MX2007011801A

MX2007011801A - Expresion de glicosiltransferasas eucarioticas activas, solubles en organismos procarioticos.

Info

Publication number: MX2007011801A
Application number: MX2007011801A
Authority: MX
Inventors: Marc F Schwartz; Tarik Soliman
Original assignee: Neose Technologies Inc
Priority date: 2005-03-24
Filing date: 2006-03-24
Publication date: 2008-02-19
Also published as: CA2602329A1; EP1863921A2; WO2006102652A2; ATE527371T1; EP1863921A4; US8137928B2; WO2006102652A3; CA2602329C; US20100143969A1; EP1863921B1; AU2006226782B2; ES2374935T3; AU2006226782A1; KR20080021590A; JP2008533992A; US20110223646A1; US20060234345A1; JP5235657B2

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos mejorados para producir glicosiltransferasas eucarioticas activas, solubles, en un microorganismo procariotico que tiene un ambiente de oxidacion.

Description

EXPRESIÓN DE GLICOSILTRANSFERASAS EUCARIOTICAS ACTIVAS, SOLUBLES EN ORGANISMOS PROCARIÓTICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos mejorados para producir glicosiltransferasas eucarióticas activas, solubles en microorganismos procarióticos que tiene un ambiente oxidante.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se sintetizan organismos eucarióticos de estructuras oligosacáridas o glicoconjugados, tales como glicolipidos o glicoproteinas, que son comercialmente y terapéuticamente útiles. Se puede llevar a cabo la síntesis in vitro de oligosacáridos o glicoconjugados usando glicosiltransferasas eucarióticas recombinantes. El método más eficiente para producir muchas proteínas recombinantes es para expresar la proteina en bacteria. Sin embargo, en bacteria. Sin embargo, en bacteria, se expresan muchas glicosiltransferasas eucarióticas como proteínas insolubles en cuerpos de inclusión de bacteria y los rendimientos de proteina de glicosiltransferasa eucariótica a partir de los cuerpos de inclusión pueden ser muy bajos. Además, muchas glicosiltransferasas eucarióticas se expresan como proteínas glicosiladas en sus células de origen. Por lo tanto, se cree que la expresión de las proteínas en bacteria no incluirá patrones de glicosilación nativa, además disminuyendo la expectación de expresión de proteina de glicosiltransferasa eucariótica activa. Véase, por ejemplo, Bretón et al., Biochimie 83:713-718 (2001). Asi, existe una necesidad para mejorar métodos para producir glicosiltransferasas eucarióticas enzimáticamente activas en organismos procarióticos, tales como, por ejemplo, bacteria. La presente invención soluciona esta y otras necesidades.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una glicosiltransferasa eucariótica activa en un microorganismo procariótico, que tiene un ambiente oxidante, por a) expresar un ácido nucleico que codifica la glicosiltransferasa eucariótica en los microorganismos procarióticos; y después b) hacer crecer el microorganismo procariótico bajo condiciones que permite la expresión de la glicosiltransferasa eucariótica activa, soluble dentro de un compartimiento celular de microorganismo procariótico. En una modalidad, la glicosiltransferasa eucariótica es un elemento seleccionado de una N- acetilglucosaminiltransferasa I eucariótica (GnT o GNT) , una N-acetilgalactosaminiltransferasa eucariótica (GalNAcT) , una galactosiltransferasa eucariótica (GalT) , y una sialiltransferasa eucariótica. Ejemplos de cada una de estas clases de enzimas, incluyen, por ejemplo, para unas proteínas N-acetilglucosaminiltransferasas eucarióticas GnTl, BGnT-1, GnT-II, GnT-III, GnT-IV (por ejemplo, GnT-IV y GnT-IVb) , GnT-V, GnT-VI, GnT-IVH, MGNT1 y OGT; para unas proteínas N-acetilgalactosaminiltransferasas eucarióticas GalNAc-T2, GalNAc-Tl y GalNAc-T3; para una galactosiltransferasa eucariótica (GalT) una ß-1,4-galactosiltransferasa eucariótica (GalTl) o una galactosiltransferasa de Core I eucariótica (Core 1 GalTl) ; para una sialiltransferasa eucariótica, una a (2 , 3) sialiltransferasa eucariótica (ST3Gal3), una N-acetilgalactosaminida a-2 , 6-sialiltransferasa I eucariótica (STßGalNAcTl) , o una gal ßl,3GalNAc a2 , 3-sialiltransferasa eucariótica (ST3GalI) . Algunos ejemplos preferidos de glicosiltransferasas eucarióticas para uso en la invención, incluye una N-acetilglucosaminiltransferasa I eucariótica (GnTl o GNTI), una N-acetilgalactosaminiltransferasa eucariótica (GalNAcT) , por ejemplo, una GalNAcTl, GalNAcT2 o GalNAcT3, una ß-1, -galactosiltransferasa eucariótica (GalTl), una a-2, 3-sialiltransferasa eucariótica (ST3Gal3), una a-N-acetilgalactosaminida a-2, 6-sialiltransferasa I eucariótica (ST6GalNAc-l) , una gal ßl,3GalNAc a2,3-sialiltransferasa eucariótica (ST3Gal-l), y una galactosiltransferasa de Core 1 eucariótica (Core-1-GalT-1) • En una primera modalidad, el microorganismo procariótico es una E . coli o una Pseudomonas bacterium que tienen un ambiente oxidante. Por ejemplo, la E . coli puede ser manipulada por ácidos nucleicos endógenos o genó icos inactivas, por ejemplo, un gen txrB y un gen gor . Se pueden usar otras cepas de E . coli incluyendo, por ejemplo, una cepa mutante trxB gor supp o una cepa mutante supp trxB gshA, ambas se describen en la Patente Estadounidense No. 6,872,563, la cual se incorpora en este documento por referencia para todo los propósitos. En una modalidad adicional, el microorganismo procariótico, por ejemplo, células de E . col i o células de Pseudomonas se hacen crecer a una temperatura entre 12-30°C mientras la glicosiltransferasa eucariótica es expresada. El microorganismo procariótico también puede expresar proteínas adicionales para mejorar la solubilidad de las glicosiltransferasas eucarióticas, por ejemplo, una isomerasa de disulfuro de proteina heteróloga (PDI) o una proteina chaperona heteróloga, o tanto PDI heterólogas como una proteina chaperona heteróloga. En otra modalidad, el método además comprende la etapa de aislar la glicosiltransferasa eucariótica. En modalidades adicionales, la glicosiltransferasa eucariótica comprende una etiqueta de purificación, por ejemplo, un dominio de proteina enlazante maltosa o un dominio de proteina enlazante de almidón. En modalidades adicionales, la glicosiltransferasa eucariótica soluble se produce en una escala comercial. La escala comercial incluye preparaciones de una cantidad suficiente de enzima para producir un producto glicosilado en una escala comercial (microgramo, miligramo o gramo) . En otro aspecto, la presente invención proporciona una glicosiltransferasa eucariótica activa, soluble producida en un microorganismo procariótico que tiene un ambiente oxidante. En una modalidad preferida, la glicosiltransferasa eucariótica activa, soluble es intracelularmente expresada en el microorganismo procariótico. En una modalidad adicional, la glicosiltransferasa eucariótica activa, soluble es no glicosilada y tiene un diferente o mínimo; patrón de glicosilación, cuando se compara a la misma glicosiltransferasa eucariótica expresada en una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de mamífero, una célula de levadura, o una célula de origen (es decir, una célula humana para una glicosiltransferasa humana) . Se prefiere que la glicosiltransferasa eucariótica no glicosilada, diferentemente o mínimamente glicosilada tiene actividad enzimática. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método in vi tro para producir un oligosacárido, poniendo en contacto un sustrato aceptor con un sustrato donador y la glicosiltransferasa eucariótica, soluble del párrafo precedente, bajo condiciones que permiten la producción del oligosacárido. En algunas modalidades, el sustrato aceptor está unido a, por ejemplo, un glicolipido, una glicoproteina, un glicopéptido, una proteina, o un péptido. En una modalidad, la glicoproteina, glicopéptido, proteina o péptido es una proteina terapéutica. Proteínas terapéuticas incluyen, por ejemplo, las proteínas listadas en la Tabla 2. En otra modalidad, el oligosacárido se produce en una escala comercial.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1, demuestra análisis SDS-PAGE de la expresión y purificación parcial de ST3Gal-l de porcino truncada etiquetada con MBP soluble. La MBP-ST3Gal-l es expresada en cepas JM109 (lineas 2-5) y cepas mutante trxB gor supp (lineas 6-9) . Las lineas 2-3 y 6-7 se sometieron a Usado clarificado antes y después de la incubaron con resina amilosa, respectivamente. Las lineas 4-5 y 8-9 son eluciones en serie de la resina amilosa que contiene MBP- ST3Gal-l parcialmente purificada. La primera linea son marcadores de peso molecular. La figura 2a demuestra análisis SDS-PAGE de la expresión y purificación parcial de GalNAc-T2 humana truncada etiquetada con MBP soluble a partir de lisados mutantes trxB gor supp (lineas 2-4) . Las lineas 2-3 se sometieron a usado clarificado antes y después de la incubación con resina de amilosa, respectivamente. La linea 4 es la elución de la resina de amilosa, que contiene MBP-GalNAc-T2 parcialmente purificada. La primera linea son marcadores de peso molecular. La figura 2b demuestra análisis SDS-PAGE de la expresión y solubilidad de GalNAc-T2 humana amino- y carboxil-truncada, expresada en E . coli mutante trxB gor supp. Las células Usadas se separaron por centrifugación en fracciones insolubles (linea 2) y solubles (linea 3) y se resolvieron por SDS-PAGE. La primera linea son marcadores de peso molecular. La figura 3 demuestra análisis SDS-PAGE de la expresión y purificación parcial de Core-1-Gal-Tl de Drosophila truncada, etiquetada con MBP soluble. La MBP- Core-1-Gal-Tl se expresa y purifica de células JM109 (lineas 2-3) y mutantes trxB gor supp (lineas 4-5) . La linea 1 contiene marcadores de peso molecular. Las lineas 2 y 4 se someten a Usado clarificado, y se muestran eluciones de resina amilosa parcialmente purificada en lineas 3 y 5. La figura 4 demuestra análisis SDS-PAGE de la expresión y purificación parcial de ST6GalNAc-l humana truncada, etiquetada con MBP soluble a partir de células mutantes trxB gor supp. La linea 1 contiene marcadores de peso molecular. Las lineas 2 y 3 se someten a lisado clarificado antes y después de la incubación con resina amilosa, respectivamente. La linea 4 contiene MBP-ST6GalNAc-l parcialmente purificada, eluida de la resina de amilosa. La figura 5 proporciona la actividad expresada, proporcionada de experimentos de producción a escala elevada para MBP-GalNAc-T2, MBP-Core-1-Gal-Tl y MBP-ST3Gal-1. Se sembraron recipientes de diez litros de fermentación con células mutantes trxB gor supp que expresan en constructo indicado, inducidas por 48 horas. Se monitoreo la actividad de glicosiltransferasa (U/litro de medio) de alícuotas tomadas en los tiempos de post-inducción indicados . La figura 6 demuestra la glicosilación de interferon-alfa-2b usando glicosiltransferasa eucariótica producida en E. coli mutante trxB gor supp. Se analizaron los productos de reacción por espectrometría de masa MALDI TOF. La figura 6A muestra interferon-alfa-2B no modificada. La figura 6B muestra el resultado de incubación con MBP- GalNAc-T2 y UDP-GalNAc. La figura 6C muestra el resultado de incubación con MBP-GalNAc-T2, MBP-Core-1-Gal-Tl, UDP-GalNAc y UDP-Gal . Se observó la masa esperada debido a la adición de GalNAc (esperada +203.2, observada +209.1) o GalNAc-Gal (esperada +365.6, observada +365.3) para interferon-alfa-2b. La figura 7 demuestra análisis SDS-PAGE de una reacción glicolPEGilación usando glicosiltransferasa eucariótica producida en E . col i mutante trxB gor supp. La interferon-alfa-2b (linea 2) es primero incubada con MBP-GalNAc-T2 purificada, MBP-Core-1-Gal-Tl, UDP-GalNAc y UDP-Gal por seis horas a 32°C (linea 3) . Después se agregaron MBP-ST3Gal-l purificada y CMP-SA-40kDa-PEG (linea 4, punto de tiempo cero horas) y se incubaron durante la noche a 32°C para permitir la reacción glicolPEGilación, para proseguir (linea 5) . Los marcadores de peso molecular están en la primera linea. La figura 8 proporciona análisis SDS-PAGE de la solubilidad y purificación parcial de GnTl humana truncada etiquetada con MBP (lineas 2-4, 8-10) y MBP-GnTl C121S (lineas 5-7, 11-13) expresadas en cepas JM109 (lineas 2-7) y E . coli mutante trxB gor supp (lineas 8-13) . Las células de los cultivos inducidos se sometieron a lisado, y el material insoluble se separó por centrifugación (lineas 2, 5, 8, 11) . Los sobrenadantes (lineas 3, 6, 9, 12) se incubaron con resina de amilosa. Las proteínas de fusión MBP parcialmente purificadas después se eluyeron a partir de la resina (lineas 4, 7, 10, 13). La primera linea son marcadores de peso molecular. La figura 9 proporciona análisis SDS-PAGE de la solubilidad y purificación parcial de GalTl de bovino truncada, etiquetada por MBP (lineas 2-4, 8-10) y MBP-GalTl C342T (lineas 5-7, 11-13) expresadas en cepas JM109 (lineas 2-7) y E . col i mutante trxB gor supp (lineas 8-13). Los cultivos inducidos se sometieron a usado y el material insoluble se separó por centrifugación (lineas 2, 5, 8, 11). Los sobrenadantes (lineas 3, 6, 9, 12) se incubaron con resina de amilosa. Las proteínas de fusión MBP parcialmente purificadas después se eluyeron a partir de la resina (lineas 4, 7, 10, 13) . La primera linea son marcadores de peso molecular. La figura 10 proporciona análisis SDS-PAGE de la expresión soluble y purificación parcial de ST3Gal3 de rata truncada, etiquetada por MBP (lineas 2-4) y ST3Gal3 etiquetada con MBP-SBD (lineas 5-7) expresadas en una cepa de E. col i mutante trxB gor supp. Las lineas 2-3 y 5-6 se sometieron a usado clarificado antes y después de la incubación con resina de amilosa, respectivamente. Las lineas 4 y 7 son las eluciones de la resina de amilosa, que contienen proteínas de fusión ST3Gal3 parcialmente purificada. La primera linea son marcadores de peso molecular .

