JPH11137247A - β１，４−ガラクトース転移酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】大腸菌内でヒト由来β１，４−ガラクトール転
移酵素を安価に効率良く生産する方法を提供する。 【解決手段】ヒト由来β１，４−ガラクトール転移酵素
をコードする遺伝子およびマルトース結合蛋白質をコー
ドする遺伝子を組み込んだ発現ベクターで大腸菌を形質
転換し、該形質転換体を培養してヒト由来β１，４−ガ
ラクトース転移酵素およびマルトース結合蛋白質からな
る融合蛋白質を生成させ、該融合蛋白質をアフィニティ
ークトマトグラフィーにより精製し、該融合蛋白質を分
解して、β１，４−ガラクトース転移酵素を採取する方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、糖蛋白質プロセッ
シング酵素の１種であるβ１，４−ガラクトース転移酵
素を安価に効率よく生産する方法に関し、詳細には、大
腸菌体内でヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵素を
融合蛋白質として製造し、さらに該酵素を融合蛋白質か
ら分解して製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、高等生物由来の糖蛋白質、糖脂質
などの複合糖質中の糖鎖部分の構造と機能に関する関心
が高まっており、その研究が盛んに行われている。糖鎖
は糖転移酵素によって生合成される。糖転移酵素は糖ヌ
クレオチドを糖供与体として、受容体となる糖鎖に糖を
転移し、糖鎖伸長を行う酵素である。その受容体の糖鎖
構造に対する特異性は厳密であり、通常、１つのグリコ
シド結合は対応する１つの糖転移酵素によって形成され
ると言われている。糖転移酵素は複合糖質の糖鎖部分の
構造研究、特定の糖鎖構造の簡便な合成、天然の糖鎖構
造の修飾に利用されている。

【０００３】β１，４−ガラクトース転移酵素はＵＤＰ
−ガラクトースを糖供与体として、Ｎ−アセチルグルコ
サミン残基にガラクトース残基を転移し、Ｇａｌβ１→
４ＧｌｃＮＡｃ結合を形成する反応を触媒する酵素であ
り、糖蛋白質、糖脂質のどちらの糖鎖にも作用する。ま
た、α−ラクトアルブミン共存下ではグルコース残基を
受容体とし、Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ結合を形成する。ま
た、β１，４−ガラクトース転移酵素は、受精や細胞接
着などに関与する酵素として重要視されてきた。

【０００４】このようなβ１，４−ガラクトース転移酵
素は、最初、牛乳あるいはヒト乳中にその存在が発見さ
れた。また、ウシ、ヒトに限らず、マウスなどの各種動
物の各種組織に存在することが知られている。その後の
研究により、該酵素は本来、膜結合型酵素であり、これ
が細胞中でプロテアーゼによるプロセッシングを経て、
可溶型の分泌酵素として乳中に分泌されることがわかっ
ている。

【０００５】β１，４−ガラクトース転移酵素は、牛乳
あるいはヒト乳から分離精製されている。しかし、乳汁
中には多くの糖転移酵素が含まれており、単一にまで精
製しようとすると非常に手間がかかり、遺伝子組換えに
よる生産が期待されている。

【０００６】該酵素をコードするｃＤＮＡは各種動物の
各種組織より単離されており、例えば成松らはヒト胎盤
（特開平2-27987 号公報）あるいはマウスのＦ９細胞
（J. Biochem., 104, 165 (1988)）から、また、N. L.
ShaperらはマウスのＣ１２７細胞（J. Biol. Chem., 26
3, 10420 (1988))から、さらに村松らはマウスのＦ９細
胞（特開平8-196279号公報）から単離している。

【０００７】これまで、該酵素の遺伝子組換技術による
発現については、A. S. Masibay らは牛胎盤由来の酵素
をＣＯＳ−７細胞（Proc. Natl. Acad.,Sci. USA, 86,
5733(1989) ）、成松らはマウスＦ９細胞由来の酵素を
ＣＯＳ−１細胞（Eur. J. Biochem., 196, 363 (1991))
で発現できることを報告している。しかし、ＣＯＳ−７
細胞やＣＯＳ−１細胞での発現は、培養時間がかかる、
培地が高価であるなどの欠点があり、大量生産にはあま
り適していない。

