発現ベクタ
ーとしてｐＢＲ３２２等ＣｏｌＥ１レプリコンをもつも
のを用いる場合、本発明のプラスミドには、ｐＡＣＹＣ
ベクターに存在するｐ１５Ａレプリコンを使用すること
ができる。
【００２３】本発明のプラスミドは、形質転換の際に選
択が容易に行われるように、必要に応じて選択マーカー
遺伝子をさらに含んでもよい。かかる選択マーカー遺伝
子としては、アンピシリン耐性（Ａｍｐr ）遺伝子、カ
ナマイシン耐性（Ｋｍr ）遺伝子、クロラムフェニコー
ル耐性（Ｃｍr ）遺伝子等が挙げられるが、外来蛋白質
発現ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子とは異なる
ことが望ましい。
択が容易に行われるように、必要に応じて選択マーカー
遺伝子をさらに含んでもよい。かかる選択マーカー遺伝
子としては、アンピシリン耐性（Ａｍｐr ）遺伝子、カ
ナマイシン耐性（Ｋｍr ）遺伝子、クロラムフェニコー
ル耐性（Ｃｍr ）遺伝子等が挙げられるが、外来蛋白質
発現ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子とは異なる
ことが望ましい。
【００２４】前記プラスミドの構築方法は、例えば、 S
ambrook, J. ら著、Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss,New York, 1989年発行に記載の方法により行うこと
ができる。前記ｐＧ−ＫＪＥ６の具体的な構築方法は、
後述の実施例に記載されている。
ambrook, J. ら著、Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss,New York, 1989年発行に記載の方法により行うこと
ができる。前記ｐＧ−ＫＪＥ６の具体的な構築方法は、
後述の実施例に記載されている。
【００２５】前記プラスミドを用いて、誘導可能なプロ
モーターによる本発明のシャペロンを発現させる方法お
よび本発明のシャペロンの発現量を調節する方法は、後
述されている。
モーターによる本発明のシャペロンを発現させる方法お
よび本発明のシャペロンの発現量を調節する方法は、後
述されている。
【００２６】本発明において、共形質転換菌とは、前記
プラスミドを外来蛋白質発現ベクターと共に大腸菌に導
入することにより得られるものである。
プラスミドを外来蛋白質発現ベクターと共に大腸菌に導
入することにより得られるものである。
【００２７】外来蛋白質発現ベクターとしては、所望の
外来蛋白質を大腸菌内で発現させるベクターで、かつ、
前記プラスミドと不和合性を示さなければいかなるもの
でも構わないが、誘導可能なプロモーターにより、目的
の外来蛋白質の発現が誘導されるベクターが好ましい。
外来蛋白質を大腸菌内で発現させるベクターで、かつ、
前記プラスミドと不和合性を示さなければいかなるもの
でも構わないが、誘導可能なプロモーターにより、目的
の外来蛋白質の発現が誘導されるベクターが好ましい。
【００２８】誘導可能なプロモーターとしては、前記と
同様のプロモーターが挙げられるが、本発明のシャペロ
ンの誘導発現に用いるプロモーター以外のプロモーター
を選ぶことにより、本発明のシャペロンと目的の外来蛋
白質とを別々に発現誘導することができる。
同様のプロモーターが挙げられるが、本発明のシャペロ
ンの誘導発現に用いるプロモーター以外のプロモーター
を選ぶことにより、本発明のシャペロンと目的の外来蛋
白質とを別々に発現誘導することができる。
【００２９】また、外来蛋白質発現ベクターは、必要に
応じて選択マーカー遺伝子を含んでもよい。かかる選択
マーカー遺伝子としては、前記と同様のものが挙げられ
るが、本発明のプラスミドに含まれる選択マーカー遺伝
子以外のものを用いることにより、共形質転換菌の二重
選別が可能となる。
応じて選択マーカー遺伝子を含んでもよい。かかる選択
マーカー遺伝子としては、前記と同様のものが挙げられ
るが、本発明のプラスミドに含まれる選択マーカー遺伝
子以外のものを用いることにより、共形質転換菌の二重
選別が可能となる。
【００３０】本発明に用いられる大腸菌としては、ＨＢ
１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００ＭＧ１６５５、Ｗ３
１１０等の野生株、ならびにｌｏｎ変異株、ｃｌｐＰＸ
変異株、ｈｓｌＶ／Ｕ変異株、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ
二重変異株、ｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ三
重変異株等のプロテアーゼ変異株、ｐｌｓＸ変異株、ｒ
ｐｏＨ欠失変異株、ｒｐｏＨミスセンス変異株等の変異
株が挙げられる。
１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００ＭＧ１６５５、Ｗ３
１１０等の野生株、ならびにｌｏｎ変異株、ｃｌｐＰＸ
変異株、ｈｓｌＶ／Ｕ変異株、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ
二重変異株、ｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ三
重変異株等のプロテアーゼ変異株、ｐｌｓＸ変異株、ｒ
ｐｏＨ欠失変異株、ｒｐｏＨミスセンス変異株等の変異
株が挙げられる。
【００３１】本発明においては、外来蛋白質をより安定
に発現させるため、ｌｏｎ変異株、ｃｌｐＰＸ変異株、
ｈｓｌＶ／Ｕ変異株、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重変異
株またはｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ三重変
異株のプロテアーゼ変異株、ｐｌｓＸ変異株ならびにｒ
ｐｏＨ欠失変異株等のｒｐｏＨ変異株を用いることがで
きる。
に発現させるため、ｌｏｎ変異株、ｃｌｐＰＸ変異株、
ｈｓｌＶ／Ｕ変異株、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重変異
株またはｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ三重変
異株のプロテアーゼ変異株、ｐｌｓＸ変異株ならびにｒ
ｐｏＨ欠失変異株等のｒｐｏＨ変異株を用いることがで
きる。
【００３２】ここで、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重変異
株としては、ｌｏｎ遺伝子およびｃｌｐＰＸ遺伝子に二
重欠失変異を導入したＭＣ４１００株由来のＫＹ２２６
３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０８７）が好適に用いられ
る。
株としては、ｌｏｎ遺伝子およびｃｌｐＰＸ遺伝子に二
重欠失変異を導入したＭＣ４１００株由来のＫＹ２２６
３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０８７）が好適に用いられ
る。
【００３３】また、ｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ
／Ｕ三重変異株とは、前記ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重
変異株において、さらにＨｓｌＶ／Ｕプロテアーゼをコ
ードするｈｓｌＶ／Ｕ遺伝子に変異を導入した変異株で
あり、ｌｏｎ遺伝子、ｃｌｐＰＸ遺伝子およびｈｓｌＶ
／Ｕ遺伝子に三重欠失変異を導入したＭＣ４１００株由
来のＫＹ２２６６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０８８）が好
適に用いられる。
／Ｕ三重変異株とは、前記ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重
変異株において、さらにＨｓｌＶ／Ｕプロテアーゼをコ
ードするｈｓｌＶ／Ｕ遺伝子に変異を導入した変異株で
あり、ｌｏｎ遺伝子、ｃｌｐＰＸ遺伝子およびｈｓｌＶ
／Ｕ遺伝子に三重欠失変異を導入したＭＣ４１００株由
来のＫＹ２２６６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０８８）が好
適に用いられる。
【００３４】また、ｐｌｓＸ変異株としては、例えば、
ｐｌｓＸがコードするポリペプチドのＮ末端領域に対応
する位置へのテトラサイクリン耐性遺伝子の挿入変異を
有するｐｌｓＸ変異株（特開平８−１４０６７１号公
報）が挙げられる。
ｐｌｓＸがコードするポリペプチドのＮ末端領域に対応
する位置へのテトラサイクリン耐性遺伝子の挿入変異を
有するｐｌｓＸ変異株（特開平８−１４０６７１号公
報）が挙げられる。
【００３５】また、ｒｐｏＨ欠失変異株としては、例え
ば、ＭＣ４１００ΔｒｐｏＨ[Zhou,Y. N. et al., J. B
acteriol. 170,3640-3649(1988)] 、ＭＧ１６５５Δｒ
ｐｏＨ等が挙げられる。ｒｐｏＨ欠失変異株では、σ32
により制御されるあらゆる熱ショック蛋白質（シャペロ
ン、プロテアーゼを含む）の発現量が抑制されている。
ｒｐｏＨ欠失変異株を、例えば、ｐＧ−ＫＪＥ６で形質
転換することによって発現抑制されたシャペロンを十分
補うことにより、プロテアーゼの量が少なく、シャペロ
ンの量の多い系が提供され、不安定な外来蛋白質を安定
発現させるためのよい効果が奏されるものと期待され
る。また、ｒｐｏＨ欠失変異株は、温度感受性であり、
通常２０℃を越える温度で生育できないが、前記したよ
うにＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを補うことによって、
２０℃を越える温度でも生育できるようになるので、取
り扱いが容易になる。従って、ｒｐｏＨ欠失変異株を用
いることが特に好ましい。
ば、ＭＣ４１００ΔｒｐｏＨ[Zhou,Y. N. et al., J. B
acteriol. 170,3640-3649(1988)] 、ＭＧ１６５５Δｒ
ｐｏＨ等が挙げられる。ｒｐｏＨ欠失変異株では、σ32
により制御されるあらゆる熱ショック蛋白質（シャペロ
ン、プロテアーゼを含む）の発現量が抑制されている。
ｒｐｏＨ欠失変異株を、例えば、ｐＧ−ＫＪＥ６で形質
転換することによって発現抑制されたシャペロンを十分
補うことにより、プロテアーゼの量が少なく、シャペロ
ンの量の多い系が提供され、不安定な外来蛋白質を安定
発現させるためのよい効果が奏されるものと期待され
る。また、ｒｐｏＨ欠失変異株は、温度感受性であり、
通常２０℃を越える温度で生育できないが、前記したよ
うにＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを補うことによって、
２０℃を越える温度でも生育できるようになるので、取
り扱いが容易になる。従って、ｒｐｏＨ欠失変異株を用
いることが特に好ましい。
【００３６】本発明において、発現させる外来蛋白質と
しては、大腸菌内で不安定化および／または不溶化する
外来蛋白質であれば、いかなる蛋白質でも構わない。か
かる外来蛋白質としては、インターフェロン、インター
ロイキン、インターロイキン受容体、インターロイキン
受容体拮抗物質、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー
刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、白血
病抑制因子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死因子、成長ホル
モン、プロインスリン、インスリン様成長因子、繊維芽
細胞成長因子、血小板由来成長因子、トランスフォーミ
ング成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因子、神経成長
因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、グリ
