JPH11253163A - シアル酸転移酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】シアル酸転移酵素を可溶性蛋白質として、大腸
菌内で発現させ、安価に効率よく生産する方法を提供す
る。 【解決手段】シアル酸転移酵素、例えばα２−６シアル
酸転移酵素またはα２−３シアル酸転移酵素をコードす
る遺伝子およびマルトース結合性蛋白質をコードする遺
伝子を組み込んだ発現ベクターで大腸菌を形質転換し、
該形質転換体を培養して、シアル酸転移酵素を生成さ
せ、培養物からシアル酸転移酵素を採取することを特徴
とするシアル酸転移酵素の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、糖蛋白質プロセッ
シング酵素の１種であるシアル酸転移酵素を安価に効率
よく生産する方法に関し、詳細には大腸菌体内で高等生
物由来のシアル酸転移酵素を融合蛋白質として製造し、
該融合蛋白質を精製し、さらに該酵素活性をもつ蛋白質
として分離する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、高等生物由来の糖蛋白質、糖脂質
などの複合糖質中の糖鎖部分の構造と機能に関する関心
が高まっており、その研究が盛んに行われている。糖鎖
は一般に糖転移酵素によって合成される。糖転移酵素は
糖ヌクレオチドを糖供与体として、受容体となる糖鎖に
糖鎖を転移し、糖鎖伸長を行う酵素である。その受容体
の糖鎖構造に対する特性は厳密であり、通常、１つのグ
リコシド結合は対応する１つの糖転移酵素よって形成さ
れると言われている。糖転移酵素は複合糖質の糖鎖部分
の構造研究、特定の糖鎖構造の簡便な合成、天然の糖鎖
構造の修飾に利用されている。

【０００３】シアル酸転移酵素は、基質特異性として、
α２−３、α２−６、α２−８などの結合様式でシアル
酸を種々の糖に転移する、基質特異性の異なる酵素が存
在する。しかし、これらのシアル酸転移酵素は、アミノ
酸配列にはそれぞれ相同性が見られ、例えば、α２−３
シアル酸転移酵素とα２−６シアル酸転移酵素の間の相
同性は、５３個のアミノ酸からなる領域に存在する。ま
た共通のモチ−フも存在する。

【０００４】α２−６シアル酸転移酵素は、ＣＭＰ−シ
アル酸を糖供与体として、Ｎ−結合型糖鎖、ポリラクト
サミンまたは糖脂質のＧａｌβ１−４／３ＧｌｃＮＡｃ
のガラクトース残基にシアル酸を転移し、シアル酸とガ
ラクトースにα２−６結合を形成する反応を触媒する酵
素であり、糖蛋白質、糖脂質のどちらの糖鎖のガラクト
ースにも作用する。α２−６シアル酸転移酵素は、糖鎖
を含む蛋白質であり、また、細胞接着などに関与する糖
鎖を生成する酵素として重要視されてきた。このような
α２−６シアル酸転移酵素は、ヒト、ラット、ニワトリ
胚乳等に、その存在が発見され、肝臓、心臓、脾臓等の
組織に存在することが知られている。該酵素は他のシア
ル酸転移酵素に見られると同様に、膜結合型酵素であ
り、膜貫通領域、幹領域、酵素活性領域をもち、細胞中
でプロテアーゼの作用を受けて、可溶型の分泌酵素とし
て細胞外に分泌されることが知られている。

【０００５】α２−３シアル酸転移酵素に関してもブ
タ、ラットの肝臓の他に、ヒトの胎盤、肝臓、骨格筋等
に広く存在することが知られ、細胞接着、細胞分化、細
胞ガン化に機能していると考えられている。

【０００６】また、一般にシアル酸転移酵素は、他の糖
転移酵素に見られない特徴として、該酵素活性のある領
域のなかに、きわめて高度に保存されている領域（シア
リルリルモチーフ）が２カ所存在している。それらは配
列番号１に記載されるアミノ酸配列の１６７〜２１１番
目または３０５〜３２７番目である。

【０００７】α２−６シアル酸転移酵素は、上記のよう
な高等動物の臓器に存在するが、このような組織から酵
素を分離精製することは、きわめて難しく、通常、該酵
素の遺伝子をクローニングし、遺伝子を大腸菌、酵母あ
るいは昆虫細胞に導入し、遺伝子を過剰に発現させこと
が試みられている。

【０００８】これらの酵素をコードするｃＤＮＡはヒ
ト、マウス等の各組織より単離されており、例えば、ヒ
ト胎盤からＧａｌβ１−４−ＧｌｃＮＡｃを受容体とし
て認識して、シアル酸を転移するα２−６シアル酸転移
酵素をコードする遺伝子が単離され、その塩基配列が決
定されている（Grundmann U.ら、Nucleic Acids Res.,1
8,667,1990 ）。

【０００９】また、ラット肝からＧａｌＮＡｃを受容体
として認識するα２−６シアル酸転移酵素をコードする
遺伝子が単離され、その塩基配列が決定されている（We
instein J.ら、J. Biol. Chem., 263,17735-17743,198
7) 。

【００１０】また、ニワトリ胚のｃＤＮＡからＧａｌＮ
Ａｃを受容体とするα２−６シアル酸転移酵素をコ−ド
する遺伝子が単離されている（Kurosawa N. ら、J. Bio
l. Chem., 269,1402,1994)。

【００１１】さらに、α２−３シアル酸転移酵素遺伝子
に関しては、ラット肝臓からＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡ
ｃを受容体とするα２−３シアル酸転移酵素遺伝子が単
離されている (D.H.van den Eijinden, J. Biol. cHE
M., 256,3159,1981)。ブタ肝臓からも、Ｇａｌβ１−３
ＧａｌＮＡｃを受容体とするα２−３シアル酸転移酵素
遺伝子が単離されている (Gillespie W.ら、J. Biol. C
hem., 267,21004,1992)。

【００１２】これまで、α２−６シアル酸転移酵素の遺
伝子組換えによる発現については、ＣＯＳ細胞で発現で
きることを報告されている。しかし、ＣＯＳ−７細胞
（Kurosawa N. ら、J. Biol. Chem. 269,1402,1994) や
ＣＯＳ−１細胞（Datta A.K.ら、J.Bio.Chem., 270,149
7,1992) での発現は、培養時間がかかる、培地が高価で
あるなどの欠点があり、大量生産にはあまり適していな
い。同様に、α２−３シアル酸転移酵素遺伝子もＣＯＳ
−１細胞での一過性の発現が報告されているに過ぎない

