JPH1118778A - シアル酸転移酵素及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents
シアル酸転移酵素及びそれをコードするｄｎａInfo
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- JPH1118778A JPH1118778A JP9184184A JP18418497A JPH1118778A JP H1118778 A JPH1118778 A JP H1118778A JP 9184184 A JP9184184 A JP 9184184A JP 18418497 A JP18418497 A JP 18418497A JP H1118778 A JPH1118778 A JP H1118778A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ラクトシルセラミドのガラクトース残基にシ
アル酸を転移してガングリオシドＧＭ3を合成する酵素
及びその酵素をコードするＤＮＡを提供する。 【解決手段】 癌細胞を分化誘導剤で処理することによ
り分化させ、分化した癌細胞からｃＤＮＡライブラリー
を作成して宿主細胞に導入し、ガングリオシドを細胞膜
上に発現した宿主細胞を検出し、上記で検出された宿主
細胞をソーティングしてライブラリーを濃縮して、濃縮
したライブラリーから導入した遺伝子を切り出す。
アル酸を転移してガングリオシドＧＭ3を合成する酵素
及びその酵素をコードするＤＮＡを提供する。 【解決手段】 癌細胞を分化誘導剤で処理することによ
り分化させ、分化した癌細胞からｃＤＮＡライブラリー
を作成して宿主細胞に導入し、ガングリオシドを細胞膜
上に発現した宿主細胞を検出し、上記で検出された宿主
細胞をソーティングしてライブラリーを濃縮して、濃縮
したライブラリーから導入した遺伝子を切り出す。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、シアル酸転移酵素
及びそれをコードするＤＮＡに関する。より詳細にはラ
クトシルセラミドのガラクトース残基にシアル酸を転移
してガングリオシドＧＭ3を合成する酵素及びその酵素
をコードするＤＮＡに関する。
及びそれをコードするＤＮＡに関する。より詳細にはラ
クトシルセラミドのガラクトース残基にシアル酸を転移
してガングリオシドＧＭ3を合成する酵素及びその酵素
をコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０は悪
性転換により無限増殖能を獲得した細胞株であり、白血
病細胞のモデルとして一般的に広く用いられている（Co
llins,S.J., Gallo, R.C., and Gallagher, R.E., Natu
re (London), 270, 347-349(1977); Collins, S.J., Bl
ood, 70, 1223(1987)）。上記細胞株は、培養を続けた
際にも分化することはなく未分化な細胞のまま増殖を続
けるが、上記細胞株の培養培地に分化誘導剤として広く
用いられているホルボールエステルを添加して培養を続
けると、細胞増殖を停止し、単球或いはマクロファージ
と同様な形態を示すようになり、分化が誘導される。そ
の過程でガングリオシドの一種であるＧＭ 3量が顕著に
増大すること（Nojiri, H., Takaku, F., Tetsuka, T.,
and Saito,M., Blood, 64, 534-541(1984)）、及び上
記ガングリオシドＧＭ3を外来性に添加した際もホルボ
ールエステルを添加した際と同様の変化、すなわち単球
系分化が細胞に起こることが報告されている（Saito,
M., Terui, Y., and Nojiri, H., Biochem. Biophys. R
es. Commun., 132, 223-231(1985)）。また、この分化
の過程において、ＧＭ3そのものが分化誘導活性を有し
ていること（Nojiri, H., Takaku., F., Miura, Y., an
d Saito, M., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83,782
-786(1986)）、さらに化学合成ＧＭ3によっても分化が
誘導されることが証明されている（Sugimoto,M. and Og
awa,T., Glycoconj. J., 2, 5-9(1985); Saito, M., No
jiri, H., Ogino, H., Yuo, A., Ogura, H., Itoh, M.,
Tomita, K.,Ogawa, T., Nagai, Y., and Kitagawa,
S., FEBS Lett., 271, 85-88(1990)）。
性転換により無限増殖能を獲得した細胞株であり、白血
病細胞のモデルとして一般的に広く用いられている（Co
llins,S.J., Gallo, R.C., and Gallagher, R.E., Natu
re (London), 270, 347-349(1977); Collins, S.J., Bl
ood, 70, 1223(1987)）。上記細胞株は、培養を続けた
際にも分化することはなく未分化な細胞のまま増殖を続
けるが、上記細胞株の培養培地に分化誘導剤として広く
用いられているホルボールエステルを添加して培養を続
けると、細胞増殖を停止し、単球或いはマクロファージ
と同様な形態を示すようになり、分化が誘導される。そ
の過程でガングリオシドの一種であるＧＭ 3量が顕著に
増大すること（Nojiri, H., Takaku, F., Tetsuka, T.,
and Saito,M., Blood, 64, 534-541(1984)）、及び上
記ガングリオシドＧＭ3を外来性に添加した際もホルボ
ールエステルを添加した際と同様の変化、すなわち単球
系分化が細胞に起こることが報告されている（Saito,
M., Terui, Y., and Nojiri, H., Biochem. Biophys. R
es. Commun., 132, 223-231(1985)）。また、この分化
の過程において、ＧＭ3そのものが分化誘導活性を有し
ていること（Nojiri, H., Takaku., F., Miura, Y., an
d Saito, M., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83,782
-786(1986)）、さらに化学合成ＧＭ3によっても分化が
誘導されることが証明されている（Sugimoto,M. and Og
awa,T., Glycoconj. J., 2, 5-9(1985); Saito, M., No
jiri, H., Ogino, H., Yuo, A., Ogura, H., Itoh, M.,
Tomita, K.,Ogawa, T., Nagai, Y., and Kitagawa,
S., FEBS Lett., 271, 85-88(1990)）。
【０００３】一方、シアル酸含有糖脂質、その中でも特
にガングリオシドが様々な生物現象において重要な機能
を担っていることが明らかとなり、その機能のみならず
生合成が解明されつつある。脊椎動物において、多くの
ガングリオシド（ガングリオ系ガングリオシド）は主要
ガングリオシドのうちで最も単純な構造を持つＧＭ3を
共通の前駆体としており、主要な機能を持つガングリオ
シドの生合成の根幹をＧＭ3の合成がなしている。
にガングリオシドが様々な生物現象において重要な機能
を担っていることが明らかとなり、その機能のみならず
生合成が解明されつつある。脊椎動物において、多くの
ガングリオシド（ガングリオ系ガングリオシド）は主要
ガングリオシドのうちで最も単純な構造を持つＧＭ3を
共通の前駆体としており、主要な機能を持つガングリオ
シドの生合成の根幹をＧＭ3の合成がなしている。
【０００４】上述のようにガングリオシドＧＭ3はそれ
自体が細胞・組織の増殖・分化に関与するとともに脊椎
動物においては様々な機能を有するより高級なガングリ
オシド群の前駆体となっていることが示唆されている。
自体が細胞・組織の増殖・分化に関与するとともに脊椎
動物においては様々な機能を有するより高級なガングリ
オシド群の前駆体となっていることが示唆されている。
【０００５】ＧＭ3は、ＣＭＰ−シアル酸：ラクトシル
セラミドシアル酸転移酵素（CMP-NeuAc;Galβ1-4Glcβ1
-1'Cerα2,3-sialyltransferase:SAT-1）によってラク
トシルセラミド中のガラクトース残基にシアル酸が転移
することによってラクトシルセラミドから合成されると
考えられているが、当該酵素の単離、またその遺伝子も
特定されていない。
セラミドシアル酸転移酵素（CMP-NeuAc;Galβ1-4Glcβ1
-1'Cerα2,3-sialyltransferase:SAT-1）によってラク
トシルセラミド中のガラクトース残基にシアル酸が転移
することによってラクトシルセラミドから合成されると
考えられているが、当該酵素の単離、またその遺伝子も
特定されていない。
【０００６】ガラクトシド構造にシアル酸をα２−３ケ
トシド結合を介して転移する酵素としては、Wienstein
et al.,J. Biol. Chem.,257, 13835(1982)、Gillespie
et al., Glycoconj.,7, 469(1990)、Gillespie,W., Kel