DEFINICIONES Las proteínas de glicosiltransferasa recombinante producida por los métodos de la invención, son útiles para transferir un sacárido de un sustrato donador a un sustrato aceptor. La adición generalmente toma lugar en el extremo re reductor de un oligosacárido o porción carbohidrato en una biomolécula. Las biomoléculas como se definen en este documento incluyen, pero no se limitan a, moléculas biológicamente significantes tales como carbohidratos, proteínas (por ejemplo, glicoproteinas) y lipidos (por ejemplo, glicolipidos, fosfolipidos, esfingolipidos y gangliósidos) . Se usan las siguientes abreviaturas en este documento: Ara = arabinosilo; Fru = fructosilo; Fue = fucosilo; Gal = galactosilo; GalNAc = N-acetilgalactosilamino; Glc = glucosilo; GlcNAc = N-acetilglucosilamino; Man = manosilo; y NeuAc = sialil (N-acetilneuraminilo) FT o FucT = fusociltransferasa* ST = sialiltransferasa* GalT = galactosiltransferasa* Se usan números Arábigos o Romanos intercambiablemente en este documento, de conformidad con el convenio que asigna nombres usado en la técnica para indicar la identidad de una glicosiltransferasa especifica (por ejemplo, FTVII y FT7 referida como la misma fucosiltransferasa) . Los oligosacáridos se consideran tener un extremo reductor y un extremo no reductor, si o no el sacárido en el extremo reductor es en hecho una azúcar reductora. De acuerdo con la nomenclatura aceptada, se describen en este documento oligosacáridos con el extremo no reductor en la izquierda y el extremo reductor en la derecha. El término "ácido siálico" se refiere a cualquier elemento de una familia de azúcares carboxiladas de nueve carbonos. El elemento más común de la familia de ácido siálico es ácido N-acetil-neuraminico (ácido 2-ceto-5-acetamido-3, 5-didesoxi-D-glicero-D-galactonomulopiranos-l-onico (a menudo abreviado como NeudAc, NeuAc o NANA) . Un segundo elemento de la familia es ácido N-glicosil-neuraminico (Neu5Gc o NeuGc) , en el cual el grupo N-acetilo de NeuAC es hidrolizado. Un tercer elemento de la familia de ácido siálico es ácido 2-ceto-3-desoxi-nonulosonico (KDN) (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)). También incluidos son ácidos siálicos 9 sustituidos como un 9-O-acil C?-C6-Neu5Ac como 9-0-lactil-Neu5Ac o 9-O-acetil-Neu5Ac, 9-desoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-desoxi-Neu5Ac . Para revisión de la familia de ácido siálico, véase, por ejemplo, Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)). Se describe la síntesis y uso de los compuestos de ácido siálico en un procedimiento de sialilación en la solicitud internacional WO 92/16640, publicada el 1 de Octubre de 1992. Un "sustrato aceptor" para una glicosiltransferasa es una porción de oligosacárido que puede actuar como un aceptor para una glicosiltransferasa particular. Cuando el sustrato aceptor está en contacto con la glicosiltransferasa correspondiente y el sustrato donaros de azúcar, y otros componentes de mezcla de reacción necesarios, y la mezcla de reacción se incuba por un periodo de tiempo suficiente, la glicosiltransferasa transfiere residuos de azúcar del sustrato donador de azúcar al sustrato aceptor. El sustrato aceptor a menudo variará de tipos diferentes de una glicosiltransferasa particular. Por ejemplo, el sustrato aceptor para una galactosido 2-L-fucosiltransferasa de mamífero (al,2-fucosiltransferasa) incluirá un Galßl, -GlcNAc-R a un término no reductor de un oligosacárido; esta fucosiltransferasa une un residuo de fucosa a la Gal, vía un enlace al,2. Los Galßl, 4-GlcNAc-R y Galßl, 3-GlcNAc-R terminales y análogos de los mismos sialilados son sustratos aceptores para al,3 y al, 4-fucosiltransferasas, respectivamente. Estas enzimas, sin embargo, unen el residuo de fucosa al residuo GlcNAc del sustrato aceptor. Por lo tanto, el término "sustrato aceptor" se toma en contexto con la glicosiltransferasa particular de interés para una aplicación particular. Se describen en este documento, sustratos aceptores para glicosiltransferasa adicionales. Sustratos aceptores también incluyen, por ejemplo, glicolipidos, péptidos, proteínas, glicopéptidos, glicoproteínas y proteínas terapéuticas. Un "sustrato donador" para glicosiltransferasa es un azúcar de nucleótido activado. Tales azúcares activados generalmente consisten de uridina, guanosina y monofosfato de citidina derivados de los azúcares (UMP, GMP y CMP, respectivamente) o derivados de difosfato de los azúcares (UDP, GDP y CDP, respectivamente) en los cuales el monofosfato o difosfato de nucleósido sirve como un grupo saliente. Por ejemplo, un sustrato donador para fucosiltransferasa es GDP-fucosa. Sustratos donadores para sialiltransferasa, por ejemplo, son nucleótidos de azúcar activada, que comprenden el ácido siálico deseado. Por ejemplo, en el caso de NeuAc, el azúcar activado es CMP-NeuAc. Otros sustratos donadores incluyen, por ejemplo, GDP mañosa, UDP galactosa, UDP-N-acetilgalactosamina, CMP-NeuAc-PEG (también referido como CMP-ácido siálico-PEG) , UDP-N-acetilglucosamina, UDP-glucosa, UDP-ácido glucoriónico y UDP-xilosa. Azúcares incluyen, por ejemplo, NeuAc, mañosa, galactosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, glucosa, ácido glucorionico y xilosa. Sistemas bacteriano, de planta y fúngico pueden algunas veces usar otros azúcares de nucleótido activados. Un "método para reformar una proteína, un péptido, una glicoproteína o un glicopéptido" como se usa en este documento, se refiere a la adición de un residuo de azúcar a una proteína, un péptido, una glicoproteína o un glicopéptido, usando una glicosiltransferasa. En una modalidad preferida, el residuo de azúcar está unido de forma covalente a una molécula PEG. Una "glicosiltransferasa eucariótica" como se usa en este documento, se refiere a una enzima que se deriva de un organismo eucariótico y que cataliza la transferencia de un residuo de azúcar a partir de un sustrato donador, es decir, de un azúcar de nucleótido activado, a un sustrato aceptor, por ejemplo, un oligosacárido, un glicolípido, un péptido, una proteína, un glicopéptido, o una glicoproteina. En modalidades preferidas, una glicosiltransferasa eucariótica transfiere un azúcar a partir de un sustrato donador, es decir, un azúcar de nucleótido, a un péptido, una proteina, un glicopéptido, o una glicoproteína. En otra modalidad preferida, una glicosiltransferasa eucariótica es una glicosiltransferasa de transmembrana tipo II. Las glicosiltransferasas de transmembrana tipo II no modificadas, típicamente incluyen un dominio citoplásmico amino terminal, un dominio de transmembrana o anclaje de señal, una región troncal y un dominio catalítico. Véase por ejemplo, Paulson y Colley, J. Biol. Chem. 264:17615-17618 (1989). Una glicosiltransferasa eucariótica puede ser derivada de un organismo eucariótico, por ejemplo, un organismo eucariótico unicelular o multicelular, una planta, un animal invertebrado, tal como Drosophila o C. elegans, un animal vertebrado, un anfibio o reptil, un mamífero, un roedor, un primate, un humano, un conejo, una rata, un ratón, una vaca o un cerdo y sucesivamente. Ejemplos de glicosiltransferasas eucarióticas siguen y también se encuentran en el listado de secuencia adjunto. Una "sialiltransferasa eucariótica" como se usa en este documento, se refiere a una sialiltransferasa derivada de un organismo eucariótico. La enzima cataliza la transferencia de una porción de ácido siálico de un donador de CMP-ácido siálico a una molécula aceptora. Las sialiltransferasas eucarióticas pueden también ser reconocidas por la presencia de motivos estructurales conservadas, por ejemplo, un motivo L de sialilo y un motivo S de sialilo como se describe en Tsuji, J. Biochem. 120:1-3 (1996), el cual se incorpora en este documento por referencia para todos los propósitos. Motivos de sialiltransferasa adicional, por ejemplo, se describen el motivo muy pequeño (VS) y motivo III en Pantel y Balaji, Glycobiology, 16:108-116 (2006), publicado el 5 de Octubre de 2005, el cual se incorpora en este documento por referencia para todos los propósitos. Las sialiltransferasa eucarióticas incluyen enzimas que forman una variedad de enlaces, que incluyen a2 ? 3,a2 -» 6,a2 ? 8. Las sialiltransferasas eucarióticas transfieren la porción de ácido siálico para azúcares aceptoras diferentes en una molécula aceptora, por ejemplo, galactosa, GalNAc y otra molécula de ácido siálico. Las sialiltransferasas eucarióticas que catalizan la reacción especifica, es decir, que son elementos de las familias ST3Gal, ST6Gal, STdGalNAc o ST8Sia pueden ser identificadas por la presencia de residuos de aminoácidos conservados dentro de aquellas familias. Tales residuos de aminoácido conservados en base a la familia se describen en Patel y Balaji, Glycobiology, 16:108-116 (2006), publicada en 5 de octubre de 2005, la cual se incorpora en este documento por referencia para todos los propósitos. Ejemplos de sialiltransferasas eucarióticas siguen y también se encuentran en el listado de secuencia adjunto. Una "a (2, 3) sialiltransferasa (ST3Gal3) eucariótica" como se usa en este documento, se refiere a una a (2, 3) sialiltransferasa aislada de un organismo eucariótico. Esta enzima cataliza la transferencia de ácido siálico al Gal de un glicósido Galßl, 3GlcNAc, Galßl, 3GalNAc o Galßl, 4GlcNAc (véase por ejemplo, Wen et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:21011; Van den Eijnden et al. (1991) J. Biol. Chem. 256:3159) . El ácido siálico está enlazado a una Gal con la formación de un a-enlace entre los dos sacáridos . La adhesión (enlazados) entre los sacáridos está entre la posición 2 de NeuAc y la posición 3 de Gal. Como otras glicosiltransferasas eucarióticas, las enzimas ST3Gal3 tienen un dominio de transmembrana, una región troncal y un dominio catalítico. Esta enzima particular puede ser aislada de hígado de rata (Weinstein et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:13845); el ADNc humano (Sasaki et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:22782-22787; Kitagawa & Paulson (1994) J. Biol. Chem. 269:1394-1401) y genómico (Kitagawa et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:931-938) se conocen secuencias de ADN, que facilitan la producción de esta enzima por expresión recombinante. La ST3Gal3 de rata ha sido clonada y se conoce la secuencia. Véase por ejemplo, Wen et al., J. Biol. Chem. 267:21011-21019 (1992) y número de acceso M97754, cada uno de los cuales se incorpora en este documento por referencia. Se describen proteínas ST3Gal3 ejemplares en, por ejemplo SEC ID Nos: 22-32. Una "a-N-acetilgalactosaminida a-2, 6-sialiltransferasa I ecuariótica (STdGalNAcTl o ST6GalNAc-l) como se usa en este documento, se refiere a una a (2, 6) sialiltransferasa aislada de un organismo eucariótica. La enzima cataliza la transferencia de ácido siálico de un donador de CMP-ácido siálico a una molécula aceptora. La transferencia es un enlace a2,6 para N-acetilgalactosamina-O-Thr/Ser . Enlaza otras glicosiltransferasa eucarióticas, enzimas ST6GalNAcTl tienen un dominio de transmembrana, una región troncal y un dominio catalítico. Se han aislado y caracterizado un número de enzimas ST6GalNAcTl, por ejemplo, la secuencia de longitud completa, Kurosawa et al., J. Biochem. 127:845-854 (2000) y número de acceso JC7248, cada uno de los cuales se incorpora en este documento por referencia. Se describen proteínas ST6GalNAc-l ejemplares en, por ejemplo, SEC ID Nos. 62-77. Una "Galßl, 3GalNAc a2 , 3-sialiltransferasa eucariótica (ST3GalI o ST3Gal-l)" como se usa en este documento, se refiere a una Galßl, 3GalNAc a2,3-sialiltransferasa aislada de un organismo eucarótico. La enzima cataliza la transferencia de ácido siálico de un donador de CMP-ácido siálico a una molécula aceptora. La transferencia es un enlace a2,3 a N-acetilgalactosamina-O-Thr/Ser. Enlaza otras glicosiltransferasas eucarióticas, enzimas ST3GalI tienen un dominio de transmembrana, una región troncal y un dominio catalítico. Se han aislado y caracterizado un número de enzimas ST3GalI, por ejemplo, la secuencia de porcino de longitud completa, Gillespie et al., J. Biol. Chem. 267:21004-21010 (1992) y número de acceso A45073, cada uno de los cuales se incorpora en este documento por referencia. Se describen proteínas ST3Gal-l ejemplares en, por ejemplo, SEC ID Nos:53-61. Otras sialiltransferasas que se pueden usar en la presente invención, incluyen, por ejemplo, "proteínas beta galactosido alfa 2, 6-sialiltransferasa eucarióticas (STdGal I). Se describen proteínas ST6Gal 1 ejemplares en, por ejemplo, SEC ID Nos: 78-82. Proteínas sialiltransferasa eucarióticas usadas en la invención, también incluyen proteínas alfa 2,8 sialiltransferasa, por ejemplo, ST8Sia I, ST8Sia II, ST8Sia III y ST8Sia IV. Ejemplos de estas proteínas sialiltransferasa se encuentran, por ejemplo, en SEC ID Nos: 83-97. Una "N-acetilglucosaminiltransferasa eucariótica" como se usa en este documento, se refiere a un derivado N-acetilglucosaminiltransferasa de un organismo eucariótico. La enzima cataliza la transferencia de N-acetilglucosamina (GlcNAc) de un donador UDP-GlcNAc para una molécula aceptora. Enlaza otras glicosiltransferasas eucarióticas, N-acetilglucosaminiltransferasa tiene un dominio de transmembrana, una región troncal y un dominio catalítico. Ejemplos de N-acetilglucosaminiltransferasas eucarióticas siguen y también se encuentran en el listado se secuencia adjunto. Una "ß-1, 2-N-acetilglucosaminiltransferasa I eucariótica (GnTI o GNTI)" como se usa en este documento, se refiere a una ß-1, 2-N-acetilglucosaminiltransferasa I derivada de un organismo eucariótico. Enlaza otras glicosiltransferasas eucarióticas, GnTI tiene un dominio de transmembrana, una región troncal y un dominio catalítico. Proteínas GnTi eucarióticas incluyen, por ejemplo, de humano, número de acceso NP_002397; de hámster Chino, número de acceso AAK61868; de conejo, número de acceso AAA31493; de rata, número de acceso NP_110488; de hámster dorado, número de acceso AAD04130; de ratón, número de acceso P27808; de pez cebra, número de acceso AAH58297; Xenopus, número de acceso CAC51119; Drosophila , número de acceso NP_525117; Anopheles, número de acceso XP_315359; C. elegans, número de acceso NP_497719; Physcomi trella pa tens, número de acceso CAD22107; Solanum tuberosum, número de acceso CAC80697; Nicotiana tabacum, número de acceso CAC80702; Oryza sa tiva, número de acceso CAD30022; Nicotiana ben thamiana , número de acceso CAC82507; y Arabidopsis thal íana , número de acceso NP_195537, cada una de las cuales se incorpora en este documento por referencia. Se describen proteína GnTl ejemplares en, por ejemplo, SEC ID Nos: 1-11. Otras proteínas N-acetilglucosaminiltransferasa eucarióticas que se pueden usar en la presente invención incluyen, por ejemplo, BGnT-1, GnT-II, GnT-III, GnT-IV (por ejemplo, GnT-IVa y GnT-IVb) , GnT-V, GnT-VI y GnTIVH, las cuales son ejemplificadas en SEC ID Nos: 140-160. Otras proteínas N-acetilglucosaminiltransferasas eucarióticas se pueden producir, usando los métodos de la presente invención e incluye, por ejemplo, proteína Maniac Fringe, MGNTl y proteínas OGT, ejemplificadas en por ejemplo, SEC ID NOs: 171-175. Una N-acetilgalactosaminiltransferasa eucariótica (GalNAcT)" como se usa en este documento, se refiere a una N-acetilgalactosaminiltransferasa aislada de un organismo eucariótico. La enzima cataliza la transferencia de N-acetilgalactosamina (GalNAc) de un donador UDP-GalNAc para 2 una molécula aceptora. Enlaza otras glicosiltransferasa eucarióticas, las enzimas GalNAcT tienen un dominio de transmembrana, una región troncal y un dominio catalítico. Se han aislado y caracterizado un número de GalNAcT, por ejemplo, GalNAcTl, número de acceso X85018; GalNAcT2, número de acceso X85019 (ambas descritas en White et al., Biol. Chem. 270:24156-24165 (1995); y GalNAcT3, número de acceso X92689 (descrito en Bennett et al., J. Biol. Chem. 271:17006-17012 (1996), cada uno de los cuales se incorpora en este documento por referencia) . Ejemplos de N-acetilgalactosaminiltransferasas eucarióticas siguen y también se encuentran en las Figuras 12-36 y en el listado se secuencia adjunto. Se describen proteínas GalNAc-T2, GalNAc-Tl y GalNAc-T3 ejemplares, se describen en, por ejemplo, SEC ID NOs: 33-40 y 192-197, 126-132 y 189-191 y 133-135, respectivamente. Una "galactosiltransferasa eucariótica" como se usa en este documento, se refiere a un derivado de galactosiltransferasa derivada de un organismo eucariótico. La enzima cataliza la transferencia de galactosa de un donador UDP-Gal a una molécula aceptora. Enlaza otras glicosiltransferasas eucarióticas, galactosiltransferasas tienen un dominio de transmembrana, una región troncal y un dominio catalítico. Ejemplos de galactosiltransferasas eucarióticas siguen y también se encuentran en el listado se secuencia adjunto. Una "ß-1, 4-galactosiltransferasa eucarótica (GalTl)" como se usa en este documento, se refiere a una ß-1, 4-galactosiltransferasa derivada de un organismo eucariótico. La enzima cataliza la transferencia de galactosa de un donador UDP-Gal a una molécula aceptora. Enlaza otras glicosiltransferasas eucarióticas, las enzimas Galtl tienen un dominio de transmembrana, una región troncal y un dominio catalítico. Se han aislado y caracterizado un número de enzimas GalTl, por ejemplo, la secuencia e bovino de longitud completa, D'Agostaro et al., Eur. J. Biochem. 183:211-217 (1989) y número de acceso CAA32695, cada uno de los cuales se incorpora en este documento por referencia. Se describen proteínas GalTl ejemplares en, por ejemplo SEC ID NOs: 12-21. Otras galactosiltransferasas que se pueden usar en la presente invención incluyen, por ejemplo SEC ID NOs: 136-139. Una "galactosiltransferasa core I eucariótica (Core 1 GalTl o Core-1-Gal-Tl) " como se usa en este documento, se refiere a una proteina con actividad Core 1 ßl, 3-galactosiltransferasa . Enlaza otras glicosiltransferasas eucarióticas, las enzimas Core 1 GalTl tienen un dominio de transmembrana, una región troncal y un dominio catalítico. Se han aislado y caracterizado un número de enzimas Core 1 GalTl, por ejemplo las secuencias de Drosophila y humana. La proteina humana se caracteriza en Ju et al., J. Biol. Chem. 277 (1), 178-186 (2002), el cual se incorpora en este documento por referencia para todos los propósitos. Se describen proteínas Core 1 GalTl ejemplares en, por ejemplo, SEC ID NOs: 41-52 y 198-199. Una fusociltransferasa eucariótica" como se usa en este documento, se refiere a un derivado de fucosiltransferasa de un organismo eucariótico. La enzima cataliza la transferencia de fucosa de un donador UDP-fucosa a una molécula aceptora. Enlaza otras glicosiltransferasas eucarióticas, las fucosiltransferasas tienen un dominio de transmembrana, una región troncal y un dominio catalítico. Ejemplos de galactosiltransferasas eucarióticas siguen y también se encuentran en el listado de secuencia adjunto. Se describen proteínas fucosiltransferasa eucarióticas ejemplares que se han usado en la presente invención en, por ejemplo, SEC ID NOs: 98-125. También incluidas en los métodos de la invención, son proteínas péptido-O-fucosiltransferasa en, por ejemplo, SEC ID NOs: 167-170. Otras proteínas de glicosiltransferasas eucarióticas que se pueden usar en la presente invención incluyen, por ejemplo, proteínas doliquil-fosfato manosiltransferasa polipéptido 1 o Dmpl, ejemplificada en SEC ID NO: 162; alfa-1, 6-manosiltransferasa, alfa-1,3- manosiltransferasa y beta-1, -manosiltransferasa, ejemplificadas en SEC ID NOs: 163-166. Una "proteína terapéutica" como se usa en este documento, se refiere a una proteína, péptido, glicoproteína o glicopéptido que se administra a un sujeto para tratar una enfermedad o disfunción o para mejorar la salud del sujeto. En una modalidad preferida, el sujeto es humano. En una modalidad preferida adicional, la proteína terapéutica es una proteína humana. En una modalidad adicional, la proteina terapéutica es glicosilada o de otra forma modificada por una o más glicosiltransferasas producidas en un microorganismo que tiene un ambiente intracelular oxidante. Un "residuo de cisteína deteriorado" como se usa en este documento, se refiere a un residuo de cisteína, el cual en una proteina correctamente plegada (es decir, una proteína con actividad biológica) , no forma un enlace disulfuro con otro residuo de cisteína. Un "acoplamiento redox" se refiere a mezclas para reducir y oxidar reactivos tiol e incluyen glutationa reducida u oxidada (GSH/GSSG) , cisteína/cisteína, cisteamina/cisteamina, DTT/GSSG y DTE/GSSG. (Véase, por ejemplo, Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)). El término "oxidante" o "agente de oxidación" se refiere a un compuesto, el cual oxida moléculas en su ambiente, es decir, las cuales cambian las moléculas en su ambiente para llegar más oxidadas y más de oxidación. Un oxidante actúa aceptando electrones, con ello se hace reducir después de tener un sustrato oxidado. Así, un oxidante es un agente, el cual acepta electrones. El término "condición de oxidación" o "ambiente de oxidación" se refiere a una condición o un ambiente, en el cual un sustrato es más probablemente llegar a ser oxidado que reducido. Por ejemplo, el periplasmo de una célula E . coli de tipo nativo, constituye un ambiente de oxidación, mientras que el citoplasma de una célula E. col i de tipo nativo es un ambiente de reducción. Una enzima en un "estado oxidado", se refiere a una enzima que tiene pocos electrones que reducen su forma. El término "reductor" o "agente de reducción", se refiere a un compuesto el cual reduce moléculas en su ambiente, es decir, el cual cambia moléculas en su ambiente para llega a ser más reducidas y más de reducción. Un agente de reducción, actúa donando electrones, con ello llega s ser más oxidada después que tiene un sustrato reducido. Así, un agente de reducción es un agente el cual denota electrones. Ejemplos de agentes de reducción incluyen (DTT), mercaptoetanol, cisteína, tioglicolato, cisteamina, glutationa y borohidruro de sodio. El término "reductasa" se refiere a una reductasa de tioredoxina, glutaniona o reductasa glutationa (también referida como "oxidoreductasa") o cualquier otra enzima que puede reducir elementos de los sistemas tioredoxina o glutaredoxina . El término "trayectorias de reductasa" se refiere a los sistemas en células, las cuales mantienen el ambiente en condiciones de reducción, e incluye el sistema glutaredoxina y el sistema tioredoxina. El término "condiciones de reducción" o "ambiente de reducción", se refiere a una condición o un ambiente en el cual un sustrato es más probablemente llegar a ser reducido que oxidado. Por ejemplo, citoplasma de una célula eucariótica constituye un ambiente de reducción. "Formación de enlace de disulfuro" u "oxidación de enlace de disulfuro", usando intercambiablemente en este documento, se refiere a los procesos que forman un enlace covalente entre dos cisteínas presentes en uno o dos polipéptidos. La oxidación de enlaces de disulfuro es medida por intercambio tiol-disulfuro entre las cisteínas del sitio activo de enzimas y cisteínas en la proteína objetivo. La formación de enlace de disulfuro es catalizada por enzimas, las cuales se refieren como catalizadores de formación de enlace de disulfuro. Una enzima en un "estado reducido", tiene más electrones que su forma oxidada.

"Reducción de enlace de disulfuro" se refiere al proceso de desdoblamiento de un enlace de disulfuro, con ello resultando en dos grupos tioles. La reducción de enlaces de disulfuro es mediada por intercambio tiol-disulfuro entre las cisteinas del sitio activo de enzimas y cisteínas en la proteína objetivo. El término "isomerización de enlace de disulfuro" se refiere a un intercambio de enlaces de disulfuro entre cisteinas diferentes, es decir, intercambio de enlaces de disulfuro. La isomerización de enlaces de disulfuro es mediada por intercambio de tiol-disulfuro, entre las cisteínas de sitio activo de enzimas y cisteínas en la proteina objetivo y catalizada por isomerasas. En E. coli , la isomerización es catalizada por DsbC o DsbG un disulfuro periplásmico enlazado a oxidoreductasa. Un "catalizador de formación de enlace de disulfuro" es un agente, el cual estimula la formación de enlace de disulfuro. Tal agente debe estar en estado oxidado para ser activo. Un "catalizador de isomerización de enlace de disulfuro", también se refiere a como una "isomerasa de enlace de disulfuro" es un agente, el cual estimula la isomerización de enlace de disulfuro. Tal agente debe estar en una forma reducida para ser activo. El término "estar en contacto" se usa en este documento intercambiablemente con los siguiente: combinado con, se agrega a, mezclado con, pasa sobre, incubado con, fluido sobre, etc. "Proteínas chaperonas" son proteínas que se conoce por promover apropiadamente el plegado de proteínas nuevamente sintetizadas. Las proteínas chaperonas incluyen, por ejemplo, factor activador; elementos de la familia chaperona HSp70, por ejemplo, DnaK; elementos de la familia chaperona HsplOO, por ejemplo, ClpB y elementos de la familia chaperona Hsp60, por ejemplo, GroEL. Véase, por ejemplo, Sorensen y Mortensen, BiolMed Central, www.microbialcellfactories . com/content/4/1/1. Las chaperonas también se conocen por permitir el pliegue de proteínas a 4°C, por ejemplo, Cpn60 y Cnp 10 de Oleispira an tartica RB8T. Véase por ejemplo, Id, y Ferrer et al., Nat. Biotechnol. 21:1266-1267 (2003). "Proteína de isomerasas de disulfuro" o "proteína PDI" puede hacer o intercambiar enlaces de disulfuro. Se describen proteínas PDI, por ejemplo, en Gerogiou et al. Patente Estadounidense No. 6,027,888, la cual se incorpora en este documento por referencia para todos los propósitos. Las proteínas PDI se derivan de organismos eucarióticos y procarióticos. Las proteínas PDI eucarióticas incluyen aquellas de la isomerasa de disulfuro de proteína IPR005792 de la familia Interpro. Proteínas PDI eucarióticas ejemplares incluyen proteínas PDI de, por ejemplo, PDI de hígado de rata, proteínas Erolp y Pdilp de Sacchromyces . Las proteínas procarióticas incluyen, por ejemplo, DsbC de E. coli . Véase, por ejemplo, Frand et al., Trends en Cell Biol. 10:203-210 (2000) . Otras proteínas procarióticas que actúan para mantener el estado redox de enlaces de disulfuro de proteína incluyen, por ejemplo, DsbB, DsbA, DsbC, DsbD y DsbG de E . col i . Estas proteínas son bien conocidas en la técnica y se describe en por ejemplo, Beckwith et al.

Patente Estadounidense No. 6,872,563, la cual se incorpora en este documento por referencia para todos los propósitos. El término "PEG" se refiere a poli (etilen glicol) . PEG es un polímero ejemplar que se ha conjugado a péptidos. El uso de PEG para derivatizar terapéuticos de péptido ha demostrado reducir la inmunogenicidad de los péptidos y prolongar el tiempo libre de la circulación. Por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,179,337 (Davis et al) contempla péptidos no inmunogénicos, tales como enzimas y hormonas del péptido acopladas a polietilenglicol (PEG) o propilenglicol. Se usan entre 10 y 100 moles de polímero por mol de péptido y al menos 15% de la actividad fisiológica es mantenida. El término "actividad especifica" como se usa en este documento, se refiere a la actividad catalítica de una enzima, por ejemplo, una glicosiltransferasa recombinante de la presente invención, y puede ser expresada en unidades de actividad. Como se usa en este documento, una unidad de actividad cataliza la formación de 1 µmol del producto por minuto a una temperatura dada (por ejemplo, a 37°C) y el valor de pH (por ejemplo, a pH 7.5). Asi, 10 unidades de una enzima es una cantidad catalítica de la enzima, en donde 10 µmol del sustrato es convertido a 10 µmol del producto en un minuto a una temperatura de, por ejemplo, 37°C y un valor de pH de, por ejemplo 7.5. Oligosacáridos "N-enlazados" son aquellos oligosacáridos que se enlazan a una estructura del péptido a través de asparagina, por vía de un enlace asparagina-N-actilglucosamina . Los oligosacáridos N-enlazados también son llamados "N-glicanos" . Oligosacáridos N-enlazados que se originan de forma natural tienen un pentasacárido core común de Man3GlcNAc2. La diferencia en la presencia de, y en el número de ramificaciones (también llamadas antenas) de azúcares periféricas tales como N-acetilglucosamina, galactosa, N-acetilgalactosamina, fucosa y ácido siálico. Opcionalmente, esta estructura puede también contener una molécula core fucosa y/o una molécula xilosa. Usando las glicosiltransferasas eucarióticas solubles producidas por los métodos de la invención, se pueden producir oligosacáridos que imitan las estructuras N-enlazadas naturales que se diseñan por el usuario. En una modalidad de la invención, las glicosiltransferasas eucarióticas solubles que generan oligosacáridos N-enlazados, se expresan en uno o más microorganismos que tienen un ambiente intracelular, oxidante. Glicosiltransferasas eucarióticas solubles que general oligosacáridos N-enlazados incluyen, por ejemplo, enzimas GnTl, Galtl y ST3Gal3. Oligosacáridos "O-enlazados" son aquellos oligosacáridos que se enlazan a una estructura del péptido a través de treonina, serina, hidroxiprolina, tirosina u otros aminoácidos que contienen hidroxi. Usando las glicosiltransferasas eucarióticas producidas por los métodos de la invención, se pueden producir oligosacáridos que imitan las estructuras O-enlazadas naturales o que son designadas por el usuario. En una modalidad de la invención, glicosiltransferasas eucarióticas que general oligosacáridos O-enlazados se expresan en uno o más microorganismos que tienen un ambiente íntracelular, oxidante. Glicosiltransferasas eucarióticas solubles que generan oligosacáridos O-enlazados incluyen, por ejemplo, enzimas GalNAc-T2, Cor-1-Gal-Tl, ST6GalNAc-l, y ST3Gal-l. Una "glicoforma sustancialmente uniforme" o un "patrón de glicosilación sustancialmente uniforme", cuando se refiere a especies de glicoproteínas, se refiere al porcentaje de los sustratos de receptor que son glicosilados por las glicosiltransferasas de interés (por ejemplo, fucosiltransferasas) . Se entenderá que un experto en la técnica, que el material de partida puede contener sustratos aceptores glicosilados. Asi, la cantidad calculada de glicosilación debe incluir sustratos aceptores que son glicosilados por los métodos de la invención, así como aquellos sustratos aceptores ya glicosilados en el material de partida. El término "actividad biológica" se refiere a una actividad enzimática de una proteína. Por ejemplo, actividad biológica de una sialiltransferasa se refiere a la actividad de transferir una porción de ácido siálico de una molécula donadora a una molécula aceptora. La actividad biológica de una GalNAcT2 se refiere a la actividad de transferir una porción N-acetilgalactosamina de una molécula donadora a una molécula aceptora. Para proteínas GalNAcT2, una proteína aceptora puede ser una proteína, un péptido, una glicoproteína o un glicopéptido. Actividad biológica de una proteína GnTl se refiere a la actividad de transferir una porción N-acetilglucosamina de una molécula donadora a una molécula aceptora. Actividad biológica de una galactosiltransferasa, se refiere a la actividad de transferir una porción de galactosa de una molécula donadora a una molécula aceptora.