【００１３】また、昆虫細胞を宿主とする発現方法は、
酵素の発現は高いが、培養にやはり時間がかかること、
製造における煩雑さなどの欠点があり、大量生産に問題
がある。大量生産にはコスト的な考え、細菌や酵母など
の微生物で発現生産する方法が有利である。そのような
例として、浜本らは、ヒト由来のシアル酸転移酵素を大
腸菌により発現させることを報告している（Riken Rev.
No.8, 39, 1995)。しかし、発現生成した酵素は、イン
クルージョンホディーとして存在しており、この不溶性
タンパクをトリトンＸ−１００および尿素で抽出した
が、再生が極めて穏やかであり、活性のあるタンパクと
して取得することは、簡単でないことを報告している。

【００１４】一方、目的とする遺伝子を大量に可溶性蛋
白として発現させ、かつ、発現産物の精製を容易にする
方法として、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼや
プロテインＡなどとの融合蛋白質として発現させる方法
がある。該方法ではグルタチオンをリガンドとするアフ
ィニティーカラムクロマトグラフィーにより、また、プ
ロテインＡとの融合蛋白質は、ＩｇＧをリガンドとする
アフィニテティーカルムクロマトグラフィーにより容易
に精製することが出来る。しかし、この場合、インクー
ルジョンボデイを生成する可能性が高い。

【００１５】また、マルトース結合性蛋白質を使用し
て、ヒト成長ホルモンを発現させた例がある (Hsing
ら、Bio/Technology, 4,991,1986) 。しかしながら、シ
アル酸転移酵素については、活性のある状態で製造した
例は、未だ知られていない。これは大腸菌ではインクル
ージョンボディを生成するのに可溶化などの困難性が予
想されるからである。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、シア
ル酸転移酵素を可溶性蛋白質として、大腸菌内で発現さ
せることにより、安価に効率よく生産する方法を提供す
ることにある。その１例として、α２−６シアル酸転移
酵素およびα２−３シアル酸転移酵素を安価に効率よく
生産する方法を提供する。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため、鋭意検討した結果、シアル酸転移酵素と
マルトース結合蛋白質の融合蛋白質として発現させるベ
クターを構築することにより、遺伝子工学的に該酵素を
生産して、上記問題点を解決できることを見いだし、本
発明を完成するに至った。

【００１８】すなわち、本発明はシアル酸転移酵素をコ
ードする遺伝子およびマルトース結合蛋白質をコードす
る遺伝子を組み込んだ発現ベクターで大腸菌を形質転換
し、該形質転換体を培養して、シアル酸転移酵素を生成
させ、培養物からシアル酸転移酵素を採取することを特
徴とするシアル酸転移酵素の製造法である。

【００１９】

【発明の実施の形態】本発明において、シアル酸転移酵
素とは、α２−３、α２−６、α２−８などの結合様式
でシアル酸を種々の糖に転移する基質特異性の異なる酵
素である。具体的にはα２−６シアル酸転移酵素または
α２−３シアル酸転移酵素が例示される。

【００２０】α２−６シアル酸転移酵素とは、ＣＭＰ−
シアル酸を糖供与体として、Ｎ−結合型糖鎖、ポリラク
トサミンまたは糖脂質のＧａｌβ１−４／３ＧｌｃＮＡ
ｃのガラクトース残基にシアル酸を転移し、シアル酸と
ガラクトースにα２−６結合を形成する反応を触媒する
酵素であり、糖蛋白質、糖脂質のどちらの糖鎖のガラク
トースにも作用する。本発明において、α２−６シアル
酸転移酵素をコードする遺伝子は、ヒト、マウス、ラッ
ト組織由来のｃＤＮＡから単離された遺伝子である。ヒ
ト肝臓由来のα２−６シアル酸転移酵素の遺伝子は、そ
のアミノ酸配列および塩基配列が既に決定されており、
配列番号１および２に示される。

【００２１】また、α２−３シアル酸転移酵素をコード
する遺伝子は、ヒト、マウス、ラット組織由来のｃＤＮ
Ａから単離された遺伝子であり、ラット肝臓からＧａｌ
β１─４ＧｌｃＮＡｃを受容体とするα２−３シアル酸
転移酵素遺伝子、ブタ肝臓からＧａｌβ１−３ＧａｌＮ
Ａｃを受容体とするα２−３シアル酸転移酵素遺伝子が
単離されている。アミノ酸配列は、配列番号５および６
に示される。

【００２２】本発明では、α２−６シアル酸転移酵素の
発現には、配列番号２に示されるアミノ酸配列（ヒト肝
臓由来のα２−６シアル酸転移酵素）をコードする遺伝
子または配列番号２に示されるアミノ酸配列から膜貫通
部位に相当するアミノ酸配列を削除したアミノ酸配列を
コードする遺伝子を使用する。膜貫通部位に相当するア
ミノ酸配列は、Ｎ末端側に存在し、細胞質尾部とよばれ
るアミノ酸配列（例、リジン又はアルギニン）に、続い
て数十個のアミノ酸配列を有する。具体的な一例として
は、その部位は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１
番目から４３番目のアミノ酸配列の間の領域にある。

【００２３】本発明では、α２−６シアル酸転移酵素の
発現には、具体例として、配列番号２に示されるアミノ
酸配列の４４番目から４０６番目までのアミノ酸配列を
コードする遺伝子を用いる。さらに、具体的には、配列
番号１に示される塩基配列の１３０番目から１２２１番
目までの塩基配列を利用してもよい。

【００２４】また、本発明ではα２−３シアル酸転移酵
素の発現には、配列番号６に示されるアミノ酸配列（ヒ
ト骨格筋由来のα２−３シアル酸転移酵素）をコードす
る遺伝子または配列番号６に示されるアミノ酸配列から
膜貫通部位に相当するアミノ酸配列を削除したアミノ酸
配列をコードする遺伝子を使用する。膜貫通部位に相当
するアミノ酸配列の具体的な一例としては、配列番号６
に示されるアミノ酸配列の１番目から６１番目のアミノ
酸配列の間の領域にある。

【００２５】本発明では、α２−３シアル酸転移酵素の
発現には、具体例として、配列番号６に示されるアミノ
酸配列の６２番目から３７５番目までのアミノ酸配列を
コードする遺伝子を用いる。さらに、具体的には、配列
番号５に示される塩基配列の１８４番目から１１２８番
目までの塩基配列を利用してもよい。

【００２６】本発明のマルトース結合タンパク質をコー
ドする遺伝子は、New England Biolab社製のｐＭＡＬ−
ｐ２あるいはｐＭＡＬ−ｃ２に由来する遺伝子である。
この遺伝子は、 Kelleman ら、Methods in Enzymol.,9
0,459-464,1982 にも記載される。