【０００８】大量生産にはコスト的な点から考え、細菌
や酵母などの微生物で発現生産する方法が有利である。
そのような例として、成松らはヒト胎盤由来の酵素を大
腸菌により発現することを報告している（J. Biochem.,
113, 747 (1993)）。しかし、発現した蛋白のうち、６
５％がインクルージョンボディとして存在しており、あ
まり効率的とは言えない。また、可溶性蛋白質として発
現した酵素蛋白質を純度よく得るためには、各種クロマ
トグラフィーによる精製を含む多くの精製工程が必要で
あり、精製に時間やコストがかかり、大量生産には必ず
しも十分とは言えない。

【０００９】一方、目的とする遺伝子を大量に可溶性蛋
白質として発現させ、かつ、発現産物の精製を容易にす
る方法として、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
やプロテインＡなどとの融合蛋白質として発現させる方
法がある。該方法ではグルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼとの融合蛋白質は、グルタチオンをリガンドとす
るアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより、ま
た、プロテインＡとの融合蛋白質はＩｇＧをリガンドと
するアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより容
易に精製することができる。このような融合蛋白質とし
て発現させた例としては、ウシ由来β１，４−ガラクト
ース転移酵素をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
との融合蛋白質として大腸菌で発現させたという報告が
ある。しかし、発現した融合蛋白質はインクルージョン
ボディを形成していた（ProteinEngineering, 6, 779
(1993)）。

【００１０】また、別な例としては、マウス由来のβ
１，４−ガラクトース転移酵素をマルトース結合蛋白質
との融合蛋白として、大腸菌で可溶性蛋白質として発現
させたという報告がある（特開平8-196279号公報）。し
かし、ヒト由来のβ１，４−ガラクトース転移酵素を発
現させた報告は、今まで見当たらない。各種疾病の診断
を行うために、β１，４−ガラクトース転移酵素の発現
量を測定するとき、感度の問題から、必ずしもその活性
値を測定できるとは限らず、抗ヒトβ１，４−ガラクト
ース転移酵素抗体があると非常に有用である。抗ヒトβ
１，４−ガラクトース転移酵素抗体を得るためには、ヒ
ト由来β１，４−ガラクトース転移酵素を効率よく大量
に得ることが望まれる。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ヒト
由来β１，４−ガラクトース転移酵素を可溶性蛋白質と
して大腸菌体内で発現させることにより、安価に効率よ
く生産する方法を提供することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、ヒト胎盤由来のβ
１，４−ガラクトース転移酵素とマルトース結合蛋白質
の融合蛋白質として発現させるベクターを構築すること
により、遺伝子工学的に該酵素を生産して、前記問題点
が解決できることを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。

【００１３】すなわち、本発明はヒト由来β１，４−ガ
ラクトース転移酵素をコードする遺伝子およびマルトー
ス結合蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベク
ターで大腸菌を形質転換し、該形質転換体からヒト由来
β１，４−ガラクトース転移酵素およびマルトース結合
蛋白質からなる融合蛋白質を生成させ、該融合蛋白質を
アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、該融
合蛋白質を分解して、β１，４−ガラクトース転移酵素
を採取することを特徴とするヒト由来β１，４−ガラク
トース転移酵素の製造法である。

【００１４】

【発明の実施態様】本発明のヒト由来β１，４−ガラク
トース転移酵素をコードする遺伝子はヒト胎盤由来のｃ
ＤＮＡから単離された遺伝子である。ヒト胎盤由来のβ
１，４−ガラクトース転移酵素の遺伝子は既に単離され
ており、そのアミノ酸配列および塩基配列は成松ら（特
開平2-27987 号公報）により決定されており、アミノ酸
配列は配列表・配列番号２に記載したとおりである。本
発明では、少なくとも配列表・配列番号１に示されるア
ミノ酸配列の６６番目から３８６番目までのアミノ酸配
列をコードする遺伝子または配列表・配列番号１に記載
される塩基配列の２０５番目から１１６７番目の塩基配
列を有する遺伝子を使用する。

【００１５】本発明のマルトース結合蛋白質をコードす
る遺伝子は、New England Biolab社製のｐＭＡＬ−ｐ２
あるいはｐＭＡＬ−ｃ２に由来する遺伝子である。