ア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフィン、プロウ
ロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血
液凝固因子、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、
スーパーオキシドディスムターゼ、レニン、リゾチー
ム、Ｐ４５０、プロキモシン、トリプシンインヒビタ
ー、エラスターゼインヒビター、リポコルチン、レプチ
ン、免疫グロブリン、１本鎖抗体、補体成分、血清アル
ブミン、スギ花粉抗原、低酸素誘導性ストレス蛋白質、
プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン産物、転写調
節因子およびウイルス構成蛋白質が挙げられる。
しては、大腸菌内で不安定化および／または不溶化する
外来蛋白質であれば、いかなる蛋白質でも構わない。か
かる外来蛋白質としては、インターフェロン、インター
ロイキン、インターロイキン受容体、インターロイキン
受容体拮抗物質、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー
刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、白血
病抑制因子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死因子、成長ホル
モン、プロインスリン、インスリン様成長因子、繊維芽
細胞成長因子、血小板由来成長因子、トランスフォーミ
ング成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因子、神経成長
因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、グリ
ア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフィン、プロウ
ロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血
液凝固因子、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、
スーパーオキシドディスムターゼ、レニン、リゾチー
ム、Ｐ４５０、プロキモシン、トリプシンインヒビタ
ー、エラスターゼインヒビター、リポコルチン、レプチ
ン、免疫グロブリン、１本鎖抗体、補体成分、血清アル
ブミン、スギ花粉抗原、低酸素誘導性ストレス蛋白質、
プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン産物、転写調
節因子およびウイルス構成蛋白質が挙げられる。
【００３７】本発明のプラスミドを外来蛋白質発現ベク
ターと共に大腸菌に導入する方法としては、塩化カルシ
ウム法、塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法
等の通常の方法が用いられる。共形質転換菌のスクリー
ニング法としては、選択マーカー遺伝子に応じた薬剤に
より行なうことができる。外来蛋白質の発現は、例え
ば、ウエスタンブロッティング等により確認することが
できる。
ターと共に大腸菌に導入する方法としては、塩化カルシ
ウム法、塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法
等の通常の方法が用いられる。共形質転換菌のスクリー
ニング法としては、選択マーカー遺伝子に応じた薬剤に
より行なうことができる。外来蛋白質の発現は、例え
ば、ウエスタンブロッティング等により確認することが
できる。
【００３８】さらに、本発明は、前記共形質転換菌を用
いる外来蛋白質の製造方法を提供する。かかる製造方法
は、（１）発現対象の外来蛋白質の安定化および／また
は可溶化に適したシャペロンの誘導条件を調べる工程、
（２）共形質転換菌を培養し、（１）で調べた誘導条件
下でシャペロンおよび外来蛋白質を誘導発現させた後、
菌体を集める工程、ならびに、（３）集めた菌体を破砕
し、外来蛋白質に応じた精製方法に従って、該外来蛋白
質を単離・精製する工程という３つの工程よりなる。
いる外来蛋白質の製造方法を提供する。かかる製造方法
は、（１）発現対象の外来蛋白質の安定化および／また
は可溶化に適したシャペロンの誘導条件を調べる工程、
（２）共形質転換菌を培養し、（１）で調べた誘導条件
下でシャペロンおよび外来蛋白質を誘導発現させた後、
菌体を集める工程、ならびに、（３）集めた菌体を破砕
し、外来蛋白質に応じた精製方法に従って、該外来蛋白
質を単離・精製する工程という３つの工程よりなる。
【００３９】まず、外来蛋白質としてプロウロキナーゼ
の発現を例に、本発明のｄｎａＫ／ｄｎａＪ／ｇｒｐＥ
オぺロンを用いて互いに協調的に働くＤｎａＫ、Ｄｎａ
ＪおよびＧｒｐＥを同時に共発現させることにより、公
知のｄｎａＫ／ｄｎａＪオぺロンを用いてＤｎａＫおよ
びＤｎａＪだけを発現させた場合に比べて、シャペロン
機能をより効果的に発揮させることが可能であることを
具体的に確認することができる。
の発現を例に、本発明のｄｎａＫ／ｄｎａＪ／ｇｒｐＥ
オぺロンを用いて互いに協調的に働くＤｎａＫ、Ｄｎａ
ＪおよびＧｒｐＥを同時に共発現させることにより、公
知のｄｎａＫ／ｄｎａＪオぺロンを用いてＤｎａＫおよ
びＤｎａＪだけを発現させた場合に比べて、シャペロン
機能をより効果的に発揮させることが可能であることを
具体的に確認することができる。
【００４０】前記ｐＡＣＹＣベクター由来でＣｍ耐性遺
伝子、ａｒａＣ、ａｒａＢプロモーター／オペレーター
遺伝子を有するプラスミドｐＡＲ３（ＡＴＣＣ８７０２
６）のａｒａＢプロモーター下流を制限酵素ＰｓｔＩで
切断し、平滑末端にした後、ＰＣＲで調製した大腸菌の
ｄｎａＫ／ｄｎａＪオペロンのコーディング領域約３ｋ
ｂと、ｇｒｐＥ遺伝子のコーディング領域約０．６ｋｂ
を挿入して、ａｒａＢプロモーターの支配下に１つのオ
ペロンからＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを発現す
るプラスミドｐＫＪＥ７を作製する。
伝子、ａｒａＣ、ａｒａＢプロモーター／オペレーター
遺伝子を有するプラスミドｐＡＲ３（ＡＴＣＣ８７０２
６）のａｒａＢプロモーター下流を制限酵素ＰｓｔＩで
切断し、平滑末端にした後、ＰＣＲで調製した大腸菌の
ｄｎａＫ／ｄｎａＪオペロンのコーディング領域約３ｋ
ｂと、ｇｒｐＥ遺伝子のコーディング領域約０．６ｋｂ
を挿入して、ａｒａＢプロモーターの支配下に１つのオ
ペロンからＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを発現す
るプラスミドｐＫＪＥ７を作製する。
【００４１】次に、ｐＫＪＥ７を制限酵素ＢｓｐＨＩお
よびＫｐｎＩで切断して、ＧｒｐＥ遺伝子のコーディン
グ領域をほぼすべて取り除き、平滑末端にした後、セル
フライゲーションさせる。ａｒａＢプロモーターからＤ
ｎａＫおよびＤｎａＪのみを発現するプラスミドを単離
し、ｐＫＪ１とする。
よびＫｐｎＩで切断して、ＧｒｐＥ遺伝子のコーディン
グ領域をほぼすべて取り除き、平滑末端にした後、セル
フライゲーションさせる。ａｒａＢプロモーターからＤ
ｎａＫおよびＤｎａＪのみを発現するプラスミドを単離
し、ｐＫＪ１とする。
【００４２】次に、ヒトプロウロキナーゼをＩＰＴＧで
発現誘導できるプラスミドｐＵＫ−０２ｐｍ０[Kanemor
i, M. et al., J. Bacteriol. 176, 5648-5653(1994)]
とｐＫＪＥ７またはｐＫＪ１とを用いて、塩化ルビジウ
ム法によりＭＧ１６５５（ＣＧＳＣ６３００；E. coli
Genetic Stock Center, Yale University)を形質転換す
る。得られたｐＵＫ−０２ｐｍ０とｐＫＪＥ７との共形
質転換菌およびｐＵＫ−０２ｐｍ０とｐＫＪ１との共形
質転換菌を単離し、それぞれＮＫ２８４およびＮＫ２８
７とする。
発現誘導できるプラスミドｐＵＫ−０２ｐｍ０[Kanemor
i, M. et al., J. Bacteriol. 176, 5648-5653(1994)]
とｐＫＪＥ７またはｐＫＪ１とを用いて、塩化ルビジウ
ム法によりＭＧ１６５５（ＣＧＳＣ６３００；E. coli
Genetic Stock Center, Yale University)を形質転換す
る。得られたｐＵＫ−０２ｐｍ０とｐＫＪＥ７との共形
質転換菌およびｐＵＫ−０２ｐｍ０とｐＫＪ１との共形
質転換菌を単離し、それぞれＮＫ２８４およびＮＫ２８
７とする。
【００４３】前記ＮＫ２８４およびＮＫ２８７を、１ｍ
ｇ／ｍｌのＬ−アラビノースを添加したＬ培地中、３７
℃で培養し、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約４０のときに１ｍ
ＭのＩＰＴＧを前記培地に添加し、１時間後に培養液の
一部を取り、トリクロロ酢酸を加え、菌体を沈殿させ
る。沈殿物を遠心分離により集め、アセトンで洗浄後、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーに溶解し、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより蛋白質を分離した後、ＣＢＢ染色に
より誘導されたシャペロンを検出する（図２）。
ｇ／ｍｌのＬ−アラビノースを添加したＬ培地中、３７
℃で培養し、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約４０のときに１ｍ
ＭのＩＰＴＧを前記培地に添加し、１時間後に培養液の
一部を取り、トリクロロ酢酸を加え、菌体を沈殿させ
る。沈殿物を遠心分離により集め、アセトンで洗浄後、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーに溶解し、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより蛋白質を分離した後、ＣＢＢ染色に
より誘導されたシャペロンを検出する（図２）。
【００４４】また、前記培養液の残りを遠心分離して回
収したＮＫ２８４およびＮＫ２８７の各菌体を超音波処
理により破砕した後、可溶性画分と不溶性画分に分画し
て、抗ウロキナーゼ抗体を用いたウエスタンブロッティ
ングにより両画分のプロウロキナーゼを検出する（図
２）。
収したＮＫ２８４およびＮＫ２８７の各菌体を超音波処
理により破砕した後、可溶性画分と不溶性画分に分画し
て、抗ウロキナーゼ抗体を用いたウエスタンブロッティ
ングにより両画分のプロウロキナーゼを検出する（図
２）。
【００４５】図２より、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒ
ｐＥを共発現させたとき、ほぼすべてのプロウロキナー
ゼが可溶性で発現するのに対して、ＤｎａＫおよびＤｎ
ａＪのみを共発現させたときはプロウロキナーゼが一部
可溶化せず、不溶性で発現することがわかる。
ｐＥを共発現させたとき、ほぼすべてのプロウロキナー
ゼが可溶性で発現するのに対して、ＤｎａＫおよびＤｎ
ａＪのみを共発現させたときはプロウロキナーゼが一部
可溶化せず、不溶性で発現することがわかる。
【００４６】以下に、ｐＧ−ＫＪＥ６およびスギ花粉抗
原ＣｒｙｊII発現ベクターによる共形質転換菌（ＮＫ２
４１）を用いた外来蛋白質の製造方法を具体的に説明す
る。ＣｒｙｊIIは、大腸菌内で発現させると、不安定な
蛋白質であり、その半減期は、スペクチノマイシンを添
加して蛋白質合成を停止させた菌体のウエスタンブロッ
ティングによれば約１０分である。
原ＣｒｙｊII発現ベクターによる共形質転換菌（ＮＫ２
４１）を用いた外来蛋白質の製造方法を具体的に説明す
る。ＣｒｙｊIIは、大腸菌内で発現させると、不安定な
蛋白質であり、その半減期は、スペクチノマイシンを添
加して蛋白質合成を停止させた菌体のウエスタンブロッ
ティングによれば約１０分である。
【００４７】（１）ＣｒｙｊIIの安定化および／または
可溶化に適するシャペロンの誘導条件の検討 まず、ｐＧ−ＫＪＥ６単独でＪＭ１０９を形質転換さ