【００２７】本発明の発現ベクターとは、上記シアル酸
転移酵素をコードする遺伝子をマルトース結合蛋白質を
コードする遺伝子を含むプラスミド、例えばｐＭＡＬ−
ｐ２あるいはｐＭＡＬ−ｃ２のマルチクローニングサイ
トに挿入することにより作製される。例えば、α２−６
シアル酸転移酵素を発現させる時は、例えばヒト肝臓由
来のα２−６シアル酸転移酵素をコードする遺伝子、ま
た、α２−３シアル酸転移酵素を発現させる時は、例え
ばヒト骨格筋由来のα２−３シアル酸転移酵素をコード
する遺伝子をマルトース結合蛋白質をコードする遺伝子
を含むプラスミド、例えばｐＭＡＬ−ｐ２あるいはｐＭ
ＡＬ−ｃ２のマルチクローニングサイトに挿入すること
により作製される。

【００２８】本発明の発現ベクターの１つ、ｐＭｓ２６
ＳＴは、配列番号２のアミノ酸配列の４４番目から４０
６番目までのアミノ酸配列をコードするヒト由来α２−
６シアル酸転移酵素遺伝子断片およびマルト−ス結合蛋
白質をコ−ドする遺伝子を含む。その一例としては、配
列番号１の塩基配列の１３０番目から１２２１番目まで
の配列を含むヒト由来α２−６シアル酸転移酵素遺伝子
断片およびマルトース結合蛋白質をコードする遺伝子を
含む。

【００２９】本発明において使用する宿主細胞は、大腸
菌である。発現ベクターで形質転換する大腸菌として
は、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＢＬ−２１株、ＪＭ１
０７株、ＴＢ１株、ＪＭ１０９株、Ｃ６００株、ＨＢ１
０１株などが挙げられる。

【００３０】具体的に、ヒト肝臓由来α２−６シアル酸
転移酵素をコードする遺伝子を取得する場合、配列番号
２のアミノ酸配列の７番目からＮ末に近いプライマー
（配列番号３）および４０１番目から４０６番目のアミ
ノ酸をコードする塩基配列を含むプライマー（配列番号
４）を合成し、これらのプライマーを用いたＰＣＲを行
い、ＰＣＲ産物を得、必要に応じて制限酵素などを用
い、得られたＰＣＲ産物を切断することにより、ＤＡＮ
断片を得ることができる。

【００３１】また、必要に応じて該ＤＮＡ断片をいくつ
かの断片に分けて、ＰＣＲ産物を得た後、適当な条件で
ライゲーションして全長のｃＤＮＡを得ることができ
る。さらに用いるプライマーは、その後、ライゲーショ
ンやサブクローニングに有効なように、通常、制限酵素
切断部位をもつように設計することが好ましい。このよ
うな方法で、α２−３シアル酸転移酵素をコードする遺
伝子も取得される。

【００３２】次いで、配列番号３および４で表されるプ
ライマーを用いて得られたＰＣＲ産物を適切な制限酵素
で切断し、ベクターへの挿入ＤＮＡ断片とする。

【００３３】得られたＤＮＡ断片を適当なプラスミドベ
クター、例えばＭ１３ｍｐ１８ベクター、Ｍ１３ｍｐ１
９ベクター、ｐＵＣ１８ベクター、pBluescript ベクタ
ーなどにサブクロ−ニングし、適当な宿主大腸菌、例え
ば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＪＭ１０９株などに形質転換
し、該形質転換株を培養し、該プラスミドを大量に得
る。

【００３４】次いで、該プラスミドから、例えば制限酵
素、EcoRI およびPstIで切断することにより、それぞれ
の転移酵素を発現するＤＮＡ断片を得ることができる。
得られたＤＮＡ断片を、例えばｐＭＡＬ−ｐ２あるいは
ｐＭＡＬ−ｃ２のマルチクローニングサイトに挿入する
ことにより、本発明の発現ベクターを作製することがで
きる。

【００３５】発現ベクターで形質転換する宿主細胞とし
ては、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＢＬ−２１株、ＪＭ
１０７株、ＴＢ１株、ＪＭ１０９株、Ｃ６００株、ＨＢ
１０１株などが例示される。形質転換法としては、塩化
カルシウム法やエレクトロポレ−ション法などが挙げら
れる。

【００３６】本発明のα２−６シアル酸転移酵素の製造
法は、α２−６シアル酸転移酵素をコードする遺伝子お
よびマルトース結合蛋白質をコードする遺伝子を組み込
んだ発現ベクターで大腸菌を形質転換し、該形質転換株
を培養して、α２−６シアル酸転移酵素およびマルトー
ス結合蛋白質からなる融合蛋白質を生成させ、これより
α２−６シアル酸転移酵素を製造する。α２−３シアル
酸転移酵素の製造法も同様である。

【００３７】培養は、常法に従い、適当な培地で行う。
例えば、０．２％グルコ−ス、５０μｇ／mlアンピシリ
ンを添加したＬＢ培地で、２０〜４０℃で培養し、対数
増殖期初期、例えば培養液の６６０ｎｍにおける吸光度
が０．４〜０．６の時に、イソプロピルチオ−β−Ｄ−
ガラクトシドを０．１〜１．０ｍＭ添加し、さらに、１
〜４時間培養する。

【００３８】シアル酸転移酵素の精製は、常法に従い、
超音波破砕などによる菌体破砕後、遠心分離し、上清を
硫安塩析、除核酸処理、種々のカラムクロマトグラフィ
ーを用いて行う。目的に応じて、転移酵素活性のある融
合蛋白質として採取するか、あるいは、さらに、例えば
ファクタ−Ｘａを使用して融合蛋白質を分解し、α２−
６シアル酸転移酵素またはα２−３シアル酸転移酵素を
採取する。ファクタ−Ｘａによる融合蛋白質の分解は、
中性の緩衝液中で、４〜４０℃で、１〜２５時間反応さ
せることにより行う。

【００３９】

【実施例】以下に、実施例により本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるもので
はない。実施例１ α２−６シアル酸転移酵素ｃＤＮＡの取得 配列番号３および４に示されるオリゴヌクレオチドを合
成して、ＰＣＲ用プライマーとした。ヒト肝臓由来のｃ
ＤＮＡ (Quick Clone : Clontech社製) を鋳型とし、こ
れらのプライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ、ｄＮＴ
ＰおよびＰｆｕポリメラーゼ (Stratagene社製）１００
単位を含むＰＣＲ用試薬を使用して、ＰＣＲを行った。
反応液は５０μｌであり、９４℃（１分間）、５５℃
（１分間）、７２℃（１分間）を１サイクルとして、３
０サイクルのＬｏｎｇ ＰＣＲを行った。

【００４０】また、配列番号３および４に示されるＰＣ
Ｒ用プライマーを用い、ヒト胎盤由来のｃＤＮＡ (Clon
tech社製）を鋳型にして、同様にＰＣＲを行った。ＰＣ
Ｒ後、反応液をアガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ
産物であるＤＮＡ断片の確認を行った。その結果、それ
ぞれ約１２２０ｂｐのＤＮＡ断片が得られていることが
わかった。