【００１６】本発明の発現ベクターは、上記ヒト由来β
１，４−ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子をマ
ルトース結合蛋白質をコードする遺伝子を含むプラスミ
ド、例えばｐＭＡＬ−ｐ２あるいはｐＭＡＬ−ｃ２のマ
ルチクローニングサイトに挿入することにより、作製す
ることができる。

【００１７】本発明の発現ベクターの１つは、上記配列
番号１のアミノ酸配列の６６番目から３８６番目までの
アミノ酸配列をコードする遺伝子断片およびマルトース
結合蛋白質をコードする遺伝子を含む。

【００１８】本発明の別な発現ベクターは、配列表・配
列番号１に示される塩基配列の２０５番目から１１６７
番目までの配列を含むヒト由来β１，４−ガラクトース
転移酵素断片をコードする遺伝子およびマルトース結合
蛋白質をコードする遺伝子を含む。これらの発現ベクタ
ーは単独、または結合して使用する。

【００１９】本発明において使用する宿主は大腸菌であ
る。

【００２０】本発明者らは大腸菌で可溶性蛋白質として
該酵素を発現させることを意図し、これまでの研究で分
泌型酵素と考えられている配列表・配列番号２のアミノ
酸配列の７９番目から３９８番目の配列をコードするＤ
ＮＡ断片あるいはそれより数アミノ酸上流を含むＤＮＡ
断片の取得を目指した。

【００２１】具体的には、該ＤＮＡ断片は、配列表・配
列番号１のアミノ酸配列の７９番目よりＮ末に近いアミ
ノ酸配列をコードすると考えられる塩基配列を含むプラ
イマーおよび少なくとも３９８番目のアミノ酸をコード
すると考えられる塩基配列を含むプライマーを合成し、
該プライマーを用いてＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物
を得、必要に応じて制限酵素などを用い、得られたＰＣ
Ｒ産物を切断することにより得ることができる。また、
必要に応じて、該断片をいくつかの断片に分けてＰＣＲ
反応で得た後、適当な条件でライゲーションすることに
より得ることもできる。また、用いるプライマーはその
後のライゲーションやサブクローニングに有利なように
通常制限酵素切断部位を持つように設計することが好ま
しい。このようなプライマーの例として、配列表・配列
番号３、４、５および６で表されるプライマーが挙げら
れる。

【００２２】配列表・配列番号３および５で表されるプ
ライマーを用いて得られたＤＮＡ断片と、配列表・配列
番号４および６で表されるプライマーを用いて得られた
ＤＮＡ断片とをライゲーションさせることにより、配列
番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡ断片が得られ
る。

【００２３】得られたＤＮＡ断片を適当なプラスミドベ
クター、例えばＭ１３ｍｐ１８ベクター、Ｍ１３ｍｐ１
９ベクター、ｐＵＣ１８ベクター、pBluescript ベクタ
ーなどにサブクローニングし、適当な宿主大腸菌、例え
ばＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＪＭ１０９株などを形質転換
し、形質転換体を培養し、該プラスミドを大量に得る。
次いで、該プラスミドから、例えば制限酵素、ＡｃｃII
I およびＳａｌＩで切断することにより、目的であるＤ
ＮＡ断片を得ることができる。得られたＤＮＡ断片をNe
w England Biolab社製のｐＭＡＬ−ｐ２あるいはｐＭＡ
Ｌ−ｃ２のマルチクローニングサイトに挿入することに
より、本発明の発現ベクターを作製することができる。

【００２４】発現ベクターで形質転換する宿主として
は、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＢＬ−２１株、ＪＭ１
０７株、ＴＢ１株、ＪＭ１０９株、Ｃ６００株、ＨＢ１
０１株などが例示される。形質転換法としては、塩化カ
ルシウム法やエレクトロポレーション法などが挙げられ
る。

【００２５】本発明のヒト由来β１，４−ガラクトース
転移酵素の製造法は、ヒト由来β１，４−ガラクトース
転移酵素をコードする遺伝子およびマルトース結合蛋白
質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターで大腸
菌を形質転換し、該形質転換体を培養してヒト由来β
１，４−ガラクトース転移酵素およびマルトース結合蛋
白質からなる融合蛋白質を生成させ、該融合蛋白質をア
フィニティークロマトグラフィーにより精製する。