m,S. and Paulson,JC.,J. Biol. Chem., 267, p21001-2
1010(1992)、Lee,YC.,Kojima,N., Wada,E., Kurosawa,
N., Nakaoka,T., Hashimoto,T. and Tsuji,S., J. Bio
l. Chem., 269, p10028-10033(1994)、Kim,YJ., Kim,K
S., Kim,SH., Kim,CH.,Ko,JH.,Choe,IS.,Tsuji,S.and L
ee,YC.,Biochem. Biophys. Res. Commun., 228,p324-32
7(1996)、特開平５−３３６９６３号公報などが知られ
ているが、いずれの酵素もＧＭ3の合成への関与は知ら
れておらず、ラクトシルセラミドにシアル酸をα２−３
ケトシド結合で転移する酵素活性を示してはいない。Sa
ndhoff,K.らは、α２−８シアル酸転移酵素（ＳＡＴ
４）と、ＧＭ3を合成する酵素が同一であると推定して
いる（J. Biol. Chem., 268, 5341(1993)）が、それは
間接的な方法に基づく推定であり、物質として同一であ
ることを裏付けているものではない。
トシド結合を介して転移する酵素としては、Wienstein
et al.,J. Biol. Chem.,257, 13835(1982)、Gillespie
et al., Glycoconj.,7, 469(1990)、Gillespie,W., Kel
m,S. and Paulson,JC.,J. Biol. Chem., 267, p21001-2
1010(1992)、Lee,YC.,Kojima,N., Wada,E., Kurosawa,
N., Nakaoka,T., Hashimoto,T. and Tsuji,S., J. Bio
l. Chem., 269, p10028-10033(1994)、Kim,YJ., Kim,K
S., Kim,SH., Kim,CH.,Ko,JH.,Choe,IS.,Tsuji,S.and L
ee,YC.,Biochem. Biophys. Res. Commun., 228,p324-32
7(1996)、特開平５−３３６９６３号公報などが知られ
ているが、いずれの酵素もＧＭ3の合成への関与は知ら
れておらず、ラクトシルセラミドにシアル酸をα２−３
ケトシド結合で転移する酵素活性を示してはいない。Sa
ndhoff,K.らは、α２−８シアル酸転移酵素（ＳＡＴ
４）と、ＧＭ3を合成する酵素が同一であると推定して
いる（J. Biol. Chem., 268, 5341(1993)）が、それは
間接的な方法に基づく推定であり、物質として同一であ
ることを裏付けているものではない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】ガングリオシドＧＭ3
の重要性が明らかになるにつれてその生合成を解明、制
御する試みがなされてきたが、ＧＭ3の合成に深く関わ
る上記シアル酸転移酵素はその酵素タンパク質精製の困
難性のため未だ単離されておらず、遺伝子発現調節機構
はもとより、タンパク質化学的解析及び酵素学的解析で
さえ未だなされていない。
の重要性が明らかになるにつれてその生合成を解明、制
御する試みがなされてきたが、ＧＭ3の合成に深く関わ
る上記シアル酸転移酵素はその酵素タンパク質精製の困
難性のため未だ単離されておらず、遺伝子発現調節機構
はもとより、タンパク質化学的解析及び酵素学的解析で
さえ未だなされていない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記シアル
酸転移酵素の遺伝子発現調節機構、タンパク質化学的解
析及び酵素学的解析を進めることにより、細胞分化の制
御を解明すべく鋭意検討を重ねた結果、発現クローニン
グ法により上記ＧＭ3合成に関与するシアル酸転移酵素
をコードする塩基配列を有するｃＤＮＡの単離に成功
し、当該ｃＤＮＡの塩基配列をもとに上記シアル酸転移
酵素の構造を明らかにした。その結果、当該酵素が既知
のシアル酸転移酵素と比して相同性が低く、また前記Sa
ndhoff,K.らが同一と推定したα２−８シアル酸転移酵
素とも別の新規酵素であることが明らかとなった。
酸転移酵素の遺伝子発現調節機構、タンパク質化学的解
析及び酵素学的解析を進めることにより、細胞分化の制
御を解明すべく鋭意検討を重ねた結果、発現クローニン
グ法により上記ＧＭ3合成に関与するシアル酸転移酵素
をコードする塩基配列を有するｃＤＮＡの単離に成功
し、当該ｃＤＮＡの塩基配列をもとに上記シアル酸転移
酵素の構造を明らかにした。その結果、当該酵素が既知
のシアル酸転移酵素と比して相同性が低く、また前記Sa
ndhoff,K.らが同一と推定したα２−８シアル酸転移酵
素とも別の新規酵素であることが明らかとなった。
【０００９】すなわち、本発明は以下の性質を有するシ
アル酸転移酵素及びそれをコードする塩基配列を有する
ＤＮＡを提供する。 作用：シアル酸供与体から、シアル酸受容体であるラ
クトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の３位水
酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシドＧＭ
3を生成する。 至適反応ｐＨ：ｐＨ６．０〜７．０。 阻害及び活性化：１０ｍＭのＭｎ2+により活性が１．
５倍以上に上昇する。
アル酸転移酵素及びそれをコードする塩基配列を有する
ＤＮＡを提供する。 作用：シアル酸供与体から、シアル酸受容体であるラ
クトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の３位水
酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシドＧＭ
3を生成する。 至適反応ｐＨ：ｐＨ６．０〜７．０。 阻害及び活性化：１０ｍＭのＭｎ2+により活性が１．
５倍以上に上昇する。
【００１０】また、上記作用を有し、アミノ酸配列のＣ
末端に配列番号５のアミノ酸配列を有するシアル酸転移
酵素及びそれをコードするＤＮＡ、並びに、上記作用を
有し、配列番号６のアミノ酸配列を有するシアル酸転移
酵素及びそれをコードするＤＮＡを提供する。
末端に配列番号５のアミノ酸配列を有するシアル酸転移
酵素及びそれをコードするＤＮＡ、並びに、上記作用を
有し、配列番号６のアミノ酸配列を有するシアル酸転移
酵素及びそれをコードするＤＮＡを提供する。
【００１１】シアル酸供与体は、好ましくは、シチジン
−５−モノリン酸−シアル酸（ＣＭＰ−シアル酸）であ
る。上記酵素及びＤＮＡは哺乳類由来が好ましく、ヒト
由来が最も好ましい。
−５−モノリン酸−シアル酸（ＣＭＰ−シアル酸）であ
る。上記酵素及びＤＮＡは哺乳類由来が好ましく、ヒト
由来が最も好ましい。
【００１２】また、本発明は以下の（ａ）又は（ｂ）の
ポリペプチドからなるシアル酸転移酵素及びそれをコー
ドするＤＮＡも提供する。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつシアル酸供与体からシアル酸受容体で
あるラクトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の
３位水酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシ
ドＧＭ3を生成する酵素活性を有するポリペプチド。
ポリペプチドからなるシアル酸転移酵素及びそれをコー
ドするＤＮＡも提供する。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつシアル酸供与体からシアル酸受容体で
あるラクトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の
３位水酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシ
ドＧＭ3を生成する酵素活性を有するポリペプチド。
【００１３】本発明のＤＮＡとして具体的には、配列番
号２のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列又はそ
の部分配列を有するＤＮＡが挙げられ、例えば配列番号
１の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
号２のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列又はそ
の部分配列を有するＤＮＡが挙げられ、例えば配列番号
１の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００１４】さらに本発明は、上記ＤＮＡの塩基配列に
よってコードされるシアル酸転移酵素のポリペプチドの
全部又は部分からなるポリペプチドを提供する。本ポリ
ペプチドは膜貫通領域を欠失していてもよい。
よってコードされるシアル酸転移酵素のポリペプチドの
全部又は部分からなるポリペプチドを提供する。本ポリ
ペプチドは膜貫通領域を欠失していてもよい。
【００１５】なお、本明細書において「酵素をコードす
る」とは、当該酵素のポリペプチドをコードすることを
意味する。また、本明細書中では、以下、シアル酸供与
体からシアル酸受容体であるラクトシルセラミドに含ま
れるガラクトース残基の３位水酸基へ選択的にシアル酸