せ、形質転換菌をクロラムフェニコールを用いてスクリ
ーニングする。得られた形質転換菌を、０〜３ｍｇ／ｍ
ｌのＬ−アラビノースおよび０〜１５０ｎｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンを添加したＬ培地中、３０℃で培養し、
Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約４０のときに菌体を集める。各
菌体の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ク
マジーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により、誘導
されたシャペロンを検出する（図３）。図３に示すよう
に、前記薬剤の濃度に依存して各シャペロンが誘導され
る。
可溶化に適するシャペロンの誘導条件の検討 まず、ｐＧ−ＫＪＥ６単独でＪＭ１０９を形質転換さ
せ、形質転換菌をクロラムフェニコールを用いてスクリ
ーニングする。得られた形質転換菌を、０〜３ｍｇ／ｍ
ｌのＬ−アラビノースおよび０〜１５０ｎｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンを添加したＬ培地中、３０℃で培養し、
Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約４０のときに菌体を集める。各
菌体の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ク
マジーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により、誘導
されたシャペロンを検出する（図３）。図３に示すよう
に、前記薬剤の濃度に依存して各シャペロンが誘導され
る。
【００４８】次に、ｐＧ−ＫＪＥ６、およびＩＰＴＧに
より誘導可能なＣｒｙｊII発現ベクターによるＭＧ１６
５５共形質転換菌（ＮＫ２４１）を、０〜８ｍｇ／ｍｌ
のＬ−アラビノースおよび０〜１０ｎｇ／ｍｌのテトラ
サイクリンを添加した以外は前記と同様の方法で培養
し、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約４０のときに、１ｍＭのＩ
ＰＴＧを培地に添加し、２時間後に菌体を回収する。各
菌体の全蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、
ＣＢＢ染色により、誘導されたシャペロンを検出し、ま
たは、ウエスタンブロッティングによりＣｒｙｊIIを検
出する（図４）。図４に示すように、ＤｎａＫ、Ｄｎａ
ＪおよびＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳまたは
前記５つとも共発現させると、ＣｒｙｊIIが高発現する
ことがわかる。
より誘導可能なＣｒｙｊII発現ベクターによるＭＧ１６
５５共形質転換菌（ＮＫ２４１）を、０〜８ｍｇ／ｍｌ
のＬ−アラビノースおよび０〜１０ｎｇ／ｍｌのテトラ
サイクリンを添加した以外は前記と同様の方法で培養
し、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約４０のときに、１ｍＭのＩ
ＰＴＧを培地に添加し、２時間後に菌体を回収する。各
菌体の全蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、
ＣＢＢ染色により、誘導されたシャペロンを検出し、ま
たは、ウエスタンブロッティングによりＣｒｙｊIIを検
出する（図４）。図４に示すように、ＤｎａＫ、Ｄｎａ
ＪおよびＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳまたは
前記５つとも共発現させると、ＣｒｙｊIIが高発現する
ことがわかる。
【００４９】また、前記回収された共形質転換菌体を超
音波処理により破砕した後、遠心分離により可溶性画分
と不溶性画分とに分画して、両画分のウエスタンブロッ
ティングによりＣｒｙｊIIの可溶性を調べる（図５）。
図５に示すように、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥ
の３つだけを共発現させると、ＣｒｙｊIIが不溶化する
ことが示される（レーン２〜５）が、ＤｎａＫ、Ｄｎａ
ＪおよびＧｒｐＥの誘導発現量が比較的少なく、Ｇｒｏ
ＥＬおよびＧｒｏＥＳを同時に発現誘導させた場合は、
ＣｒｙｊIIが可溶なまま安定化することがわかる（レー
ン６〜９）。しかし、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐ
Ｅを大過剰に発現させた場合は、ＧｒｏＥＬおよびＧｒ
ｏＥＳを同時に発現誘導させてもＣｒｙｊIIが不溶化す
る（レーン１０）。従って、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥ
Ｓを同時に発現誘導させた場合は、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ
およびＧｒｐＥの過剰発現によるＣｒｙｊIIの不溶化を
ある程度抑制することがわかる。
音波処理により破砕した後、遠心分離により可溶性画分
と不溶性画分とに分画して、両画分のウエスタンブロッ
ティングによりＣｒｙｊIIの可溶性を調べる（図５）。
図５に示すように、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥ
の３つだけを共発現させると、ＣｒｙｊIIが不溶化する
ことが示される（レーン２〜５）が、ＤｎａＫ、Ｄｎａ
ＪおよびＧｒｐＥの誘導発現量が比較的少なく、Ｇｒｏ
ＥＬおよびＧｒｏＥＳを同時に発現誘導させた場合は、
ＣｒｙｊIIが可溶なまま安定化することがわかる（レー
ン６〜９）。しかし、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐ
Ｅを大過剰に発現させた場合は、ＧｒｏＥＬおよびＧｒ
ｏＥＳを同時に発現誘導させてもＣｒｙｊIIが不溶化す
る（レーン１０）。従って、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥ
Ｓを同時に発現誘導させた場合は、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ
およびＧｒｐＥの過剰発現によるＣｒｙｊIIの不溶化を
ある程度抑制することがわかる。
【００５０】ＣｒｙｊIIの安定化は、スペクチノマイシ
ンを添加して蛋白質合成を停止させた菌体中のＣｒｙｊ
IIの残量をウエスタンブロッティングにより定量するこ
とにより、半減期として表される。前記条件下では、そ
の半減期は４０分以上となる（図６）。
ンを添加して蛋白質合成を停止させた菌体中のＣｒｙｊ
IIの残量をウエスタンブロッティングにより定量するこ
とにより、半減期として表される。前記条件下では、そ
の半減期は４０分以上となる（図６）。
【００５１】ＣｒｙｊIIの発現にシャペロンが及ぼす影
響をさらに明らかにするために、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、
ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ各変異株（ＭＣ
４１００由来）に、前記ＣｒｙｊII発現ベクターを導入
し、前記と同様にＣｒｙｊIIの発現と可溶性を調べる
（図７）。図７に示すように、ＤｎａＫ変異株およびＤ
ｎａＪ変異株中では、ＣｒｙｊIIは不溶化するが、Ｇｒ
ｐＥ変異株中では、あまり影響が見られない。ＧｒｏＥ
Ｌ変異株およびＧｒｏＥＳ変異株中では、ＣｒｙｊIIは
可溶性であるが、発現量が減っており、ＣｒｙｊIIがさ
らに不安定になっていると推測される。
響をさらに明らかにするために、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、
ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ各変異株（ＭＣ
４１００由来）に、前記ＣｒｙｊII発現ベクターを導入
し、前記と同様にＣｒｙｊIIの発現と可溶性を調べる
（図７）。図７に示すように、ＤｎａＫ変異株およびＤ
ｎａＪ変異株中では、ＣｒｙｊIIは不溶化するが、Ｇｒ
ｐＥ変異株中では、あまり影響が見られない。ＧｒｏＥ
Ｌ変異株およびＧｒｏＥＳ変異株中では、ＣｒｙｊIIは
可溶性であるが、発現量が減っており、ＣｒｙｊIIがさ
らに不安定になっていると推測される。
【００５２】以上の結果を考慮すると、ＤｎａＫ、Ｄｎ
ａＪおよびＧｒｐＥの発現量は、多すぎても少なすぎて
もＣｒｙｊIIの不溶化が起こるということが示唆され、
ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥは、ＣｒｙｊIIのフ
ォールディングに何らかの重要な影響を与えていると考
えられる。
ａＪおよびＧｒｐＥの発現量は、多すぎても少なすぎて
もＣｒｙｊIIの不溶化が起こるということが示唆され、
ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥは、ＣｒｙｊIIのフ
ォールディングに何らかの重要な影響を与えていると考
えられる。
【００５３】次に、ｒｐｏＨ欠失変異株共形質転換菌
（ＮＫ１９６）を用いて、前記と同様にしてＣｒｙｊII
のフォールディングに係わるシャペロンをさらに詳細に
検討する（図８、９）。図８、９に示すように、ｒｐｏ
Ｈ欠失変異株では、一連のシャペロンやプロテアーゼの
量が減少しているため、発現したＣｒｙｊIIは非常に安
定であるが著しく不溶化する（図８および９、レーン
ａ）。また、ＣｒｙｊIIの可溶化については、Ｄｎａ
Ｋ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥの３つだけ、またはＧｒｏ
ＥＬおよびＧｒｏＥＳの２つだけを共発現させた場合
は、ＣｒｙｊIIは可溶化せず（図９、レーンｂ、ｃ）、
ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒ
ｏＥＳの５つを共発現させた場合に初めてＣｒｙｊIIが
可溶化する（図９、レーンｄ）。さらに、前記５つを共
発現させる条件下で、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐ
Ｅの発現量をさらに増やすと、ＣｒｙｊIIの再不溶化が
起こり（図９、レーンｅ）、ＮＫ２４１での実験結果と
一致する。
（ＮＫ１９６）を用いて、前記と同様にしてＣｒｙｊII
のフォールディングに係わるシャペロンをさらに詳細に
検討する（図８、９）。図８、９に示すように、ｒｐｏ
Ｈ欠失変異株では、一連のシャペロンやプロテアーゼの
量が減少しているため、発現したＣｒｙｊIIは非常に安
定であるが著しく不溶化する（図８および９、レーン
ａ）。また、ＣｒｙｊIIの可溶化については、Ｄｎａ
Ｋ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥの３つだけ、またはＧｒｏ
ＥＬおよびＧｒｏＥＳの２つだけを共発現させた場合
は、ＣｒｙｊIIは可溶化せず（図９、レーンｂ、ｃ）、
ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒ
ｏＥＳの５つを共発現させた場合に初めてＣｒｙｊIIが
可溶化する（図９、レーンｄ）。さらに、前記５つを共
発現させる条件下で、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐ
Ｅの発現量をさらに増やすと、ＣｒｙｊIIの再不溶化が
起こり（図９、レーンｅ）、ＮＫ２４１での実験結果と
一致する。
【００５４】前記結果を考え合わせると、以下のような
仮説をたてることができる。即ち、ＧｒｏＥＬおよびＧ
ｒｏＥＳは、ＣｒｙｊIIと結合してプロテアーゼによる
分解を阻害するが、ＣｒｙｊIIのフォールディングには
あまり関与しない。一方、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧ
ｒｐＥは、ＣｒｙｊIIのフォールディングにも深く係わ
っており、特にＤｎａＪが重要な役割を担っていると考
えられる。しかし、過剰にＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧ
ｒｐＥが発現しても不溶化してしまう。そこで、Ｃｒｙ
ｊIIのフォールディングを効率的に行なうためには、Ｄ
ｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥならびにＧｒｏＥＬお
よびＧｒｏＥＳの両シャペロングループが適度に存在す
る方がよい。この仮説は、これまでに示されてきたシャ
ペロンが互いに協調的に働くという諸説ともよく一致す
るものである。
仮説をたてることができる。即ち、ＧｒｏＥＬおよびＧ
ｒｏＥＳは、ＣｒｙｊIIと結合してプロテアーゼによる
分解を阻害するが、ＣｒｙｊIIのフォールディングには
あまり関与しない。一方、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧ
ｒｐＥは、ＣｒｙｊIIのフォールディングにも深く係わ
っており、特にＤｎａＪが重要な役割を担っていると考
えられる。しかし、過剰にＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧ
ｒｐＥが発現しても不溶化してしまう。そこで、Ｃｒｙ
ｊIIのフォールディングを効率的に行なうためには、Ｄ
ｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥならびにＧｒｏＥＬお
よびＧｒｏＥＳの両シャペロングループが適度に存在す
る方がよい。この仮説は、これまでに示されてきたシャ
ペロンが互いに協調的に働くという諸説ともよく一致す
るものである。
【００５５】ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥ
ＬおよびＧｒｏＥＳの５つのシャペロンを同時にまたは
グループ別に共発現させて外来蛋白質発現への影響およ
び効果的な発現を調べることは、新規である。Ｃｒｙｊ
IIのような共発現させるシャペロンの種類や量によって
挙動の変わる蛋白質を研究することは、シャペロンの働
きを知る上でも興味深いと思われる。また、ｒｐｏＨ欠
失変異株中でシャペロンのみを過剰発現させる系は、他
の外来蛋白質のより効率的な発現にも適用できると思わ
れる。
ＬおよびＧｒｏＥＳの５つのシャペロンを同時にまたは
グループ別に共発現させて外来蛋白質発現への影響およ
び効果的な発現を調べることは、新規である。Ｃｒｙｊ
IIのような共発現させるシャペロンの種類や量によって
挙動の変わる蛋白質を研究することは、シャペロンの働
きを知る上でも興味深いと思われる。また、ｒｐｏＨ欠
失変異株中でシャペロンのみを過剰発現させる系は、他
の外来蛋白質のより効率的な発現にも適用できると思わ
れる。
【００５６】（２）ＮＫ２４１の培養、シャペロンおよ
び外来蛋白質の誘導発現ならびに菌体の回収 このようにして得られたＣｒｙｊIIを安定および可溶化
発現させるために好適なシャペロン誘導条件下（１０ｎ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび１ｍｇ／ｍｌのＬ−
アラビノース）で、ＮＫ２４１を（１）と同様に培養
し、ＫｌｅｔｔＵｎｉｔ約４０のときに、１ｍＭのＩＰ
ＴＧを培地に添加し、２時間後に菌体を集める。
び外来蛋白質の誘導発現ならびに菌体の回収 このようにして得られたＣｒｙｊIIを安定および可溶化
発現させるために好適なシャペロン誘導条件下（１０ｎ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび１ｍｇ／ｍｌのＬ−
アラビノース）で、ＮＫ２４１を（１）と同様に培養
し、ＫｌｅｔｔＵｎｉｔ約４０のときに、１ｍＭのＩＰ
ＴＧを培地に添加し、２時間後に菌体を集める。
【００５７】（３）ＣｒｙｊIIの単離・精製 集めた菌体を破砕して、遠心分離等により上清を回収
し、ゲル濾過、各種のカラムクロマトグラフィー等、蛋
白質の精製に使用されている通常の方法によりＣｒｙｊ
IIを精製する。
し、ゲル濾過、各種のカラムクロマトグラフィー等、蛋
白質の精製に使用されている通常の方法によりＣｒｙｊ
IIを精製する。
【００５８】別の例として、ヒト低酸素誘導性ストレス
蛋白質ＯＲＰ１５０発現ベクターｐＯＲＰ４（ＩＰＴＧ
により誘導）およびｐＧ−ＫＪＥ６をＪＭ１０９に導入
して得られた共形質転換菌（ＮＫ２６９）を用いるヒト
ＯＲＰ１５０の製造方法について述べる。大腸菌内でｐ
ＯＲＰ４単独でヒトＯＲＰ１５０を発現させると、発現
したＯＲＰ１５０の多くが不溶化する。ＮＫ２６９は、
培養開始時から培地にＬ−アラビノースを添加すると、
理由は不明であるが生育できないので、Ｌ−アラビノー
スおよびテトラサイクリンをＫｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約４
０のときに加えること以外は前記と同様にして、ＮＫ２
６９を培養し、発現誘導させる（図１０）。図１０に示
すように、ヒトＯＲＰ１５０は、ＧｒｏＥＬおよびＧｒ
ｏＥＳだけを共発現させた場合は、半分以上が可溶性画
分にきており（パネル右、レーンｂ）、ＤｎａＫ、Ｄｎ
ａＪおよびＧｒｐＥの３つだけまたは前記５つを同時に
発現させた場合には、ほとんど可溶化することがわかる
（パネル右、レーンｃ、ｄ、ｅ）。
蛋白質ＯＲＰ１５０発現ベクターｐＯＲＰ４（ＩＰＴＧ
により誘導）およびｐＧ−ＫＪＥ６をＪＭ１０９に導入
して得られた共形質転換菌（ＮＫ２６９）を用いるヒト
ＯＲＰ１５０の製造方法について述べる。大腸菌内でｐ
ＯＲＰ４単独でヒトＯＲＰ１５０を発現させると、発現
したＯＲＰ１５０の多くが不溶化する。ＮＫ２６９は、
培養開始時から培地にＬ−アラビノースを添加すると、
理由は不明であるが生育できないので、Ｌ−アラビノー
スおよびテトラサイクリンをＫｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約４
０のときに加えること以外は前記と同様にして、ＮＫ２
６９を培養し、発現誘導させる（図１０）。図１０に示
すように、ヒトＯＲＰ１５０は、ＧｒｏＥＬおよびＧｒ
ｏＥＳだけを共発現させた場合は、半分以上が可溶性画
分にきており（パネル右、レーンｂ）、ＤｎａＫ、Ｄｎ
ａＪおよびＧｒｐＥの３つだけまたは前記５つを同時に
発現させた場合には、ほとんど可溶化することがわかる
（パネル右、レーンｃ、ｄ、ｅ）。
【００５９】従って、ヒトＯＲＰ１５０を製造するため
には、例えば、Ｌ培地中でＮＫ２６９を培養し、Ｋｌｅ
ｔｔ Ｕｎｉｔ約４０のときに、１０ｎｇ／ｍｌのテト
ラサイクリン、１０ｍｇ／ｍｌのＬ−アラビノースおよ
び１ｍＭのＩＰＴＧを前記培地に添加して発現誘導させ
る。２時間培養後、前記と同様に菌体を集め、ＯＲＰ１
５０を単離・精製する。
には、例えば、Ｌ培地中でＮＫ２６９を培養し、Ｋｌｅ
ｔｔ Ｕｎｉｔ約４０のときに、１０ｎｇ／ｍｌのテト
ラサイクリン、１０ｍｇ／ｍｌのＬ−アラビノースおよ
び１ｍＭのＩＰＴＧを前記培地に添加して発現誘導させ
る。２時間培養後、前記と同様に菌体を集め、ＯＲＰ１
５０を単離・精製する。
【００６０】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。特に明記しない限り、以下の実施例
は、 Sambrook, J. ら著、Molecular Cloning: A Labor
atory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, New York, 1989年発行、Current Protocols
in Protein Science(ed. Coligan, J. E. et al.), Joh
n Wiley and Sons,Inc.等に記載の方法で行った。
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。特に明記しない限り、以下の実施例
は、 Sambrook, J. ら著、Molecular Cloning: A Labor
atory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, New York, 1989年発行、Current Protocols
in Protein Science(ed. Coligan, J. E. et al.), Joh
n Wiley and Sons,Inc.等に記載の方法で行った。
【００６１】実施例１ｐＫＪＥ7 の調製 ｐＡＣＹＣベクター由来でＣｍ耐性遺伝子、ａｒａＣ、
ａｒａＢプロモーター／オペレーター遺伝子を有するプ
ラスミドｐＡＲ３（ＡＴＣＣ８７０２６）のａｒａＢプ
ロモーター下流を制限酵素ＰｓｔＩで切断し、平滑末端
にした後、ＰＣＲで調製した大腸菌のｄｎａＫ／ｄｎａ
Ｊオペロンのコーディング領域約３ｋｂと、ｇｒｐＥ遺
伝子のコーディング領域約０．６ｋｂを挿入して、ａｒ
ａＢプロモーターの支配下に１つのオペロンからＤｎａ
Ｋ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを発現するプラスミドｐＫ
ＪＥ７を作製した。
ａｒａＢプロモーター／オペレーター遺伝子を有するプ
ラスミドｐＡＲ３（ＡＴＣＣ８７０２６）のａｒａＢプ
ロモーター下流を制限酵素ＰｓｔＩで切断し、平滑末端
にした後、ＰＣＲで調製した大腸菌のｄｎａＫ／ｄｎａ
Ｊオペロンのコーディング領域約３ｋｂと、ｇｒｐＥ遺
伝子のコーディング領域約０．６ｋｂを挿入して、ａｒ
ａＢプロモーターの支配下に１つのオペロンからＤｎａ
Ｋ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを発現するプラスミドｐＫ
ＪＥ７を作製した。
【００６２】比較例１ｐＫＪ１の調製 実施例１で得られたｐＫＪＥ７を制限酵素ＢｓｐＨＩお
よびＫｐｎＩで切断して、ＧｒｐＥ遺伝子のコーディン
グ領域をほぼすべて取り除き、平滑末端にした後、セル
フライゲーションさせた。ａｒａＢプロモーターからＤ
ｎａＫおよびＤｎａＪのみを発現するプラスミドを単離
し、ｐＫＪ１とした。
よびＫｐｎＩで切断して、ＧｒｐＥ遺伝子のコーディン
グ領域をほぼすべて取り除き、平滑末端にした後、セル
フライゲーションさせた。ａｒａＢプロモーターからＤ
ｎａＫおよびＤｎａＪのみを発現するプラスミドを単離
し、ｐＫＪ１とした。
【００６３】実施例２ＮＫ２８４共形質転換菌の調製 ヒトプロウロキナーゼをＩＰＴＧで発現誘導できるプラ
スミドｐＵＫ−０２ｐｍ０[Kanemori, M. et al., J. B
acteriol. 176, 5648-5653(1994)] １０ｎｇと、実施例
１で得られたｐＫＪＥ７を１０ｎｇ用いて、塩化ルビジ
ウム法によりＭＧ１６５５（ＣＧＳＣ６３００；E. col
i Genetic Stock Center, Yale University)を形質転換
した。クロラムフェニコールおよびアンピシリンにより
スクリーニングし、ｐＵＫ−０２ｐｍ０とｐＫＪＥ７と
の共形質転換菌を単離し、ＮＫ２８４とした。
スミドｐＵＫ−０２ｐｍ０[Kanemori, M. et al., J. B
acteriol. 176, 5648-5653(1994)] １０ｎｇと、実施例
１で得られたｐＫＪＥ７を１０ｎｇ用いて、塩化ルビジ
ウム法によりＭＧ１６５５（ＣＧＳＣ６３００；E. col
i Genetic Stock Center, Yale University)を形質転換
した。クロラムフェニコールおよびアンピシリンにより
スクリーニングし、ｐＵＫ−０２ｐｍ０とｐＫＪＥ７と
の共形質転換菌を単離し、ＮＫ２８４とした。
【００６４】比較例２ＮＫ２８７共形質転換菌の調製 実施例２において、ｐＫＪＥ７の代わりに比較例１で得
られたｐＫＪ１を用いること以外は実施例２と同様にし
て、ｐＵＫ−０２ｐｍ０とｐＫＪ１との共形質転換菌を
単離し、ＮＫ２８７とした。
られたｐＫＪ１を用いること以外は実施例２と同様にし
て、ｐＵＫ−０２ｐｍ０とｐＫＪ１との共形質転換菌を