【００２６】培養は、常法に従い、適当な培地、例えば
0.2%グルコース、50μg/mlアンピシリンを添加したＬＢ
培地で、20〜40℃で振とう培養し、対数増殖期初期、例
えば培養液の 660nmにおける吸光度が 0.4〜0.6 の時
に、イソプロピルチオ- β-D-ガラクトシドを 0.1〜1.0
mM 添加し、さらに、 1〜4 時間培養することにより行
なうことができる。

【００２７】アフィニティークロマトグラフィーとして
は、例えば、アミロースレジン（New England Biolab社
製）カラムを使用する。さらに、α- ラクトアルブミン
やウリジン-5'-ジホスホガラクトースをリガンドとする
アフィニティークロマトグラフィーも利用することがで
きる。

【００２８】本発明では、次いで、該融合蛋白質を例え
ばファクターＸａを使用して分解して、β１，４−ガラ
クトース転移酵素を採取する。その分解は中性の緩衝液
中で4〜40℃で、 1〜25時間反応させることにより行う
ことができる。

【００２９】

【発明の効果】本発明の方法では、ヒト由来β１，４−
ガクトース転移酵素を可溶性蛋白質として容易に効率よ
く大量に生産することができる。また、得られたβ１，
４−ガラクトース転移酵素を利用することにより、診断
等に有用な抗ヒトβ１，４−ガクトース転移酵素抗体を
容易に得ることができる。

【００３０】

【実施例】以下に、実施例により本発明をさらに詳細に
説明する。実施例１ ＰＣＲによるｃＤＮＡ断片の取得 配列表・配列番号３、４、５および６に示されるオリゴ
ヌクレオチドを合成してプライマーとした。ヒト胎盤由
来のゲノムＤＮＡ（Clontech社製）を鋳型に配列表・配
列番号３および５に示されるオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして、それぞれ２５ｐｍｏｌｅ、ＰＣＲ用試薬
（TaKaRa Taq、宝酒造製）を用い、反応液５０μｌで、
９４℃（１分間）、５５℃（１分間）、７２℃（２分
間）を１サイクルとして３０サイクルＰＣＲ反応を行っ
た。また、配列表・配列番号４および６に示されるオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして、ヒト胎盤由来のｃ
ＤＮＡ（Clontech社製）を鋳型に同様にＰＣＲ反応を行
った。

【００３１】ＰＣＲ反応後、反応液をアガロースゲル電
気泳動によりＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片の確認を行っ
た。その結果、それぞれ、約４００ｂｐ、約８００ｂｐ
のＤＮＡ断片が得られていることがわかった。該ＤＮＡ
断片をそれぞれＭ１３ｍｐ１８ベクターに導入し、ヌク
レオチド配列の確認を行い、配列表・配列番号１の塩基
配列のうち、１〜３８４、３８２〜１１９２の配列を含
むことがわかり、該断片がβ１，４−ガラクトース転移
酵素遺伝子の一部であることが確認された。

【００３２】実施例２ 発現ベクターｐＭｓＧＴの構築 実施例１で得られた２つのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲー
ションキット（宝酒造製）を用いて、ライゲーションし
た。得られたＤＮＡ断片は、配列表・配列番号１に示し
た塩基配列を有する。アガロースゲル電気泳動でライゲ
ーション反応生成物の確認を行った後、反応生成物をプ
ラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）の制限酵
素、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩサイトに挿入し、新規プ
ラスミドｐＳＫＧＴを得た。

【００３３】得られたプラスミドｐＳＫＧＴで大腸菌Ｘ
Ｌ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換した。得られた形質転換体
を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養
し、得られた菌体よりプラスミドｐＳＫＧＴを常法に従
い抽出した。プラスミドｐＳＫＧＴを制限酵素、Ａｃｃ
III で切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化
し、さらに制限酵素、ＳａｌＩで切断し、β１，４−ガ
ラクトース転移酵素断片をコードする約１０００ｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。