を転移してガングリオシドＧＭ3を生成する活性を有す
る本発明のシアル酸転移酵素を便宜的にシアル酸転移酵
素−１又はＳＡＴ−１とも記載する。
る」とは、当該酵素のポリペプチドをコードすることを
意味する。また、本明細書中では、以下、シアル酸供与
体からシアル酸受容体であるラクトシルセラミドに含ま
れるガラクトース残基の３位水酸基へ選択的にシアル酸
を転移してガングリオシドＧＭ3を生成する活性を有す
る本発明のシアル酸転移酵素を便宜的にシアル酸転移酵
素−１又はＳＡＴ−１とも記載する。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を説
明する。 ＜１＞本発明のシアル酸転移酵素−１をコードするＤＮ
Ａ（本発明ＤＮＡ） 本発明ＤＮＡには、それが有する塩基配列によってコー
ドされるポリペプチドを含むシアル酸転移酵素が以下の
ような理化学的性質を有するものが包含される。 作用：シアル酸供与体から、シアル酸受容体であるラ
クトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の３位水
酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシドＧＭ
3を生成する。すなわち、上記シアル酸受容体のガラク
トース残基の３位の水酸基以外には実質的にシアル酸を
転移しない。シアル酸供与体としてはＣＭＰ−シアル酸
が好適には挙げられる。 至適反応ｐＨ：本酵素は、実施例中に記載の酵素活性
測定方法において、酵素反応液のｐＨ６．０〜７．０の
範囲、特にｐＨ６．５付近で高いシアル酸転移活性を有
する。 阻害及び活性化：１０ｍＭ Ｍｎ2+存在下で、非存在
下と比して１．５倍以上に活性が上がる。
明する。 ＜１＞本発明のシアル酸転移酵素−１をコードするＤＮ
Ａ（本発明ＤＮＡ） 本発明ＤＮＡには、それが有する塩基配列によってコー
ドされるポリペプチドを含むシアル酸転移酵素が以下の
ような理化学的性質を有するものが包含される。 作用：シアル酸供与体から、シアル酸受容体であるラ
クトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の３位水
酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシドＧＭ
3を生成する。すなわち、上記シアル酸受容体のガラク
トース残基の３位の水酸基以外には実質的にシアル酸を
転移しない。シアル酸供与体としてはＣＭＰ−シアル酸
が好適には挙げられる。 至適反応ｐＨ：本酵素は、実施例中に記載の酵素活性
測定方法において、酵素反応液のｐＨ６．０〜７．０の
範囲、特にｐＨ６．５付近で高いシアル酸転移活性を有
する。 阻害及び活性化：１０ｍＭ Ｍｎ2+存在下で、非存在
下と比して１．５倍以上に活性が上がる。
【００１７】また、本発明ＤＮＡには、それが有する塩
基配列によってコードされるポリペプチドを含むシアル
酸転移酵素が、上記の作用を有し、アミノ酸配列のＣ
末端に配列番号５のアミノ酸配列を有するもの、並び
に、上記の作用を有し、配列番号６のアミノ酸配列を
有するものも包含される。配列番号６のアミノ酸配列は
シアル酸転位酵素に存在するいわゆるシアリルモチーフ
に相当する配列であり、通常には、シアル酸転移酵素の
ポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号２のア
ミノ酸配列におけるアミノ酸番号１３６〜１８３の部分
に相当する部分に存在する。
基配列によってコードされるポリペプチドを含むシアル
酸転移酵素が、上記の作用を有し、アミノ酸配列のＣ
末端に配列番号５のアミノ酸配列を有するもの、並び
に、上記の作用を有し、配列番号６のアミノ酸配列を
有するものも包含される。配列番号６のアミノ酸配列は
シアル酸転位酵素に存在するいわゆるシアリルモチーフ
に相当する配列であり、通常には、シアル酸転移酵素の
ポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号２のア
ミノ酸配列におけるアミノ酸番号１３６〜１８３の部分
に相当する部分に存在する。
【００１８】本発明ＤＮＡには、以下の（ａ）又は
（ｂ）のポリペプチドをコードしているものが包含さ
れ、これらのポリペプチドをコードしているのであれば
その塩基配列は特に限定されない。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつシアル酸供与体からシアル酸受容体で
あるラクトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の
３位水酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシ
ドＧＭ3を生成する酵素活性を有するポリペプチド。
（ｂ）のポリペプチドをコードしているものが包含さ
れ、これらのポリペプチドをコードしているのであれば
その塩基配列は特に限定されない。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつシアル酸供与体からシアル酸受容体で
あるラクトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の
３位水酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシ
ドＧＭ3を生成する酵素活性を有するポリペプチド。
【００１９】すなわち、配列番号２のアミノ酸配列は、
シアル酸供与体から、シアル酸受容体であるラクトシル
セラミドに含まれるガラクトース残基の３位水酸基へ選
択的にシアル酸を転移する活性を実質的に害さない１も
しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位
を有していてもよく、そのようなアミノ酸配列の置換、
欠失、挿入又は転位を有するポリペプチドをコードす
る、塩基配列の置換、欠失、挿入及び転位を有するＤＮ
Ａのいずれもが本発明ＤＮＡに包含される。本明細書に
おける「アミノ酸の数個」とは当該酵素の活性が失われ
ない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、
例えば３６０アミノ酸残基からなるポリペプチドの場
合、２０程度以下の数を示す。当該酵素の活性の測定法
は公知の方法（特開平７−３２７６７８号公報）におい
て宿主細胞に導入するｃＤＮＡと酵素の基質を変更する
ことによって容易に行うことが可能であり、例えば本明
細書中において具体的に示した方法により当業者であれ
ば容易に実施可能であるため、目的とする酵素活性の有
無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ以上の
アミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択
することができる。ＤＮＡの塩基配列の置換、欠失、挿
入又は転位は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異
点の両側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡが有する塩
基配列の相当する部分と入れ換えることにより、ＤＮＡ
に導入することができる。また、部位特異的変異法（Kr
amer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154,
350(1987);Kunkel,T.A. et al., Meth. in Enzymol.,15
4,367(1987)）などの方法によっても、ＤＮＡに置換、
欠失、挿入又は転位を導入することができる。
シアル酸供与体から、シアル酸受容体であるラクトシル
セラミドに含まれるガラクトース残基の３位水酸基へ選
択的にシアル酸を転移する活性を実質的に害さない１も
しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位
を有していてもよく、そのようなアミノ酸配列の置換、
欠失、挿入又は転位を有するポリペプチドをコードす
る、塩基配列の置換、欠失、挿入及び転位を有するＤＮ
Ａのいずれもが本発明ＤＮＡに包含される。本明細書に
おける「アミノ酸の数個」とは当該酵素の活性が失われ
ない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、
例えば３６０アミノ酸残基からなるポリペプチドの場
合、２０程度以下の数を示す。当該酵素の活性の測定法
は公知の方法（特開平７−３２７６７８号公報）におい
て宿主細胞に導入するｃＤＮＡと酵素の基質を変更する
ことによって容易に行うことが可能であり、例えば本明
細書中において具体的に示した方法により当業者であれ
ば容易に実施可能であるため、目的とする酵素活性の有
無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ以上の
アミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択
することができる。ＤＮＡの塩基配列の置換、欠失、挿
入又は転位は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異
点の両側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡが有する塩
基配列の相当する部分と入れ換えることにより、ＤＮＡ