単離し、ＮＫ２８７とした。
【００６５】試験例１ＮＫ２８４およびＮＫ２８７を用いたプロウロキナーゼ
の発現 実施例２で得られたＮＫ２８４および比較例２で得られ
たＮＫ２８７を、１ｍｇ／ｍｌのＬ−アラビノース（和
光純薬工業株式会社製）を添加したＬ培地中、３７℃で
培養し、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約４０のときに１ｍＭの
ＩＰＴＧ（和光純薬工業株式会社製）を培地に添加し、
１時間後に培養液の一部を取り、トリクロロ酢酸を終濃
度５％になるように加え、菌体を沈殿させた。沈殿物を
遠心分離により集め、アセトンで洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ用サンプルバッファーに溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により蛋白質を分離した後、ＣＢＢ染色により誘導され
たシャペロンを検出した（図２、パネル左）。
の発現 実施例２で得られたＮＫ２８４および比較例２で得られ
たＮＫ２８７を、１ｍｇ／ｍｌのＬ−アラビノース（和
光純薬工業株式会社製）を添加したＬ培地中、３７℃で
培養し、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約４０のときに１ｍＭの
ＩＰＴＧ（和光純薬工業株式会社製）を培地に添加し、
１時間後に培養液の一部を取り、トリクロロ酢酸を終濃
度５％になるように加え、菌体を沈殿させた。沈殿物を
遠心分離により集め、アセトンで洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ用サンプルバッファーに溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により蛋白質を分離した後、ＣＢＢ染色により誘導され
たシャペロンを検出した（図２、パネル左）。
【００６６】また、前記培養液の残りを遠心分離して回
収したＮＫ２８４およびＮＫ２８７の各菌体を超音波処
理により破砕した後、遠心分離により可溶性画分と不溶
性画分に分画して、抗ウロキナーゼ抗体（SANBIO BV 社
製) を用いたウエスタンブロッティングにより両画分の
プロウロキナーゼを検出した（図２、パネル右）。
収したＮＫ２８４およびＮＫ２８７の各菌体を超音波処
理により破砕した後、遠心分離により可溶性画分と不溶
性画分に分画して、抗ウロキナーゼ抗体（SANBIO BV 社
製) を用いたウエスタンブロッティングにより両画分の
プロウロキナーゼを検出した（図２、パネル右）。
【００６７】実施例３ｐＧ−ＫＪＥ６の調製 Ｐｚｔ−１プロモーターを有するプラスミドｐＵＨＥ２
Ｐｚｔ−１（ドイツハイデルベルク大学 H. Bujard博士
より入手）のＰｚｔ−１プロモーター下流に存在するル
シフェラーゼ遺伝子を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｂａ
Ｉで切り出し、そこにｐＫＶ１５６１[Kanemori, M. et
al., J. Bacteriol. 176,4235-4242(1994)]を制限酵素
ＸｈｏＩで消化して得たプロモーター領域を含まない大
腸菌ｇｒｏＥオペロンを連結して、Ｐｚｔ−１プロモー
ターの支配下にＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを発現する
プラスミドｐＧｒｏ８を作製した。次いで、トランスポ
ゾンＴｎ１０を有する大腸菌からＰＣＲにより約８００
ｂｐのテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）遺伝
子を調製し、ｐＧｒｏ８のＰｚｔ−１プロモーター上流
に存在するＡａｔＩ部位に挿入し、ｐＧｒｏ１０Ｒを得
た。
Ｐｚｔ−１（ドイツハイデルベルク大学 H. Bujard博士
より入手）のＰｚｔ−１プロモーター下流に存在するル
シフェラーゼ遺伝子を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｂａ
Ｉで切り出し、そこにｐＫＶ１５６１[Kanemori, M. et
al., J. Bacteriol. 176,4235-4242(1994)]を制限酵素
ＸｈｏＩで消化して得たプロモーター領域を含まない大
腸菌ｇｒｏＥオペロンを連結して、Ｐｚｔ−１プロモー
ターの支配下にＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを発現する
プラスミドｐＧｒｏ８を作製した。次いで、トランスポ
ゾンＴｎ１０を有する大腸菌からＰＣＲにより約８００
ｂｐのテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）遺伝
子を調製し、ｐＧｒｏ８のＰｚｔ−１プロモーター上流
に存在するＡａｔＩ部位に挿入し、ｐＧｒｏ１０Ｒを得
た。
【００６８】次に、ｐＧｒｏ１０Ｒを制限酵素ＳａｃＩ
およびＡｖｒIIで切断して、ｔｅｔＲ−Ｐｚｔ−１−ｇ
ｒｏＥＳｇｒｏＥＬを含む断片を調製し、末端平滑化処
理をした後、これを実施例１で得られたｐＫＪＥ７のＸ
ｍｎＩ部位に挿入して、ａｒａＢプロモーターからＤｎ
ａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを、Ｐｚｔ−１からＧｒ
ｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを発現するプラスミドｐＧ−Ｋ
ＪＥ６を作製した。
およびＡｖｒIIで切断して、ｔｅｔＲ−Ｐｚｔ−１−ｇ
ｒｏＥＳｇｒｏＥＬを含む断片を調製し、末端平滑化処
理をした後、これを実施例１で得られたｐＫＪＥ７のＸ
ｍｎＩ部位に挿入して、ａｒａＢプロモーターからＤｎ
ａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを、Ｐｚｔ−１からＧｒ
ｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを発現するプラスミドｐＧ−Ｋ
ＪＥ６を作製した。
【００６９】実施例４ＪＭ１０９におけるｐＧ−ＫＪＥ６からのシャペロンの
誘導発現 実施例３で得られたｐＧ−ＫＪＥ６を１０ｎｇ用いて、
塩化ルビジウム法によりＪＭ１０９（ＴａＫａＲａコン
ピテントセル、宝酒造株式会社製）を形質転換した。ク
ロラムフェニコールによりスクリーニングして得られた
形質転換菌を、０〜３ｍｇ／ｍｌのＬ−アラビノース
（和光純薬工業株式会社製）および０〜１５０ｎｇ／ｍ
ｌのテトラサイクリン（ナカライテスク株式会社製）を
添加したＬ培地中、３７℃で培養し、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎ
ｉｔ約４０のときに培養液にトリクロロ酢酸を終濃度５
％となるように加え、菌体を沈殿させた。各沈殿物を遠
心分離により集め、アセトンで洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ用サンプルバッファーに溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より蛋白質を分離した後、ＣＢＢ染色により、誘導され
たシャペロンを検出した（図３）。
誘導発現 実施例３で得られたｐＧ−ＫＪＥ６を１０ｎｇ用いて、
塩化ルビジウム法によりＪＭ１０９（ＴａＫａＲａコン
ピテントセル、宝酒造株式会社製）を形質転換した。ク
ロラムフェニコールによりスクリーニングして得られた
形質転換菌を、０〜３ｍｇ／ｍｌのＬ−アラビノース
（和光純薬工業株式会社製）および０〜１５０ｎｇ／ｍ
ｌのテトラサイクリン（ナカライテスク株式会社製）を
添加したＬ培地中、３７℃で培養し、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎ
ｉｔ約４０のときに培養液にトリクロロ酢酸を終濃度５
％となるように加え、菌体を沈殿させた。各沈殿物を遠
心分離により集め、アセトンで洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ用サンプルバッファーに溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より蛋白質を分離した後、ＣＢＢ染色により、誘導され
たシャペロンを検出した（図３）。
【００７０】実施例５ＮＫ２４１共形質転換菌の調製 スギ花粉抗原ＣｒｙｊIIｃＤＮＡ[Namba, M. et al.,FE
BS Lett. 353,124-128(1994)] の成熟型ＣｒｙｊII蛋白
質（Ａｒｇ46〜Ｓｅｒ433 ）をコードする領域を、ＩＰ
ＴＧで誘導可能な大腸菌用発現プラスミドｐＫＫ２２３
−３（Pharmacia Biotech 社製) のＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ
Ｉ部位に挿入して、ｐＫＣＪ２を作製した。次いで、ｐ
ＫＣＪ２のＢａｍＨＩ部位に、ｐＭＪＲ１５６０（Amer
sham社製) から調製したｌａｃＩq 遺伝子を挿入してｐ
ＫＣＪ２Ｉとした。
BS Lett. 353,124-128(1994)] の成熟型ＣｒｙｊII蛋白
質（Ａｒｇ46〜Ｓｅｒ433 ）をコードする領域を、ＩＰ
ＴＧで誘導可能な大腸菌用発現プラスミドｐＫＫ２２３
−３（Pharmacia Biotech 社製) のＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ
Ｉ部位に挿入して、ｐＫＣＪ２を作製した。次いで、ｐ
ＫＣＪ２のＢａｍＨＩ部位に、ｐＭＪＲ１５６０（Amer
sham社製) から調製したｌａｃＩq 遺伝子を挿入してｐ
ＫＣＪ２Ｉとした。
【００７１】１０ｎｇの実施例３で得られたｐＧ−ＫＪ
Ｅ６と１０ｎｇの前記ＣｒｙｊII発現ベクターｐＫＣＪ
２Ｉとを用いて、塩化ルビジウム法によりＭＧ１６５５
（ＣＧＳＣ６３００）(E. coli Genetic Stock Center,
Yale University) を形質転換した。クロラムフェニコ
ールおよびアンピシリンによりスクリーニングして共形
質転換菌を単離し、ＮＫ２４１を得た。
Ｅ６と１０ｎｇの前記ＣｒｙｊII発現ベクターｐＫＣＪ
２Ｉとを用いて、塩化ルビジウム法によりＭＧ１６５５
（ＣＧＳＣ６３００）(E. coli Genetic Stock Center,
Yale University) を形質転換した。クロラムフェニコ
ールおよびアンピシリンによりスクリーニングして共形
質転換菌を単離し、ＮＫ２４１を得た。
【００７２】実施例６ＮＫ２４１を用いたＣｒｙｊIIの発現 実施例５で得られたＮＫ２４１を、０〜８ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−アラビノースおよび０〜１０ｎｇ／ｍｌのテトラサ
イクリンを添加した以外は実施例４と同様の方法で培養
し、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約４０のときに、１ｍＭのＩ
ＰＴＧを培地に添加し、２時間後に培養液の一部を取
り、トリクロロ酢酸を終濃度５％になるように加え、菌
体を沈殿させた。沈殿物を遠心分離により集め、アセト
ンで洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーに
溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質を分離した後、
ＣＢＢ染色により、誘導されたシャペロンを検出した。
さらに、抗ＣｒｙｊIIモノクローナル抗体Ｎ−２６[ 澤
谷ら、アレルギー 43,467-473(1994)]を用いるウエスタ
ンブロッティングによりＣｒｙｊIIを検出した（図
４）。
Ｌ−アラビノースおよび０〜１０ｎｇ／ｍｌのテトラサ
イクリンを添加した以外は実施例４と同様の方法で培養
し、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約４０のときに、１ｍＭのＩ
ＰＴＧを培地に添加し、２時間後に培養液の一部を取