【００４１】これらのＤＮＡ断片を常法により塩基配列
の確認を行い、配列番号１の塩基配列を有することを確
認し、該ＤＮＡ断片がα２−６シアル酸転移酵素遺伝子
を含む遺伝子断片（１２２１ｂｐ）であることを確認し
た。

【００４２】実施例２ 発現ベクターｐＭｓ２６ＳＴの
構築 実施例１で得られたＤＮＡ断片（ヒト肝臓由来ｃＤＮ
Ａ）をプラスミドＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭ (Stratage
ne社製) の制限酵素、SrFIサイトに挿入し、プラスミド
ＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭ６Ｔを得た。このプラスミド
で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換の条件
は、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル１００μｌに上
記プラスミド溶液 (100g/ml)１μｌを加え、氷浴中で３
０分間、４２℃で１分１５秒間、水浴中で５分間、ＳＯ
Ｃ培地９００μｌを加え、３７℃で１時間培養した。

【００４３】得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、得られた菌体から
プラスミドＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭ６Ｔを常法に従い
抽出した。このプラスミドを制限酵素、EcoRI 、PstIで
切断後、アガロ−ス電気泳動を行い、シアル酸転移酵素
をコードするEcoRI-PstIＤＮＡ断片（1111塩基）を得
た。該断片はＮ末端から４３個のアミノ酸が削除された
α２−６シアル酸転移酵素遺伝子を含む。

【００４４】他方、ベクタープラスミドｐＭＡＬ−ｐ２
（New England Biolab社製）を制限酵素、EcoRI および
PstIで切断後、同様にアガロース電気泳動を行い、リニ
アなベクターを調製した。得られた両断片をＤＮＡライ
ゲーションキット（東洋紡製）を用いて、ライゲーショ
ンさせ、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養後、プ
ラスミドｐＭｓ２６ＳＴを得た。

【００４５】実施例３ 遺伝子組換え大腸菌を用いたα
２−６シアル酸転移酵素−マルトース結合蛋白質融合蛋
白の調製 実施例２で得た発現ベクターｐＭｓ２６ＳＴで大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換し、得られた組換え大腸菌０．３
ｍｌを０．１％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢ培地３０ｍｌの入った坂口フラスコ
に植菌し、３７℃で３時間および２５℃で１時間、６０
０ｒｐｍ振とう培養した。その後、イソプロピルチオ−
β−Ｄ−ガラクトシドを０．１ｍＭになるように加え
た。さらに、培養を４時間続け、培養液１ｍｌを遠心分
離し、菌体を遠心分離にて集め、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＮａＮ₃ 、１ｍＭ β−
メルカプトエタノールを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）０．１ｍｌで再懸濁した。懸濁液を超
音波破砕装置にて処理し、遠心分離し、その上清を粗融
合蛋白質溶液（菌体破砕粗酵素液）とした。

【００４６】実施例４ マルト−ス融合タンパクのα２
−６シアル酸転移酵素活性の確認 実施例３で得た菌体破砕粗酵素液のα２−６シアル酸転
移酵素活性の確認するために、シチジン−５’−モノホ
スホシアル酸０．２ｍＭ、下記化１で表されるピリジル
アミノ化オリゴ糖０．１μＭおよび菌体破砕粗酵素液１
０μｌおよび２０μｌを含む２５ｍＭカコジル酸緩衝液
（ｐＨ７．５）反応液５０μｌを３７℃で１時間反応さ
せた。比較のために、ｐＭＡＬ−ｐ２ベクターを導入し
た大腸菌ＪＭ１０９を同様に培養し、菌体を破砕し、コ
ントロールとした。

【００４７】

【化１】

【００４８】反応後、沸騰水中で２分間インキュベート
することにより反応を停止させた。反応液１０μｌをＨ
ＰＬＣで分析することにより、シアル酸が転移した生成
物（化２）を確認した。

【００４９】

【化２】

【００５０】図１〜３には、それぞれのＨＰＬＣの結果
を示す。ＨＰＬＣの条件は、カラム：YMC-Pack ODS-A,
Eluent:(A)100mM acetic acid-triethylamine (pH4.0),
(B)100mM acetic acid-triethylamine (pH4.0) contai
ning 0.5% 1-butanol, (A):(B)= 65:35, Flow Rate:1.0
ml/min., Detection: fluorescence (Ex.320nm, Em.400
nm), Column Temp.:40℃ 図１はコントロール（ｐＭＡＬ−ｐ２）のＨＰＬＣであ
り、図２は菌体破砕粗酵素液１０μｌを加え、１時間反
応させた反応液のＨＰＬＣであり、図３は菌体破砕粗酵
素液２０μｌを加え、１時間反応させた反応液のＨＰＬ
Ｃである。各図のピーク１はＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ３
ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＡ（受容体）、ピーク２は生成物で
あり、標準品、Ｎｅｕ５Ａｃ−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ
３ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＡ (宝酒造製) と溶出位置が一致
し、シアル酸転移生成物、Ｎｅｕ５Ａｃ−ＧｌｃＮＡｃ
２−Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＡであることが確認さ
れた。ＰＡとは、２−アミノピリジンを示す。

【００５１】実施例５ α２−３シアル酸転移酵素ｃＤ
ＮＡの取得 配列番号８および９に示されるオリゴヌクレオチドを合
成して、ＰＣＲ用プライマーとした。ヒト骨格由来のｃ
ＤＮＡ (Quick Clone : Clontech社製) を鋳型にし、こ
れらのプライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ、ｄＮＴ
ＰおよびＰｆｕポリメラーゼ (Stratagene社製）１００
単位を含むＰＣＲ用試薬を使用して、ＰＣＲを行った。
反応液は５０μｌであり、９４℃（１分間）、５５℃
（１分間）、７２℃（１分間）を１サイクルとして、３
０サイクルのＬｏｎｇ ＰＣＲを行った。

【００５２】ＰＣＲ後、反応液をアガロースゲル電気泳
動によりＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片の確認を行った。
その結果、それぞれ約１１３０ｂｐのＤＮＡ断片が得ら
れていることがわかった。

【００５３】常法により、これらのＤＮＡ断片の塩基配
列を決定し、配列番号５の塩基配列を有することを確認
し、これらのＤＮＡ断片がα２−３シアル酸転移酵素遺
伝子を含む遺伝子断片（１１２８ｂｐ）であることが確
認された。

【００５４】実施例６ α２−３シアル酸転移酵素遺伝
子が正方向に挿入されたｐＭＡＬ−ｐ２ベクターの構築 実施例５で得られたα２−３シアル酸転移酵素遺伝子
（ヒト骨格筋由来ｃＤＮＡ）をプラスミドＰＣＲ−Ｓｃ
ｒｉｐｔＴＭＡｍｐＳＫ（＋） (Stratagene社製) ベク
ターを制限酵素、NotIおよびBamHI で切断し、アガロー
スゲル電気泳動でα２−３シアル酸転移酵素遺伝子を含
むＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ (DNA Blunting
Kit、宝酒造社製) によって、平滑末端にした。ｐＭＡ
Ｌ−ｐ２ベクターは、SalIで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼによって平滑末端にし、上記平滑末端にしたα２
−３シアル酸転移酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片とライゲ
ーションした。ライゲーション後、大腸菌ＪＭ１０９に
形質転換した。複数の形質転換体からプラスミドを調製
し、正方向にα２−３シアル酸転移酵素遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片が挿入されたｐＭＡＬ−ｐ２ベクターを選ん
だ。