に導入することができる。また、部位特異的変異法（Kr
amer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154,
350(1987);Kunkel,T.A. et al., Meth. in Enzymol.,15
4,367(1987)）などの方法によっても、ＤＮＡに置換、
欠失、挿入又は転位を導入することができる。
【００２０】本発明ＤＮＡとして具体的には配列番号２
のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列又はその部
分塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましいが
これに限定はされない。上記の「部分塩基配列を有する
ＤＮＡ」とは、例えばシアル酸転移酵素−１のポリペプ
チドをコードするＤＮＡとハイブリダイズしシアル酸転
移酵素−１のＤＮＡを検出するためのプローブとして使
用することができる又はそれによってコードされるポリ
ペプチドがシアル酸転移酵素−１活性を有するあるいは
シアル酸転移酵素−１と同様の抗原性を有するＤＮＡを
示す。上記ハイブリダイズは、一般にスクリーニング等
のＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡをハイブリダイズさせる際
に用いられている方法によって行えばよく、例えば、Ｄ
ＮＡのスクリーニングなどに使用される条件としては、
５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム／
リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ緩衝液）、５×デンハルト
溶液（Denhaedt's solution）、０．５％ＳＤＳと５０
μｇ／ｍｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で
目的ＤＮＡをプレハイブリダイズし、32Ｐラベルした本
発明ＤＮＡ（例えば配列番号１記載の塩基配列を有する
ＤＮＡ）を添加し、４２℃で１６時間ハイブリダイズさ
せた後、５５℃で１×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、さらに
０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳにより洗浄すること
が挙げられる。一般的なハイブリダイズは上述のような
条件下で行われることが多いが、当業者であれば同様の
ハイブリダイズを目的として各溶液の組成や詳細な条件
を変更することにより同様のハイブリダイズを行うこと
が可能であるため、同様な効果を得ることが可能な条件
であれば上述の条件に特に限定はされない。
のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列又はその部
分塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましいが
これに限定はされない。上記の「部分塩基配列を有する
ＤＮＡ」とは、例えばシアル酸転移酵素−１のポリペプ
チドをコードするＤＮＡとハイブリダイズしシアル酸転
移酵素−１のＤＮＡを検出するためのプローブとして使
用することができる又はそれによってコードされるポリ
ペプチドがシアル酸転移酵素−１活性を有するあるいは
シアル酸転移酵素−１と同様の抗原性を有するＤＮＡを
示す。上記ハイブリダイズは、一般にスクリーニング等
のＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡをハイブリダイズさせる際
に用いられている方法によって行えばよく、例えば、Ｄ
ＮＡのスクリーニングなどに使用される条件としては、
５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム／
リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ緩衝液）、５×デンハルト
溶液（Denhaedt's solution）、０．５％ＳＤＳと５０
μｇ／ｍｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で
目的ＤＮＡをプレハイブリダイズし、32Ｐラベルした本
発明ＤＮＡ（例えば配列番号１記載の塩基配列を有する
ＤＮＡ）を添加し、４２℃で１６時間ハイブリダイズさ
せた後、５５℃で１×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、さらに
０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳにより洗浄すること
が挙げられる。一般的なハイブリダイズは上述のような
条件下で行われることが多いが、当業者であれば同様の
ハイブリダイズを目的として各溶液の組成や詳細な条件
を変更することにより同様のハイブリダイズを行うこと
が可能であるため、同様な効果を得ることが可能な条件
であれば上述の条件に特に限定はされない。
【００２１】本発明ＤＮＡが有する塩基配列としてより
具体的には、配列番号１に示す全塩基配列又はその部分
配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。このよ
うなＤＮＡとして具体的には、配列番号１における塩基
番号２０２〜１２７８の塩基配列からなるＤＮＡが挙げ
られる。
具体的には、配列番号１に示す全塩基配列又はその部分
配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。このよ
うなＤＮＡとして具体的には、配列番号１における塩基
番号２０２〜１２７８の塩基配列からなるＤＮＡが挙げ
られる。
【００２２】配列番号１に示す塩基配列においては、シ
アル酸転移酵素−１のｃＤＮＡのオープンリーディング
フレームの５’末端部に３つのイン・フレームのＡＴＧ
コドンが含まれている。３つのＡＴＧコドンの周囲の塩
基配列は、全て−３の位置のプリンが保存されている。
このことは効率的な翻訳に関するＫｏｚａｋの知見（Ko
zak, M. (1986)Cell, 44,283-292）を満足しており、い
ずれのＡＴＧコドンも開始コドンとして機能する可能性
がある。
アル酸転移酵素−１のｃＤＮＡのオープンリーディング
フレームの５’末端部に３つのイン・フレームのＡＴＧ
コドンが含まれている。３つのＡＴＧコドンの周囲の塩
基配列は、全て−３の位置のプリンが保存されている。
このことは効率的な翻訳に関するＫｏｚａｋの知見（Ko
zak, M. (1986)Cell, 44,283-292）を満足しており、い
ずれのＡＴＧコドンも開始コドンとして機能する可能性
がある。
【００２３】ところで、β−１，４−ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼは、フレーム内に２つのＡＴＧコドンを
含むことが知られている（Nakazawa, K. et al. (1988)
J.Biochem, 104, 165-168、Shaper, N. et al. (1988)
J. Biol. Chem., 263, 10420-10428）。また、Shaper
らは、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ
は、２箇所からの翻訳開始の結果、長いものと短いもの
との両方の形態が合成されることを示している。さら
に、Lopezらは、長い形態のものは原形質膜を優先的に
標的とし、短い形態のものは主としてゴルジ体内に存在
することを示唆する証拠を示している（Lopez, L. et a
l. (1991) J. Biol. Chem., 266, 15984-15591）。同様
に、シアル酸転移酵素−１についても、複数のＡＴＧコ
ドンが開始コドンとして機能する可能性はあるが、定か
ではない。しかし、いずれのＡＴＧコドンが開始コドン
であっても、上記のシアル酸転移酵素−１のポリペプチ
ドをコードする点では同じであり、第２番目、第３番目
のＡＴＧコドンから始まる塩基配列を有するＤＮＡも本
発明に包含されるものである。
ンスフェラーゼは、フレーム内に２つのＡＴＧコドンを
含むことが知られている（Nakazawa, K. et al. (1988)
J.Biochem, 104, 165-168、Shaper, N. et al. (1988)
J. Biol. Chem., 263, 10420-10428）。また、Shaper
らは、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ
は、２箇所からの翻訳開始の結果、長いものと短いもの
との両方の形態が合成されることを示している。さら
に、Lopezらは、長い形態のものは原形質膜を優先的に
標的とし、短い形態のものは主としてゴルジ体内に存在
することを示唆する証拠を示している（Lopez, L. et a
l. (1991) J. Biol. Chem., 266, 15984-15591）。同様
に、シアル酸転移酵素−１についても、複数のＡＴＧコ
ドンが開始コドンとして機能する可能性はあるが、定か
ではない。しかし、いずれのＡＴＧコドンが開始コドン
であっても、上記のシアル酸転移酵素−１のポリペプチ
ドをコードする点では同じであり、第２番目、第３番目