り、トリクロロ酢酸を終濃度５％になるように加え、菌
体を沈殿させた。沈殿物を遠心分離により集め、アセト
ンで洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーに
溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質を分離した後、
ＣＢＢ染色により、誘導されたシャペロンを検出した。
さらに、抗ＣｒｙｊIIモノクローナル抗体Ｎ−２６[ 澤
谷ら、アレルギー 43,467-473(1994)]を用いるウエスタ
ンブロッティングによりＣｒｙｊIIを検出した（図
４）。
【００７３】また、前記培養液の残りを遠心分離して回
収したＮＫ２４１菌体を超音波処理により破砕した後、
遠心分離により可溶性画分と不溶性画分とに分画して、
前記と同様にウエスタンブロッティングにより両画分の
ＣｒｙｊIIを検出した（図５）。
収したＮＫ２４１菌体を超音波処理により破砕した後、
遠心分離により可溶性画分と不溶性画分とに分画して、
前記と同様にウエスタンブロッティングにより両画分の
ＣｒｙｊIIを検出した（図５）。
【００７４】実施例７ＮＫ２４１で発現させたＣｒｙｊIIの安定性 実施例５で得られたＮＫ２４１を、２０ｎｇ／ｍｌのテ
トラサイクリン、８ｍｇ／ｍｌのＬ−アラビノースまた
は２０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンと８ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−アラビノースを添加した以外は実施例４と同様の方
法で培養し、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約４０のときに、１
ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加し、２時間ＣｒｙｊIIを発
現誘導した。次に、５００μｇ／ｍｌとなるようにスペ
クチノマイシン（シグマ社製）を加えて蛋白質合成を止
め、経時的にサンプリングして菌体を集めた。各菌体の
全蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、抗Ｃｒ
ｙｊIIモノクローナル抗体Ｎ−２６を用いてウエスタン
ブロッティングを行なった。ウエスタンブロッティング
像をスキャナーで取り込み、解析ソフトIntelligent Qu
antfier(日本バイオイメージ社製) で、バンド強度を定
量した（図６）。
トラサイクリン、８ｍｇ／ｍｌのＬ−アラビノースまた
は２０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンと８ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−アラビノースを添加した以外は実施例４と同様の方
法で培養し、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約４０のときに、１
ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加し、２時間ＣｒｙｊIIを発
現誘導した。次に、５００μｇ／ｍｌとなるようにスペ
クチノマイシン（シグマ社製）を加えて蛋白質合成を止
め、経時的にサンプリングして菌体を集めた。各菌体の
全蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、抗Ｃｒ
ｙｊIIモノクローナル抗体Ｎ−２６を用いてウエスタン
ブロッティングを行なった。ウエスタンブロッティング
像をスキャナーで取り込み、解析ソフトIntelligent Qu
antfier(日本バイオイメージ社製) で、バンド強度を定
量した（図６）。
【００７５】実施例８種々のシャペロン変異株中でのＣｒｙｊIIの発現 ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒ
ｏＥＳ各変異株（ＭＣ４１００株由来）として、それぞ
れ、ＭＣ４１００ΔｄｎａＫ５２[Nagai, H. et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10280-10284(1994)]、
ＭＣ４１００ｄｎａＪ２５９[Ishiai, M. et al., J. B
acteriol. 174, 5597-5603(1992)] 、ＭＣ４１００ｇｒ
ｐＥ２８０[Ishiai, M. et al., J. Bacteriol. 174, 5
597-5603(1992)] 、ＭＣ４１００ＥＬ４４[Tilly, K. &
Georgopoulos, C., J. Bacteriol. 149, 1082-1088(19
82)]、ＭＣ４１００ＥＳ７２[Tilly, K. & Georgopoulo
s,C., J. Bacteriol. 149, 1082-1088(1982)]を用い
た。実施例５に記載の方法に従って、１０ｎｇのＣｒｙ
ｊII発現ベクターを前記変異株に導入し、実施例６と同
様にしてＣｒｙｊIIの発現と可溶性を調べた（図７）。
ｏＥＳ各変異株（ＭＣ４１００株由来）として、それぞ
れ、ＭＣ４１００ΔｄｎａＫ５２[Nagai, H. et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10280-10284(1994)]、
ＭＣ４１００ｄｎａＪ２５９[Ishiai, M. et al., J. B
acteriol. 174, 5597-5603(1992)] 、ＭＣ４１００ｇｒ
ｐＥ２８０[Ishiai, M. et al., J. Bacteriol. 174, 5
597-5603(1992)] 、ＭＣ４１００ＥＬ４４[Tilly, K. &
Georgopoulos, C., J. Bacteriol. 149, 1082-1088(19
82)]、ＭＣ４１００ＥＳ７２[Tilly, K. & Georgopoulo
s,C., J. Bacteriol. 149, 1082-1088(1982)]を用い
た。実施例５に記載の方法に従って、１０ｎｇのＣｒｙ
ｊII発現ベクターを前記変異株に導入し、実施例６と同
様にしてＣｒｙｊIIの発現と可溶性を調べた（図７）。
【００７６】実施例９ｒｐｏＨ欠失変異株中でのＣｒｙｊIIの発現 ＭＣ４１００ΔｒｐｏＨ[Zhou, Y. N. et al., J. Bact
eriol. 170,3640-3649(1988)] のΔｒｐｏＨ：：ｋａｎ
遺伝子を、Ｔ４ファージを用いたトランスダクションに
よりＭＧ１６５５に移した。カナマイシン耐性を指標に
ΔｒｐｏＨ：：ｋａｎの移った菌株を選択し、２０℃で
は増殖するが３０℃、３７℃および４２℃で増殖できな
いことを確認してＭＧ１６５５ΔｒｐｏＨ株ＮＫ１６１
を得た。
eriol. 170,3640-3649(1988)] のΔｒｐｏＨ：：ｋａｎ
遺伝子を、Ｔ４ファージを用いたトランスダクションに
よりＭＧ１６５５に移した。カナマイシン耐性を指標に
ΔｒｐｏＨ：：ｋａｎの移った菌株を選択し、２０℃で
は増殖するが３０℃、３７℃および４２℃で増殖できな
いことを確認してＭＧ１６５５ΔｒｐｏＨ株ＮＫ１６１
を得た。
【００７７】ＭＧ１６５５の代わりに前記ＭＧ１６５５
ΔｒｐｏＨ株ＮＫ１６１を用いること以外は、実施例５
と同様にして、ｒｐｏＨ欠失変異株共形質転換菌ＮＫ１
９６を得た。ＮＫ１９６を用いて、実施例６と同様にし
てＣｒｙｊIIの発現と可溶性を調べた（図８、９）。
ΔｒｐｏＨ株ＮＫ１６１を用いること以外は、実施例５
と同様にして、ｒｐｏＨ欠失変異株共形質転換菌ＮＫ１
９６を得た。ＮＫ１９６を用いて、実施例６と同様にし
てＣｒｙｊIIの発現と可溶性を調べた（図８、９）。
【００７８】実施例１０ＮＫ２６９共形質転換菌の調製 ヒトＯＲＰ１５０ｃＤＮＡ[Ikeda, J. et al., Bioche
m. Biophys. Res. Comm. 230, 94-99(1997)] の成熟型
ＯＲＰ１５０蛋白質（Ｌｅｕ33〜Ｌｅｕ999 ）をコード
する領域を、ＩＰＴＧで誘導可能な大腸菌用発現プラス
ミドｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia Biotech 社製) のＮｃ
ｏＩ部位に挿入して、ｐＯＲＰ４を作製した。１０ｎｇ
のｐＯＲＰ４および１０ｎｇの実施例３で得られたｐＧ
−ＫＪＥ６を、実施例４に記載の方法に従って、ＪＭ１
０９を形質転換し、共形質転換菌ＮＫ２６９を得た。
m. Biophys. Res. Comm. 230, 94-99(1997)] の成熟型
ＯＲＰ１５０蛋白質（Ｌｅｕ33〜Ｌｅｕ999 ）をコード
する領域を、ＩＰＴＧで誘導可能な大腸菌用発現プラス
ミドｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia Biotech 社製) のＮｃ
ｏＩ部位に挿入して、ｐＯＲＰ４を作製した。１０ｎｇ
のｐＯＲＰ４および１０ｎｇの実施例３で得られたｐＧ
−ＫＪＥ６を、実施例４に記載の方法に従って、ＪＭ１
０９を形質転換し、共形質転換菌ＮＫ２６９を得た。
【００７９】実施例１１ＮＫ２６９を用いたヒトＯＲＰ１５０の発現 実施例１０で得られたＮＫ２６９は、培養開始時から培
地にＬ−アラビノースを添加すると生育できないので、
Ｌ−アラビノースおよびテトラサイクリンをＫｌｅｔｔ
Ｕｎｉｔ約４０のときに加えること以外は実施例６と
同様にして、ＮＫ２６９を培養し、ヒトＯＲＰ１５０を
発現誘導させた（図１０）。
地にＬ−アラビノースを添加すると生育できないので、
Ｌ−アラビノースおよびテトラサイクリンをＫｌｅｔｔ
Ｕｎｉｔ約４０のときに加えること以外は実施例６と
同様にして、ＮＫ２６９を培養し、ヒトＯＲＰ１５０を
発現誘導させた（図１０）。
【００８０】
【発明の効果】本発明により、大腸菌の菌体内で外来蛋
白質を安定化かつ可溶化させて発現するために用いられ
るシャペロンをコードするオペロン、かかるオペロンを
有する発現プラスミド、かかるプラスミドを外来蛋白質
発現ベクターと共に大腸菌に導入して得られる共形質転
換菌およびかかる共形質転換菌を用いる外来蛋白質の製
造方法が提供される。本発明によれば、大腸菌における
外来蛋白質の効率的な遺伝子工学的生産が可能となる。
白質を安定化かつ可溶化させて発現するために用いられ
るシャペロンをコードするオペロン、かかるオペロンを
有する発現プラスミド、かかるプラスミドを外来蛋白質
発現ベクターと共に大腸菌に導入して得られる共形質転
換菌およびかかる共形質転換菌を用いる外来蛋白質の製
造方法が提供される。本発明によれば、大腸菌における
外来蛋白質の効率的な遺伝子工学的生産が可能となる。
【図１】図１は、プラスミドｐＧ−ＫＪＥ６の概略図を
示す。
示す。
【図２】図２は、ＮＫ２８４およびＮＫ２８７におい
て、１ｍｇ／ｍｌのＬ−アラビノース（Ａｒａ）による
シャペロンの発現誘導（パネル左）ならびにプロウロキ
ナーゼ（ｐｒｏＵＫ）の可溶性（パネル右）を示す電気
泳動の写真である。図中、Ｓは可溶性画分を示し、Ｉは
不溶性画分を示す。
て、１ｍｇ／ｍｌのＬ−アラビノース（Ａｒａ）による
シャペロンの発現誘導（パネル左）ならびにプロウロキ
ナーゼ（ｐｒｏＵＫ）の可溶性（パネル右）を示す電気
泳動の写真である。図中、Ｓは可溶性画分を示し、Ｉは
不溶性画分を示す。
【図３】図３は、ＪＭ１０９において、ｐＧ−ＫＪＥ６
からのシャペロンの発現誘導を示す電気泳動の写真であ
る。各レーンの上の数字は、Ｌ−アラビノース（Ａｒ
ａ）およびテトラサイクリン（Ｔｃ）の濃度を示す。
からのシャペロンの発現誘導を示す電気泳動の写真であ
る。各レーンの上の数字は、Ｌ−アラビノース（Ａｒ
ａ）およびテトラサイクリン（Ｔｃ）の濃度を示す。
【図４】図４は、ＮＫ２４１において、種々の濃度のＡ
ｒａおよびＴｃによるシャペロンの発現誘導（パネル
左）ならびにＣｒｙｊIIの発現（パネル右）を示す電気
泳動の写真である。
ｒａおよびＴｃによるシャペロンの発現誘導（パネル
左）ならびにＣｒｙｊIIの発現（パネル右）を示す電気
泳動の写真である。
【図５】図５は、図４の各レーンと同じサンプルを可溶