【００３４】ベクタープラスミドｐＭＡＬ−ｃ２（New
England Biolab社製）を制限酵素、ＥｃｏＲＩで切断
後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化し、さらに制
限酵素、ＳａｌＩで切断した。得られた両断片をＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造製）を用いて、ライゲー
ションさせ、新規なプラスミドｐＭｓＧＴを得た。

【００３５】実施例３ 組換え大腸菌を用いたβ１，４
−ガラクトース転移酵素−マルトース結合蛋白質・融合
蛋白の調製 実施例２で得た発現ベクターｐＭｓＧＴで大腸菌ＢＬ２
１株を形質転換した。得られた組換え大腸菌を０．２％
グルコースおよび５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む
ＬＢ培地１０ｍｌの入った試験管に一白金耳植菌し、３
７℃で一晩振とう培養した。得られた培養液を１ｍｌづ
つ上記培地１００ｍｌの入った坂口フラスコ１０本に植
菌した。３７℃で振とう培養し、培養液の６６０ｎｍに
おける吸光度が０．５に達した時点で、イソプロピルチ
オ−β−Ｄ−ガラクトシドを０．３ｍＭになるように加
えた。さらに、３７℃で培養を２時間続けた。

【００３６】菌体を遠心分離して集め、１０ｍＭ塩化マ
ンガン、２００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭβ−メルカ
プトエタノールを含む１０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ
７．４）５０ｍｌで再懸濁した。懸濁液を超音波破砕装
置にて処理し、遠心分離し、その上清を粗融合蛋白溶液
とした。予め、上記緩衝液で平衡化しておいたアミロー
スレジン（New England Biolab社製）カラムに粗酵素液
を上記緩衝液で５倍希釈した液を通液することにより、
β１，４−ガラクトース転移酵素−マルトース結合蛋白
質・融合蛋白を吸着させた。上記緩衝液でカラムを洗浄
した後、マルトースを１０ｍＭ含む上記緩衝液で吸着し
た融合蛋白を溶出させた。溶出画分を集め、融合蛋白溶
液とした。

【００３７】実施例４ β１，４−ガラクトース転移酵
素の調製 実施例３で得た融合蛋白溶液５ｍｌに、融合蛋白質の１
％に相当する量のファクターＸａ（New England Biolab
社製) を加え、４℃で１２時間反応させた。反応後、透
析膜（分画分子量１３，０００）で外液として２５ｍＭ
塩化ナトリウムを含む１０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ
７．４）を用いて透析した。透析後、透析液を予め前記
緩衝液で平衡化したＱセファロース（ファルマシア社
製）カラムに通液し、目的蛋白を吸着させた。３〜５カ
ラム分の前記緩衝液でカラムを洗浄した後、前記緩衝液
中の塩化ナトリウム濃度を２０ｍＭから５００ｍＭまで
グラジェントすることにより蛋白を溶出させた。各画分
の蛋白濃度を測定するとともにＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳
動することによりβ１，４−ガラクトース転移酵素画分
を集めた。その結果を図１に示す。図１中、レーン１
は、分子量マーカー、レーン２はファクターＸａで分解
した生成物、レーン３はマルトース結合蛋白質−ガラク
トース転移酵素融合蛋白質、レーン４はマルトース蛋白
質を示す。

【００３８】実施例５ β１，４−ガラクトース転移酵
素の活性の確認 実施例４で得たβ１，４−ガラクトース転移酵素６μ
ｇ、ウリジン−５’−ジホスホガラクトース０．２ｍ
Ｍ、塩化マンガン１０ｍＭ、下記化１で表されるピリジ
ルアミノ化オリゴ糖０．１μＭを含む反応液５０ｕｌを
３７℃で反応させた。反応後、沸騰水中で２分間インキ
ュベートすることにより反応を停止させた。反応液をＨ
ＰＬＣで分析することにより、ガラクトースが転移した
生成物を確認した（図２ＡおよびＢ）。図２中、Ａは２
時間反応させた結果、Ｂは４時間反応させた結果であ
り、ピーク１はＧｌｃＮＡｃ₂ −Ｍａｎ₃ ＧｌｃＮＡｃ
₂ 基質、ピーク２および３はＧａｌ₁ ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｍ
ａｎ₃ ＧｌｃＮＡｃ₂ 中間体、ピーク４はＧａｌ₂ Ｇｌ
ｃＮＡｃ₂ Ｍａｎ₃ ＧｌｃＮＡｃ₂ 最終生成物を示す。