"Escala comercial" se refiere a producción de escala en gramo de un producto glicosilado en una reacción única. En modalidades preferidas, escala comercial se refiere a la producción de al menos aproximadamente 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 25, 50, 75, 80, 90 o 100, 125, 150, 175, 200, 500 o 1000 gramos de producto glicosilado en una reacción única. Producción a escala comercial de un polipéptido glicosiltransferasa eucariótica se refiere a una producción a escala en gramo de un polipéptido glicosiltransferasa eucariótica. En una modalidad preferida, escala comercial se refiere a producción entre 1 U/kg de proteína hasta 1000 U/kg de proteína. El término "sustancialmente" en las definiciones anteriores de "sustancialmente uniforme" generalmente significa al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80% o más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de los sustratos aceptores para una glicosiltransferasa particular son glicosilados. El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos que se originan de forma natural o no natura, por ejemplo, aminoácidos sintéticos, así como análogos de aminoácido y miméticos de aminoácido que funcionan en una manera similar a los aminoácidos que se originan de forma natural.

Aminoácidos que se origina de forma natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que son modificados posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxilglutamato y 0-fosfoserina. Análogos de aminoácido, se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica, como un aminoácido que se origina de forma natural, es decir, un a carbono que se une a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras de péptido modificado, pero retiene la misma estructura química básica, como un aminoácido que se origina de forma natural. Miméticos de aminoácido se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona en una manera similar a un aminoácido que se origina de forma natural. "Proteina", "polipéptido" o "péptido" se refiere a un polímero en el cual los monómeros son aminoácidos y están unidos juntos a través de uniones de amida, alternativamente referido como un polipéptido. Se puede usar cuando los aminoácidos son a-aminoácidos, ya sea el isómero L-óptico o isómero D-óptico. Adicionalmente, también se incluyen aminoácidos no naturales, por ejemplo, ß-alanina, fenilglicina y homoarginina . Aminoácidos que no son genes codificados también pueden ser usados en la presente invención. Además, también se pueden usar en la presente invención aminoácidos que se han modificado, incluyen grupos reactivos. Todos los aminoácidos usados en la presente invención, pueden ser ya sea el isómero D o L. Los isómeros L son generalmente preferidos. Además, otros peptidomiméticos también son útiles en la presente invención. Para una revisión general, véase Spatola, A.F. en CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINOACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983) . El término "recombinante" cuando se usa con referencia a una célula, indica que la célula replica un ácido nucleico heterólogo, o expresa un péptido o proteína codificada por un ácido nucleico heterólogo. Las células recombinantes pueden contener genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula. Las células recombinantes pueden también contener genes encontrados en la forma nativa de las células, en donde los genes se modifican y se re-introducen en la célula por medios artificiales. El término también abarca células que contienen un ácido nucleico endógeno a la célula que se ha modificado son remover el ácido nucleico de la célula; tales modificaciones incluyen aquellas obtenidas por reemplazo del gen, mutación específico al sitio y técnicas relacionadas. Una "proteína recombinante" es una, la cual se ha producido por una célula recombinante. En modalidades preferidas, se produce una glicosiltransferasa eucariótica por una célula bacteriana recombinante. Una "proteína de fusión" se refiere a una proteína, que comprende secuencias de aminoácido que están en adición a, en lugar de, menos que y/o diferente de las secuencias de aminoácido que codifican la proteína o subsecuencia de mismo, originales o nativos de longitud completa. Se puede agregar más de un dominio adicional a una glicosiltransferasa como se describe en este documento, por ejemplo, un dominio accesorio y una etiqueta de epítope o etiqueta de purificación, o etiquetas de epítope múltiple o etiquetas de purificación. Componentes de proteínas de fusión incluyen "enzimas accesorios" y/o "etiquetas de purificación". Una "enzima accesorio" como se refiere en este documento, es una enzima que se involucra en catalizar una reacción que, por ejemplo, forma un sustrato para una glicosiltransferasa. Una enzima accesorio puede, por ejemplo, catalizar la formación de azúcar de nucleótido que se usa como una porción donadora por una glicosiltransferasa. Una enzima accesorio puede también ser una que se usa en la generación de un trifosfato de nucleótido requerido por la formación de un azúcar de nucleótido, o en la generación del azúcar la cual se incorpora en el azúcar de nucleótido. Ejemplos de enzimas accesorio y se describe la fusión de enzimas accesorio, por ejemplo, en la solicitud PCT CA98/01180, presentada en 15 de Diciembre de 1998. Las glicosiltransferasas recombinantes de la invención, pueden ser construidas y expresadas como una proteína de fusión con una "etiqueta de purificación" molecular en un extremo, lo cual facilita la purificación de la proteína. Tales etiquetas también se pueden usar para inmovilización de una proteína de interés, durante la reacción de glicosilación. Etiquetas adecuadas incluyen "etiquetas epítope", las cuales son una secuencia de proteína que es específicamente reconocida por un anticuerpo. Las etiquetas epítope son generalmente incorporadas en proteínas de fusión para permitir el uso de un anticuerpo ya disponible para detectar o aislar inequívocamente la proteína de fusión. Una "etiqueta FLAG" es una etiqueta epítope comúnmente usada, específicamente reconocida por un anticuerpo anti-FLAG monoclonal, que consiste de la secuencia AspTyrLysAspAspAspAspLys (SEC ID NO: 201) o una variante del mismo sustancialmente idéntica. Otras etiquetas epítopes que se pueden usar en la invención incluyen, por ejemplo, etiqueta myc, AU1, AU5, DDDDK (SEC ID NO: 202) (EC5), etiqueta E, etiqueta E2, Glu-Glu, un péptido de residuo 6, EYMPME (SEC ID NO: 203), derivado de la proteína media T Polioma, HA, HSV, IRS, KT3, etiqueta SI, etiqueta T7, etiqueta V5, VSV-G, ß-galactosidasa, Gal4, proteina fluorescente verde (GFP) , luciferasa, proteina C, proteína A, proteína que se une a la celulosa, GST (glutationa S-transferasa) , una etiqueta de etapa, Nus-S, PEl-asas, Pfg 27, proteina que se une a calmodulina, dsb A y fragmentos de los mismos, y granzima B. Péptidos epítope y anticuerpos que se unen específicamente a secuencias de epítope están comercialmente disponibles de, por ejemplo, Covance Research Products, Inc.; Bethyl Laboratories, Inc.; Abcam Ltd.; y Novus Biologicals, Inc. Otras etiquetas de purificación adecuadas se conocen por aquellos expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, una etiqueta de afinidad como un péptido hexahistidina (SEC ID NO: 204) u otros péptidos poli-histidina, los cuales se unen a iones de metal, tales como iones de níquel o cobalto. Proteínas que comprenden etiquetas de purificación se pueden purificar usando un patrón de unión que une la etiqueta de purificación, por ejemplo, anticuerpos para la etiqueta de purificación, iones de níquel o cobalto o resinas, y amilosa, maltosa o una ciclodextrina. Etiquetas de purificación también incluyen dominios que se unen a almidón, dominios de tioredoxina de E. coli (vectores y anticuerpos comercialmente disponibles de, por ejemplo, Santa Cruz Biotechnology, Inc. y Alpha Diagnostic International, Inc.), y la mitad de carboxi-terminal de la proteina SUMO (vectores y anticuerpos comercialmente disponibles de, por ejemplo, Life Sensors Inc.). Se describen dominios que se unen al almidón tal como un dominio que se une a la maltosa de E . col i y SBD (dominio que se une al almidón) de una amilasa de A . niger, en WO 99/15636, incorporada en este documento por referencia. Se describe la purificación de afinidad de una proteína de fusión que comprende un dominio que se une al almidón, usando una resina derivatizada de betaciclodextrina (BCD) en USSN 60/468,374, presentada el 5 de Mayo de 2003, incorporada en este documento por referencia en su totalidad. Las glicosiltransferasa también pueden incluir una etiqueta de proteína desdoblada, tal como una "inteina". Las inteínas facilitan el retiro de, por ejemplo, una etiqueta de purificación o epítope. Las inteínas y kits para su uso están comercialmente disponibles, por ejemplo, de New Englad Biolabs. El término "dominio funcional" con referencia a glicosiltransferasas, se refiere a un dominio de las glicosiltransferasas que confieren o modulan una actividad de la enzima, por ejemplo, especificidad del sustrato aceptor, actividad catalítica, afinidad de unión, localización dentro del aparto de Golgi, anclaje a una membrana celular u otra actividad biológica o bioquímica. Ejemplos de dominios funcionales de glicosiltransferasas incluyen, pero no se limitan a, el dominio catalítico, región troncal, anclaje de señal o dominio de transmembrana y extremo citoplásmico amino-terminal. Los términos "expresión de nivel" o "expresión de expresión" con referencia a una proteína, se refiere a la cantidad de una proteína producida por una célula. La cantidad de proteína producida por una célula puede ser medida por los ensayos y unidades de actividad descritas en este documento o conocidas por un experto en la técnica. Un experto en la técnica, conocerá como medir y describir la cantidad de proteína producida por una célula, usando una variedad de ensayos y unidades, respectivamente. Así, la descripción de cuantificación y cuantitativa del nivel de expresión de una proteína, por ejemplo, una glicosiltransferasa, no se limita a los ensayos usados para medir la actividad o las unidades usadas para describir la actividad, respectivamente. La cantidad de proteína producida por una célula, puede ser determinada por ensayos estándares conocidos, por ejemplo, el ensayo de proteina por Bradford (1976), el kit de ensayo de proteína de ácido bicinconinico de Pierce (Rockford, Illinois), o como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,641,668. Otro método para determinar la expresión de proteína es para analizar un Usado u otra muestra que contiene la proteína, usando electroforesis en gel, por ejemplo SDS-PAGE, seguido por una etapa de visualización. Las etapas de visualización incluyen tintes y teñidos de proteína, por ejemplo, teñido Comassie o de plata, o inmunoensayos, tales como análisis de manchado western, usando un anticuerpo que específicamente se enlaza a la proteina de interés. Los anticuerpos pueden ser dirigidos contra la glicosiltransferasa o contra una etiqueta de purificación o epítope covalentemente unida a la proteina. El término "actividad enzimática" se refiere a una actividad de una enzima y puede ser medida por los ensayos y unidades descritos en este documento o conocidos por un experto en la técnica. Ejemplos de una actividad de una glicosiltransferasa incluye, pero no se limita a, aquello asociado con los dominios funcionales de la enzima, por ejemplo, especificidad del sustrato aceptor, actividad catalítica, afinidad de unión, localización dentro del aparato de Golgi, anclaje a una membrana celular u otra actividad biológica o bioquímica. Una "región troncal" con referencia a glicosiltransferasas se refiere a un dominio de proteína, o una subsecuencia del mismo, el cual en la glicosiltransferasa nativa se localiza adyacente al anclaje de señal o dominio de transmembrana, entre la región de membrana y el dominio catalítico más pequeño, y se ha reportado por funcionar como una señal de retención para mantener la glicosiltransferasa en el aparato de Golgi y como un sitio de desdoblamiento proteolítico. Regiones troncales generalmente inician con el primero aminoácido hidrofílico, seguido por el dominio de transmembrana hidrofóbica y termina en el dominio catalítico, o en algunos casos, el primer residuo de cisteína seguido del dominio de transmembrana. Regiones troncales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, la región troncal de fucosiltransferasa VI, residuos de aminoácido 40-54; la región troncal de GnTl de mamífero, residuos de aminoácido de aproximadamente 36 hasta aproximadamente 103 (véase, por ejemplo, la enzima humana); la región troncal de GalTl de mamífero, residuos de aminoácido de aproximadamente 71 a aproximadamente 129 (véase, por ejemplo, la enzima de bovino) ; la región troncal de ST3GalIII de mamífero, residuos de aminoácido de aproximadamente 29 hasta aproximadamente 84 (véase, por ejemplo, la enzima de rata); la región troncal de Coe-1-Gal-Tl de invertebrado, residuos de aminoácido de aproximadamente 36 hasta aproximadamente 102 (véase, por ejemplo, la enzima de Drosophila ) ; la región troncal de Core-1-Gal-Tl de mamífero, residuos de aminoácido de aproximadamente 32 hasta aproximadamente 90 (véase, por ejemplo, la enzima de humano); la región troncal de ST3Gall de humano, residuos de aminoácido de aproximadamente 28 hasta aproximadamente 61 (véase, por ejemplo, la enzima de porcino) o para los residuos de aminoácido de enzima de humano de aproximadamente 18 hasta aproximadamente 58; la región troncal de ST6GalNAc-l de mamífero, residuos de aminoácido de aproximadamente 30 hasta aproximadamente 207 (véase, por ejemplo, la enzima de murina) , aminoácidos 35-278 para la enzima de humano o aminoácidos 37-253 para la enzima de pollo; la región troncal de GalNAc-T2 de mamífero, residuos de aminoácido de aproximadamente 71 hasta aproximadamente 129 (véase, por ejemplo, la enzima de rata) . Un "domino catalítico" se refiere a un dominio de proteína, o una subsecuencia del mismo, que cataliza una reacción enzimática desarrollada por la enzima. Por ejemplo, un dominio catalítico de una sialiltransferasa incluirá una subsecuencia de la sialiltransferasa suficiente para transferir residuos de ácido siálico de un donador a un sacárido A aceptor. Un dominio catalítico puede incluir una enzima completa, una subsecuencia del mismo, o puede incluir secuencias de aminoácido adicionales que no se unen a la enzima, o una subsecuencia del mismo, como se encuentra en la naturaleza. Una región catalítica ejemplar es, pero no se limita a, el dominio catalítico de fucosiltransferasa VII, residuos de aminoácido 39-342; el dominio catalítico de GnTl de mamífero, residuos de aminoácido de aproximadamente 104 hasta aproximadamente 445 (véase, por ejemplo, la enzima de humano); el dominio catalítico de GalTl de mamífero, residuos de aminoácido de aproximadamente 130 hasta aproximadamente 402 (véase, por ejemplo, la enzima de bovino); y el dominio catalítico de ST3Gal3 de mamífero, residuos de aminoácido de aproximadamente 85 hasta aproximadamente 374 (véase, por ejemplo, la enzima de rata) . Se describen dominios catalíticos y mutantes de truncación de proteínas GalNAc-T2 en USSN 60/576,530 presentada el 3 de Junio de 2004; y solicitud para patente provisional de Estados Unidos, Número de Documento del Abogado 040853-01-5149-P1, presentada el 3 de Agosto de 2004; ambas se incorporan en este documento por referencia para todos los propósitos. Se pueden identificar dominios catalíticos alineándolos con glicosiltransferasas conocidas. Una "subsecuencia" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que comprenden una parte de una secuencia más larga de ácidos nucleicos o aminoácidos (por ejemplo, proteína) respectivamente. Una "glicosiltransferasa de truncación" o una "glicosiltransferasa truncada" o variantes gramáticos, se refieren a una glicosiltransferasa que tiene pocos residuos de aminoácidos que una glicosiltransferasa que se origina de forma natural, pero que retiene actividad enzimática. Glicosiltransferasas truncadas incluyen, por ejemplo, enzimas GnTl truncadas, enzimas GalTl truncadas, enzimas ST3GalIII truncadas, enzimas GalNAc-T2 truncadas, enzimas Core 1 GalTl truncadas, residuos de aminoácidos de aproximadamente 32 hasta aproximadamente 90 (véase, por ejemplo, la enzima de humano) ; enzimas ST3Gall truncadas, enzimas ST6GalNAc-l truncadas y enzimas GalNAc-T2 truncadas. Se pueden suprimir cualquier número de residuos de aminoácidos tan grande como para retener la actividad de la enzima. En algunas modalidades, se pueden suprimir dominios o porciones de dominios, por ejemplo, se puede suprimir un dominio de anclaje de señal que deja una truncación, que comprende una región troncal y un dominio catalítico; un dominio de anclaje de señal y se puede suprimir una porción de una región troncal que deja una truncación, que comprende la región troncal restante y un dominio catalítico; o un dominio de anclaje de señal y se puede suprimir una región troncal que deja una truncación, que comprende un dominio catalítico. También pueden ocurrir truncaciones de glicosiltransferasa en el C-término de la proteína. Por ejemplo, algunas enzimas GalNAcT tienen un dominio lectina C-terminal que puede ser suprimido son disminuir la actividad enzimática. El término "ácido nucleico" se refiere a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido en ya sea forma de ramificado único o doble, y de otra forma limitada, abarca análogos conocidos de nucleótidos naturales que hibridizan a ácidos nucleicos en una manera similar a nucleótidos que se origina de forma natural. A menos que se indique de otra forma, una secuencia de ácido nucleico particular incluye la secuencia complementaria del mismo . Un "cásete de expresión recombinante" o simplemente un "cásete de expresión" es un constructo de ácido nucleico, generado recombinantemente o sintéticamente, con elementos de ácido nucleico que son capaces de afectar la expresión de un gen estructural en hospedantes compatibles con tales secuencias. Expresión de cásete incluye al menos, promotores y opcionalmente, señales de terminación de transcripción. Típicamente, el cásete de expresión recombinante incluye un ácido nucleico para ser transcrito (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido deseado), y un promotor. También se pueden usar factores adicionales necesarios o útiles para afectar la expresión, como se describe en este documento. Por ejemplo, un cásete de expresión puede ser también incluir secuencias de nucleótido que codifican una secuencia de señal que dirige la secreción de una proteína expresada de la célula hospedante. También se pueden incluir señales de terminación de transcripción, mejoradores y otras secuencias de ácido nucleico que influyen en la expresión del gen, en un cásete de expresión. En modalidades preferidas, un cásete de expresión recombinante que codifican una secuencia de aminoácido, que comprende una glicosiltransferasa eucariótica expresada en una célula hospedante bacteriana. Una "secuencia heteróloga" o un "ácido nucleico heterólogo", como se usa en este documento, es una que se origina de una fuente extraña a la célula hospedante particular, o, si de la misma fuente, es modificada de su forma original. Así, un gen de glicoproteína heteróloga en una célula hospedante eucariótica, incluye un gen que codifica glicoproteína, que es endógena a la célula hospedante particular que se ha modificado. La modificación de la secuencia heteróloga puede ocurrir, por ejemplo, tratando el ADN con una enzima de restricción para generar un fragmento de ADN que es capaz de ser operablemente enlazada al promotor. También pueden ser útiles técnicas tales como mutagénesis dirigida al sitio para modificar una secuencia heteróloga. El término "aislado" se refiere a material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes, los cuales interfieren con la actividad de una enzima. Para un sacárido, proteína o ácido nucleico de la invención, el término "aislado" se refiere al material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes, los cuales normalmente acompañan al material encontrado en su estado nativo. Típicamente, un sacárido aislado, proteína o ácido nucleico de la invención es al menos aproximadamente 80% puro, usualmente al menos 90%, y preferiblemente al menos aproximadamente 95% puro como se midió por intensidad de banda en un gel de teñido de plata u otro método para determinar la pureza. Se puede indicar la pureza y homogeneidad por un número de medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, una proteina o ácido nucleico en una muestra que se puede resolver por electroforesis en gel de poliacrilamida, y después la proteína o ácido nucleico puede ser visualizado por tinción. Para ciertos propósitos de alta resolución de la proteina o ácidos nucleico, puede ser deseable una CLAR o por ejemplo, se puede utiliza medios similares para purificación. El término "operablemente enlazado" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia control de expresión de ácido nucleico (tal como un promotor, secuencia de señal o arreglo de sitios que se unen al factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de expresión afecta la transcripción y/o traducción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia. Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de proteina, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son los mismos, cuando se comparan y se alinean para máxima correspondencia, como se midió usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por inspección visual . La frase "sustancialmente idéntico", en el contexto de dos ácidos nucleicos o proteínas, se refiere a dos o más secuencias o sustancias que tienen al menos más que aproximadamente 60% de identidad de secuencia de ácido nucleico o aminoácido, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, preferiblemente 91%, 92%, 93%, 94%, 9%%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de residuo de nucleótido o aminoácido, cuando se comparan y se alinean para máxima correspondencia, como se midió usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por inspección visual. Preferiblemente, la identidad sustancial existe sobre una región de las secuencias que tienen al menos aproximadamente 50 residuos en longitud, más preferiblemente sobre una región de al menos 100 residuos, y más preferiblemente las secuencias son sustancialmente idénticas sobre al menos aproximadamente 150 residuos. En una modalidad más preferida, las secuencias son sustancialmente idénticas sobre la longitud completa de las regiones codificadas. Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, a la cual las secuencias se prueba se comparan. Cuando se usa un algoritmo de comparación se secuencia, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan coordinados subsecuentes, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. Después el algoritmo de comparación de secuencia calcula el porcentaje de secuencia idéntica para las secuencias de prueba relativo a la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa designado. Se puede conducir alineamiento óptimo de secuencias por comparación, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de smith & Waterman, Adv. Appl, Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por la búsqueda para método de semejanza de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o por inspección visual (véase generalmente, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds, Current Protocols, un riego conjunto entre Greene Publishíng Associates, Inc. y John Wiley % Sons, Inc. (Suplemento de 1995) (Ausubel) ) . Ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y semejanza de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Alschuel et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, respectivamente. El software para realizar los análisis BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional para Información Biotecnológica (www . ncbi . nlm. nih-gov/) . Este algoritmo involucra primero identificando pares de secuencia muy marcados (HSPs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de duda, la cual ya sea iguala o satisface algunos registro T del umbral valioso positivo, cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una base de datos de la secuencia. T se refiere como el umbral de registro de palabra de proximidad (Altschul et al, supra) . Estos choques de palabras cercanas iniciales, actúan como semillas para iniciar la búsqueda para encontrar HSPs largos que los contienen. Los choques de la palabra son después extendidos en ambas direcciones, a lo largo de cada secuencia, así como puede ser incrementado para el registro de alineación cumulativa. Los registros cumulativos se calculan usando, para secuencias de nucleótido, los parámetros M (registro con recompensa para un par de residuos marcados; siempre > 0) y N (registro penalizado para residuos mal emparejados; siempre < 0). Para secuencias de aminoácido, se usa una matriz de registro para calcular el registro cumulativo. La extensión de choques de palabras en cada dirección son interrumpidos cuando: falla el registro de alineación cumulativa por la cantidad X de su máximo valor logrado; el registro cumulativo pasa a cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuo de registro negativo; o se alcanza el final de la secuencia. Los parámetros de algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias del nucleótido) usa como valor por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectación (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácido, se uso el programa BLASTP como valor por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectación (E) de 10, y la matriz de registro BLOSUM62 (véase, Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989) ) . Además al cálculo del porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza análisis estadístico de la semejanza entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altchul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medición de semejanza proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), la cual proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una combinación entre dos secuencias de nucleótido o aminoácido puede ocurrir por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en comparación del aminoácido de prueba para el ácido nucleico de referencia es menos que aproximadamente 0.1, más preferiblemente menos que aproximadamente 0.01 y más preferiblemente menos que aproximadamente 0.001. Una indicación adicional que dos secuencias de ácido nucleico o proteínas son sustancialmente idénticas, es que la proteína codificada por el primer ácido nucleico es inmunológicamente a través del reactivo con la proteína codificada por el segundo ácido nucleico, como se describe abajo. Asi, una proteina es típicamente sustancialmente idéntica a una segunda proteína, por ejemplo, en donde los dos péptidos difieren únicamente por sustituciones conservativas . Otra indicación que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibridizan a cada otra bajo condiciones rigurosas, como se describe abajo. La frase "específicamente hibridizado" se refiere al enlace, transmisión de dúplex o hibridizado de una molécula, únicamente a una secuencia de nucleótido particular bajo condiciones rigurosas, cuando la secuencia está presente en un complejo de mezcla (por ejemplo, celular total), ADN o ARN. El término "condiciones rigurosas", se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda hibridiza a si secuencia objetivo, pero no otras secuencias. Condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Secuencias más largas hibridizan específicamente a temperaturas más altas. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan por ser aproximadamente 15°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica en una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica definida, pH y concentración de ácido nucleico) en la cual 50% de las sondas son complementarias para hibridizar la secuencia objetivo a la secuencia objetivo en equilibrio. (Como las secuencias objetivo están generalmente presentes en exceso, en Tm, 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio) . Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas, en las cuales la concentración de sal es menos que aproximadamente 1.0 M de ion de Na, típicamente aproximadamente 0.01 hasta 1.0 M de concentración de ion de Na (u otras sales) a pH 7.0 hasta 8.3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para sonda corta (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayor que 50 nucleótidos) . También se pueden lograr condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. Para hibridación selectiva o específica, una señal positiva es típicamente al menos dos veces la formación, preferiblemente 10 veces la formación de hibridización. Condiciones de hibridización rigurosas ejemplares pueden ser como siguen: 50% de formamida, 5x SSC y 1% de SDS, incubado a 42°C, o 5x SSC, 1% SDS, incubado a 65°C, con lavado en 0.2x SSC y 0.1% SDS a 65°C. Para RCP, una temperatura de aproximadamente 36°C es típicamente para amplificación rigurosa baja, a pesar que las temperaturas de cocido pueden variar entre aproximadamente 32-48°C dependiendo de la longitud del cebador. Para amplificación RCP de alta rigurosidad, una temperatura de aproximadamente 62°C es típica, a pesar que las temperaturas de cocido de alta rigurosidad pueden variar de aproximadamente 50°C hasta aproximadamente 65°C, dependiendo de la longitud del cebador y especificidad. Condiciones de ciclo típico para amplificación tanto de rigurosidad alta como rigurosidad baja, incluyen una fase de desnaturalización de 90-95°C por30-120 segundos, una fase de cocido dura 30-120 segundos, y una fase de extensión de aproximadamente 72°C por 1-2 minutos. Están disponibles protocolos y guías para reacciones de amplificación de alta y baja rigurosidad, por ejemplo, en Innis et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, N.Y. Las frases "específicamente unido a una proteína" o "específicamente inmunoreactivo con", cuando se refiere a un anticuerpo, se refiere a una reacción enlazante, la cual es determinante de la presencia de la proteína en la presencia de una población heterogénea de proteínas y otros biológicos. Así, bajo condiciones de inmunoensayo designado, los anticuerpos especificados se une preferencialmente a una proteína particular y no se unen en una cantidad significante a otras proteínas presentes en la muestra. Unión especifica a una proteína bajo tales condiciones, requiere un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para una proteína particular. Se pueden usar una variedad de formatos de inmunoensayos para seleccionar anticuerpos específicamente inmunoreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA de fase sólida son rutinariamente usados para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunoreactivos con una proteína. Véase Harlow y Lañe (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que se pueden usar para determinar la inmunoreactividad específica. "Modificaciones conservativamente modificadas" de una secuencia de polinucleótido particular, se refiere a aquellos polinucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en donde el polinucleótido no codifica una secuencia de aminoácido, para esencialmente secuencias idénticas. Debido a que la degeneración del código genético, un número amplio de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones CGU, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG todos codifican la arginina del aminoácido. Así, en cada posición en donde una arginina es especificada por un codón, el codón puede ser alterado por cualquiera de los codones correspondientes descritos son alterar la proteina codificada. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silentes", las cuales son unas especies de "variaciones conservadoramente modificadas". Cada secuencia de polinucleótido descritas en este documento, las cuales codifican una proteína, también describen cada posible variación silente, excepto en donde se note de otra forma. Un experto en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, el cual es ordinariamente el único codón para metionina y UGG el cual es ordinariamente el único codón para triptofano) puede ser modificado para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica por técnicas estándar. Por lo tanto, cada una "variación silente" de un ácido nucleico, el cual codifica una proteína está implícita en cada secuencia descrita. Además, un experto reconocerá que las sustituciones, supresiones o adiciones individuales, las cuales alteran, agregan o suprimen un aminoácido único o un porcentaje pequeño de aminoácidos (típicamente menos del 5%, más típicamente menos del 1%) en una secuencia codificada son "variaciones conservadoramente modificadas", en donde las alteraciones resultan en la sustitución de un aminoácido, con un aminoácido químicamente similar. Tabletas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidos en la técnica. Un experto en la técnica apreciará que muchas variaciones conservadoras de proteínas, por ejemplo, glicosiltransferasas, y ácido nucleico el cual codifica proteina, proporciona productos esencialmente idénticos. Por ejemplo, debido a la degeneración del código genético, "sustituciones silentes" (es decir, sustituciones de una secuencia de ácido nucleico, la cual no resulta en una alteración en una proteina codificada) son una característica incluida de cada secuencia de ácido nucleico, la cual codifica un aminoácido. Como se describe en este documento, las secuencias son preferiblemente optimizadas por expresión en una célula hospedante particular, usada para producir las glicosiltransferasas quiméricas (por ejemplo, levadura, de humano y similares). Similarmente, "sustitución de aminoácido conservativo", en una o pocos aminoácidos en una secuencia de aminoácido se sustituyen con diferentes aminoácidos con propiedades muy similares (véase, por ejemplo, la sección de definiciones, supra) , también son fácilmente identificadas por ser muy similares a secuencias de aminoácido particular, o para una secuencia de ácido nucleico particular, la cual codifica un aminoácido. Tales variaciones conservadoramente sustituidas de cualquier secuencia particular son una característica de la presente invención. Véase también, Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company. Además, sustituciones, supresiones o adiciones individuales, las cuales alteran, agregan o suprimen un aminoácido o un porcentaje menor de aminoácidos en una secuencia codificada, son también "variaciones conservativamente modificadas". La práctica de esta invención puede involucrar la construcción de ácidos nucleicos recombinantes y la expresión de genes en células hospederas, preferiblemente, células hospederas bacterianas. Las técnicas de clonación molecular para lograr estos términos se conocen en la técnica. Una amplia variedad de métodos de amplificación y clonación in vi tro, adecuada para la construcción de ácidos nucleicos recombinantes tales como vectores de expresión, son bien conocidas para personas expertas. Ejemplos de estas técnicas e instrucciones suficientes para dirigir a personas de habilidad a través de muchos ejercicios de clonación, se encuentran en Berger and Ki mel, Guide to Molecular Cloning Techniques , Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al , eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1999 Supplement) (Ausubel). Las células hospederas adecuadas para expresión de los polipéptidos recombinantes son conocidas por aquellos de habilidad en la técnica, e incluyen por ejemplo, células procariótícas, tales como E. coli y células eucarióticas que incluyen células de insecto, de mamífero y fúngicas (por ejemplo, Aspergill us niger) . Ejemplos de protocolos suficientes para dirigir a personas de habilidad a través de métodos de purificación in vi tro, que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) , la reacción en cadena de ligasa (LCR) , amplificación de Qß-replicasa y otras técnicas mediadas por la polimerasa de ARN, se encuentran en Berger, Sambrook, and Ausubel, así como también Mullis et al . (1987) U.S. Patent No. 4,683,202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applica tions (Linis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Ms) ; Arnheim & Levinson (October 1, 1990) C&EN 36- 47; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81-94 (Kwoh et al (1989) Proc . Na tl . Acad. Sci . USA 86:1173 Guatelli et al . (1990) Proc . Na tl . Acad. Sci . USA 87:1874 Lomell et al (1989) J. Clin . Chem . 35: 1826; Landegren et al . (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt 1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu and Wallace (1989) Gene 4:560; y Barringer et al . (1990) Gene 89: 117. Métodos mejorados de clonación de ácidos nucleicos amplificados in vi tro, se describen en Wallace et al , Pat. Estadounidense No. 5,426,039.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. INTRODUCCIÓN Esta invención proporciona por primera vez, métodos para intensificar la producción de glicosiltransferasas eucarióticas activas, solubles, en microorganismos usando organismos procarióticos, por ejemplo, bacterias que tienen ambientes intracelulares de oxidación. La invención abarca el mejoramiento de la expresión de glicosiltransferasa, a través del uso de organismos procarióticos que tienen naturalmente, ambientes intracelulares de oxidación, tales como Pseudomonas . La invención también abarca el uso de organismos procarióticos que tienen amientes intracelulares de reducción naturalmente, pero que son manipulados para tener un ambiente intracelular oxidante. Por ejemplo, E. col i en general, tiene un ambiente intracelular de reducción. La expresión de proteínas heterólogas en E. col i, frecuentemente puede ser difícil o impráctico debido que los enlaces disulfuro no son aproximadamente oxidados, conduciendo al plegamiento alterado de la proteína y expresión de proteínas en cuerpos de inclusión. E . coli y otros organismos procarióticos que tienen un ambiente intracelular naturalmente de reducción, pueden ser manipulados, sin embargo, para generar un ambiente intracelular que favorece la oxidación de enlaces disulfuro. Por ejemplo, E. coli puede ser manipulado para reducir la actividad de proteínas reductasa endógenas, ya sea por mutación de los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas o por manipulación de otras actividades de proteína en un ciclo de oxidación-reducción intracelular. Por ejemplo, en E . col i , las mutaciones de inactivación en la proteina tioredoxina reductasa (trxB) , la proteína glutationa reductasa (gor) , o en ambas proteínas, resulta en células que tienen un ambiente de oxidación. Las células E . col i que tienen mutaciones en trxB y gor, son comercialmente disponibles, por ejemplo, de EMD Biosciences, Inc. En modalidades preferidas, las glicosiltransferasas eucarióticas activas solubles, son expresadas intracelularmente dentro del microorganismo procariótico que tiene un ambiente de oxidación, es decir, dentro de la membrana celular y no en el espacio periplásmico o secretadas de la célula. En otra modalidad preferida, las glicosiltransferasas eucarióticas solubles expresadas en un microorganismo procariótico que tienen un ambiente de oxidación, mantienen su actividad enzimática y son no glicosiladas, glicosiladas de manera diferente o glicosiladas mínimamente, comparadas con la misma glicosiltransferasa eucariótica cuando se expresan en una célula eucariótica, por ejemplo, una levadura, una célula de mamífero o una célula de origen, es decir, una célula humana para una glicosiltransferasa humana. En una modalidad, la producción de glicosiltransferasas eucarióticas activas, solubles en microorganismos procarióticos, que tienen ambientes intracelulares de oxidación, es además mejorada haciendo crecer las células bajo condiciones que reducen el nivel de producción de proteína recombinante, es decir, la glicosiltransferasa eucariótica, por debajo de aquella de un nivel máximo. En otra modalidad preferida, la producción de glicosiltransferasas eucarióticas activas, solubles en microorganismos procarióticos que tienen ambientes intracelulares de oxidación, haciendo crecer las células bajo condiciones que reducen el nivel de producción de proteína recombinante, por ejemplo, inferior que una temperatura de crecimiento óptima, resulta en expresión tanto incrementada como actividad incrementada de la glicosiltransferasa eucariótica soluble, comparada con su expresión en una célula hospedera de tipo nativo, con un ambiente de reducción, por ejemplo. E. coli .