性画分と不溶性画分とに分画することによるＣｒｙｊII
の挙動（可溶性）を示す電気泳動の写真である。図中、
Ｓは可溶性画分を示し、Ｉは不溶性画分を示す。
性画分と不溶性画分とに分画することによるＣｒｙｊII
の挙動（可溶性）を示す電気泳動の写真である。図中、
Ｓは可溶性画分を示し、Ｉは不溶性画分を示す。
【図６】図６は、ＮＫ２４１において、種々のシャペロ
ンと共発現させたＣｒｙｊIIの安定性を示すグラフであ
る。図中、０分の時のＣｒｙｊII量の値を１として示
し、ＣｒｙｊII残量が０．５の値を示す時間をＣｒｙｊ
II量の半減期とする。
ンと共発現させたＣｒｙｊIIの安定性を示すグラフであ
る。図中、０分の時のＣｒｙｊII量の値を１として示
し、ＣｒｙｊII残量が０．５の値を示す時間をＣｒｙｊ
II量の半減期とする。
【図７】図７は、種々のシャペロン変異株中でのＣｒｙ
ｊIIの発現を示す電気泳動の写真である。図中、ＭＣは
親株ＭＣ４１００を示し、Ｋ- はＭＣ４１００Δｄｎａ
Ｋ５２を示し、Ｊ- はＭＣ４１００ｄｎａＪ２５９を示
し、Ｅ- はＭＣ４１００ｇｒｐＥ２８０を示し、Ｌ- は
ＭＣ４１００ＥＬ４４を示し、Ｓ- はＭＣ４１００ＥＳ
７２を示す。図中、Ｓは可溶性画分を示し、Ｉは不溶性
画分を示す。
ｊIIの発現を示す電気泳動の写真である。図中、ＭＣは
親株ＭＣ４１００を示し、Ｋ- はＭＣ４１００Δｄｎａ
Ｋ５２を示し、Ｊ- はＭＣ４１００ｄｎａＪ２５９を示
し、Ｅ- はＭＣ４１００ｇｒｐＥ２８０を示し、Ｌ- は
ＭＣ４１００ＥＬ４４を示し、Ｓ- はＭＣ４１００ＥＳ
７２を示す。図中、Ｓは可溶性画分を示し、Ｉは不溶性
画分を示す。
【図８】図８は、ｒｐｏＨ欠失変異株中での種々の濃度
のＡｒａおよびＴｃによるシャペロンの発現誘導（パネ
ル上）ならびにＣｒｙｊIIの発現（パネル下）を示す電
気泳動の写真である。
のＡｒａおよびＴｃによるシャペロンの発現誘導（パネ
ル上）ならびにＣｒｙｊIIの発現（パネル下）を示す電
気泳動の写真である。
【図９】図９は、図８の各レーンと同じサンプルを可溶
性画分と不溶性画分とに分画することによるＣｒｙｊII
の可溶性を示す電気泳動の写真である。図中、Ｓは可溶
性画分を示し、Ｉは不溶性画分を示す。
性画分と不溶性画分とに分画することによるＣｒｙｊII
の可溶性を示す電気泳動の写真である。図中、Ｓは可溶
性画分を示し、Ｉは不溶性画分を示す。
【図１０】図１０は、ＮＫ２６９において、種々の濃度
のＡｒａおよびＴｃによるシャペロンの発現誘導（パネ
ル左）ならびにＯＲＰ１５０の発現（パネル右）を示す
電気泳動の写真である。各パネルの両端のレーンは、分
子量マーカーを示す。パネル右の各レーンのＳは可溶性
画分を示し、Ｉは不溶性画分を示す。
のＡｒａおよびＴｃによるシャペロンの発現誘導（パネ
ル左）ならびにＯＲＰ１５０の発現（パネル右）を示す
電気泳動の写真である。各パネルの両端のレーンは、分
子量マーカーを示す。パネル右の各レーンのＳは可溶性
画分を示し、Ｉは不溶性画分を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/51 Ｃ０７Ｋ 14/51 14/52 14/52 14/61 14/61 14/62 14/62 14/65 14/65 14/705 14/705 14/745 14/745 14/765 14/765 14/81 14/81 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/12 9/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｅ Ｆ Ｈ Ｌ Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (15)
- 【請求項１】 ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥのシ
ャペロンをコードする人工オペロン。 - 【請求項２】 誘導可能なプロモーターを含む請求項１
記載の人工オペロン。 - 【請求項３】 誘導可能なプロモーターが、ｌａｃ、ｔ
ｒｐ、ａｒａＢおよびＰｚｔ−１からなる群より選ばれ
た請求項２記載の人工オペロン。 - 【請求項４】 請求項１〜３いずれか記載の人工オペロ
ンを有し、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを発現す
るプラスミド。 - 【請求項５】 誘導可能なプロモーターに接続したｇｒ
ｏＥオペロンをさらに含んでなり、ＤｎａＫ、Ｄｎａ
Ｊ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを発現する
請求項４記載のプラスミド。 - 【請求項６】 ｇｒｏＥオペロンに接続している誘導可
能なプロモーターが、ｌａｃ、ｔｒｐ、ａｒａＢおよび
Ｐｚｔ−１からなる群より選ばれた請求項５記載のプラ
スミド。 - 【請求項７】 請求項４〜６いずれか記載のプラスミド
を、外来蛋白質発現ベクターと共に大腸菌に導入して得
られる共形質転換菌。 - 【請求項８】 大腸菌が、プロテアーゼ変異株である請
求項７記載の共形質転換菌。 - 【請求項９】 プロテアーゼ変異株が、ｌｏｎおよびｃ
ｌｐＰＸ二重変異株またはｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈ
ｓｌＶ／Ｕ三重変異株である請求項８記載の共形質転換
菌。 - 【請求項１０】 大腸菌が、ｐｌｓＸ変異株である請求
項７記載の共形質転換菌。 - 【請求項１１】 大腸菌が、ｒｐｏＨ変異株である請求
項７記載の共形質転換菌。 - 【請求項１２】 ｒｐｏＨ変異株が、ｒｐｏＨ欠失変異
株である請求項１１記載の共形質転換菌。 - 【請求項１３】 外来蛋白質が、インターフェロン、イ
ンターロイキン、インターロイキン受容体、インターロ
イキン受容体拮抗物質、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコ
ロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチ
ン、白血病抑制因子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死因子、
成長ホルモン、プロインスリン、インスリン様成長因
子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、トラン
スフォーミング成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因
子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経栄
養因子、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフ
ィン、プロウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチ
ベーター、血液凝固因子、プロテインＣ、グルコセレブ
ロシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、レニ
ン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシン、トリプシン
インヒビター、エラスターゼインヒビター、リポコルチ
ン、レプチン、免疫グロブリン、１本鎖抗体、補体成
分、血清アルブミン、スギ花粉抗原、低酸素誘導性スト
レス蛋白質、プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン
産物、転写調節因子およびウイルス構成蛋白質からなる
群より選ばれた請求項７〜１２いずれか記載の共形質転
換菌。 - 【請求項１４】 請求項７〜１３いずれか記載の共形質
転換菌を用いることを特徴とする、外来蛋白質の製造方
法。 - 【請求項１５】 ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥの
発現量とＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳの発現量が外来蛋
白質の安定化および／または可溶化に適したシャペロン
の誘導条件下で、共形質転換菌の培養を行う請求項１４
記載の製造方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18055897A JP3344618B2 (ja) | 1997-06-20 | 1997-06-20 | シャペロン発現プラスミド |
| US09/100,110 US6159708A (en) | 1997-06-20 | 1998-06-19 | Chaperone expression plasmids |
| CA002235468A CA2235468C (en) | 1997-06-20 | 1998-06-19 | Chaperone expression plasmids |
| DE69824487T DE69824487T2 (de) | 1997-06-20 | 1998-06-19 | Expressionsplasmide für Chaperone |
| EP98111348A EP0885967B1 (en) | 1997-06-20 | 1998-06-19 | Chaperone expression plasmids |
| AT98111348T ATE269410T1 (de) | 1997-06-20 | 1998-06-19 | Expressionsplasmide für chaperone |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18055897A JP3344618B2 (ja) | 1997-06-20 | 1997-06-20 | シャペロン発現プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH119274A true JPH119274A (ja) | 1999-01-19 |
| JP3344618B2 JP3344618B2 (ja) | 2002-11-11 |
Family
ID=16085388
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18055897A Expired - Lifetime JP3344618B2 (ja) | 1997-06-20 | 1997-06-20 | シャペロン発現プラスミド |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6159708A (ja) |
| EP (1) | EP0885967B1 (ja) |
| JP (1) | JP3344618B2 (ja) |
| AT (1) | ATE269410T1 (ja) |
| CA (1) | CA2235468C (ja) |
| DE (1) | DE69824487T2 (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001061487A (ja) * | 1999-07-29 | 2001-03-13 | F Hoffmann La Roche Ag | 分子シャペロンの共分泌による自然に折り畳まれた分泌タンパク質の製造法 |
| JP2002335959A (ja) * | 2001-04-30 | 2002-11-26 | F Hoffmann La Roche Ag | フォールディング補助タンパク質の共発現を伴うｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系でのタンパク質の発現方法 |
| JP2003500056A (ja) * | 1999-05-21 | 2003-01-07 | ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー | 分子シャペロンを用いるタンパク質コンホメーションの調節方法 |