【００３９】

【化１】

【００４０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1192 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：ヒト 配列 AAAGAATTC 9 GCG ATG CCA GGC GCG TCC CTA CAG CGG GCC TGC CGC CTG CTC GTG GCC 57 Ala Met Pro Gly Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala 1 5 10 15 GTC TGC GCT CTG CAC CTT GGC GTC ACC CTC GTT TAC TAC CTG GCT GGC 105 Val Cys Ala Leu His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly 20 25 30 CGC GAC CTG AGC CGC CTG CCC CAA CTG GTC GGA GTC TCC ACA CCG CTG 153 Arg Asp Leu Ser Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu 35 40 45 CAG GGC GGC TCG AAC AGT GCC GCC GCC ATC GGG CAG TCC TCC GGG GAG 201 Gln Gly Gly Ser Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gln Ser Ser Gly Glu 50 55 60 CTC CGG ACC GGA GGG GCC CGG CCG CCG CCT CCT CTA GGC GCC TCC TCC 249 Leu Arg Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Ser Ser 65 70 75 80 CAG CCG CGC CCG GGT GGC GAC TCC AGC CCA GTC GTG GAT TCT GGC CCT 297 Gln Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro Val Val Asp Ser Gly Pro 85 90 95 GGC CCC GCT AGC AAC TTG ACC TCG GTC CCA GTG CCC CAC ACC ACC GCA 345 Gly Pro Ala Ser Asn Leu Thr Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala 100 105 110 CTG TCG CTG CCC GCC TGC CCT GAG GAG TCC CCG CTA CTA GTG GGC CCC 393 Leu Ser Leu Pro Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro 115 120 125 ATG CTG ATT GAG TTT AAC ATG CCT GTG GAC CTG GAG CTC GTG GCA AAG 441 Met Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val Ala Lys 130 135 140 CAG AAC CCA AAT GTG AAG ATG GGC GGC CGC TAT GCC CCC AGG GAC TGC 489 Gln Asn Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Cys 145 150 155 160 GTC TCT CCT CAC AAG GTG GCC ATC ATC ATT CCA TTC CGC AAC CGG CAG 537 Val Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln 165 170 175 GAG CAC CTC AAG TAC TGG CTA TAT TAT TTG CAC CCA GTC CTG CAG CGC 585 Glu His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gln Arg 180 185 190 CAG CAG CTG GAC TAT GGC ATC TAT GTT ATC AAC CAG GCG GGA GAC ACT 633 Gln Gln Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Asp Thr 195 200 205 ATA TTC AAT CGT GCT AAG CTC CTC AAT GTT GGC TTT CAA GAA GCC TTG 681 Ile Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Gln Glu Ala Leu 210 215 220 AAG GAC TAT GAC TAC ACC TGC TTT GTG TTT AGT GAC GTG GAC CTC ATT 729 Lys Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile 225 230 235 240 CCA ATG AAT GAC CAT AAT GCG TAC AGG TGT TTT TCA CAG CCA CGG CAC 777 Pro Met Asn Asp His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His 245 250 255 ATT TCC GTT GCA ATG GAT AAG TTT GGA TTC AGC CTA CCT TAT GTT CAG 825 Ile Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln 260 265 270 TAT TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA AGT AAA CAA CAG TTT CTA ACC ATC 873 Tyr Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Thr Ile 275 280 285 AAT GGA TTT CCT AAT AAT TAT TGG GGC TGG GGA GGA GAA GAT GAT GAC 921 Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp 290 295 300 ATT TTT AAC AGA TTA GTT TTT AGA GGC ATG TCT ATA TCT CGC CCA AAT 969 Ile Phe Asn Arg Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn 305 310 315 320 GCT GTG GTC GGG AGG TGT CGC ATG ATC CGC CAC TCA AGA GAC AAG AAA 1017 Ala Val Val Gly Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys 325 330 335 AAT GAA CCC AAT CCT CAG AGG TTT GAC CGA ATT GCA CAC ACA AAG GAG 1065 Asn Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu 340 345 350 ACA ATG CTC TCT GAT GGT TTG AAC TCA CTC ACC TAC CAG GTG CTG GAT 1113 Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gln Val Leu Asp 355 360 365 GTA CAG AGA TAC CCA TTG TAT ACC CAA ATC ACA GTG GAC ATC GGG ACA 1161 Val Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr 370 375 380 CCG AGC TAGCGTTTTG GTACACGTCG ACTAC 1192 Pro Ser 385