II. GLICOSILTRANSFERASAS EUCARIÓTICAS ACTIVAS, SOLUBLES Y SU EXPRESIÓN EN MICROORGANISMOS PROCARIÓTICOS CON AMBIENTES INTRACELULARES DE OXIDACIÓN Cualquier glicosiltransferasa que es predominantemente insoluble cuando se expresa en un ambiente de reducción, por ejemplo, E . coli de tipo nativo, puede ser expresada en un organismo procariótico que tiene un ambiente oxidante intracelular para facilitar la expresión de una proteína soluble, activa. Las glicosiltransferasas son entonces usadas para síntesis o remodelación de oligosacáridos, glicoproteínas, glicopéptidos o glicolipidos . Las glicosiltransferasas preferidas incluyen, glicosiltransferasas eucarióticas, como se describe en este documento.

A. Glicosil transferasas eucarióticas Cualquier glicosiltransferasa eucariótica puede ser usada en los métodos de la presente invención. Las glicosiltransferasas eucarióticas pueden ser que glicosiltransferasas que se originan naturalmente, proteínas no modificadas o que han sido modificadas para mejorar la actividad catalítica, o estabilidad y otras características de las proteínas. La modificación de glicosiltransferasas eucarióticas incluye por ejemplo, truncación de la proteina para remover por ejemplo, la región troncal, el domino de señal-anclaje o una Proción de la región troncal o el domino de señal-anclaje, o remoción de tanto la región troncal como el dominio de señal-anclaje; o remoción de un residuo de cisteína no apareado por sustitución a otro residuo de aminoácido. Una glicosiltranferasa puede también ser truncada al C-término para remover un dominio o dominios no catalíticos. Por ejemplo, un dominio de lectina C-terminal, puede ser removido de enzimas GalNAcT sin disminuir la actividad enzimática. Las glicosiltransferasas modificadas son descritas por ejemplo, en el documento USSN 60/542,210, presentada en Febrero 4, 2004; USSN 60/599,406, presentada en Agosto 6, 2004; USSN 60/627,406, presentada en Noviembre 12, 2004; USSN 60/576,433, presentada en Junio 3, 2004; USSN 60/650,011, presentada en Febrero 4, 2005; PCT/US05/19583, presentada en Junio 3, 2005; USSN 60/576,530, presentada en Junio 3, 2004; USSN 60/598,584, presentada en Agosto 3, 2004; PCT/US05/19442, presentada en Junio 3, 2005; PCT/US05/03856, presentada en Febrero 4, 2005; y WO 2004/063344; cada una de las cuales está incorporada en este documento por referencia para todos los propósitos . Modalidades preferidas de la invención incluyen métodos para producir por ejemplo, una N-acetilglucosaminiltransferasa eucariótica (GnTI o GNTI, GnTII o GNTII, GnTIII o GNTIII, GnTIV o GNTIV, GnTV o GNTV, GnTIV o GNTIV) ; una N-acetilgalactosaminiltransferasa eucariótica (GalNAcT, por ejemplo, GalNAcTl, GalNAcT2, o GalNAcT3); cualquier galactosiltransferasa, por ejemplo, una ß-1, 4-galactosiltransferasa eucariótica (GalTl) o una galactosiltransferasa core I eucaríótica (Core-1-Gal-Tl) ; cualquier sialiltransferasa eucariótica, por ejemplo, una a (2, 3) sialiltransferasa eucariótica (ST3Gal3), o una a-N- acetilgalactosaminida a-2, 6-sialiltransferase I eucariótica (ST6GalNAc-l) , o una gal ßl,3GalNAc a2,3-sialiltransferasa eucariótica (ST3Gal-l) ; y cualquier fucosiltransferasa eucariótica. Muchos ejemplos de proteínas que tienen las actividades listadas anteriormente, se conocen, véase por ejemplo, afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/, en particular Familias de Glicosiltransferasa 2, 4, 6, 7, 10, 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 37, 38, 41, 42, 49, 52, 54, 65, ó 68. Otras glicosiltransferasas que pueden ser producidas usando los métodos descritos, se encuentran en el listado de secuencia informal adjunto. Como se indica anteriormente, la glicosiltransferasa puede ser modificada antes de la producción usando los métodos descritos. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, truncación de la glicosiltransferasa para remover toda o una porción de un dominio no catalítico, tal como un dominio citoplásmico, un dominio de señal-anclaje, una región troncal, y/o un dominio de lectina. Las glicosiltransferasas truncadas ejemplares que pueden ser producidas en la presente invención incluyen, por ejemplo, mutantes ST3Gal III (?27, ?28, ?73, ?85, ?86), GnTI humano (?103), GalTl bovino (?40, ?129, ?70), GalNAcT2 humano (?51, ?40, ?73, ?94, ?51?445, ?53, ?53?445) , ST3Gall (?45), Core-1-Gal-Tl de Drosophila (?31, ?50) , y STdGalNAcl humano, se muestran en la Tabla 1 Tabla 1: Mutantes STßGalNAcI Sitio de Mutación (primer Truncación aminoácido) ?35 K36 ?124 K125 ?257 S258 ?35 K36 ?72 T73 ?109 E110 ?133 M134 ?48 Q49 ?152 V153 ?225 L226 ?226 R227 ?232 T233 o -1 ?231 K232 o -J a. •I i-i*-"- l - _ ?30 K31 ?31 D32 ?51 E52 z ?126 S127 •o H ?185 S186 2 ?200 S201 III. AMBIENTES DE OXIDACIÓN, INTRACELULAR En modalidades preferidas, las glicosiltransferasas eucarióticas activas, solubles, son expresadas en organismos procarióticos que tienen ambientes citoplásmicos de oxidación.

A. Identificación de ambientes de oxidación, intracelular La actividad de proteína y repliegue de proteína, frecuente depende de la formación correcta de enlaces de disulfuro. Los enlaces de disulfuro son reacciones de intercambio de tiol-disulfuro reversibles (SH-SS) , que son mayormente influenciados por el estado redox del ambiente que circunda la proteína. En muchas células, que incluyen E . coli y otros organismos procarióticos, glutationa, una cisteína que contiene tripéptido, es un amortiguador redox tiol-disulfuro importante. El estado redox de microorganismos procarióticos es también afectado por otras proteínas, tales como tioredoxinas . Las proteínas reductasa en cambio, regulan el estado redox de glutationa, glutaredoxinas y tioredoxinas. En E . coli , glutationas codificadas por gshA y gshB, regulan el estado redox de glutaredoxinas. Las proteínas reductasas incluyen por ejemplo, tioredoxina reductasa y glutationa oxidoreductasa. La E . col i tiene tioredoxinas codificadas por genes trxA y trxB, glutaredoxina 1, glutaredoxina 2, y glutaredoxina 3, codificadas por genes grxA, grxB y grxC. Muchas de las proteínas que regulan el estado de oxidación de una célula, por ejemplo, tioredoxina, glutationa, tioredoxina y glutationa oxidoreductasa, comprenden una porción CX?X2C . Las proteínas también comprenden una porción estructural de proteína conocida como el pliegue de tioredoxina. Un método para identificar procariotas que tienen un ambiente intracelular de oxidación, es medir la relación de glutationa reducida (GSH) a glutationa oxidada (GSSG) . Las relaciones óptimas de GSH/GSSG para el pliegue de proteína han sido determinadas. In vitro, los rendimientos máximos de proteínas apropiadamente plegadas, ocurren a relaciones GSH/GSSG de menos de 50, preferiblemente menos de 40, más preferiblemente menos de 30, todavía más preferiblemente menos de 20, y más preferiblemente menos de 10. En células de mamíferos, las relaciones citoplásmicas GSH/GSSG varían desde 20/1 hasta 100/1, mientras las relaciones GSH/GSSG de la trayectoria secretoria (en donde ocurren la mayoría de repliegues de proteínas), varían desde 1/1 a 3/1. Hwang et al . , Science 257:1496-1502 (1992). E. coli expresa algunas proteínas intracelulares con enlaces disulfuro. Las proteínas E . coli que tienen enlaces disulfuro, son secretadas en el espacio periplásmico, el cual tiene un ambiente de oxidación. Las relaciones GSH/GSSG de E. coli intracelular de tipo nativo típicas, varían desde 50/1 hasta 200/1. Hwang et al . , supra. Los métodos de la invención pueden ser usados para producir glicosiltransferasas eucarióticas en organismos procarióticos que tienen un ambiente intracelular de oxidación. Los microorganismos con ambiente intracelular de oxidación, típicamente tienen relaciones GSH/GSSG de menos de 50, preferiblemente menos de 40, más preferiblemente menos de 30, todavía más preferiblemente menos de 20, y más preferiblemente menos de 10. De este modo, en algunas modalidades, los microorganismos de la invención tendrán relaciones GSH/GSSG que varían, por ejemplo, desde 0 hasta 50, o desde 0.1 hasta 25, o desde 0.5 hasta 10. Los organismos procarióticos con ambientes intracelulares pueden ser identificados por ejemplo, determinando la relación GSH/GSSG intracelular de los organismos procarióticos. Los ensayos para la concentración de glutationa total, son comercialmente disponibles de por ejemplo, Sigma. Los ensayos para la determinación de una relación GSH/GSSG, se describen en por ejemplo, Hwang et ah, Science 257:1496-1502 (1992). Métodos para cuantificar el contenido intracelular de GSH y GSSG por derivatización con N- (l-pirenil)maleimida (NPM) , seguidos por cuantificación usando CLAR, se describen en Ostergaard, et al., J. Cell Biol. 166:337-345 (2004). Un número de ensayos adicionales están disponibles para aquellos de habilidades para determinar si un organismo procariótico tiene un ambiente de oxidación, intracelular.