【００５５】実施例７ α２−３シアル酸転移酵素遺伝
子の膜貫通領域の除去 配列番号９に示されるオリゴヌクレオチドをディリーシ
ョンプライマーとして、Qantum LeapTM Nested Deletio
n Kit (Clontech 社製) を用いて、上記ベクターからα
２−３シアル酸転移酵素遺伝子の膜貫通領域を含む６１
個のアミノ酸に相当する遺伝子の削除を行った。

【００５６】正方向にα２−３シアル酸転移酵素遺伝子
を含むＤＮＡ断片が挿入されたｐＭＡＬ−ｐ２ベクター
１００ｎｇとディリーションプライマー２００ｎｇをア
ニーリングバッファー２００ｎｇをアニーリングバッフ
ァー中で１００℃、３分間加熱後、シンセシスバッファ
ー、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡライゲースを
加え、１６℃で１０分間、３７℃で２時間、７０℃で５
分間の反応を行った。

【００５７】制限酵素、XbaIで未改変ベクターを切断
後、BMH71-18musSエレクトロセル（宝酒造社製) に形質
転換した。複数の形質転換体からプラスミドを調製し、
ＤＮＡ配列決定を行い、マルトース結合性蛋白質にイン
フレームで、Ｎ末端から６１個のアミノ酸が削除された
α２−３シアル酸転移酵素遺伝子が融合して発現した形
質転換体（以下、保持されている発現ベクターをｐＭｓ
２３ＳＴと呼ぶ）を選んだ。

【００５８】実施例８ 遺伝子組換え大腸菌を用いたα
２−３シアル酸転移酵素−マルトース結合蛋白質融合蛋
白の調製 実施例７で得た発現ベクターｐＭｓ２３ＳＴで大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換し、得られた組換え大腸菌０．３
ｍｌを０．１％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢ培地３０ｍｌの入った坂口フラスコ
に植菌し、３７℃で３時間及び２５℃で１時間、６００
ｒｐｍ振とう培養した。その後、イソプロピルチオ−β
−Ｄ−ガラクトシドを０．１ｍＭになるように加えた。
さらに、培養を４時間続け、培養液１ｍｌを遠心分離
し、菌体を遠心分離にて集め、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．
２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＮａＮ₃ 、１ｍＭ β−メル
カプトエタノールを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）０．１ｍｌで再懸濁した。懸濁液を超音
波破砕装置にて処理し、遠心分離し、その上清を粗融合
蛋白質溶液（菌体破砕粗酵素液）とした。

【００５９】実施例９ マルト−ス融合タンパクのα２
−３シアル酸転移酵素活性の確認 実施例８で得た菌体破砕粗酵素液のα２−３シアル酸転
移酵素活性の確認するために、シチジン−５’−モノホ
スホシアル酸０．２ｍＭ、Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ
で表されるピリジルアミノ化オリゴ糖０．１μＭおよび
菌体破砕粗酵素液１０μｌおよび２０μｌを含む２５ｍ
Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ６．０）反応液５０μｌを３
７℃で１時間反応させた。比較のために、ｐＭＡＬ−ｐ
２ベクターを導入した大腸菌ＪＭ１０９を同様に培養
し、菌体を破砕し、コントロールとした。

【００６０】反応後、沸騰水中で２分間インキュベート
することにより反応を停止させた。反応液１０μｌをＨ
ＰＬＣで分析することにより、シアル酸が転移した生成
物を確認した。

【００６１】図４〜６にそれぞれのＨＰＬＣの結果を示
す。図４はコントロール（ｐＭＡＬ−ｐ２）のＨＰＬＣ
であり、図５は菌体破砕粗酵素液１０μｌを加え、１時
間反応させた反応液のＨＰＬＣであり、図６は菌体破砕
粗酵素液２０μｌを加え、１時間反応させた反応液のＨ
ＰＬＣである。各図のピーク１はＧａｌβ１−４Ｇｌｃ
−ＰＡ（受容体）、ピーク２は生成物であり、標準品、
Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ (宝
酒造製) と溶出位置が一致し、シアル酸転移生成物、Ｎ
ｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡである
ことが確認された。

【００６２】

【発明の効果】本発明では、従来、大腸菌ではインクル
ージョンボディしか産生できなかったシアル転移酵素を
活性ある可溶性蛋白質として発現させることを可能にす
る。また、本発明方法では、α２−６シアル酸転移酵素
を容易に効率よく大量に生産することができる。また、
得られたα２−６シアル酸転移酵素を利用することによ
り、診断等に有用な抗体α２−６−シアル酸転移酵素抗
体を容易に得ることができる。該酵素の融合蛋白質ある
いはマルト−ス結合蛋白を分解除去したα２−６シアル
酸転移酵素を用いて、シアル酸の転移反応に容易に使用
することができる。

【００６３】本発明方法は、ヒト由来α２−６シアル酸
転移酵素に限定されるものでなく、他起源由来α２−６
シアル酸転移酵素の発現にも有効であるばかりでなく、
広く高等動物由来のα２−３シアル酸転移酵素、α２−
８シアル酸転移酵素に適用されるものである。