| JP2004357586A (ja) * | 2003-06-04 | 2004-12-24 | Hiroyuki Ono | 細胞障害タンパク質ｍ毒素の発現方法 |
| JP2005503157A (ja) * | 2001-09-17 | 2005-02-03 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 組換え生産においてタンパク質の溶解性、発現率及び活性を増大させるための方法 |
| JP2006506332A (ja) * | 2002-07-15 | 2006-02-23 | バイエル・ヘルスケア・アクチェンゲゼルシャフト | インターロイキン−４およびその突然変異蛋白質の精製法 |
| JP2017532057A (ja) * | 2014-10-30 | 2017-11-02 | サノフイ | ステロイドの２１−ヒドロキシル化 |
| EP3683308A1 (en) | 2015-06-10 | 2020-07-22 | Toyama Prefectural University | Active-form mutant enzyme production method, new active-form mutant enzyme, and solubilized mutant protein production method |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5881826A (en) | 1997-02-13 | 1999-03-16 | Actisystems, Inc. | Aphron-containing well drilling and servicing fluids |
| JP2000083670A (ja) * | 1998-09-09 | 2000-03-28 | Hsp Kenkyusho:Kk | ＤｓｂＡ／ＤｓｂＢ／ＤｓｂＣ／ＤｓｂＤ発現プラスミド |
| JP4249832B2 (ja) * | 1998-12-28 | 2009-04-08 | タカラバイオ株式会社 | トリガーファクター発現プラスミド |
| US6440715B1 (en) * | 1999-03-12 | 2002-08-27 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and expression of Rhodothermus Obamensis DNA polymerase I large fragment in E. coli |
| EP1048732A1 (de) * | 1999-04-26 | 2000-11-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen |
| FI109361B (fi) | 1999-05-04 | 2002-07-15 | Korpela Timo | Mikrobinen proteiinin ilmentämisjärjestelmä |
| US6495360B1 (en) * | 1999-05-28 | 2002-12-17 | Photogen, Inc. | Method for enhanced protein stabilization and for production of cell lines useful for production of such stabilized proteins |
| US7378096B2 (en) * | 1999-09-30 | 2008-05-27 | Health Research, Inc. | Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease |
| DE10046960A1 (de) * | 2000-09-22 | 2002-04-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zur Herstellung einer aktiven, heterodimeren AMW-RT in prokaryotischen Zellen |
| US6960465B1 (en) * | 2001-06-27 | 2005-11-01 | Northwestern University | Increased cell resistance to toxic organic substances |
| AU2003201727A1 (en) * | 2002-01-07 | 2003-07-24 | European Molecular Biology Laboratory | Recombinant protein expression |
| LT5053B (lt) | 2002-12-24 | 2003-09-25 | Biotechnologijos Institutas | Šaperonai dnak, dnaj ir grpe iš meiothermus ruber, pasižymintys padidintu terminiu stabilumu ir baltymų aktyvios struktūros atstatymo (refoldavimo) in vitro sistema ir būdas |
| MX2007011801A (es) * | 2005-03-24 | 2008-02-19 | Neose Technologies Inc | Expresion de glicosiltransferasas eucarioticas activas, solubles en organismos procarioticos. |
| US20150353940A1 (en) | 2013-08-05 | 2015-12-10 | Absci, Llc | Vectors for use in an inducible coexpression system |
| CZ308223B6 (cs) * | 2016-01-28 | 2020-03-11 | Mikrobiologický Ústav Av Čr V.V.I. | Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy |
| CN108456688A (zh) * | 2017-02-21 | 2018-08-28 | 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 | 一种基于t7启动子的重组表达质粒、转化子及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4758512A (en) * | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
| JPH08140671A (ja) * | 1994-11-25 | 1996-06-04 | H S P Kenkyusho:Kk | 大腸菌変異株 |
| JP3656277B2 (ja) * | 1995-05-17 | 2005-06-08 | 味の素株式会社 | 組換えｄｎａ法によるトランスグルタミナーゼの効率的製造法 |
-
1997
- 1997-06-20 JP JP18055897A patent/JP3344618B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-06-19 CA CA002235468A patent/CA2235468C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-06-19 US US09/100,110 patent/US6159708A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-19 AT AT98111348T patent/ATE269410T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-06-19 DE DE69824487T patent/DE69824487T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-19 EP EP98111348A patent/EP0885967B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003500056A (ja) * | 1999-05-21 | 2003-01-07 | ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー | 分子シャペロンを用いるタンパク質コンホメーションの調節方法 |
| JP2001061487A (ja) * | 1999-07-29 | 2001-03-13 | F Hoffmann La Roche Ag | 分子シャペロンの共分泌による自然に折り畳まれた分泌タンパク質の製造法 |
| JP2002335959A (ja) * | 2001-04-30 | 2002-11-26 | F Hoffmann La Roche Ag | フォールディング補助タンパク質の共発現を伴うｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系でのタンパク質の発現方法 |
| JP2005503157A (ja) * | 2001-09-17 | 2005-02-03 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 組換え生産においてタンパク質の溶解性、発現率及び活性を増大させるための方法 |
| JP2006506332A (ja) * | 2002-07-15 | 2006-02-23 | バイエル・ヘルスケア・アクチェンゲゼルシャフト | インターロイキン−４およびその突然変異蛋白質の精製法 |
| JP2011088922A (ja) * | 2002-07-15 | 2011-05-06 | Bayer Schering Pharma Ag | インターロイキン−４およびその突然変異蛋白質の精製法 |
| JP2004357586A (ja) * | 2003-06-04 | 2004-12-24 | Hiroyuki Ono | 細胞障害タンパク質ｍ毒素の発現方法 |
| JP2017532057A (ja) * | 2014-10-30 | 2017-11-02 | サノフイ | ステロイドの２１−ヒドロキシル化 |
| JP2021097709A (ja) * | 2014-10-30 | 2021-07-01 | サノフイＳａｎｏｆｉ | ステロイドの２１−ヒドロキシル化 |
| EP3683308A1 (en) | 2015-06-10 | 2020-07-22 | Toyama Prefectural University | Active-form mutant enzyme production method, new active-form mutant enzyme, and solubilized mutant protein production method |
| US10730909B2 (en) | 2015-06-10 | 2020-08-04 | Toyama Prefectual University | Method of producing an active-form mutant enzyme |
| US11312747B2 (en) | 2015-06-10 | 2022-04-26 | Toyama Prefectural University | Method of producing an active-form mutant enzyme |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2235468A1 (en) | 1998-12-20 |
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