Estos ensayos incluyen medición de la actividad de glutationa reductasa y estado redox de combinación de glutationa (Tuggle and Fuchs, J. Bacter. 162:448-450 (1985)), sensibilidad a oxidantes específicos de tiol en medio de crecimiento (Prinz et al., J. Biol. Chem. 272:15661-15667 (1997)), activación transcripcional del gen OxyR en E. coli , después de la exposición a peróxido de hidrógeno o diamida (Bessette et al , PNAS 96:13703-13708 (1999) , medición del estado redox de un gen reportero, tal como una proteína fluorescente verde sensible al redox, (rxYFP) (Ostergaard et al , J. Cell Biol. 166:337- 345 (2004)), detección de glutationa usando tintes sensibles a glutationa, tales como monoclorobimano, CellTracker Green CMFDA, o-ftaldialdehído, y naftalen-2, 3- dicarboxaldehído de por ejemplo, Molecular Probes, y oxidación de residuo de cisteína en proteínas después de la exposición de células a un reactivo sulfhidrilo-alquilación, tal como ácido 4-acetamido-4 ' - maleimidistibeno-2, 2-disulfónico (Jurado et al, J. Mol. Biol. 320: 1-10 (2002)).

B . Microorganismos procarióticos que tienen ambientes intracelulares de oxidación El método de la invención se lleva a cabo usando microorganismos procarióticos que tienen ambientes intracelulares oxidantes. Tales microorganismos incluyen microorganismos procarióticos que tienen ambientes de oxidación intracelular, endógenos, y microorganismos procarióticos que son genéticamente manipulados para tener un ambiente de oxidación intracelular. Algunos organismos procarióticos tienen ambientes de oxidación intracelular, endógena, y de este modo, promueven la formación de enlaces de disulfuro dentro de la célula. Los compartimientos intracelulares oxidantes en organismos procarióticos, específicamente excluyen un espacio periplásmico bacteriano. Los organismos procarióticos que tienen ambientes de oxidación intracelular, endógenos, pueden ser usados para producir glicosiltransferasa eucariótica activa, soluble, en un compartimiento intracelular, Los organismos procarióticos con ambientes de oxidación intracelular, endógenos, incluyen elementos de por ejemplo, especies de Pseudomonas, que incluyen testosteroni , putida , aeruginosa , syringae y fl uorescens; algunas bacterias gram positiva; y algunas bacterias gram negativa. Las especies y cepas de Pseudomonas adicionales se describen en por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. US 2005/0186666, publicada el 25 de Agosto de 2005, la cual está incorporada por referencia en este documento para todos los propósitos. La bacteria gram positiva incluye, por ejemplo, las especies de Bacill us, Listeria , Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, y Clostridium . Los organismos procarióticos con modificación de una trayectoria de redox, pueden también ser usados en los métodos de la invención, para producir glicosiltranferasa eucariótica activa, soluble o proteínas terapéuticas activas, solubles. Las modificaciones pueden ser realizadas en organismos procarióticos que tienen un ambiente de reducción, por ejemplo, E . coli u otras bacterias gram negativa o algunas bacterias gram positiva. Los organismos procarióticos son modificados para promover un ambiente intracelular de oxidación, con ello, mejorando la formación de enlace disulfuro intracelular y repliegue de la proteína de por ejemplo, glicosiltransferasa eucariótica. Muchos organismos procarióticos usan dos trayectorias para reducir los enlaces disulfuro que forman en algunas proteínas citoplásmicas, que incluyen, proteínas recombinantemente expresadas. Los componentes de estas trayectorias pueden ser manipulados para promover la formación de un ambiente de oxidación intracelular. La primera trayectoria es el sistema de tioredoxina, el cual en general, incluye una tioredoxina reductasa y tioredoxina. La tioredoxina reductasa mantiene la tioredoxina en un estado reducido. La segunda trayectoria es el sistema glutaredoxina, el cual en general, incluye una glutationa oxidoreductasa, glutationa y glutaredoxinas.

La inactivación de mutaciones de algunos componentes de estas trayectorias redox, puede finalmente, incrementar la formación de enlaces disulfuro en proteínas expresadas, y en el caso de proteínas heterólogas expresadas en el organismo procariótico, puede incrementar la solubilidad y actividad de las proteínas heterólogas expresadas. Por ejemplo, en la eliminación E . coli de actividad de tioredoxina reductasa resulta en una acumulación de tioredoxina oxidada que actúa como una oxidasa en el compartimiento intracelular. Algunos ejemplos preferidos son microorganismos procarióticos que tienen actividad reductasa reducida o ausente. Por ejemplo, la actividad de una tioredoxina reductasa y/o una glutationa oxidoreductasa, puede ser reducida o eliminada para modificar el ambiente intracelular, con ello, produciendo un ambiente intracelular de oxidación que favorece la formación de enlaces disulfuro. Por ejemplo, las cepas de E. coli que tienen mutaciones en tanto el gen tioredoxina reductasa { trxB) como el gen glutationa oxidoreductasa ( gor) , son capaces de expresar proteínas con niveles superiores de formación de enlaces disulfuro. Véase por ejemplo, Prinz et al . , J. Biol Chem 272:15661-15667 (1997). Estos mutantes dobles trxB gor, crecen muy lento en la mayoría del medio de crecimiento, aunque el crecimiento puede ser intensificado por adición de un reductor, tal como DTT. Sin embargo, las cepas de mutantes dobles, frecuentemente dan origen a cepas mutantes supresoras que retienen las mutaciones trxB gor y que crecen más rápido en el medio que carece de DTT. Un ejemplo de una mutación supresora trxB gor en E. coli, es una mutación del gen ahpC, el cual codifica una subunidad catalítica de alquil hidroperoxidasa, AhpCF. Esta mutación supresora agrega un tripleto al ADN que codifica el sitio catalítico de la enzima AhpCF. Las cepas E. coli de mutante doble de crecimiento rápido, por ejemplo, cepas trxB, gor, supp y trxB, gshA, supp, son descritas en la Patente Estadounidense No. 6,872,563, las cuales están incorporadas por referencia en este documento para todos los propósitos. Tales cepas de E. coli manipuladas, por ejemplo, cepas trxB, gor, supp, son comercialmente disponibles, por ejemplo, bajo los nombres comerciales ORIGAMI TM, ORIGAMI 2 TM y ROSETTA-GAMI TM, de por ejemplo, EMD Biosciences, Inc. Otras mutaciones de E. coli, pueden resultar en un ambiente intracelular oxidante, por ejemplo, cepas trxB, gshA y trxB, gshA supp. Otras manipulaciones de componentes de una trayectoria redox en un microorganismo, pueden ser usadas para mejorar la formación de enlaces disulfuro en una proteína, por ejemplo, una glicosiltransferasa eucariótica. Por ejemplo, proteínas con actividad oxidante, por ejemplo, proteínas de tioredoxina de E . col i en cepas mutantes trxB, gor, pueden ser sobre expresadas en el microorganismo procariótico. Otro ejemplo es la expresión o sobre expresión de mutantes de tioredoxina que tienen actividad oxidante intensificada. Ejemplos de tales mutantes son descritos en por ejemplo, Besette, et al . , PNAS 96:13703-13708 (1999). La expresión citoplásmica objetivo de ciertas enzimas oxidantes, puede también ser usada para mejorar la formación de enlaces disulfuro intracelulares. Por ejemplo, proteínas de oxidación que son típicamente expresadas en el espacio periplásmico, por ejemplo, DsbC, pueden ser expresadas en un citoplasma bacteriano, por ejemplo, suprimiendo una secuencia objetivo periplásmica o incluyendo una secuencia de retención citoplásmica. Otras proteínas periplásmicas oxidantes, pueden ser expresadas en el citoplasma bacteriano para mejorar la oxidación de proteínas citoplásmicas, por ejemplo, suprimiendo una secuencia objetivo periplásmica o incluyendo una secuencia de retención citoplásmica. Los ácidos nucleicos de tioredoxina reductasa, ácidos nucleicos de glutationa oxidoreductasa, ácidos nucleicos de tioredoxina, ácidos nucleicos de glutationa y ácidos nucleicos que codifican otras proteínas, involucradas en el mantenimiento de un ambiente redox intracelular, pueden ser identificados en otras bacterias, por ejemplo, Azotobacter sp . (por ejemplo, A . vinelandii) , Pseudomonas sp., Rhizobium sp . , Erwinía sp. , Escherichia sp . (por ejemplo., E . coli ) , Bacillus, Pseudomonas, Proteus , Salmonella , Serra tia , Shigella , Rhizobia , Vitreoscilla , Paracoccus, y Klebsiella sp. , entre muchas otras. Tales genes pueden ser identificados por análisis de secuencia y comparación con genes tioredoxina reductasa conocidos, genes glutationa oxidoreductasa y genes que codifican otras proteínas involucradas en el mantenimiento de un ambiente redox intracelular o a la secuencia de aminoácido de los productos codificados. Las proteínas codificadas, pueden además, ser identificadas funcionalmente por ensayos enzimáticos o por ensayos de complementación genética de mutantes de E. coli de una función de gen apropiado. Los genes endógenos de tioredoxina reductasa y glutationa oxidoreductasa, pueden ser por ejemplo, mutados para inactivar el producto del gen usando técnicas estándares de biología molecular y aquellas cepas mutadas también pueden ser usadas para expresar proteínas con niveles incrementados de formación de enlace disulfuro, comparadas con cepas no mutadas.

IV. EXPRESIÓN DE GLICOSILTRANSFERASAS EUCARIÓTICAS ACTIVAS, SOLUBLES, EN MICROORGANISMOS PROCARIÓTICOS QUE TIENEN AMBIENTES DE OXIDACIÓN Los polipéptidos glicosiltransferasa eucarióticos activos, solubles de la invención, pueden ser expresados en una variedad de microorganismos procarióticos con ambientes intracelulares de oxidación, que incluyen E. coli y otros hospederos bacterianos, como se describe anteriormente. Una vez expresado en un organismo procariótico que tiene un ambiente intracelular de oxidación, los polipéptidos glicosiltransferasa eucarióticos activos, solubles, pueden ser usados para producir productos glicosilados. Por ejemplo, los polipéptidos glicosiltransferasa eucarióticos activos, solubles, pueden ser aislados usando técnicas estándares de purificación de proteína y usados en reacciones in vi tro descritas en este documento, para elaborar productos glicosilados. Los polipéptidos glicosiltransferasa eucarióticos activos, solubles, parcialmente purificados, también pueden ser usados en reacciones in vi tro para elaborar productos glicosílados, como pueden ser organismos procarióticos permeabilizados que expresan los polipéptidos glicosiltransferasa eucarióticos activos, solubles. Típicamente, el polinucleótido que codifica el polipéptido glicosiltransferasa eucariótico, es colocado bajo el control de un promotor que es funcional en los organismos procarióticos deseados que tienen un ambiente oxidante. Una variedad extremadamente amplia de promotores son bien conocidos, y pueden ser usados en los vectores de expresión de la invención, dependiendo de la aplicación particular. Ordinariamente, el promotor seleccionado, depende de la célula en la cual el promotor es activo. Otras secuencias de control de expresión, tales como sitios de enlace al ribosoma, sitios de terminación de transcripción y similares, también están opcionalmente incluidos. Constructos que incluyen una o más de estas secuencias de control son llamados "casetes de expresión". Por consiguiente, la invención proporciona casetes de expresión en los cuales, los ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión están incorporados para expresión de alto nivel en un microorganismo deseado que tiene un ambiente oxidante. Las secuencias de control de expresión que son adecuadas para uso en una célula hospedera particular, son a menudo obtenidas clonando un gen que es expresado en tal célula. Las secuencias de control procarióticas comúnmente usadas, las cuales son definidas en este documento para incluir promotores para iniciación de la transcripción, opcionalmente con un operador, junto con secuencias de sitio de enlace al ribosoma, incluyen tales promotores comúnmente usados como el sistema de promotor beta- lactamasa (penicilinasa) y lactosa ( lac) (Change et al, Na ture (1977) 198: 1056), el sistema promotor de triptofano ( trp) (Goeddel et al , Nucleic Acids Res . (1980) 8: 4057), el promoter tac (DeBoer, et al , Proc . Na tl . Acad. Sd. U. S . A. (1983) 80:21-25); y el promotor derivado de lambda PL y el sitio de enlace al ribosoma del gen N (Shimatake et al , Na ture (1981) 292: 128). El sistema promotor particular no es crítico a la invención, puede ser usado cualquier promotor disponible que funciona en procariotas. Para expresión de polipéptidos glicosiltransferasa eucarióticos activos, solubles, en células procarióticas distintas de E . coli , se requiere un promotor que funciona en las especies procarióticas particulares. Tales promotores se pueden obtener a partir de genes que han sido clonados a partir de las especies, o se pueden usar promotores heterólogos. Por ejemplo, el promotor trp-lac híbrido, funciona en Bacill us, en adición a E. coli . Los promotores son conocidos para otras especies bacterianas, por ejemplo, Pseudomonas . Véase por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. US 2005/0186666, publicada el 25 de Agosto de 2005, la cual está en este documento incorporada por referencia para todos los propósitos. Un sitio de enlace al ribosoma (RBS) , es convenientemente incluido en el cásete de expresión de la invención. Un RBS en E. coli , por ejemplo, consiste de una secuencia de nucleótidos de 3-9 nucleótidos de longitud localizado 3-11 nucleótidos corriente arriba del codón de iniciación (Shine and Dalgarno, Na ture (1975) 254: 34; Steitz, In Biological regula tion and development : Gene expression (ed. R.F. Goldberger) , vol. 1, p. 349, 1979, Plenum Publishing, NY) . Cualquiera de los promotores constitutivos o regulados puede ser usado en la presente invención. Los promotores regulados pueden ser ventajosos debido a que las células hospederas pueden crecer a densidades altas antes de que sea inducida la expresión de las proteínas de fusión. La expresión de alto nivel de proteínas heterólogas disminuye el crecimiento celular en algunas situaciones y puede no ser deseada en todas las situaciones, véase abajo. Un promotor inducible es un promotor que dirige la expresión de un gen en donde el nivel de expresión es alterable por factores ambientales o de desarrollo, tales como, por ejemplo, temperatura, pH, condiciones anaeróbicas o aeróbicas, luz, factores de transcripción y químicos. Tales promotores son referidos en este documento como promotores "inducibles", los cuales permiten controlar la sincronización de la expresión de la glicosiltransferasa o enzima involucrada en la síntesis de azúcar del nucleótido. Para E. col i y otras células hospederas bacterianas, los promotores inducibles son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, el promotor lac, el promotor PL lambda del bacteriófago, el promotor trp-lac híbrido (Amann et al . (1983) Gene 25: 167; de Boer et al . (1983) Proc . Na t ' l Acad. Sci . USA 80 : 21), y el promotor T7 bacteriófago (Studier et al . (1986) J. Mol . Biol . ; Tabor et al . (1985) Proc . Na t 'l . Acad. Sic . USA 82: 1074-8) . Estos promotores y sus usos, se discuten en Sambrook et al . , supra . Un promotor inducible particularmente preferido para expresión en procariotas, es un promotor dual que incluye un componente de promotor lac ligado a un componente promotor obtenido a partir de un gen o genes que codifican las enzimas involucradas en el metabolismo de galactosa (por ejemplo, un promotor a partir de un gen UDPgalactosa 4-epimerasa ( galE) ) . El promotor dual tac-gal , el cual se describe en la Solicitud de Patente PCT No. W098. Otro promotor inducible es el promotor cspA, el cual es altamente inducible a bajas temperaturas en E. coli . Véase por ejemplo, Sorensen and Mortensen, BíoMed Central , www.microbialcellfactories . com/content/4/1/1 y Mujacic et al. Gene 238:325-3332 (1999). Un constructo que incluye un polinucleótido de interés operablemente ligado a las señales de control de expresión del gen que, cuando se coloca en una célula hospedera apropiada, acciona la expresión del polinucleótido, es llamado un "cásete de expresión". Los casetes de expresión que codifican las proteínas de fusión de la invención, son a menudo colocados en los vectores de expresión para introducción en la célula hospedera. Los vectores típicamente incluyen, además de un cásete de expresión, una secuencia de ácido/o nucleico que permite al vector, replicarse independientemente en una o más células hospederas seleccionadas. En general, esta secuencia es una que permite al vector, replicarse independientemente del ADN del cromosoma hospedero, e incluye orígenes de replicación de secuencias autónomamente replicantes. Tales secuencias son bien conocidas por una variedad de bacterias. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322, es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas. Alternativamente, el vector puede replicarse llegando a ser integrado en el complemento genómico de la célula hospedera y siendo replicado como la célula que se somete a replicación de ADN. Un vector de expresión preferido para expresión de la enzima que está en las células bacterianas es pTGK, el cual incluye un promotor tac-gal dual y se describe en la Publicación de Solicitud de Patente PCT No. WO98/20111. Otro vector de clonación útil es pCWin2-MBP o una versión de pCWin2 con una 5' UTR modificada. Véase por ejemplo, PCT/US05/00302, presentada el 6 de Enero de 2005, la cual está incorporada en este documento por referencia para todos los propósitos. La construcción de constructos de polinucleótidos en general, requiere del uso de vectores capaces de replicarse en la bacteria. Una plétora de kits son comercialmente disponibles para la purificación de plásmidos de bacterias (véase por ejemplo, EasyPrepJ, FlexiPrepJ, ambos de Pharmacia Biotech; StrataCleanJ, de Stratagene; y, QIAexpress Expression System, Qiagen) . Los plásmidos purificados y aislados, pueden entonces además, ser manipulados para producir otros plásmidos, y usados para transfectar células. La clonación en por ejemplo, E . coli, Spreptomyces o Bacill us es posible. Los marcadores seleccionables son a menudo, incorporados en los vectores de expresión usados para expresar los polinucleótidos de la invención. Estos genes pueden codificar un producto de gen, tal como una proteína, necesarios para la supervivencia o crecimiento de células hospederas transformadas que crecen en un medio de cultivo selectivo. Las células hospederas no transformadas con el vector que contiene el gen de selección, no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, tales como ampicilina, neomicina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Alternativamente, los marcadores seleccionables pueden codificar proteínas que complementan las deficiencias auxotróficas o suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos, por ejemplo, el gen, que codifica D-alanina racemasa para Bacilos. A menudo, los vectores tendrán un marcador seleccionable que es funcional en, por ejemplo, E . col i u otras células en las cuales el vector es replicado antes de ser introducido en la célula hospedera. Un número de marcadores seleccionables se conocen por aquellos expertos en la técnica, y se describen por ejemplo, en Sambrook et al . , supra . Un sistema de expresión auxotrófico se conoce para especies de Pseudomonas . Véase por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. US 2005/0186666, publicada el 25 de Agosto de 2005, la cual es incorporada en este documento por referencia para todos los propósitos. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes listados anteriormente, emplea técnicas de ligación estándar como se describe en las referencias citadas anteriormente. Los fragmentos de ADN o plásmidos aislados, son desdoblados, ajustados y re-ligados en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos. Para confirmar secuencias correctas en plásmidos construidos, los plásmidos pueden ser analizados por técnicas estándares tales como por digestión de endonucleasa de restricción y/o análisis de secuencia de conformidad con métodos conocidos. Las técnicas de clonación molecular para lograr estos términos son conocidas en la técnica. Una amplia variedad de métodos de amplificación y clonación in vi tro, adecuados para la construcción de ácidos nucleicos recombinantes, es bien conocida por las personas de habilidad. Ejemplos de estas técnicas e instrucciones suficientes para dirigir a personas de habilidad a través de muchos ejercicios de clonación, se encuentran en Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques , Methods in Enzymology, Volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al . , eds., Curren t Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement) (Ausubel). Una variedad de vectores comunes adecuados para uso como materiales de partida para construir los vectores de expresión de la invención, es bien conocida en la técnica. Para clonación en bacterias, vectores comunes incluyen vectores derivados de pBR322, tal como vectores derivados de pBLUESCRIPT™, y ?-fago. Los métodos para introducir los vectores de expresión en microorganismos procarióticos elegidos, no son particularmente críticos, y tales métodos son bien conocidos por aquellos de habilidad en la técnica. Por ejemplo, los vectores de expresión pueden ser introducidos en células procarióticas, que incluyen E. col i , por transformación de cloruro de calcio, y en células eucarióticas por tratamiento de fosfato de calcio o electroporación. Otros métodos de transformación son también adecuados . El acoplamiento traduccional puede ser usado para mejorar la expresión. La estrategia usa una estructura lectora abierta corriente arriba corta, derivada del gen nativo altamente expresado al sistema traduccional, el cual es colocado corriente abajo del promotor, y un sitio de enlace al ribosoma seguido después de algunos codones de aminoácido por un codón de terminación. Solo antes del codón de terminación, está un segundo sitio de enlace al ribosoma, y después el codón de terminación es un codón de inicio para el inicio de la traducción. El sistema disuelve la estructura secundaria en el ARN, permitiendo la iniciación eficiente de la traducción. Véase, Squires, et al . (1988), J. Biol . Chem . 263: 16297-16302. Los polipéptidos glicosiltransferasa eucarióticos activos, solubles, son preferiblemente expresados intracelularmente . La expresión intracelular a menudo resulta en rendimientos altamente sorprendentes. Si es necesario, la cantidad de proteína activa, soluble, puede ser incrementada realizando procedimientos de repliegues (véase por ejemplo, Sambrook et al , supra . ; Marston et al , Bio/Technology (1984) 2:800; Schoner et al . , Bio/Technology (1985) 3:151. En otra modalidad, las proteínas glicosiltransferasa eucarióticas activas, solubles, son fusionadas a una subsecuencia de proteína A, una proteína de enlace a maltosa, una proteína de enlace al almidón, o albúmina de suero bovino (BSA) , por ejemplo, para facilitar la purificación, secreción o estabilidad. Los polipéptidos glicosiltransferasa eucarióticos activos, solubles de la invención, pueden también, ser ligados a otras proteínas bacterianas. Este procedimiento a menudo, resulta en altos rendimientos, debido a que las secuencias de control procarióticas normales dirigen la transcripción y traducción. En E . coli , las fusiones lacZ son a menudo usadas para expresar proteínas heterólogas. Otros ejemplos se discuten abajo. Los vectores adecuados son fácilmente disponibles, tales como las series pUR, pEX, y pMRlOO (véase por ejemplo, Sambrook et al . , supra ) . Para ciertas aplicaciones, puede ser deseable desdoblar los aminoácidos no glicosiltransferasa a partir de la proteína de fusión después de la purificación. Esto puede ser realizado por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica, que incluyen, desdoblamiento por bromuro de cianógeno, una proteasa, o por el Factor Xa (véase por ejemplo, Sambrook et al . , supra; Itakura et al , Science (1977) 198: 1056; Goeddel et al . , Proc . Na tl . Acad . Sic . USA (1979) 76: 106; Nagai et al . , Na ture (1984) 309: 810; Sung et al . , Proc . Na tl . Acad. Sic . USA (1986) 83: 561). Los sitios de desdoblamiento pueden ser diseñados por ingeniería en el gen para la proteína de fusión en el punto deseado de desdoblamiento. Más de una proteína recombinante puede ser expresada en una célula hospedera única, colocando múltiples casetes transcripcionales en un vector de expresión único, o utilizando marcadores seleccionables diferentes para cada uno de los vectores de expresión, los cuales son empleados en la estrategia de clonación. Por ejemplo, glicosiltransferasas múltiples pueden ser expresadas en una célula única, por ejemplo, glicosiltransferasas que dirigen la glicosilación N-ligada o glícosiltransferasas que dirigen la glicosilación 0-ligada. Un sistema adecuado para obtener proteínas recombinantes a partir de E . col i , el cual mantiene la integridad de sus N-términos, ha sido descrito por Miller et al . Biotechnology 7:698-704 (1989). En este sistema, el gen de interés es producido como una fusión C-terminal a los primeros 76 residuos del gen ubiquitina de levadura que contiene un sitio de desdoblamiento de peptidasa. El desdoblamiento en la unión de las dos porciones resulta en la producción de una proteína que tiene un residuo N- terminal auténtico intacto.