【００６４】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：1221 配列の型 ：核酸 鎖の長さ：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の特徴： 起源: ヒト肝臓 配列 ATG ATT CAC ACC AAC CTG AAG AAA AAG TTC AGC TGC TGC GTC CTG GTC 48 Met Ile His Thr Asn Leu Lys Lys Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val 1 5 10 15 TTT CTT CTG TTT GCA GTC ATC TGT GTG TGG AAG GAA AAG AAG AAA GGG 96 Phe Leu Leu Phe Ala Val Ile Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly 20 25 30 AGT TAC TAT GAT TCC TTT AAA TTG CAA ACC AAG GAA TTC CAG GTG TTA 144 Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gln Thr Lys Glu Phe Gln Val Leu 35 40 45 AAG AGT CTG GGG AAA TTG GCC ATG GGG TCT GAT TCC CAG TCT GTA TCC 192 Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser Gln Ser Val Ser 50 55 60 TCA AGC AGC ACC CAG GAC CCC CAC AGG GGC CGC CAG ACC CTC GGC AGT 240 Ser Ser Ser Thr Gln Asp Pro His Arg Gly Arg Gln Thr Leu Gly Ser 65 70 75 80 CTC AGA GGC CTA GCC AAG GCC AAA CCA GAG GCC TCC TTC CAG GTG TGG 288 Leu Arg Gly Leu Ala Lys Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gln Val Trp 85 90 95 AAC AAG GAC AGC TCT TCC AAA AAC CTT ATC CCT AGG CTG CAA AAG ATC 336 Asn Lys Asp Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gln Lys Ile 100 105 110 TGG AAG AAT TAC CTA AGC ATG AAC AAG TAC AAA GTG TCC TAC AAG GGG 384 Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Phe Ser Ala Glu Ala Leu Arg Cys His Leu 115 120 125 CCA GGA CCA GGC ATC AAG TTC AGT GCA GAG GCC CTG CGC TGC CAC CTC 432 Arg Asp His Val Asn Val Ser Met Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser Tyr 130 135 140 CGG GAC CAT GTG AAT GTA TCC ATG GTA GAG GTC ACA GAT TTT CCC TTC 480 Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ile Lys Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe 145 150 155 160 AAT ACC TCT GAA TGG GAG GGT TAT CTG CCC AAG GAG AGC ATT AGG ACC 528 Asn Thr Ser Glu Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr 165 170 175 AAG GCT GGG CCT TGG GGC AGG TGT GCT GTT GTG TCG TCA GCG GGA TCT 576 Lys Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala Gly Ser 180 185 190 CTG AAG TCC TCC CAA CTA GGC AGA GAA ATC GAT GAT CAT GAC GCA GTC 624 Leu Lys Ser Ser Gln Leu Gly Arg Glu Ile Asp Asp His Asp Ala Val 195 200 205 CTG AGG TTT AAT GGG GCA CCC ACA GCC AAC TTC CAA CAA GAT GTG GGC 672 Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr Ala Asn Phe Gln Gln Asp Val Gly 210 215 220 ACA AAA ACT ACC ATT CGC CTG ATG AAC TCT CAG TTG GTT ACC ACA GAG 720 Thr Lys Thr Thr Ile Arg Leu Met Asn Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu 225 230 235 240 AAG CGC TTC CTC AAA GAC AGT TTG TAC AAT GAA GGA ATC CTA ATT GTA 768 Lys Arg Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile Val 245 250 255 TGG GAC CCA TCT GTA TAC CAC TCA GAT ATC CCA AAG TGG TAC CAG AAT 816 Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys Trp Tyr Gln Asn 260 265 270 CCG GAT TAT AAT TTC TTT AAC AAC TAC AAG ACT TAT CGT AAG CTG CAC 864 Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His 275 280 285 CCC AAT CAG CCC TTT TAC ATC CTC AAG CCC CAG ATG CCT TGG GAG CTA 912 Pro Asn Gln Pro Phe Tyr Ile Leu Lys Pro Gln Met Pro Trp Glu Leu 290 295 300 TGG GAC ATT CTT CAA GAA ATC TCC CCA GAA GAG ATT CAG CCA AAC CCC 960 Trp Asp Ile Leu Gln Glu Ile Ser Pro Glu Glu Ile Gln Pro Asn Pro 305 310 315 320 CCA TCC TCT GGG ATG CTT GGT ATC ATC ATC ATG ATG ACG CTG TGT GAC 1008 Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr Leu Cys Asp 325 330 335 CAG GTG GAT ATT TAT GAG TTC CTC CCA TCC AAG CGC AAG ACT GAC GTG 1056 Gln Val Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser Lys Arg Lys Thr Asp Val 340 345 350 TGC TAC TAC TAC CAG AAG TTC TTC GAT AGT GCC TGC ACG ATG GGT GCC 1114 Cys Tyr Tyr Tyr Gln Lys Phe Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala 355 360 365 TAC CAC CCG CTG CTC TAT GAG AAG AAT TTG GTG AAG CAT CTC AAC CAG 1162 Tyr His Pro Leu Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gln 370 375 380 GGC ACA GAT GAG GAC ATC TAC CTG CTT GGA AAA GCC ACA CTG CCT GGC 1210 Gly Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Pro Gly 385 390 395 400 TTC CGG ACC ATT CAC TGC TAA 1221 Phe Arg Thr Ile His Cys 405

【００６５】配列番号：２ 配列の長さ：406 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 起源：ヒト肝臓 配列 Met Ile His Thr Asn Leu Lys Lys Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val 1 5 10 15 Phe Leu Leu Phe Ala Val Ile Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly 20 25 30 Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gln Thr Lys Glu Phe Gln Val Leu 35 40 45 Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser Gln Ser Val Ser 50 55 60 Ser Ser Ser Thr Gln Asp Pro His Arg Gly Arg Gln Thr Leu Gly Ser 65 70 75 80 Leu Arg Gly Leu Ala Lys Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gln Val Trp 85 90 95 Asn Lys Asp Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gln Lys Ile 100 105 110 Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Phe Ser Ala Glu Ala Leu Arg Cys His Leu 115 120 125 Arg Asp His Val Asn Val Ser Met Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser Tyr 130 135 140 Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ile Lys Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe 145 150 155 160 Asn Thr Ser Glu Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr 165 170 175 Lys Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala Gly Ser 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Gln Leu Gly Arg Glu Ile Asp Asp His Asp Ala Val 195 200 205 Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr Ala Asn Phe Gln Gln Asp Val Gly 210 215 220 Thr Lys Thr Thr Ile Arg Leu Met Asn Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu 225 230 235 240 Lys Arg Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile Val 245 250 255 Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys Trp Tyr Gln Asn 260 265 270 Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His 275 280 285 Pro Asn Gln Pro Phe Tyr Ile Leu Lys Pro Gln Met Pro Trp Glu Leu 290 295 300 Trp Asp Ile Leu Gln Glu Ile Ser Pro Glu Glu Ile Gln Pro Asn Pro 305 310 315 320 Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr Leu Cys Asp 325 330 335 Gln Val Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser Lys Arg Lys Thr Asp Val 340 345 350 Cys Tyr Tyr Tyr Gln Lys Phe Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala 355 360 365 Tyr His Pro Leu Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gln 370 375 380 Gly Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Pro Gly 385 390 395 400 Phe Arg Thr Ile His Cys 405

【００６６】配列番号：３ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGATTCACA CCAACCTGAA G 21

【００６７】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTAGCAGTGA ATGGTCCGGA A 21