【００４１】配列番号：２ 配列の長さ：398 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴 起源 生物名：ヒト 配列 Met Arg Leu Arg Glu Pro Leu Leu Ser Arg Ser Ala Ala Met Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu 20 25 30 His Leu Arg Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser 35 40 45 Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gln Gly Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gln Ser Ser Gly Glu Leu Arg Thr Gly 65 70 75 80 Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Ser Ser Gln Pro Arg Pro 85 90 95 Gly Gly Asp Ser Ser Pro Val Val Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser 100 105 110 Asn Leu Thr Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro 115 120 125 Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met Leu Ile Glu 130 135 140 Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val Ala Lys Gln Asn Pro Asn 145 150 155 160 Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser Pro His 165 170 175 Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu His Leu Lys 180 185 190 Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gln Arg Gln Gln Leu Asp 195 200 205 Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Asp Thr Ile Phe Asn Arg 210 215 220 Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Gln Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp 225 230 235 240 Tyr Thr Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp 245 250 255 His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile Ser Val Ala 260 265 270 Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln Tyr Phe Gly Gly 275 280 285 Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro 290 295 300 Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg 305 310 315 320 Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly 325 330 335 Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro Asn 340 345 350 Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met Leu Ser 355 360 365 Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gln Val Leu Asp Val Gln Arg Tyr 370 375 380 Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser 385 390 395 398

【００４２】配列番号：３ 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAAGAATTCG CGATGCCAGG CCTCCTTCCC T 31

【００４３】配列番号：４ 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTAGTCGACG TGTACCAAAA CGCTAGCT 28

【００４４】配列番号：５ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATACTAGTA GCGGGGACTC CTCAGGGCA 29

【００４５】配列番号：６ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAGACTAGTG GGCCCCATGC TGATTGA 27

【図面の簡単な説明】

【図１】 アフィニティー精製されたマルトース結合蛋
白質−β１，４−ガラクトース転移酵素融合蛋白質の電
気泳動を示す図に代わる写真でる。

【図２】 β１，４−ガラクトース転移酵素反応生成物
おＨＰＬＣクトマログラフィーの結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ダニエル ジー モラン 大阪府高槻市氷室２−31−９ ベテルハイ ムアネックス １−Ｈ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵
   素をコードする遺伝子およびマルトース結合蛋白質をコ
   ードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターで大腸菌を形
   質転換し、該形質転換体を培養して、ヒト由来β１，４
   −ガラクトース転移酵素およびマルトース結合蛋白質か
   らなる融合蛋白質を生成させ、該融合蛋白質をアフィニ
   ティークロマトグラフィーにより精製し、該融合蛋白質
   を分解して、β１，４−ガラクトース転移酵素を採取す
   ることを特徴とするヒト由来β１，４−ガラクトース転
   移酵素の製造法。
2. 【請求項２】 ヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵
   素をコードする遺伝子が、ヒト胎盤由来のｃＤＮＡから
   単離された遺伝子である請求項１記載の製造法。
3. 【請求項３】 ヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵
   素をコードする遺伝子が、配列表・配列番号１に示され
   るアミノ酸配列の６６番目から３８６番目までのアミノ
   酸配列をコードする遺伝子である請求項１記載の製造
   法。
4. 【請求項４】 ヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵
   素をコードする遺伝子が、配列表・配列番号１に記載さ
   れる塩基配列の２０５番目から１１６７番目の塩基配列
   を有する請求項１記載の製造法。
5. 【請求項５】 マルトース結合蛋白質をコードする遺伝
   子が、ｐＭＡＬ−ｐ２あるいはｐＭＡＬ−ｃ２に由来す
   る遺伝子である請求項１記載の製造法。
6. 【請求項６】 発現ベクターがｐＭｓＧＴである請求項
   １記載の製造法。
7. 【請求項７】 融合蛋白質をファクターＸａで分解する
   請求項１記載の製造法。