V. PURIFICACIÓN DE GLICOSILTRANSFERASAS EUCARIOTICAS ACTIVAS, SOLUBLES Los polipéptidos glicosiltransferasa eucarióticos activos, solubles, de la presente invención, son preferiblemente expresados como proteínas intracelulares y pueden ser usados en esta forma, en los métodos de la presente invención. Por ejemplo, las células permeabilizadas o un extracto celular crudo que contiene el polipéptido glicosiltransferasa eucariótico activo, soluble, intracelular expresado, puede ser usado en los métodos de la presente invención. Alternativamente, el polipéptido de glicosiltransferasa eucariótico activo, soluble, puede ser purificado de conformidad con procedimientos estándares de la técnica, que incluyen, precipitación de sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía de columna, electroforesis de gel y similares (véase, en general, R. Scopes, Protein Purifica tion, Springer-Verlag, N. Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182 : Guide to Protein Purifica tion . , Academic Press, Inc. N. Y. (1990)). Las composiciones sustancialmente puras de al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90% de homogenidad, son preferidas, y 92, 95, 98 a 99% o más homogenidad, son más preferidas. Las proteínas purificadas pueden también ser usadas, por ejemplo, como inmunógenos para la producción de anticuerpos. Para facilitar la purificación y expresión de los polipéptidos glicosiltranferasa eucarióticos activos, solubles, de la invención, los ácidos nucleicos que codifican las proteínas, también pueden incluir una secuencia de codificación para un epítope o "etiqueta" para la cual, un reactivo de enlace de afinidad está disponible, es decir, una etiqueta de purificación. Ejemplos de epítopes adecuados incluyen, los genes reporteros myc y V-5; vectores de expresión empleados para producción recombinante de proteínas de fusión que tienen estos epítopes, son comercialmente disponibles (por ejemplo, vectores de Invitrogen (Carlsbad CA) pcADN3.1/Myc-His y pcADN3.1/V5-His, son adecuados para expresión en células de mamífero) . Los vectores de expresión adicionales adecuados para unirse a una etiqueta de las glicosiltransferasas de la invención, y sistemas de detección correspondientes, son conocidos por aquellos de habilidad en la técnica, y varios son comercialmente disponibles (por ejemplo, "FLAG" (Kodak, Rochester NY) . Otro ejemplo de una etiqueta adecuada es una secuencia de polihistidina, la cual es capaz de enlazarse a los ligandos de afinidad de quelatos metálicos. Típicamente, seis histidinas adyacentes (SEC ID NO: 204) son usadas, aunque una puede usar más o menos de seis. Los ligandos de afinidad de quelatos metálicos adecuados que pueden servir como la porción enlazante para una etiqueta de polihistidina incluyen, ácido nitrilo-tri-acético (NTA) (Hochuli, E. (1990) "Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents" In Genetic Engineering: Principies and Methods, J.K. Setlow, Ed., Plenum Press, NY; commercially available from Qiagen (Santa Clarita, CA) ) . Otras etiquetas de epítopes o purificación incluyen por ejemplo, AU1, AU5, DDDDK (SEC ID NO:202), (EC5) , etiqueta E, etiqueta E2, Glu-Glu, un péptido de 6 residuos, EYMPME (SEC ID NO:203), derivada de la proteína T media del Polioma, HA, HSV, IRS, KT3, etiqueta S, etiqueta SI, etiqueta T7, etiqueta V5, VSV-G, ß-galactosidasa, Gal4, proteína fluorescente verde (GFP) , luciferasa, proteína C, proteína A, proteína de enlace a celulosa, GST (glutationa S-transferasa) , una etiqueta de etapas, Nus-S, PPI-ases, Pfg 27, proteína de enlace a calmodulina, dsb A y fragmentos de las mismas, y granzima B. Los péptidos epítopes y anticuerpos que se enlazan específicamente a las secuencias epítopes, son comercialmente disponibles de por ejemplo, Covance Research Products, Inc.; Bethyl Laboratories, Inc.; Abeam Ltd.; and Novus Biologicals, Inc. Las etiquetas de purificación también incluyen dominios de enlace a maltosa y dominios de enlace al almidón. Las proteínas que comprenden etiquetas de purificación, pueden ser purificadas usando un asociado de enlace que se enlaza a la etiqueta de purificación, por ejemplo, anticuerpos a la etiqueta de purificación, iones o resinas de níquel o cobalto, y amilosa, maltosa o una ciclodextrina. Las etiquetas de purificación también incluyen dominios de enlace al almidón, dominios de tioredoxina de E. coli (vectores y anticuerpos comercialmente disponibles de por ejemplo, Santa Cruz Bioptechnology, Inc., and Alpha Diagnostic International, Inc.), y la mitad carboxi-terminal de la proteina SUMO (vectores y anticuerpos comercialmente disponibles de por ejemplo, Life Sensores, Inc.). Los dominios de enlace al almidón, tales como el dominio de enlace a maltosa de E. coli y SBD (dominio de enlace al almidón) de una amilasa de A. niger, son descritos en el documento WO 99/15636, aquí incorporada por referencia. La purificación de afinidad de una proteína de fusión que comprende un dominio de enlace al almidón usando una resina derivada de betaciclodextrina (BCD) , se describe en el documento WO 2005/014779, publicada el 17 de Febrero de 2005, aquí incorporada por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, un polipéptido glicosiltransferasa eucariótico activo, soluble, comprende más de una etiqueta de epítope o purificación. Otros haptenos que son adecuados para uso como etiquetas, se conocen por aquellos de habilidad en la técnica, y se describen por ejemplo, en Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR) . Por ejemplo, dinitrofenol (DNP) , digoxigenina, barbituratos (véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,414,085), y varios tipos de fluoróforos, son empleados como haptenos, como derivados de estos compuestos. Los kits son comercialmente disponibles para enlazar haptenos y otras porciones a proteínas y otras moléculas. Por ejemplo, en donde el hapteno incluye un tiol, un enlazador heterobifuncional tal como SMCC, pueden ser usados para unir etiqueta a los residuos lisina presentes en el reactivo de captura. Uno de habilidades en la técnica podrá reconocer que se pueden hacer modificaciones a los dominios catalíticos o funcionales del polipéptido glicosiltransferasa eucariótico activo, soluble, sin disminuir su función biológica. Algunas modificaciones se pueden hacer para facilitar la clonación, expresión o incorporación del dominio catalítico en una proteína de fusión. Tales modificaciones son bien conocidas por aquellos de habilidad en la técnica e incluyen, por ejemplo, la adición de codones en cualquiera de los términos del polinucleótido que codifica el dominio catalítico para proporcionar, por ejemplo, una metionina agregada al término amino, para proporcionar un sitio de iniciación, o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poli His), colocados en cualquiera de los términos para crear sitios de enzimas de restricción convenientemente localizadas o codones de terminación o secuencias de purificación. En modalidades preferidas, la purificación de glicosiltransferasas eucarióticas, es simplificada por la expresión de las proteínas en microorganismos que tienen ambientes de oxidación. Debido a que la solubilidad de las proteínas expresadas es mejorada, las etapas de purificación que consumen tiempo, tales como solubilización, desnaturalización y repliegue, pueden ser omitidas a partir de un protocolo de purificación. Las glicosiltransferasas eucarióticas producidas por los métodos de la invención pueden ser usadas para producir productos de péptidos glicosilados y proteínas glicosiladas. Los productos de péptidos glicosilados y proteínas glicosiladas, pueden también ser purificados, si se desea por el usuario, con cualquiera de los métodos de purificación de proteína descritos en este documento.

VI. MEJORAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SOLUBILIZACIÓN DE PROTEÍNA La reducción de enlaces disulfuro en proteínas heterólogamente expresadas, tal como los polipéptidos glicosiltransferasa eucarióticos usados en los métodos de la invención, frecuentemente resulta en plegamiento alterado de proteínas y precipitación de la solución. En células bacterianas tales como por ejemplo, E. coli , las proteínas de plegamiento alterado son expresadas como cuerpos de inclusión insolubles. La solubilización de una proteína es en general, indicada por la presencia de la proteína en una fracción acuosa, después de la centrifugación a una velocidad apropiada por un periodo apropiado. Además, la expresión de proteínas apropiadamente plegadas resulta en niveles incrementados de actividad de proteina. De este modo, ensayos de actividad enzimática pueden también ser usados para determinar si ha ocurrido un plegado de proteina apropiado. La solubilización de un polipéptido glicosiltransferasa eucariótico expresado en un microorganismo con un ambiente de oxidación, puede ser comparada con la solubilización de un polipéptido glicosiltransferasa eucariótico expresado en un microorganismo con un ambiente de reducción, por ejemplo, una cepa E . coli , con un ambiente de reducción. En algunas modalidades, un polipéptido glicosiltransferasa eucariótico expresado en un microorganismo con un ambiente de oxidación, es expresado en una fracción soluble a niveles que son hasta 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 500, 1000 o hasta 10,000 veces mayor que los niveles solubles del mismo polipéptido glicosiltransferasa eucariótico expresado en un microorganismo con un ambiente de reducción. En otras modalidades, un polipéptido glicosiltransferasa eucariótico expresado en un microorganismo con un ambiente de oxidación, tiene niveles de actividad por ejemplo, U/célula o U/mg de proteína, hasta 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 500, 1000 o hasta 10,000 veces mayor que los niveles de actividad del mismo polipéptido glicosiltransferasa eucariótico expresado en un microorganismo con un ambiente de reducción.

A . Caracterización de solubilidad de proteína En modalidades preferidas, las glicosiltransferasa eucarióticas, son expresadas como proteínas solubles intracelularmente dentro de un microorganismo procariótico. La solubilidad de polipéptidos glicosiltransferasa eucarióticos, puede ser determinada como se describe anteriormente, determinando los niveles de proteina en una fracción acuosa después de la centrifugación a una velocidad apropiada por un periodo apropiado. Los niveles de proteína pueden ser determinados usando métodos conocidos por aquellos de habilidad en la técnica, por ejemplo, inmunoensayos o comparación directa de proteínas separadas mediante por ejemplo, SDS-PAGE. Los inmunoensayos pueden ser realizados usando anticuerpos específicos para el polipéptido glicosiltransferasa eucariótico de interés o usando anticuerpos específicos para un epítope o etiqueta de purificación, que está covalentemente ligada al polipéptido glicosiltransferasa eucariótico. La solubilidad puede también ser determinada ensayando la actividad enzimática de los polipéptidos glicosiltranferasa eucarióticos en una fracción soluble de un microorganismo procariótico. En una modalidad preferida, la actividad de glicosiltransferasa es medible en una fracción intracelular soluble a partir de un microorganismo procariótico . Los polipéptidos glicosiltranferasa eucarióticos pueden ser usados para hacer productos glicosilados en mezclas de reacción in vitro, que incluyen por ejemplo, oligosacáridos, glicolípidos, glicoproteinas y glicopéptidos. Las mezclas de reacción in vi tro, pueden incluir microorganismos permeabilizados que comprenden, los polipéptidos glicosiltranferasa eucarióticos, polipéptidos glicosiltransferasa eucarióticos parcialmente purificados, o polipéptidos glicosiltransferasa eucarióticos purificados; así como también sustratos donadores, sustratos aceptores, y amortiguadores de reacción apropiados. Para reacciones in vitro, los polipéptidos glicosiltranferasa eucarióticos, sustratos aceptores, sustratos donadores y otros ingredientes de mezcla de reacción, son combinados mezclando en un medio de reacción acuoso. El medio en general, tiene un valor de pH de aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 9.0. La selección de un medio se basa en la capacidad del medio para mantener un valor de pH al nivel deseado. De este modo, en algunas modalidades, el medio es amortiguado a un valor de pH de aproximadamente 7.5. Si un amortiguador no se usa, el pH del medio debe mantenerse a un valor de aproximadamente 5 a 8.5, dependiendo del glicosiltransferasa particular usado. Por ejemplo, sialiltransferasa, el intervalo es preferiblemente desde aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 8.0. Las cantidades de enzima o concentraciones, son expresadas en unidades de actividad, lo cual es una medida de la relación inicial del catalizador. Una unidad de actividad cataliza la formación de 1 µmol de producto por minuto, a una temperatura dada (típicamente 37°C) y un valor de pH (típicamente 7.5) . De este modo, 10 unidades de una enzima, es una cantidad catalítica de la enzima en donde 10 µmol del sustrato son convertidos a 10 µmol de producto en un minuto, a una temperatura de 37°C y un valor de pH de 7.5.

La mezcla de reacción puede incluir cationes de metales divalentes (Mg2+, Mn2+) . El medio de reacción puede también comprender detergentes solubilizantes (por ejemplo, Tritón o SDS) , o solventes orgánicos tales como metanol o etanol, si es necesario. Las enzimas pueden ser utilizadas libres en solución, o pueden ser unidas a un soporte tal como un polímero. La mezcla de reacción es de este modo, sustancialmente homogénea al comienzo, aunque algún precipitado puede formarse durante la reacción. La temperatura en la cual el proceso anterior se lleva a cabo, puede variar desde solo arriba del congelamiento, a la temperatura en la cual la enzima más sensible desnaturaliza. Tal intervalo de temperatura es preferiblemente aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 45°C, y más preferiblemente, a aproximadamente 20°C, hasta aproximadamente 37°C. La mezcla de reacción así formada, se mantiene por un periodo de tiempo suficiente para obtener el rendimiento elevado deseado de determinantes de oligosacáridos deseados, presentes en los grupos de oligosacáridos unidos a la glicoproteína a ser glicosilada. Para preparaciones a escala comercial, la reacción a menudo, permitirá proceder por entre aproximadamente 0.5- 240 horas, y más típicamente, entre aproximadamente 1-36 horas.

B . Mejoramiento de sol ubilidad de proteína Puede ocurrir el mejoramiento adicional de la solubilidad de polipéptidos glicosiltransferasa eucarióticos, por ejemplo, reduciendo la velocidad de expresión de la proteína o expresando la proteína en combinación con, por ejemplo, una proteina chaperona. El mejoramiento de la velocidad de formación de enlaces disulfuro apropiados, puede conducir a expresión superior de glicosiltransferasas solubles activas. Otro método para mejorar la expresión de glicosiltransferasas solubles, es reducir la velocidad de expresión, con ello, permitiendo al polipéptido nascente más veces para lograr una conformación soluble, estable. La combinación de los dos métodos, como se describe en este documento, es una modalidad preferida de la invención. La expresión máxima de una proteína heteróloga en general, ocurre bajo condiciones de crecimiento óptimas para las células hospederas. Un método para disminuir la expresión de proteínas es disminuir la velocidad de crecimiento de las células. En una modalidad preferida, las células hospederas se hacen crecer a una temperatura por debajo de su temperatura de crecimiento óptima. Por ejemplo, la temperatura de crecimiento óptima de E. col i es 37°C. Por lo tanto, una temperatura menor que la temperatura de crecimiento óptima para E. coli , es menor de 37°C, por ejemplo, entre 4°C y 36°C, entre 8°C y 33°C, entre 12°C y 30°C, o entre 18°C y 26°C, o aproximadamente 20°C, o aproximadamente 24°C. La temperatura usada para disminuir la producción de proteína, dependerá de la temperatura de crecimiento óptima de las células hospederas. Como un ejemplo, E. col i y muchas otras bacterias tienen una temperatura de crecimiento óptima de 37 °C. De este modo, una temperatura inferior que una temperatura de crecimiento óptima para E . col i , u otra bacteria que crece óptimamente a 37°C, podría ser entre 4-35°C, entre 12-30°C, o entre 15-20°C. En una modalidad preferida, la temperatura inferior que una temperatura de crecimiento óptima para E . coli o para otra bacteria que crece óptimamente a 37°C es entre 18 y 23°C. Para células que crecen óptimamente a 30°C, como lo hacen muchas levaduras, una temperatura inferior que una temperatura de crecimiento óptima podría ser entre 10 y 25°C, entre 12 y 21°C, o entre 15 y 20°C. Otro método para reducir la velocidad de expresión de una proteína heteróloga, es variar la concentración de una molécula que regula la expresión de un promotor inducible. Por ejemplo, algunas mutaciones lacY permiten a la expresión de proteína, ser controlada variando la cantidad de IPTG, la molécula inductora, en el medio. En modalidades preferidas, la concentración de IPTG en el medio es menor que la óptima, por ejemplo, la expresión de una proteina que no forma cuerpos de inclusión cuando se sobre expresa en un microorganismo procariótico. En algunas modalidades, un polipéptido glicosiltransferasa eucariótico es expresado en un microorganismo que tiene un ambiente de oxidación y que además comprende una proteína chaperona heteróloga. Las proteínas chaperonas incluyen, por ejemplo, factor de activación; elementos de la familia chaperona Hsp70, por ejemplo, DnaK; elementos de la familia chaperona HsplOO, por ejemplo, ClpB, y elementos de la familia chaperona Hsp60, por ejemplo, GroEL. Véase por ejemplo, Sorensen and Mortensen, BioMed Central, www.microbialcellfactories . com/content/4/1/1. Las chaperonas también se conoce que permiten el pliegue de proteina a 4°C por ejemplo, Cpn60 y Cpn 10, de Oleispira antartica RB8T. Véase, por ejemplo, Id. and Ferrer et al . , Na t . Biotechnol . 21:1266-1267 (2003). Proteínas chaperoninas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aquellas listadas en el listado de secuencia informal adjunto. En otras modalidades, un polipéptido glicosiltransferasa eucariótico, es expresado en un microorganismo que tiene un ambiente de oxidación que además comprende una isomerasa de disulfuro de proteína heteróloga (PDI) . Las proteínas PDI puede hacer o intercambiar enlaces disulfuro. Las proteínas PDI son descritas por ejemplo, en Georgiou et al . U.S. Patent No. 6,027,888, la cual está en este documento, incorporada por referencia para todos los propósitos. Las proteínas PDI incluyen por ejemplo, proteínas PDI de hígado de rata, Ero lp y Pdi lp de Sacchromyces . Las proteínas procarióticas incluyen por ejemplo, DsbC de E. coli . Véase por ejemplo, Frand et al . , Trends in Cell Biol . 10:203-210 (2000). En algunas modalidades, DsbC son expresadas en un citoplasma bacteriano por ejemplo, suprimiendo una secuencia objetivo periplásmica o que incluye, una secuencia de retención citoplásmica . Otras proteínas procarióticas que actúan para mantener el estado redox de enlaces de disulfuro de proteina incluyen, por ejemplo, DsbB, DsbA, DsbC, DsbD y DsbG de E . col i . Estas proteínas son bien conocidas en la técnica y se describen en por ejemplo, Beckwith et al . , Patente Estadounidense No. 6,872,563, la cual está en este documento incorporada por referencia para todos los propósitos. En algunas modalidades, DsbB, DsbA, DsbC, DsbD y DsbG, son expresados en el citoplasma bacteriano para mejorar la oxidación de proteínas citoplásmica, por ejemplo, suprimiendo una secuencia objetivo periplásmica o que incluye una secuencia de retención citoplásmica. En una modalidad adicional, un polipéptido glicosiltransferasa eucariótico, es expresado en un microorganismo procariótico que tiene un ambiente de oxidación y que también comprende una proteína chaperona heteróloga y/o una proteína PDI heteróloga o una proteína tal como DsbB, DsbA, DsbC, DsbC, y DsbG de E . col i .