【００６８】配列番号：５ 配列の長さ：1128 配列の型：核酸 鎖の数：2本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：cDNA to mRNA 起源：ヒト骨格筋 配列 ATG GGA CTC TTG GTA TTT GTG CGC AAT CTG CTG CTA GCC CTC TGC CTC 48 Met Gly Leu Leu Val Phe Val Arg Asn Leu Leu Leu Ala Leu Cys Leu 1 5 10 15 TTT CTG GTA CTG GGA TTT TTG TAT TAT TCT GCG TGG AAG CTA CAC TTA 96 Phe Leu Val Leu Gly Phe Leu Tyr Tyr Ser Ala Trp Lys Leu His Leu 20 25 30 CTC CAG TGG GAG GAG GAC TCC AAT TCA GTG GTT CTT TCC TTT GAC TCC 144 Leu Gln Trp Glu Glu Asp Ser Asn Ser Val Val Leu Ser Phe Asp Ser 35 40 45 GCT GGA CAA ACA CTA GGC TCA GAG TAT GAT CGG TTG GGC TTC CTC CTG 192 Ala Gly Gln Thr Leu Gly Ser Glu Tyr Asp Arg Leu Gly Phe Leu Leu 50 55 60 AAT CTG GAC TCT AAA CTG CCT GCT GAA TTA GCC ACC AAG TAC GCA AAC 240 Asn Leu Asp Ser Lys Leu Pro Ala Glu Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Asn 65 70 75 80 TTT TCA GAG GGA GCT TGC AAG CCT GGC TAT GCT TCA GCC TTG ATG ACG 288 Phe Ser Glu Gly Ala Cys Lys Pro Gly Tyr Ala Ser Ala Leu Met Thr 85 90 95 GCC ATC TTC CCC CGG TTC TCC AAG CCA GCA CCC ATG TTC CTG GAT GAC 336 Ala Ile Phe Pro Arg Phe Ser Lys Pro Ala Pro Met Phe Leu Asp Asp 100 105 110 TCC TTT CGC AAG TGG GCT AGA ATC CGG GAG TTC GTG CCG CCT TTT GGG 384 Ser Phe Arg Lys Trp Ala Arg Ile Arg Glu Phe Val Pro Pro Phe Gly 115 120 125 ATC AAA GGT CAA GAC AAT CTG ATC AAA GCC ATC TTG TCA GTC ACC AAA 432 Ile Lys Gly Gln Asp Asn Leu Ile Lys Ala Ile Leu Ser Val Thr Lys 130 135 140 GAG TAC CGC CTG ACC CCT GCC TTG GAC AGC CTC CGC TGC CGC CGC TGC 480 Glu Tyr Arg Leu Thr Pro Ala Leu Asp Ser Leu Arg Cys Arg Arg Cys 145 150 155 160 ATC ATC GTG GGC AAT GGA GGC GTT CTT GCC AAC AAG TCT CTG GGG TCA 528 Ile Ile Val Gly Asn Gly Gly Val Leu Ala Asn Lys Ser Leu Gly Ser 165 170 175 CGA ATT GAC GAC TAT GAC ATT GTG GTG AGA CTG AAT TCA GCA CCA GTG 576 Arg Ile Asp Asp Tyr Asp Ile Val Val Arg Leu Asn Ser Ala Pro Val 180 185 190 AAA GGC TTT GAG AAG GAC GTG GGC AGC AAA ACG ACA CTG CGC ATC ACC 624 Lys Gly Phe Glu Lys Asp Val Gly Ser Lys Thr Thr Leu Arg Ile Thr 195 200 205 TAC CCC GAG GGC GCC ATG CAG CGG CCT GAG CAG TAC GAG CGC GAT TCT 672 Tyr Pro Glu Gly Ala Met Gln Arg Pro Glu Gln Tyr Glu Arg Asp Ser 210 215 220 CTC TTT GTC CTC GCC GGC TTC AAG TGG CAG GAC TTT AAG TGG TTG AAA 720 Leu Phe Val Leu Ala Gly Phe Lys Trp Gln Asp Phe Lys Trp Leu Lys 225 230 235 240 TAC ATC GTC TAC AAG GAG AGA GTG AGT GCA TCG GAT GGC TTC TGG AAA 768 Tyr Ile Val Tyr Lys Glu Arg Val Ser Ala Ser Asp Gly Phe Trp Lys 245 250 255 TCT GTG GCC ACT CGA GTG CCC AAG GAG CCC CCT GAG ATT CGA ATC CTC 816 Ser Val Ala Thr Arg Val Pro Lys Glu Pro Pro Glu Ile Arg Ile Leu 260 265 270 AAC CCA TAT TTC ATC CAG GAG GCC GCC TTC ACC CTC ATT GGC CTG CCC 864 Asn Pro Tyr Phe Ile Gln Glu Ala Ala Phe Thr Leu Ile Gly Leu Pro 275 280 285 TTC AAC AAT GGC CTC ATG GGC CGG GGG AAC ATC CCT ACC CTT GGC AGT 912 Phe Asn Asn Gly Leu Met Gly Arg Gly Asn Ile Pro Thr Leu Gly Ser 290 295 300 GTG GCA GTG ACC ATG GCA CTA CAC GGC TGT GAC GAG GTG GCA GTC GCA 960 Val Ala Val Thr Met Ala Leu His Gly Cys Asp Glu Val Ala Val Ala 305 310 315 320 GGA TTT GGC TAT GAC ATG AGC ACA CCC AAC GCA CCC CTG CAC TAC TAT 1008 Gly Phe Gly Tyr Asp Met Ser Thr Pro Asn Ala Pro Leu His Tyr Tyr 325 330 335 GAG ACC GTT CGC ATG GCA GCC ATC AAA GAG TCC TGG ACG CAC AAT ATC 1056 Glu Thr Val Arg Met Ala Ala Ile Lys Glu Ser Trp Thr His Asn Ile 340 345 350 CAG CGA GAG AAA GAG TTT CTG CGG AAG CTG GTG AAA GCT CGC GTC ATC 1104 Gln Arg Glu Lys Glu Phe Leu Arg Lys Leu Val Lys Ala Arg Val Ile 355 360 365 ACT GAT CTA AGC AGT GGC ATC TGA 1128 Thr Asp Leu Ser Ser Gly Ile 370 375