のＡＴＧコドンから始まる塩基配列を有するＤＮＡも本
発明に包含されるものである。
【００２４】配列番号１の最初のＡＴＧコドンで始まる
単一のオープンリーディングフレームからは、３５９ア
ミノ酸残基からなり、分子量４１，２４４Ｄａ、Ｎ−結
合グリコシレーション部位である可能性がある２カ所の
部位を有するタンパク質が予測される。このアミノ酸配
列から作成したハイドロパシープロット（図１）から、
Ｎ末端から１６〜２９番目のアミノ酸残基に渡る長さ１
４残基の連続した１つの顕著な疎水性部分が認められ、
トランスメンブレンドメイン（膜貫通領域）を有するこ
とが予想される。
単一のオープンリーディングフレームからは、３５９ア
ミノ酸残基からなり、分子量４１，２４４Ｄａ、Ｎ−結
合グリコシレーション部位である可能性がある２カ所の
部位を有するタンパク質が予測される。このアミノ酸配
列から作成したハイドロパシープロット（図１）から、
Ｎ末端から１６〜２９番目のアミノ酸残基に渡る長さ１
４残基の連続した１つの顕著な疎水性部分が認められ、
トランスメンブレンドメイン（膜貫通領域）を有するこ
とが予想される。
【００２５】尚、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配
列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されることは、
当業者であれば容易に理解されるところである。また、
本発明ＤＮＡには、本発明ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又は
ＲＮＡも包含される。さらに本発明ＤＮＡは、ＳＡＴ−
１をコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよく、
この一本鎖およびこれと相補的な配列を有するＤＮＡ鎖
又はＲＮＡ鎖からなる二本鎖であってもよい。
列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されることは、
当業者であれば容易に理解されるところである。また、
本発明ＤＮＡには、本発明ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又は
ＲＮＡも包含される。さらに本発明ＤＮＡは、ＳＡＴ−
１をコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよく、
この一本鎖およびこれと相補的な配列を有するＤＮＡ鎖
又はＲＮＡ鎖からなる二本鎖であってもよい。
【００２６】また、本発明ＤＮＡは、ＳＡＴ−１のポリ
ペプチド全体をコードするコード領域全長の塩基配列を
有していてもよく、またＳＡＴ−１のポリペプチドの一
部分をコードする塩基配列を有するものであってもよ
い。
ペプチド全体をコードするコード領域全長の塩基配列を
有していてもよく、またＳＡＴ−１のポリペプチドの一
部分をコードする塩基配列を有するものであってもよ
い。
【００２７】ところで、一般に哺乳動物のシアル酸転移
酵素では、アミノ酸配列に高い相同性を有することが知
られており、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチド
も、種間におけるアミノ酸配列の相同性は約６５％以上
と想定される。従って、本発明で具体的に開示している
ＤＮＡがコードするポリペプチドと高い相同性を有する
ポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡも本発明に包
含される。上述のようにＳＡＴ−１のポリペプチドは膜
貫通領域を有するが、膜内の末端にあたるＮ末端部から
当該膜貫通領域を含む領域を欠失したＳＡＴ−１のポリ
ペプチドの部分もまた本発明に包含される。このような
ポリペプチドを具体的に例示すると、例えば配列番号２
に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号３８〜３５９
などが挙げられる。
酵素では、アミノ酸配列に高い相同性を有することが知
られており、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチド
も、種間におけるアミノ酸配列の相同性は約６５％以上
と想定される。従って、本発明で具体的に開示している
ＤＮＡがコードするポリペプチドと高い相同性を有する
ポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡも本発明に包
含される。上述のようにＳＡＴ−１のポリペプチドは膜
貫通領域を有するが、膜内の末端にあたるＮ末端部から
当該膜貫通領域を含む領域を欠失したＳＡＴ−１のポリ
ペプチドの部分もまた本発明に包含される。このような
ポリペプチドを具体的に例示すると、例えば配列番号２
に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号３８〜３５９
などが挙げられる。
【００２８】＜２＞本発明ＤＮＡの製造方法 以下、本発明ＤＮＡを得る方法について説明する。本発
明によりＳＡＴ−１のポリペプチドのアミノ酸配列が明
らかにされたので、その配列に基づいて作成したオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラー
ゼ・チェイン・リアクション法）によって染色体ＤＮＡ
あるいはｍＲＮＡから本発明ＤＮＡを増幅することによ
って取得することも可能であり、また、特に以下の各工
程からなる発現クローニング法により製造することも可
能である。 （１）癌細胞を分化誘導剤で処理することにより分化さ
せる。 （２）分化した癌細胞からｃＤＮＡライブラリーを作成
し、宿主細胞に導入する。 （３）ガングリオシドを細胞膜上に発現した宿主細胞を
検出する。 （４）上記で検出された宿主細胞をソーティングして、
ライブラリーを濃縮する。 （５）濃縮したライブラリーから導入した遺伝子を切り
出す。
明によりＳＡＴ−１のポリペプチドのアミノ酸配列が明
らかにされたので、その配列に基づいて作成したオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラー
ゼ・チェイン・リアクション法）によって染色体ＤＮＡ
あるいはｍＲＮＡから本発明ＤＮＡを増幅することによ
って取得することも可能であり、また、特に以下の各工
程からなる発現クローニング法により製造することも可
能である。 （１）癌細胞を分化誘導剤で処理することにより分化さ
せる。 （２）分化した癌細胞からｃＤＮＡライブラリーを作成
し、宿主細胞に導入する。 （３）ガングリオシドを細胞膜上に発現した宿主細胞を
検出する。 （４）上記で検出された宿主細胞をソーティングして、
ライブラリーを濃縮する。 （５）濃縮したライブラリーから導入した遺伝子を切り
出す。
【００２９】スクリーニングによって、通常には上記Ｓ
ＡＴ−１の完全長ｃＤＮＡを選択する。以下に、本発明
ＤＮＡを製造する方法の一例を具体的に説明する。 （１）癌細胞の分化誘導 癌細胞としては、浮遊系細胞が好ましく、そのような癌
細胞として血球系のリンパ種及び白血病の細胞が挙げら
れ好ましい。そのような細胞として、例えばヒト由来の
ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０）、ＭＯＬＴ−４
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８２）、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５９３）、マウス由来のＭ１（ＡＴＣＣ ＴＩ
Ｂ１９２）等の哺乳類由来の細胞が好ましく、新鮮骨髄
性白血病細胞なども用いることが可能である。そのよう
な癌細胞の中でもヒト由来の細胞が最も好ましく、特に
ＨＬ−６０が分化誘導を行いやすいため好ましい。培養
したこの癌細胞株に分化誘導剤を添加して２０時間以
上、好ましくは２４〜４８時間程度培養することによっ
て分化を誘導する。培養法としては使用する細胞によっ
て適した条件下で行えばよいが、通常、一般的な細胞培
養条件として５〜７vol％ＣＯ2、９５〜９３vol％空気条
件下で３７〜３８℃が挙げられる。分化誘導剤としては
例えばホルボールエステル（12-O-テトラデカノイルホ
ルボールエステル(TPA)など）、ジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）、レチノイン酸（ＲＡ）及び1α,25-ジヒ
ドロキシビタミンD3（1α,25(OH2D3)）等が挙げられ、
特に限定はされないが、その中でもＴＰＡが多くの白血
病細胞株に対して比較的同様な分化誘導活性を有するた
め好ましい。例えば癌細胞としてＨＬ−６０、分化誘導
剤としてＴＰＡを使用する場合は、２４ｎＭ程度のＴＰ
Ａ存在下で４８時間培養することにより、ＨＬ−６０は
単球・マクロファージ様に分化し、形態の変化が観察さ
れる。
ＡＴ−１の完全長ｃＤＮＡを選択する。以下に、本発明
ＤＮＡを製造する方法の一例を具体的に説明する。 （１）癌細胞の分化誘導 癌細胞としては、浮遊系細胞が好ましく、そのような癌
細胞として血球系のリンパ種及び白血病の細胞が挙げら
れ好ましい。そのような細胞として、例えばヒト由来の
ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０）、ＭＯＬＴ−４