C. Expresión de glicosil transf erasa eucariótica truncada , activa , en microorganismos procarioticos que tienen ambientes de reducción Inesperadamente, algunas de las glicosiltranferasa eucarióticas truncadas, tienen actividad en organismos procarióticos con ambientes intracelulares de reducción. La actividad en un ambiente intracelular de reducción fue típicamente mucho menor que la actividad de la misma proteína en un organismo procariótico que tiene un ambiente mtracelular de oxidación. En algunas modalidades, las glicosiltransferasas eucarióticas truncadas son fusionadas a, por ejemplo, un dominio de enlace a maltosa, o un dominio de enlace al almidón, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la Tabla 4 muestra que una proteína GnTl truncada de tipo nativo fusionada a MBP, tiene 1.7 U/litro de actividad. Por el contrario, la misma proteina tiene 45 U/litro de actividad cuando se expresa en mutantes trxB, gor, supp, de E . coli . Otras pruebas de glicosiltransferasa parecen no tener actividad en el ambiente de reducción de las células JM109. Por lo tanto, en una modalidad, la invención incluye métodos para producir una glicosiltransferasa activa, soluble, truncada, en un microorganismo que tiene un ambiente de reducción, por ejemplo, E . coli . En modalidades preferidas, la glicosiltransferasa es GnTl.

VII. USO DE GLICOSILTRANSFERASAS EUCARIÓTICAS SOLUBLES PRODUCIDAS POR MICROORGANISMOS PROCARIÓTICOS CON AMBIENTES DE OXIDACIÓN La invención proporciona métodos para producir glicosiltransferasas eucarióticas, solubles, en microorganismos procarióticos, preferiblemente en una escala comercial. Las glicosiltransferasas eucarióticas solubles, son entonces usadas para sintetizar enzimáticamente, glicoproteinas, glicolípidos, y porciones de oligosacáridos, y glicoproteinas glicoPEGiladas o glicopéptidos, que incluyen proteínas terapéuticas, también preferiblemente, en una escala comercial. Las reacciones enzimáticas de la invención, toman lugar en un medio de reacción que comprende al menos, un sustrato aceptor, glicosiltransferasa eucariótica, soluble, y sustrato donador, y típicamente, un catión de metal divalente soluble. En algunas modalidades, las enzimas accesorias y sustratos para la porción catalítica de la enzima accesoria, también están presentes, de manera que las enzimas accesorias pueden sintetizar el sustrato donador para la glicosiltransferasa. Las proteínas glicosiltransferasa eucarióticas, solubles, catalizan la adición de un sacárido a un sustrato aceptor, por ejemplo, una proteína terapéutica activa soluble. Se conoce un número de métodos para usar glicosiltransferasas para sintetizar glicoproteínas y glicolípidos que tienen porciones de oligosacáridos deseados. Métodos ejemplares se describen, por ejemplo, en el documento WO 96/32491, Ito et al . , (1993) Puré Appl . Chem . 65: 753, y Patente Estadounidense US 5,352,670, 5,374,541, y 5,545,553. Las proteínas glicosiltransferasa eucarióticas, solubles, preparadas como se describe en este documento, pueden ser usadas en combinación con glicosiltransferasas adicionales. Por ejemplo, se puede usar una combinación de proteína glicosiltransferasa eucariótica soluble, y una glicosiltransferasa bacteriana. De manera similar, las proteínas glicosiltransferasa eucariótica, solubles, pueden ser usadas con enzimas accesorias recombinantes, las cuales pueden o no pueden ser fusionadas a las proteínas glicosiltransferasas eucarióticas, solubles. Los productos producidos por los procesos anteriores, pueden ser usados con o sin purificación adicional. En algunas modalidades, son producidos oligosacáridos. Las técnicas estándares, bien conocidas, por ejemplo, cromatografia de capa delgada o gruesa, cromatografia de intercambio iónico, o filtración de membrana, pueden ser usadas para la recuperación de sacáridos glicosilados. También, por ejemplo, puede ser usada filtración de membrana, utilizando una nanofiltración o membrana osmótica inversa como se describe en la Patente AU No. 735695 comúnmente asignada. Como un ejemplo adicional, la filtración de membrana en donde las membranas tienen un valor límite de peso molecular de aproximadamente 1000 hasta aproximadamente 10,000, puede ser usada para remover proteínas. Como otro ejemplo, la osmosis inversa o nanofiltración, puede entonces ser usada para remover sales. Las membranas de nanofiltro son una clase de membranas de osmosis inversa las cuales pasan las sales monovalentes pero retienen las sales polivalentes y solutos no cargados, mayores de aproximadamente 200 hasta aproximadamente 1000 Daltons, dependiendo de la membrana usada. De este modo, por ejemplo, los oligosacáridos producidos por las composiciones y métodos de la presente invención, pueden ser retenidos en las membranas y las sales contaminantes, pasarán en estos. Los productos que son por ejemplo, proteínas glicosiladas o péptidos glicosilados, pueden también ser usados sin purificación adicional. 0, si se desea por el usuario, por las proteínas glicosiladas o péptidos glicosilados, pueden ser aislados o purificados usando métodos de purificación de proteína estándares.

VIII. SUSTRATOS ACEPTORES/SUSTRATO DONADOR Los sustratos donadores adecuados usados por las glicosiltransferasas eucarióticas y métodos de la invención, incluyen pero no se limitan a, UDP-GIc, UDP-GIcNAc, UDP- Gal, UDP-GalNAc, GDP-Man, GDP-Fuc, UDP-GIcUA, UDP-GIcNH2, UDP-GaINH2, y CMP-ácido siálico. Guo et al, Appl ied Biochem . and Biotech . 68: 1-20 (1997). Los sustratos aceptores adecuados usados por las proteínas glicosiltransferasa eucarióticas, solubles y métodos de la invención, incluyen pero no se limitan a, polisacáridos, oligosacáridos, proteínas, lípidos, gangliósidos y otras estructuras biológicas (por ejemplo, células completas) , que pueden ser modificadas por los métodos de la invención. Estructuras ejemplares, las cuales pueden ser modificadas por los métodos de la invención, incluyen cualquiera de un número de glicolípidos, glicoproteínas y estructuras de carbohidratos conocidas por aquellos expertos en la técnica. Ejemplos de sustratos aceptores adecuados usados en reacciones catalizadas de proteínas glicosiltransferasa eucarióticas, son descritas en Guo et al , Applied Biochem . and Biotech . 68: 1-20 (1997), pero no se limitan a estas. En modalidades preferidas, el sustrato aceptor es una proteína terapéutica. Las proteínas terapéuticas preferidas para modificación por la glicosiltransferasa producida usando microorganismos que tienen un ambiente intracelular, oxidativo, se encuentran en la Tabla 2.

Tabla 2. Proteínas terapéuticas preferidas Hormonas y factores de Receptores y Receptores crecimiento Quiméricos Factor de estimulación de CD4 la colonia del granulocito Receptor del factor (G-CSF) necrosis del tumor (TNF-R) Factor de estimulación de Fusión Fe TNF-R: IgG la colonia del granulocito- Alfa-CD20 macrófago (GM-CSF) TPO PSGL-1 Eritropoyetina (EPO) Complemento Variantes de EPO GlyCAM o su quimera Hormona de estimulación del N-CAM o su quimera folículo (FSH) Hormona del crecimiento Anticuerpos Monoclonales humano (HGH) ( Inmunoglobulinas ) Insulina MAb-anti-RSV Alfa-TNF Receptor MAb-anti-IL-2 Leptina MAb-anti-CEA Gonadotropina coriónica MAb-Glicoproteína Ilb/IIIa humana (Reopro™) Factor-20 del crecimiento MAB-anti-EGF del fibroblasto (FGF-20) Factor-20 del crecimiento MAb-Her-2 (Herceptin™) del fibroblasto (FGF-21) Enzimas e Inhibidores MAb-CD20 (Rituxan™) Activador del plasminógeno MAb-alfa-CD3 de tipo tejido (TPA) Variantes TPA MAb-TNFa (Remicade™) Urocinasa MAb-CD4 Factor de coagulación del MAb-PSGL-1 Factor VII Factor VIII Proteina Mab-anti F o Virus Factor de coagulación del Sincitial respiratorio Factor IX Factor X Anti-trombina-III Factor XIII Células hrDNase Células rojas de la sangre Glucocerebosidasa Células rojas-blancas (por (Cerezyme™) ejemplo, células T, células Hirudin B, células dendríticas, macrófagos, células NK, al antitripsina (inhibidor neutrófilos, monocitos y de proteasa al) similares) Antitrombina III Células troncales a-glucosidasa de ácido Plaquetas (maltasa de ácido) a-galactosidasa A Otros a-L-iduronidasa Antígenos de la superficie de Hepatitis B (HbsAg) Urocinasa Toxina-IL-2 de difteria quimérica Citosinas y_ Citosinas quiméricas Interleucina-1 (IL-1), Ib, 2, 3, 4 Interferón-alfa (IFN-alfa) ínterferón-alfa-2b ínterferón-beta Interferon-gamma ínterferón-omega Otras proteínas terapéuticas preferidas que pueden ser producidas en organismos procarióticos que tienen ambientes intracelulares de oxidación, se describen en la Solicitud No. PCT/US02/32263, presentada en Octubre 9, 2002; Solicitud de Patente Provisional No. 60/448,381, presentada en Febrero 19, 2003; Solicitud de Patente Provisional No. 60/438,582, presentada en Enero 6, 2003; Solicitud de Patente Provisional No. 60/407,527, presentada en Agosto 28, 2002; Solicitud de Patente Provisional No. 60/404,249, presentada en Agosto 16, 2002; Solicitud de Patente Provisional No. 60/396,594, presentada en Julio 17, 2002; Solicitud de Patente Provisional No. 60/391,777, presentada en Junio 25, 2002; Solicitud de Patente Provisional No. 60/387,292, presentada en Junio 7, 2002; Solicitud de Patente Provisional No. 60/334,301, presentada en Noviembre 28, 2001; Solicitud de Patente Provisional No. 60/334,233, presentada en Noviembre 28, 2001 ; Solicitud de Patente Provisional No. 60/344,692, presentada en Octubre 19, 2001; y Solicitud de Patente Provisional No. 60/328,523, presentada en Octubre 10, 2001; y en las siguientes Publicaciones de Solicitudes de Patentes 20040142856, 20040137557, 20040132640, 20040126838, 20040115168, 20040082026, 20040077836, 20040063911, 20040043446. Las proteínas terapéuticas preferidas en las referencias anteriores, son también referidas como péptidos preferidos para remodelación. En algunas modalidades, las proteínas terapéuticas incluyen un sitio de glicosilación O-ligado. El sitio de glicosilación O-ligado puede ser que se origina naturalmente en una proteína o péptido de tipo nativo, o puede ser en un péptido o proteína mutante, por ejemplo, una proteína o péptido mutante en el cual un sitio de glicosilación O-ligado que no se origina naturalmente se introduce, o una proteina o péptido mutante que comprende sitios de glicosilación O-ligados que se originan naturalmente y que no se originan naturalmente. Proteínas ejemplares con sitios de glicosilación O-ligados incluyen, por ejemplo, factor de estimulación de la colonia de granulocitos (G-CSF), por ejemplo, tipos nativos de 175 y 178 aminoácidos (con o sin residuos de metionina N-terminal), interferón (por ejemplo, interferón alfa, por ejemplo, interferón alfa 2b, o interferón alfa 2a) , factor de estimulación de la colonia de macrófagos del granulocito (GM-CSF) , hormona de crecimiento humano, interleucina (por ejemplo, interleucina 2), y factor de crecimiento del fibroblasto (FGF). Ejemplos de proteínas y péptidos mutantes y de tipo nativo se encuentran en, por ejemplo, los documentos PCT/US2004 /014254 , presentada en Mayo 7, 2004; No. de Solicitud de Patente Provisional Estadounidense 60/469,114, presentada en Mayo 9, 2003; No. de Solicitud de Patente Provisional Estadounidense 60/494,751, presentada en Agosto 13, 2003; No. de Solicitud de Patente Provisional Estadounidense 60/495,076, presentada en Agosto 14, 2003; No. de Solicitud de Patente Provisional Estadounidense 60/535,290, presentada en Enero 8, 2003; PCT/US05/000799, presentada en Enero 10, 2005; USSN 11/033365 presentada en Enero 10, 2005; No. de Solicitud de Patente Provisional Estadounidense 60/535284, presentada en Enero 8, 2004; No. de Solicitud de Patente Provisional Estadounidense 60/544411, presentada en Febrero 12, 2004; No. de Solicitud de Patente Provisional Estadounidense 60/546631, presentada en Febrero 20, 2004; No. de Solicitud de Patente Provisional Estadounidense 60/555813, presentada en Marzo 23, 2004; No. de Solicitud de Patente Provisional Estadounidense 60/570891, presentada en Mayo 12, 2004; PCT/US05/39226, presentada en Octubre 31, 2005; y No. de Solicitud de Patente Provisional Estadounidense 60/623342, presentada en Octubre 29, 2004; cada uno de los cuales está incorporado en este documento por referencia para todos los propósitos. La invención también abarca proteínas terapéuticas que han sido modificadas para incrementar la resistencia a las proteasas. En una modalidad, la proteína terapéutica resistente a la proteasa es una proteína de hormona de crecimiento humano. Las proteínas terapéuticas resistentes a la proteasa ejemplares, se encuentran en por ejemplo, Solicitud de Patente Provisional Estadounidense No. 60/669736, presentada en Abril 8, 2005; Solicitud de Patente Provisional Estadounidense No. 60/710401, presentada en Agosto 22, 2005; y Solicitud de Patente Provisional Estadounidense No. 60/720030, presentada en Septiembre 23, 2005; cada una de las cuales es incorporada en este documento por referencia para todos los propósitos.

VII . Conjugación de azúcares modificadas a péptidos Los azúcares modificados son conjugados a proteínas o péptidos glicosilados o no glicosilados, usando una enzima apropiada para mediar la conjugación. Preferiblemente, las concentraciones de (los) azúcar (es), enzima (s) y péptido (s) aceptor (res) donadores modificados o proteína (s), se seleccionan de manera tal que la glicosilación procede hasta que el aceptor es consumido. Las consideraciones discutidas abajo, mientras se exponen en el contexto de una sialiltransferasa, son en general, aplicables a otras reacciones de glicosiltransferasa. La presente invención también se proporciona para producción a escala industrial de péptidos modificados. Como se usa en este documento, una escala industrial en general, produce por ejemplo, al menos un microgramo, un miligramo o un gramo de conjugado purificado, terminado. En la discusión que sigue, la invención es ejemplificada por la conjugación de porciones de ácido siálico modificado a un péptido glicosilado. El ácido siálico modificado ejemplar, es etiquetado con PEG. El enfoque de la siguiente discusión al uso de ácido siálico modificado con PEG y péptidos glicosilados, es para claridad de ilustración, y no está propuesto para implicar que la invención está limitada a la conjugación de estos dos asociados. Uno de habilidades entenderá que la discusión en general, es aplicable a las adiciones de porciones glicosilo modificadas distintas que el ácido siálico. Sin embargo, la discusión es igualmente aplicable a la modificación de una unidad glicosilo con agentes distintos de PEG que incluyen otros polímeros solubles en agua, porciones terapéuticas y biomoléculas . Se puede usar un procedimiento enzimático para la introducción selectiva de carbohidratos PEGilados o PPGilados sobre un péptido o glicopéptido. El método utiliza azúcares modificados que contienen PEG, PPG o un grupo funcional reactivo enmascarado, y se combina con la glicosiltransferasa apropiada. Seleccionando la glicosiltransferasa que hará el enlace carbohidrato deseado y utilizando el azúcar modificado como el sustrato donador, el PEG o PPG puede ser introducido directamente sobre la estructura peptídica, sobre el residuo de azúcar existente de un glicopéptido o sobre los residuos de azúcar que han sido agregados a un péptido. Un aceptor para la sialiltransferasa, está presente en el péptido a ser modificado por los métodos de la presente invención, ya sea como estructura que se origina naturalmente o una colocada ahí recombinantemente, enzimáticamente o químicamente. Los aceptores adecuados incluyen, pro ejemplo, aceptores de galactosilo tales como, estructuras que contienen Galßl, 4GlcNAc, Galßl, 4GalNAc, Galßl, 3GalNAc, lacto-N-tetraose, Galßl, 3GlcNAc, Galßl, 3Ara, Galßl, 6GlcNAc, Galßl, 4Glc (lactosa), GalNAc y ácido siálico, y otros aceptores conocidos por aquellos de habilidad en la técnica (véase, por ejemplo, Paulson et al , J. Biol . Chem . 253:5617-5624 (1978)). En una modalidad, un aceptor para la sialiltransferasa está presente en el glicopéptido a ser modificado hasta la síntesis in vivo del glicopéptido. Tales glicopéptidos pueden ser sialilados usando los métodos reivindicados sin modificación previa del patrón de glicosilación del glicopéptido. Alternativamente, los métodos de la invención pueden ser usados para sialilar un péptido que no incluye un aceptor adecuado; primero, se modifica el péptido para incluir un aceptor por métodos conocidos por aquellos de habilidad en la técnica. En una modalidad ejemplar, un residuo GalNAc se agrega por la acción de una transferasa GalNAc. En una modalidad ejemplar, el aceptor galactosilo es montado adjuntando un residuo de galactosa a un aceptor apropiado ligado al péptido, por ejemplo, un GlcNAc. El método incluye incubar el péptido a ser modificado con una mezcla de reacción que contiene una cantidad adecuada de una galactosiltransferasa (por ejemplo, galßl, 3 ó galßl, 4) y un donador galactosilo adecuado (por ejemplo, UDP-galactosa) . La reacción se deja proceder sustancialmente hasta la terminación o, alternativamente, la reacción es terminada cuando se agrega una cantidad preseleccionada del residuo de galactosa. Otros métodos para montar un aceptor sacárido seleccionado serán aparentes para aquellos expertos en la técnica. En otra modalidad, oligosacáridos ligados al glicopéptido, son primero "recortados", ya sea en todo o en parte, para exponer ya sea un aceptor para la sialiltransferasa o una porción en la cual uno o más residuos apropiados pueden ser agregados para obtener un aceptor adecuado. Enzimas tales como glicosiltransferasas y endoglicosidasas (véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,716,812), son empleadas para las reacciones de recorte y unión. Los métodos para conjugación de azúcares modificados a péptidos o proteínas, se encuentran en por ejemplo, en los documentos USSN 60/328,523 presentada en Octubre 10, 2001; USSN 60/387,292, presentada en Junio 7, 2002; USSN 60/391,777 presentada en Junio 25, 2002; USSN 60/404,249 presentada en Agosto 16, 2002; y PCT/US02/32263; cada uno de los cuales están incorporados en este documento por referencia para todos los propósitos. Se debe notar que, como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "y" y "el", incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otro modo. De este modo, por ejemplo, referencia a "una célula", incluye una pluralidad de tales células y equivalentes de los mismos, conocidos por aquellos de habilidad en la técnica, y asi sucesivamente . Las publicaciones discutidas en este documento, son proporcionadas solamente por su descripción previa a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este documento, está construido como una admisión de que la presente invención no está titulada para proceder tal publicación en virtud de sus fechas de publicación actuales, las cuales pueden necesariamente, ser independientemente confirmadas. Las citaciones están incorporadas en este documento por referencia.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Expresión de glicosiltransferasas a partir de la trayectoria de oligosacáridos O-ligados Procedimientos Generales Se diseñaron constructos para expresar fusiones de proteina de enlace a maltosa (MBP) a truncaciones amino-terminales de la glicosiltransferasa. Los constructos son diseñados con un ? (número) que se refiere a la posición del último aminoácido removido (para truncaciones amino-terminales) o el primer aminoácido removido (para truncaciones carboxilo-terminales) a partir de la proteína de longitud completa correspondiente. Se usaron los siguientes constructos: MBP-GalNAc-T2 (?51) humano, GalNAc-T2 (?51 ?445) humano, MBP-Core-1-Gal-Tl (?50) de Drosophila, MBP-ST3Gal-l (?45) porcino, y MBP-SBD-ST3Gal-l (?45; SBD es la etiqueta del dominio de enlace de almidón, insertado entre el MBP y los dominios catalíticos) , y MBP-ST6GalNAc-l (?35) humano. Los ácidos nucleicos que codifican las enzimas, fueron típicamente clonados en sitios BamHI-XhoI o BamHI-EcoRI de pCWin2-MBP o una versión de pCWin2 con un 5' UTR modificado. Véase por ejemplo, el documento PCT/US05/00302, presentado en Enero 6, 2005, el cual se incorpora en este documento por referencia para todos los propósitos. Se realizó la clonación usando técnicas estándares (por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, FM, et al, eds. John Wiley & Sons, Inc. 1998) . Para la expresión de proteína, un loopful de células a partir de una placa fresca, se usó para inocular un cultivo de 100 ml de LB martona que contiene 50 µg/ml de canamicina. Los cultivos fueron incubados a 37 °C con sacudimiento a 180-200 rpm, y se monitorearon por OD620-Cuando el OD620 alcanzó 0.4-0.6, los cultivos se transfirieron a un incubador de sacudimiento a 20°C (180-200 rpm) por 15-20 minutos. El IPTG entonces se agregó a una concentración final de 0.1 mM, y la incubación por sacudimiento a 20°C, se continuó durante la noche. Las células fueron cosechadas por centrifugación a 4°C, 7000xg por 15 minutos. Para el análisis de la solubilidad de proteína y purificación parcial de las proteínas de fusión, las pelotillas celulares bacterianas de cultivos inducidos, fueron resuspendidas en 30 ml de TE (20 mM de Tris, pH 7.4, 1 mM de EDTA) , y Usadas por rompimiento mecánico con dos pasos a través de un microfluidizador a 15,000 psi. El material insoluble se formó en pelotillas por centrifugación por 10 minutos a 3000-5000 x g a 4°C. Los sobrenadantes se separaron de las pelotillas, y se tomó una muestra de cada sobrenadante para análisis de ensayo de actividad. Los sobrenadantes restantes se ajustaron a una concentración final de 200 mM de NaCl y se incubaron mezclados a temperatura ambiente, con resina de amilosa lavada. Después de 1-2 horas, las perlillas fueron colectadas por centrifugación breve, lavadas con 10 volúmenes de lecho de perlilla de amortiguador de columna (20 mM de Tris pH 7.4, 200 mM de NaCl, 1 mM de EDTA), y se colectaron en una columna desechable. Las proteínas de fusión purificadas, fueron eluidas con un volumen de lecho de perlillas de amortiguador de columna que contiene 10 M de maltosa. Las muestras de la pelotilla insoluble, sobrenadante y elución de resina amilosa, se analizaron por SDS-PAGE. Para el ensayo de actividad GalNAc-T2, las reacciones se llevaron a cabo en una mezcla de muestra de enzima con 20 mM de Tris pH 7, 10 mM de MnCl2, 1.5 mM de UDP-GalNAc, 1 mM de aceptor de péptido sintético. Después de una incubación de 30 minutos a 37°C, la reacción se apagó con HCl 0.01N, y el aceptor peptidico se separó de la mezcla de reacción por centrifugación a través de un concentrador de 10,000 MWCO. El péptido y el GalNAc-péptido, fueron detectados y cuantificados por RP-CLAR. Para el ensayo de actividad Core-1-Gal-Tl, las reacciones de galactosiltransferasa se llevaron a cabo en una mezcla de muestra enzimática con 3.5 mg/ml de mucina submaxilar asialo-bovino (asialo-BSM) , 50 mM de MES pH 6.5, 20 mM de MnCl2, y UDP-galactosa radiactivamente-etiquetado . Después de una incubación de una hora a 37 °C, la reacción se detuvo y los productos de reacción de proteína se separaron del UDP-Gal por precipitación de ácido. La galactosa radioactiva transferida al asialo-BSM, fue subsecuentemente detectada y cuantificada usando un contador de escintilación . Para el ensayo de ST6GalNAc-l y ST3Gal-l, los ensayos de sialiltransferasa se llevaron a cabo en formato de fase sólida usando asialo-BSM como un aceptor y formas biotiniladas del donador CMP-NAN. Brevemente, una placa de 96 cavidades revestida con asialo-BSM, se incubó a 37°C con muestras de MBP-ST6GalNAc-l y se biotiniló CMP-NAN en 20 mM de BisTris a pH 6.7, 2.5 mM de MgCl2, 2.5 mM de MnCl2, 50 mM de NaCl2, Tween-80 al 0.05% por 2-4 horas. La microplaca fue entonces lavada, y el ácido siálico biotinilado transferido a la asialo-BSM unido a la placa, se etiquetó con europio-estreptavidina, y se detectó por el tiempo de fluorescencia resuelto.