【００６９】配列番号：６ 配列の長さ：375 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：タンパク質 起源：ヒト骨格筋 配列 Met Gly Leu Leu Val Phe Val Arg Asn Leu Leu Leu Ala Leu Cys Leu 1 5 10 15 Phe Leu Val Leu Gly Phe Leu Tyr Tyr Ser Ala Trp Lys Leu His Leu 20 25 30 Leu Gln Trp Glu Glu Asp Ser Asn Ser Val Val Leu Ser Phe Asp Ser 35 40 45 Ala Gly Gln Thr Leu Gly Ser Glu Tyr Asp Arg Leu Gly Phe Leu Leu 50 55 60 Asn Leu Asp Ser Lys Leu Pro Ala Glu Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Asn 65 70 75 80 Phe Ser Glu Gly Ala Cys Lys Pro Gly Tyr Ala Ser Ala Leu Met Thr 85 90 95 Ala Ile Phe Pro Arg Phe Ser Lys Pro Ala Pro Met Phe Leu Asp Asp 100 105 110 Ser Phe Arg Lys Trp Ala Arg Ile Arg Glu Phe Val Pro Pro Phe Gly 115 120 125 Ile Lys Gly Gln Asp Asn Leu Ile Lys Ala Ile Leu Ser Val Thr Lys 130 135 140 Glu Tyr Arg Leu Thr Pro Ala Leu Asp Ser Leu Arg Cys Arg Arg Cys 145 150 155 160 Ile Ile Val Gly Asn Gly Gly Val Leu Ala Asn Lys Ser Leu Gly Ser 165 170 175 Arg Ile Asp Asp Tyr Asp Ile Val Val Arg Leu Asn Ser Ala Pro Val 180 185 190 Lys Gly Phe Glu Lys Asp Val Gly Ser Lys Thr Thr Leu Arg Ile Thr 195 200 205 Tyr Pro Glu Gly Ala Met Gln Arg Pro Glu Gln Tyr Glu Arg Asp Ser 210 215 220 Leu Phe Val Leu Ala Gly Phe Lys Trp Gln Asp Phe Lys Trp Leu Lys 225 230 235 240 Tyr Ile Val Tyr Lys Glu Arg Val Ser Ala Ser Asp Gly Phe Trp Lys 245 250 255 Ser Val Ala Thr Arg Val Pro Lys Glu Pro Pro Glu Ile Arg Ile Leu 260 265 270 Asn Pro Tyr Phe Ile Gln Glu Ala Ala Phe Thr Leu Ile Gly Leu Pro 275 280 285 Phe Asn Asn Gly Leu Met Gly Arg Gly Asn Ile Pro Thr Leu Gly Ser 290 295 300 Val Ala Val Thr Met Ala Leu His Gly Cys Asp Glu Val Ala Val Ala 305 310 315 320 Gly Phe Gly Tyr Asp Met Ser Thr Pro Asn Ala Pro Leu His Tyr Tyr 325 330 335 Glu Thr Val Arg Met Ala Ala Ile Lys Glu Ser Trp Thr His Asn Ile 340 345 350 Gln Arg Glu Lys Glu Phe Leu Arg Lys Leu Val Lys Ala Arg Val Ile 355 360 365 Thr Asp Leu Ser Ser Gly Ile 370 375

【００７０】配列番号：７ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGGGACTCT TGGTATTTGT G 21

【００７１】配列番号：８ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCAGATGCCA CTGCTTAGAT G 21

【００７２】配列番号：９ 配列の長さ：45 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTCGGGATCG AGGGAAGGTT CCTCCTGAAT CTGGACTCTA AACTG 45

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドｐＭＡＬ−ｐ２のＨＰＬＣの結果
を示す図である。

【図２】 菌体破砕粗酵素液１０μｌのＨＰＬＣの結果
を示す図である。

【図３】 菌体破砕粗酵素液２０μｌのＨＰＬＣの結果
を示す図である。

【図４】 プラスミドｐＭＡＬ−ｐ２のＨＰＬＣの結果
を示す図である。

【図５】 菌体破砕粗酵素液１０μｌのＨＰＬＣの結果
を示す図である。

【図６】 菌体破砕粗酵素液２０μｌのＨＰＬＣの結果
を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 富士 祥聡 北海道札幌市北14条西１丁目グリーンハイ ム205

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シアル酸転移酵素をコードする遺伝子お
   よびマルトース結合蛋白質をコードする遺伝子を組み込
   んだ発現ベクターで大腸菌を形質転換し、該形質転換体
   を培養して、シアル酸転移酵素を生成させ、培養物から
   シアル酸転移酵素を採取することを特徴とするシアル酸
   転移酵素の製造法。
2. 【請求項２】 シアル酸転移酵素が、α２−６シアル酸
   転移酵素またはα２−３シアル酸転移酵素である請求項
   １記載のシアル酸転移酵素の製造法。
3. 【請求項３】 シアル酸転移酵素が、ヒト由来α２−６
   シアル酸転移酵素である請求項１記載のシアル酸転移酵
   素の製造法。
4. 【請求項４】 ヒト由来α２−６シアル酸転移酵素をコ
   ードする遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列
   をコードする遺伝子を含む請求項３記載のシアル酸転移
   酵素の製造法。
5. 【請求項５】 ヒト由来α２−６シアル酸転移酵素をコ
   ードする遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列
   から膜貫通部位に相当するアミノ酸配列を削除したアミ
   ノ酸配列をコードする遺伝子を含む請求項３記載のシア
   ル酸転移酵素の製造法。
6. 【請求項６】 ヒト由来α２−６シアル酸転移酵素をコ
   ードする遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列
   の４４番目から４０６番目までのアミノ酸配列をコード
   する遺伝子を含む請求項３記載のシアル酸転移酵素の製
   造法。
7. 【請求項７】 ヒト由来α２−６シアル酸転移酵素をコ
   ードする遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列の１
   ３０番目から１２２１番目までの塩基配列をを含む請求
   項３記載のシアル酸転移酵素の製造法。
8. 【請求項８】 シアル酸転移酵素が、ヒト由来α２−３
   シアル酸転移酵素である請求項１記載のシアル酸転移酵
   素の製造法。
9. 【請求項９】 ヒト由来α２−３シアル酸転移酵素をコ
   ードする遺伝子が、配列番号６に示されるアミノ酸配列
   をコードする遺伝子を含む請求項８記載のシアル酸転移
   酵素の製造法。
10. 【請求項１０】 ヒト由来α２−３シアル酸転移酵素を
    コードする遺伝子が、配列番号６に示されるアミノ酸配
    列から膜貫通部位に相当するアミノ酸配列を削除したア
    ミノ酸配列をコードする遺伝子を含む請求項８記載のシ
    アル酸転移酵素の製造法。
11. 【請求項１１】 ヒト由来α２−３シアル酸転移酵素を
    コードする遺伝子が、配列番号６に示されるアミノ酸配
    列の６２番目から３７５番目までのアミノ酸配列をコー
    ドする遺伝子を含む請求項８記載のシアル酸転移酵素の
    製造法。
12. 【請求項１２】 ヒト由来α２−３シアル酸転移酵素を
    コードする遺伝子が、配列番号５に示される塩基配列の
    １８４番目から１１２８番目までの塩基配列を含む請求
    項８記載のシアル酸転移酵素の製造法。
13. 【請求項１３】 マルトース結合蛋白質をコードする遺
    伝子が、ｐＭＡＬ−ｐ２あるいはｐＭＡＬ−ｃ２に由来
    する遺伝子である請求項１〜１２のいずれか１項記載の
    シアル酸転移酵素の製造法。
14. 【請求項１４】 発現ベクターがｐＭｓ２６ＳＴである
    請求項１〜７のいずれか１項記載のシアル酸転移酵素の
    製造法。
15. 【請求項１５】 発現ベクターがｐＭｓ２３ＳＴである
    請求項１または８〜１２のいずれか１項記載のシアル酸
    転移酵素の製造法。