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８２）、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５９３）、マウス由来のＭ１（ＡＴＣＣ ＴＩ
Ｂ１９２）等の哺乳類由来の細胞が好ましく、新鮮骨髄
性白血病細胞なども用いることが可能である。そのよう
な癌細胞の中でもヒト由来の細胞が最も好ましく、特に
ＨＬ−６０が分化誘導を行いやすいため好ましい。培養
したこの癌細胞株に分化誘導剤を添加して２０時間以
上、好ましくは２４〜４８時間程度培養することによっ
て分化を誘導する。培養法としては使用する細胞によっ
て適した条件下で行えばよいが、通常、一般的な細胞培
養条件として５〜７vol％ＣＯ2、９５〜９３vol％空気条
件下で３７〜３８℃が挙げられる。分化誘導剤としては
例えばホルボールエステル（12-O-テトラデカノイルホ
ルボールエステル(TPA)など）、ジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）、レチノイン酸（ＲＡ）及び1α,25-ジヒ
ドロキシビタミンD3（1α,25(OH2D3)）等が挙げられ、
特に限定はされないが、その中でもＴＰＡが多くの白血
病細胞株に対して比較的同様な分化誘導活性を有するた
め好ましい。例えば癌細胞としてＨＬ−６０、分化誘導
剤としてＴＰＡを使用する場合は、２４ｎＭ程度のＴＰ
Ａ存在下で４８時間培養することにより、ＨＬ−６０は
単球・マクロファージ様に分化し、形態の変化が観察さ
れる。
【００３０】（２）分化した癌細胞からのｃＤＮＡの構
築 分化した癌細胞からのＲＮＡの調製 上記（１）で分化を誘導した癌細胞を好ましくは５００
〜２０００×ｇで遠心処理により回収し、細胞から例え
ばグアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法（Kingston,
R. E.,(1991) in Current Protocols in Molecular Bio
logy, Suppl. 14, Unit 4.2, Green Publishing Associ
ates and Wiley Interscience, New York）等の公知の
方法により全ＲＮＡを調製する。このようにして得られ
る全ＲＮＡから、オリゴｄＴ（oligo-(dT)）セルロース
カラムクロマトグラフィー等によってポリ(A)+ＲＮＡを
精製する。
築 分化した癌細胞からのＲＮＡの調製 上記（１）で分化を誘導した癌細胞を好ましくは５００
〜２０００×ｇで遠心処理により回収し、細胞から例え
ばグアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法（Kingston,
R. E.,(1991) in Current Protocols in Molecular Bio
logy, Suppl. 14, Unit 4.2, Green Publishing Associ
ates and Wiley Interscience, New York）等の公知の
方法により全ＲＮＡを調製する。このようにして得られ
る全ＲＮＡから、オリゴｄＴ（oligo-(dT)）セルロース
カラムクロマトグラフィー等によってポリ(A)+ＲＮＡを
精製する。
【００３１】ポリ(A)+ＲＮＡからのｃＤＮＡの構築 上記ポリ(A)+ＲＮＡを鋳型とし、オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いた逆転写ＰＣＲにより、癌細胞由来のｃ
ＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲは、通常の方法
と同様にして行えばよいが、具体的方法を示すならば以
下の通りである。１μｌのポリ(A)+ＲＮＡ、それぞれ１
００ｐｍｏｌのオリゴｄＴとランダムオリゴヌクレオチ
ドプライマー、それぞれ５００μＭの４種類のデオキシ
ヌクレオシド三リン酸、２００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写
酵素（ギブコＢＲＬ(Gibco BRL)）、１ｍＭジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）、１２０単位のＲＮａｓｅ（リボヌ
クレアーゼ）インヒビター（宝酒造（株）製）を含む緩
衝液（終体積２０μｌ）を５０℃で６０分間インキュベ
ートし、ｃＤＮＡ一次鎖を合成する。次に、上記の逆転
写反応混合液５μｌ、各１００ｐｍｏｌのランダムオリ
ゴヌクレオチドプライマー、それぞれ２５０μＭの４種
類のデオキシヌクレオシド三リン酸、１．２５単位のＴ
ａｑポリメラーゼを含む反応液（終体積５０μｌ）に対
し、９５℃１分、４６〜６２℃１分、７２℃２分を３５
サイクル繰り返して行う。
ライマーを用いた逆転写ＰＣＲにより、癌細胞由来のｃ
ＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲは、通常の方法
と同様にして行えばよいが、具体的方法を示すならば以
下の通りである。１μｌのポリ(A)+ＲＮＡ、それぞれ１
００ｐｍｏｌのオリゴｄＴとランダムオリゴヌクレオチ
ドプライマー、それぞれ５００μＭの４種類のデオキシ
ヌクレオシド三リン酸、２００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写
酵素（ギブコＢＲＬ(Gibco BRL)）、１ｍＭジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）、１２０単位のＲＮａｓｅ（リボヌ
クレアーゼ）インヒビター（宝酒造（株）製）を含む緩
衝液（終体積２０μｌ）を５０℃で６０分間インキュベ
ートし、ｃＤＮＡ一次鎖を合成する。次に、上記の逆転
写反応混合液５μｌ、各１００ｐｍｏｌのランダムオリ
ゴヌクレオチドプライマー、それぞれ２５０μＭの４種
類のデオキシヌクレオシド三リン酸、１．２５単位のＴ
ａｑポリメラーゼを含む反応液（終体積５０μｌ）に対
し、９５℃１分、４６〜６２℃１分、７２℃２分を３５
サイクル繰り返して行う。
【００３２】このようにして得られた癌細胞のｃＤＮＡ
は、発現ベクターに保持させた後、宿主細胞に導入して
宿主細胞をスクリーニングするために使用される。宿主
細胞としては、哺乳類由来の細胞株で、ラクトシルセラ
ミド陽性である細胞であれば用いることができる。その
ような細胞株としては例えばヒトナマルバ（Namalwa）
細胞（細井ら：Cytotechnology,1,151(1988)）、チャイ
ニーズハムスター由来のＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
６１等）、サル由来のＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６
５０等）、マウス由来の３ＬＬ細胞（Taniguchi,S.,
（信州大学加齢適応研究センター））などが挙げられ
る。しかし、本発明においてＳＡＴ−１の酵素活性の検
出をより容易にすることが可能であるため、更にＧＭ3
陰性の培養細胞が好ましい。そのような細胞としては３
ＬＬ細胞の突然変異株である３ＬＬ−ＨＫ４６細胞（In
okuchi,J.,（生化学工業（株）））が挙げられ、好まし
い。発現ベクターとしてはｐＣＥＶ１８（Maruyama,K.
（東京大学医科学研究所、現東京医科歯科大学）より恵
与）、ｐＣＸＮ２（Niwa, H., Yamamura, K. and Miyaz
aki, J. (Gene, 108, p193-200(1991)）、ｐＦＬＡＧ−
ＣＭＶ−２（EastmanKodak製）、ｐＡＧＥ１０７（Miya
jiら, Cytotechnology, 3, 133(1990)）、ｐＡＳ３−３
（特開平２−２２７０７５号公報）、ｐＡＭｏＥＲＣ３
Ｓｃ（特開平５−３３６９６３号公報）、ｐｃＤ２（Ch
en,C.ら, Mol. Cell. Biol., 7, 2745-2452(1987)）な
どが挙げられ、使用する宿主細胞に合わせて適宜選択さ
れる。例えば宿主細胞として３ＬＬ−ＨＫ４６を使用し
た場合は、ｐＣＥＶ１８を発現ベクターとして使用する
ことが好ましい。ベクターへの上記で癌細胞のポリ(A)+
ＲＮＡを基に調製されたＰＣＲ産物の導入は、公知の方
法から使用するベクターに適した方法が選択される。
は、発現ベクターに保持させた後、宿主細胞に導入して
宿主細胞をスクリーニングするために使用される。宿主
細胞としては、哺乳類由来の細胞株で、ラクトシルセラ
ミド陽性である細胞であれば用いることができる。その
ような細胞株としては例えばヒトナマルバ（Namalwa）
細胞（細井ら：Cytotechnology,1,151(1988)）、チャイ
ニーズハムスター由来のＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
６１等）、サル由来のＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６
５０等）、マウス由来の３ＬＬ細胞（Taniguchi,S.,
（信州大学加齢適応研究センター））などが挙げられ
る。しかし、本発明においてＳＡＴ−１の酵素活性の検
出をより容易にすることが可能であるため、更にＧＭ3
陰性の培養細胞が好ましい。そのような細胞としては３
ＬＬ細胞の突然変異株である３ＬＬ−ＨＫ４６細胞（In
okuchi,J.,（生化学工業（株）））が挙げられ、好まし
い。発現ベクターとしてはｐＣＥＶ１８（Maruyama,K.