ST3Gal -l Células mutantes JM109 y trxB gor supp que portan el constructo MBP-ST3Gal-l, se indujeron por expresión durante la noche a 20°C. Como se muestra en la Figura 1, la expresión de MBP-ST3Gal-l como una proteína soluble, se observó en ambas cepas, con niveles de expresión superiores, observados en la cepa mutante trxB supp mutante. La proteína de fusión soluble de ambos lisados, se purificó en resina amilosa (Figura 1), y los ensayos de actividad en ambos lisados y muestras de proteína parcialmente purificadas, indican que la proteína de fusión soluble, fue enzimáticamente activa (Tabla 3) , con niveles significantemente superiores de actividad recuperada de las células mutantes trxB gor supp.

GalNAc-T2 Cuando se expresan en células JM109, MBP-GalNAcT2 es predominantemente insoluble, con solamente niveles indicadores de actividad detectados en la fracción soluble (Tabla 3) . El constructo GalNAc-T2 humano truncado etiquetado con MBP, se introdujo en una cepa mutante trxB gor supp, y se indujo para expresión durante la noche a 20°C. Como se muestra en la Figura 2, MBP-GalNAc-T2 fue solublemente expresado y fácilmente purificado en resina amilosa. Los ensayos de actividad en tanto muestras parcialmente purificadas como Usadas, indican que la proteina de fusión soluble fue una enzima activa expresada a niveles muy superiores que aquellos observados en los lisados de células JM109 (Tabla 3) . Las GalNAcT2 truncadas que carecen de ambas secuencias amino-terminales y su dominio de lectina carboxi-terminal, también fue soluble y activa cuando se expresa en células mutantes trxB gor supp (Figura 2b y Tabla 3) .

Core-1 -Gal -Tl Trabajos previos con constructos Core-1-Gal-Tl de Drosophila truncados etiquetados con MBP, se expresaron insolublemente en células JM109 sin aparente actividad en la fracción soluble (Tabla 3). El constructo Core-1-Gal-Tl de Drosophila truncado etiquetado con MBP, se introdujo en una cepa mutante trxB gor supp, y se indujo para expresión durante la noche a 20°C. Como se muestra en la Figura 3, el MBP-GalNAc-T2, fue preferiblemente expresado como una proteína soluble en la cepa mutante trxB gor supp, y fue parcialmente purificado en resina amilosa. Los ensayos de actividad en las muestras de lisados, indican que la proteína soluble fue una enzima activa cuando se expresa en ya sea MBP etiquetado o no etiquetado en el mutante trxB gor supp (Tabla 3) .

ST6GalNAc-l Trabajos previos con constructos ST6GalNAc-l etiquetados con MBP, encontraron que las proteínas de fusión se expresan como cuerpos de inclusión insolubles en células JM109. El constructo ST6GalNAc-l humano truncado, etiquetado con MBP, se expresó en una cepa mutante trxB gor supp como una proteina soluble, y fue parcialmente purificada en resina amilosa (Figura 4). Los ensayos de actividad en la muestra de usado detectaron la actividad de sialiltransferasa (Tabla 3) .

Tabla 3: Rendimientos basados en la actividad de enzima observada de glicosiltransferasa glicano O-ligada Sumario de las actividades en muestras de lisados para las proteínas de fusión indicadas expresadas en ya sea E . col i mutante JM109 o trxB gor supp, no probadas. 10L de Fermentación de Glicosil transferasas expresadas en células mutantes trxB gor supp Se sembraron recipientes de fermentación de diez litros con cepas mutantes trxB gor supp de E . coli , que expresan una de las siguientes proteínas: MBP-ST3Gal-l, MBP-GalNAc-T2, y MBP-Core-1-Gal-Tl . Después del crecimiento a 37 °C, a OD62o de aproximadamente 0.5, la temperatura se cambió a 20°C. Después que la temperatura del cultivo alcanzó 20°C, se agregó 0.1 mM de IPTG para inducir la expresión de la proteina. Se removieron las alícuotas de las células a los puntos de tiempo indicados (Figura 5) , se procesaron en lisados clarificados y se sometieron a ensayo para determinar la actividad enzimática. Como se muestra en la Figura 5, los niveles de enzima expresados, se mantuvieron o incrementaron durante un periodo de inducción de 48 horas para cada proteína de fusión.

O-glicosilación y glicolPEGilación de Interferón-alfa -2b El interferon-alfa-2b fue glicosilado usando glicosiltransferasas eucarióticas que han sido producidos en E . col i de mutante trxB gor supp (Figura 6) . El GalNAc fue primero agregado al interferón a través de la actividad de la enzima MBP-GalNAc-T2. La galactosa fue entonces agregada a través de la actividad de la enzima MBP-Corel-Gal-Tl. Los productos de reacción fueron analizados por espectrometría de masas MALDI-TOF. La Figura 6A es interferón-alfa-2b sola. La primera reacción (Figura 6B) , incluye 40 µg de interferón-alfa-2b, 0.4 mM de UDP-GalNAc, y 20 mU/ g de MBP-GalNAc-T2. La segunda reacción (Figura 6C) incluye interferón-alfa-2b (40 µg) , 0.4 mM de UDP-GalNAc, 20 mU/mg de MBP-GalNAc-T2, 0.4 mM de UDP-Gal y 20 mU/mg de MBP-Corel-Gal-Tl . Ambas reacciones se llevaron a cabo a 32°C por seis horas en 20 mM de BisTris a pH 6.7, 50 mM de NaCl, 10 mM de MnC12 y 0.02% de NaN3. Como se muestra en la Figura 6A y 6B, los picos de masa para el interferón se incrementaron en la primera reacción, consistente con la adición de GalNAc. De manera similar, en la Figura 6C, la masa del interferón es además incrementada en la segunda reacción, consistente con la adición de GalNAc-Gal . Como se muestra en la Figura 7, las glicosiltransferasas eucarióticas producidas en E . col i mutante trxB gor supp, también fueron usadas para glicoPEGilar la interferón-alfa-2b . Una reacción de glicosilación de interferón-alfa-2b, se llevó a cabo primero usando MBP-GalNAcT2 y MBP-Core-1-Gal-Tl, producidos de lisados mutantes trxB gor, supp. La primera reacción contiene 40 µg de interferón-alfa-2b, 0.4 mM de UDP-Gal, 20 mU/mg de MBP-GalNAc-T2 , 0.4 mM de UDP-Gal, 20 mU/mg de MBP-Corel-Gal-Tl, 20 mM de BisTris pH 6.7, 50 mM de NaCl, 10 mM de MnCl2, y NaN3 al 0.02%. Después de una incubación de seis horas a 32°C, se agregaron 0.08 mM de CMP-NAN- 40kDaPEG, y 50 mU/mg de MBP-ST3Gal-l, y la reacción se continuó durante la noche a 32°C. El progreso de la reacción se monitoreó por SDS-PGAE de alícuotas tomadas antes de la adición de MBP-GalNAc-T2 y MBP-Core-1-Gal-Tl , inmediatamente antes y después de la adición de MBP-ST3Gal- 1, y a la terminación de la reacción. Como se muestra en la Figura 7, línea 3, la adición de GalNAc-Gal, causa una reducción discernible en la movilidad electroforética del interferón. La sialilPEGilación adicional del interferón por MBP-ST3Gal-l, resulta en una reducción dramática en la movilidad, consistente con la adición de 40 kDa de ácido siálico-PEG (Figura 7, linea 5).

Ejemplo 2: Expresión de giclosiltransferasas eucarióticas a partir de la trayectoria de oligosacárido N-ligado Procedimientos Generales Se diseñaron constructos para expresar fusiones de proteína de enlace a maltosa (MBP) a truncaciones amino-terminales de la glicosiltransferasa. Los constructos son diseñados con un ? (número) que se refiere al numero de aminoácidos removidos a partir del término amino de la proteína nativa correspondientes. Se usaron los siguientes constructos: MBP-GnTl (?103) humano, MBP-GalTl (?129) bovino, y MBP-ST3Gal3 (?72) de rata y MBP-SBD-ST3Gal3 (?72; SBD es la etiqueta del dominio de enlace de almidón, insertado entre el MBP y el dominio catalítico) , y MBP- ST6GalNAc-l (?35) humano. Para GnTl y GalTl, una versión alterna de cada enzima que porta una mutación sin sentido invertida única, también se probó. Los ácidos nucleicos que codifican las enzimas, fueron típicamente clonados en sitios BamHI-XhoI o BamHI-EcoRI de pCWin2-MBP. Véase por ejemplo, el documento PCT/US05/00302 , presentado en Enero 6, 2005, el cual se incorpora en este documento por referencia para todos los propósitos. Se realizó la clonación usando técnicas estándares (por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, FM, et al, eds. John Wiley & Sons, Inc. 1998) . Se realizaron análisis de expresión, y solubilidad y purificación de proteína, como se describe en el Ejemplo 1. Para el ensayo de actividad GnTl, las reacciones se llevaron a cabo usando métodos desarrollados a partir de métodos de literatura común (por ejemplo, Schachter, Reck, and Paulson (2003) Methods Enzymol 363, 459-475) . Brevemente, la actividad de n-acetilglucosaminiltransferasa, se monitoreó como la transferencia de UDP-GlcNAc radioactivamente etiquetado a Maní, 6 (Maní, 3) Man-O-octil (OM3). El sustrato y producto fueron purificados por fase inversa, y suprimidos y cuantificados usando un contador de escintilación . Para el ensayo de actividad GalTl, las reacciones de galactosiltransferasa se llevaron a cabo en una mezcla de muestra de enzima en 50 mM de HEPES pH 7.5, .5 mM de lacto-n-triosa II, 6 mM de UDP-Gal y 5 mM de MnS04. Después de una hora de incubación a 37°C, la reacción se detuvo y los productos de reacción de carbohidrato se separaron por centrifugación a través de un concentrador 10,000 MWCO. El sustrato y producto fueron detectados y cuantificados por CLAR. Para el ensayo de ST3Gal3, los ensayos de sialiltransferasa se llevaron a cabo en una mezcla de muestra de enzima en 20 mM de MOPS pH 6.5, 0.1 mg/ml de BSA, 10 mM de MnCl2, 2 mM de CMP-NAN, y 30 mM de lacto-n-neotreaosa. Después de una incubación de dos horas a 30°C, las reacciones se detuvieron por inactivación por calor y el sustrato de reacción y producto, se detectaron y cuantificaron por CLAR.

GnTl Cultivos de JM109 y trxB gor supp mutantes de E . col i , inducidos por expresión de MBP-GnTl y MBP-GnTl C121S a 20°C, fueron analizados por solubilidad y actividad de las proteínas de fusión. Como se muestra en la Figura 8, niveles superiores de expresión soluble de proteínas de fusión tanto MBP-GnTl, fueron vistos en la cepa mutante trxB gor supp, y todas las proteínas de fusión solubles fueron recuperadas con resina amilosa. Los ensayos de actividad en las muestras de MBP-GnTl, indican que la enzima se expresó a más de 25 veces niveles de actividad superior en las células mutantes trxB gor supp que en las células JM109 (Tabla 4) . El MBP-GnTl C121S fue también expresado como una enzima activa soluble, aunque a aproximadamente niveles diez veces inferiores que el constructo MBP-GnTl en la cepa equivalente de E . col i (Tabla 4) .

Gal Tl Cultivos de JM109 y trxB gor supp mutantes de E . coli , inducidos por expresión de MBP-GalTl y MBP-GalTl C342T a 20°C, se analizaron por solubilidad y actividad de las proteínas de fusión. Como se muestra en la Figura 9, niveles superiores de expresión soluble de proteínas de fusión tanto MBP-GalTl, fueron observados en la cepa mutante trxB gor supp, y todas las proteínas de fusión solubles fueron recuperadas con resina amilosa. Los ensayos de actividad en MBP-GalTl, expresados en JM109, fueron incapaces de detectar la actividad enzimática, mientras la enzima MBP-GalTl activa, fue recuperada de la muestra de expresión mutante trxB gor supp (Tabla 4). El constructo MBP-GalTl C342T se recuperó como una enzima activa de ambas cepas de E . coli , con más niveles de actividad cinco veces mayor que los observados en las muestras mutantes trxB gor supp .

ST3Gal3 Cultivos de trxB gor supp mutantes de E. coli inducidos por la expresión de MBP-ST3Gal3 y MBP-SBD-ST3Gal3 a 20°C, se analizaron para solubilidad y actividad de las proteínas de fusión. Como se muestra en la Figura 10, ambas versiones de la proteina de fusión ST3Gal3, fueron solublemente expresadas en células mutantes trxBgor supp, y ambas fueron recuperadas en resina amilosa. Ambas proteínas de fusión ST3Gal3, solublemente expresadas en células mutantes trxB gor supp, fueron enzimáticamente activas, con el constructo etiquetado con MBP más de cinco veces más activo que el constructo etiquetado con MBP-SBD (Tabla 4). El MBP-SBD-ST3Gal3 expresado en células JM109, no tiene actividad enzimática detectable.

Tabla 4 : Rendimientos basados en la actividad de enzima observada de glicosiltransferasa glicano O-ligada Sumario de las actividades en muestras de lisados para las proteínas de fusión indicadas expresadas en ya sea E . coli mutante JM109 o trxB gor supp, no probadas.

Ejemplo 3: Expresión de glicosiltransferasas eucarióticas en Pseudomonas Procedimientos Generales Actividades de las siguientes glicosiltransferasas eucarióticas fueron probadas en un sistema de expresión de Pseudomonas : dos truncaciones N-terminales de ST3Gal-l porcino, y ST6GalNAc-l de pollo. Los constructos, con (número ?) , que se refieren al número de aminoácidos removidos del término amino de la proteína nativa correspondiente, fueron: ST3Gal-l (?45) porcino, ST3Gal-l (?56) porcino, y ST6GalNAc-l (?231) de pollo. Las glicosiltransferasas fueron fusionadas a una secuencia de secreción de Pseudomonas en donde la expresión es dirigida al periplasma, y/o fue expresada como proteínas no fusionadas dirigidas al citoplasma. La expresión se accionó por el promotor Ptac inducible por IPTG. La clonación se realizó usando técnicas estándares (por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, FM, et al, eds. John Wiley & Sons, Inc. 1998). Los plásmidos que comprenden ácidos nucleicos que expresan las glicosiltransferasas, fueron transformados en la cepa de P. fl uorescens DC206 (?pyrF, laclQI ) . Véase por ejemplo, documento US 2005/0186666, publicado en agosto 25, 2005, el cual está incorporado en este documento por referencia para todos los propósitos. Las células transformadas se hicieron crecer en una escala de litro en medio mínimo (M9) , suplementado con oligoelementos y glucosa al 1%. Después de una fase de crecimiento inicial, la expresión de glicosiltransferasa se indujo por adición de IPTG al medio. Las células se hicieron crecer en medio de inducción por entre 24 y 120 horas. Las células fueron cosechadas por centrifugación, los sobrenadantes se descargaron y las pelotillas celulares se congelaron y almacenaron a -20°C. Para la preparación del usado celular, la pasta de células congeladas (8-14 gramos de peso húmedo), se descongeló y resuspendió en amortiguador de lisis MES (50 mM de MES, pH 6.5), que contiene 100 mM de NaCl y una relación de aproximadamente 1 gramo de pasta celular húmeda por 2 ml de amortiguador de lisis. Las suspensiones se rompieron por dos pasos a través de una célula de presión French a 10,000 y 20,000 psi, respectivamente. El material insoluble se removió por centrifugación, y los sobrenadantes se clarificaron además, pasando a través de filtros de jeringa de 0.45 µm y 0.2 µm. Las muestras de las fracciones insolubles y solubles, fueron analizadas por SDS-PAGE. Para el ensayo de actividad de sialiltransferasa, las reacciones se llevaron a cabo en una mezcla de muestra de ensayo con 0.5-2 mg/ml de asialo-fetuina (para ST3Gal-l) y asialo-BSM (para ST6GalNAc-l ) , 50 mM de MES o BisTris a pH 6.5, 100 M de NaCl, y CMP-NAN radioactivamente etiquetado. Después de una incubación de 30-60 minutos a 37°C, la reacción se detuvo y los productos de reacción de la proteina se separaron del CMP-NAN por precipitación de ácido. El ácido siálico radioactivo transferido a asialo-fetuina o asialo-BSM, fue subsecuentemente detectado y cuantificado usando un contador de escintilación.

ST3Gal -l Los lisados celulares de cultivos de Pseudomonas que expresan constructos ST3Gal-l periplásmicos o citoplásmicos, fueron ensayados por actividad de sialiltransferasa. Como se resume en la Tabla 5, la actividad de sialiltransferasa fue observada en muestras de tanto constructos ST3Gall- ?45 como ?56, citoplásmicos y periplásmicos objetivo, con niveles superiores de actividad de las muestras de ST3Gal-l ?56.

ST6GalNAc-l Los lisados celulares de cultivos de Pseudomonas que expresan ST6GalNAc-l de pollo citoplásmico, fueron ensayados por actividad de sialiltransferasa. Como se resume en la Tabla 5, la actividad de sialiltransferasa se observó en muestras de ST6GalNAc-l de pollo citoplásmico de objetivo.

Tabla 5: Rendimientos basados en la actividad de enzima observada de glicosiltransferasa glicano O-ligada expresada en Pseudomonas Sumario de pruebas de actividad y expresión de constructos ST3Gal-l y ST6GalNAc-l usando Pseudomonas .

Se entiende que los ejemplos y modalidades descritos en este documento, son para propósitos ilustrativos solamente y que se sugerirán varias modificaciones o cambios en vista de los mismos, para personas expertas en la técnica y son incluidos dentro del espíritu y punto de vista de esta solicitud y campo de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en este documento, están por este medio incorporadas por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN
Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:
REIVINDICACIONES 1. Un método para producir una glicosiltransferasa eucariótica activa soluble en un microorganismo procariótico, caracterizada porque el microorganismo tiene un ambiente de oxidación, el método comprende las etapas de a) expresar un ácido nucleico que codifica la glicosiltransferasa eucariótica en el microorganismo procariótico; y b) hacer crecer el microorganismo bajo condiciones que permiten la expresión de la glicosiltransferasa eucariótica activa soluble, dentro de un compartimiento celular de microorganismo procariótico. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la glicosiltransferasa eucariótica es un elemento seleccionado del grupo que consiste de una N-acetilglucosaminiltransferasa I eucariótica (GnT o GNT) , una N-acetilgalactosaminiltransferasa eucariótica
(GalNAcT) , una galactosiltransferasa eucariótica (GalT) , y una sialiltransferasa eucariótica. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la N-acetilglucosaminiltransferasa eucariótica es; la N-acetilgalactosaminiltransferasa eucariótica es; la galactosiltransferasa eucariótica (GalT) es una ß-1, 4-galactosiltransferasa eucariótica (GalTl) o una galactosiltransferasa core I eucariótica (Core 1 GalTl) ; la sialiltransferasa eucariótica es una (2, 3) sialiltransferasa eucariótica (ST3Gal3), una a-N-acetilgalacosaminida a-2, 6-sialiltransferasa I eucariótica
(ST6GalNAcTl) , o una gal ßl,3GalNAc a2 , 3-sialiltransferasa eucariótica (ST3GalI) . 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo procariótico es una bacteria E . coli o Pseudomonas . 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la E . col i tiene una mutación en el gen trxB y un gen gor se hace crecer a una temperatura entre 12-30°C.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo procariótico tiene una mutación en un ácido nucleico de reductasa endógena.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo procariótico se hace crecer a una temperatura inferior que una temperatura de crecimiento óptimo.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende la etapa de aislar la glicosiltransferasa eucariótica activa, soluble .
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la glicosiltransferasa eucariótica activa soluble, es producida en una escala comercial.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la glicosiltransferasa eucariótica activa soluble, comprende una etiqueta de purificación.
11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo procariótico comprende una isomerasa de disulfuro de proteína heteróloga (PDI).
12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo procariótico comprende una proteína chaperona heteróloga.
13. Una glicosiltransferasa eucariótica activa soluble, caracterizada porque se elabora por el método de la reivindicación 1.
14. Un método in vitro para producir una proteína terapéutica glicosilada de oligosacárido, caracterizado porque comprende la etapa de contactar un sustrato aceptor con un sustrato donador y la glicosiltransferasa eucariótica soluble de conformidad con la reivindicación 13, bajo condiciones que permiten la producción del oligosacárido.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el sustrato aceptor es unido a un glicolípido, una glicoproteína, un glicopéptido, una proteina, o un péptido.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la glicoproteina, glicopéptido, proteina o péptido, es una proteína terapéutica .
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la proteína terapéutica se selecciona de la Tabla 2.
18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque además comprende la etapa de aislar el oligosacárido.
19. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el oligosacárido es producido a una escala comercial.