（東京大学医科学研究所、現東京医科歯科大学）より恵
与）、ｐＣＸＮ２（Niwa, H., Yamamura, K. and Miyaz
aki, J. (Gene, 108, p193-200(1991)）、ｐＦＬＡＧ−
ＣＭＶ−２（EastmanKodak製）、ｐＡＧＥ１０７（Miya
jiら, Cytotechnology, 3, 133(1990)）、ｐＡＳ３−３
（特開平２−２２７０７５号公報）、ｐＡＭｏＥＲＣ３
Ｓｃ（特開平５−３３６９６３号公報）、ｐｃＤ２（Ch
en,C.ら, Mol. Cell. Biol., 7, 2745-2452(1987)）な
どが挙げられ、使用する宿主細胞に合わせて適宜選択さ
れる。例えば宿主細胞として３ＬＬ−ＨＫ４６を使用し
た場合は、ｐＣＥＶ１８を発現ベクターとして使用する
ことが好ましい。ベクターへの上記で癌細胞のポリ(A)+
ＲＮＡを基に調製されたＰＣＲ産物の導入は、公知の方
法から使用するベクターに適した方法が選択される。
【００３３】ｃＤＮＡライブラリーの宿主細胞への導
入 上記の方法により構築したｃＤＮＡライブラリーを公知
の手法を用いて宿主細胞へトランスフェクションする。
具体的には、例えばエレクトロポレーション法（Miyaji
ら,Cytotechnology, 3, 133(1990)）、リン酸カルシウ
ム法（特開平２−２２７０７５号公報）及びリポフェク
ション法（Philip, L.F. et al., Proc.Natl. Acad. Sc
i.USA, 84, 7413(1987)）などが挙げられ適宜選択され
るが、エレクトロポレーション法が好ましい。また、Ｓ
ＡＴ−１をコードするｃＤＮＡを検出する際に、より正
確な酵素活性の検出を行うため、ＧＭ3から合成される
ことが知られており、細胞膜上に発現し、容易に検出が
可能であるＧＤ3をＧＭ3から直接合成する酵素である、
ヒトα２−８シアル酸転移酵素をコードするＤＮＡ（特
開平７−３２７６７８号公報など）を宿主細胞に前もっ
てトランスフェクションしておくこと、及び、同時にト
ランスフェクションすることも可能であり、また、好ま
しい。従って、例えばベクターとしてｐＣＥＶ１８を使
用して構築したｃＤＮＡライブラリーを、宿主細胞とし
てのＧＤ3合成経路を持たない３ＬＬ−ＨＫ４６細胞に
導入する際には、ライブラリーのｃＤＮＡを保持したｐ
ＣＥＶ１８を、通常の３ＬＬ−ＨＫ４６細胞に直接トラ
ンスフェクションしてもよいし、予め３ＬＬ−ＨＫ４６
細胞にα２−８シアル酸転移酵素のｃＤＮＡを、ｐＣＥ
Ｖ１８等の真核生物発現ベクターを用いて導入して作成
した遺伝子組み換え体３ＬＬ−ＳＴ２８にトランスフェ
クションしてもよいし、また、α２−８シアル酸転移酵
素のｃＤＮＡ導入したベクターと同時に３ＬＬ−ＨＫ４
６細胞にトランスフェクションしてもよい。
入 上記の方法により構築したｃＤＮＡライブラリーを公知
の手法を用いて宿主細胞へトランスフェクションする。
具体的には、例えばエレクトロポレーション法（Miyaji
ら,Cytotechnology, 3, 133(1990)）、リン酸カルシウ
ム法（特開平２−２２７０７５号公報）及びリポフェク
ション法（Philip, L.F. et al., Proc.Natl. Acad. Sc
i.USA, 84, 7413(1987)）などが挙げられ適宜選択され
るが、エレクトロポレーション法が好ましい。また、Ｓ
ＡＴ−１をコードするｃＤＮＡを検出する際に、より正
確な酵素活性の検出を行うため、ＧＭ3から合成される
ことが知られており、細胞膜上に発現し、容易に検出が
可能であるＧＤ3をＧＭ3から直接合成する酵素である、
ヒトα２−８シアル酸転移酵素をコードするＤＮＡ（特
開平７−３２７６７８号公報など）を宿主細胞に前もっ
てトランスフェクションしておくこと、及び、同時にト
ランスフェクションすることも可能であり、また、好ま
しい。従って、例えばベクターとしてｐＣＥＶ１８を使
用して構築したｃＤＮＡライブラリーを、宿主細胞とし
てのＧＤ3合成経路を持たない３ＬＬ−ＨＫ４６細胞に
導入する際には、ライブラリーのｃＤＮＡを保持したｐ
ＣＥＶ１８を、通常の３ＬＬ−ＨＫ４６細胞に直接トラ
ンスフェクションしてもよいし、予め３ＬＬ−ＨＫ４６
細胞にα２−８シアル酸転移酵素のｃＤＮＡを、ｐＣＥ
Ｖ１８等の真核生物発現ベクターを用いて導入して作成
した遺伝子組み換え体３ＬＬ−ＳＴ２８にトランスフェ
クションしてもよいし、また、α２−８シアル酸転移酵
素のｃＤＮＡ導入したベクターと同時に３ＬＬ−ＨＫ４
６細胞にトランスフェクションしてもよい。
【００３４】（３）ガングリオシドを発現した宿主細胞
の検出 ｃＤＮＡライブラリーを導入した宿主細胞は、一般的な
細胞培養条件下で培養される。ｃＤＮＡを導入した２４
時間以降、好ましくは３６〜４８時間後に宿主細胞を抗
ガングリオシド抗体あるいはガングリオシドに結合する
レクチンを用いた免疫染色により染色するが、抗体を用
いる染色法がより正確であり好ましい。例えば、宿主細
胞として３ＬＬ−ＨＫ４６を用いた場合には、細胞膜上
に発現したＧＭ3を認識する例えば抗ＧＭ3モノクローナ
ル抗体 Ｍ２５９０（Ｌ６１２(ATCC CRL10724)が産生
するモノクローナル抗体：J. Biol. Chem., 260, 13328
-13333(1985)）を用いて検出する。免疫染色は一般的な
方法に従って行えばよい。また、宿主細胞として例えば
上記の３ＬＬ−ＳＴ２８を用いた場合には、本発明ＤＮ
Ａが導入された際に生成されるＧＭ3から合成されるＧ
Ｄ3を検出する。ＧＤ 3を検出するための免疫染色法とし
ては通常用いられる一般的な方法（特開平２−３２７６
７８号公報）によって行うことができる。その際は、使
用する一次抗体としてはＧＤ3を認識する抗体であれば
特に限定はされないが、モノクローナル抗体が好まし
く、そのような抗体としては例えば抗ＧＤ3モノクロー
ナル抗体Ｒ２４（ハイブリドーマ(ATCC HB8445)が産生
するモノクローナル抗体：Cancer Res., 49, p191-196
(1989)）などが挙げられ、好ましい。上記の一般的な抗
体を用いる免疫染色法として具体的には、上記培養後の
宿主細胞（１×１０5個）をＢＳＡ溶液（０．１％ＢＳ
Ａ ＰＢＳ（＋））で２〜３回程度遠心洗浄し、一次抗
体を含む１００μｌの前記ＢＳＡ溶液に懸濁する。３０
分間氷冷下で反応させた後、上記ＢＳＡ溶液で２回程度
洗浄する。さらに一次抗体に対するＦＩＴＣ標識二次抗
体１μｌを含むＢＳＡ溶液１００μｌ中で、氷冷条件下
で３０分間反応させる。ＢＳＡ溶液で１回洗浄し、フロ
ーサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ：ベクトン
・デッキンソン(Becton Dickinson)製）で、蛍光が強い
細胞を検出する。蛍光の強い、例えば全体の５％の細胞
をセルソーターで選別し、これからプラスミドＤＮＡを
抽出する。プラスミドＤＮＡの宿主細胞からの抽出は一
般的な公知の方法によって行われる。
の検出 ｃＤＮＡライブラリーを導入した宿主細胞は、一般的な
細胞培養条件下で培養される。ｃＤＮＡを導入した２４
時間以降、好ましくは３６〜４８時間後に宿主細胞を抗
ガングリオシド抗体あるいはガングリオシドに結合する
レクチンを用いた免疫染色により染色するが、抗体を用
いる染色法がより正確であり好ましい。例えば、宿主細
胞として３ＬＬ−ＨＫ４６を用いた場合には、細胞膜上
に発現したＧＭ3を認識する例えば抗ＧＭ3モノクローナ
ル抗体 Ｍ２５９０（Ｌ６１２(ATCC CRL10724)が産生
するモノクローナル抗体：J. Biol. Chem., 260, 13328
-13333(1985)）を用いて検出する。免疫染色は一般的な
方法に従って行えばよい。また、宿主細胞として例えば
上記の３ＬＬ−ＳＴ２８を用いた場合には、本発明ＤＮ
Ａが導入された際に生成されるＧＭ3から合成されるＧ
Ｄ3を検出する。ＧＤ 3を検出するための免疫染色法とし
ては通常用いられる一般的な方法（特開平２−３２７６
７８号公報）によって行うことができる。その際は、使
用する一次抗体としてはＧＤ3を認識する抗体であれば
特に限定はされないが、モノクローナル抗体が好まし
く、そのような抗体としては例えば抗ＧＤ3モノクロー
ナル抗体Ｒ２４（ハイブリドーマ(ATCC HB8445)が産生
するモノクローナル抗体：Cancer Res., 49, p191-196
(1989)）などが挙げられ、好ましい。上記の一般的な抗
体を用いる免疫染色法として具体的には、上記培養後の
宿主細胞（１×１０5個）をＢＳＡ溶液（０．１％ＢＳ
Ａ ＰＢＳ（＋））で２〜３回程度遠心洗浄し、一次抗
体を含む１００μｌの前記ＢＳＡ溶液に懸濁する。３０
分間氷冷下で反応させた後、上記ＢＳＡ溶液で２回程度
洗浄する。さらに一次抗体に対するＦＩＴＣ標識二次抗
体１μｌを含むＢＳＡ溶液１００μｌ中で、氷冷条件下
で３０分間反応させる。ＢＳＡ溶液で１回洗浄し、フロ
ーサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ：ベクトン
・デッキンソン(Becton Dickinson)製）で、蛍光が強い
細胞を検出する。蛍光の強い、例えば全体の５％の細胞
をセルソーターで選別し、これからプラスミドＤＮＡを
抽出する。プラスミドＤＮＡの宿主細胞からの抽出は一
般的な公知の方法によって行われる。
【００３５】（４）ＳＡＴ−１のｃＤＮＡのソーティン
グとｃＤＮＡの取得 上記の操作により得られたプラスミドＤＮＡを、適当な
宿主細胞株にトランスフェクションし、上記抗ＧＭ3抗
体を用いる免疫染色と例えばフローサイトメーターによ
る全体の５％の強い蛍光を発する細胞の回収を２回以上
繰り返し、目的のｃＤＮＡをソーティングにより濃縮す
る。前記ソーティングに用いる宿主細胞としては、哺乳
類の培養細胞が好ましく、特に３ＬＬ−ＨＫ４６が好ま
しい。また、使用するベクターとしては哺乳類細胞用の
発現ベクターであれば特に限定はされないが、ｐＣＥＶ
１８が好ましい。ソーティングによって濃縮した目的の
ｃＤＮＡを保持した前記ベクターを、ｐＢＫＣＭＶ（ス
トラタジーン社製）などの哺乳類細胞用の発現ベクター
に公知の方法により前記のヒトα２−８シアル酸転移酵
素のｃＤＮＡを導入した発現ベクターと同時に３ＫＫ−
ＨＫ４６細胞等のＧＤ3合成経路を有さない哺乳類由来
の培養細胞にトランスフェクションし、上記と同様に免
疫染色及びフローサイトメーターによる検出を行い、強
蛍光を発する全体の５％の細胞を得る。この細胞から公
知の方法によりプラスミドＤＮＡを抽出する。このプラ
スミドＤＮＡから一般的な方法によって切り出すことで
得られるｃＤＮＡにより、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（E. coli
DH10B：ギブコ社製）を形質転換し、これらを一穴あた
り１００コロニーを形成するよう植菌し、シブセレクシ
ョンを行うことにより、最終的に約２．１Ｋｂｐのイン
サート（４Ｃ７）を含む単一のクローン、ｐＣＥＶ４Ｃ
７を得ることができる。
グとｃＤＮＡの取得 上記の操作により得られたプラスミドＤＮＡを、適当な
宿主細胞株にトランスフェクションし、上記抗ＧＭ3抗
体を用いる免疫染色と例えばフローサイトメーターによ
る全体の５％の強い蛍光を発する細胞の回収を２回以上
繰り返し、目的のｃＤＮＡをソーティングにより濃縮す
る。前記ソーティングに用いる宿主細胞としては、哺乳
類の培養細胞が好ましく、特に３ＬＬ−ＨＫ４６が好ま
しい。また、使用するベクターとしては哺乳類細胞用の
発現ベクターであれば特に限定はされないが、ｐＣＥＶ
１８が好ましい。ソーティングによって濃縮した目的の
ｃＤＮＡを保持した前記ベクターを、ｐＢＫＣＭＶ（ス
トラタジーン社製）などの哺乳類細胞用の発現ベクター
に公知の方法により前記のヒトα２−８シアル酸転移酵
素のｃＤＮＡを導入した発現ベクターと同時に３ＫＫ−
ＨＫ４６細胞等のＧＤ3合成経路を有さない哺乳類由来
の培養細胞にトランスフェクションし、上記と同様に免
疫染色及びフローサイトメーターによる検出を行い、強
蛍光を発する全体の５％の細胞を得る。この細胞から公
知の方法によりプラスミドＤＮＡを抽出する。このプラ
スミドＤＮＡから一般的な方法によって切り出すことで
得られるｃＤＮＡにより、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（E. coli
DH10B：ギブコ社製）を形質転換し、これらを一穴あた
り１００コロニーを形成するよう植菌し、シブセレクシ
ョンを行うことにより、最終的に約２．１Ｋｂｐのイン
サート（４Ｃ７）を含む単一のクローン、ｐＣＥＶ４Ｃ
７を得ることができる。
【００３６】（５）ＳＡＴ−１をコードするｃＤＮＡ
４Ｃ７の塩基配列の決定 上記のようにして得られたｃＤＮＡはそのままあるいは
ｐＣＲIIなどの適当なプラスミドにサブクレーニングし
て、既知の一般的な方法により塩基配列を決定すること
ができる。
４Ｃ７の塩基配列の決定 上記のようにして得られたｃＤＮＡはそのままあるいは
ｐＣＲIIなどの適当なプラスミドにサブクレーニングし
て、既知の一般的な方法により塩基配列を決定すること
ができる。
【００３７】上記のようにして決定されたＳＡＴ−１を
コードするｃＤＮＡの塩基配列及びこの塩基配列から予
想されるアミノ酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列の
みを配列番号２に示す。
コードするｃＤＮＡの塩基配列及びこの塩基配列から予
想されるアミノ酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列の
みを配列番号２に示す。
【００３８】また、膜貫通領域を欠失した、すなわち可
溶化タンパク質形態のＳＡＴ−１のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡは以下のようにして取得することが可能で
ある。すなわち、まず配列番号１に示す塩基配列に基づ
き、当該酵素のポリペプチドのＮ−末端側で適当な短縮
化形態となるように選択したプライマーを合成し、クロ
ーン化したＳＡＴ−１のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法
により増幅する。例えば、Ｎ−末端の３７アミノ酸残基
が欠失した短縮化形態のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを得る場合には、例えば目的とする塩基配列の３’及
び５’末端部に存在する塩基配列を基にオリゴヌクレオ
チドプライマーを合成する。例えば配列番号３及び４に
示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを
それぞれ５’プライマー及び３’プライマーとして用い
てＰＣＲを行えばよい。次いで、増幅して得られたＰＣ
Ｒ産物を必要により精製して目的ＤＮＡを得ることが可
能である。
溶化タンパク質形態のＳＡＴ−１のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡは以下のようにして取得することが可能で
ある。すなわち、まず配列番号１に示す塩基配列に基づ
き、当該酵素のポリペプチドのＮ−末端側で適当な短縮
化形態となるように選択したプライマーを合成し、クロ
ーン化したＳＡＴ−１のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法
により増幅する。例えば、Ｎ−末端の３７アミノ酸残基
が欠失した短縮化形態のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを得る場合には、例えば目的とする塩基配列の３’及
び５’末端部に存在する塩基配列を基にオリゴヌクレオ
チドプライマーを合成する。例えば配列番号３及び４に
示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを
それぞれ５’プライマー及び３’プライマーとして用い
てＰＣＲを行えばよい。次いで、増幅して得られたＰＣ
Ｒ産物を必要により精製して目的ＤＮＡを得ることが可
能である。
【００３９】＜３＞本発明ＤＮＡの塩基配列によってコ
ードされるＳＡＴ−１のポリペプチドの全部又は部分か
らなるポリペプチド 本発明は、上記の本発明ＤＮＡによってコードされるＳ
ＡＴ−１のポリペプチドの全部又は部分からなるポリペ
プチドも提供する。本明細書において、上記のポリペプ
チドの「部分」とは、シアル酸転移酵素−１活性を有す
る、抗原性を有するなどの何らかの活性ないし機能を有
する部分を意味する。本ポリペプチドは単独であっても
よいし、他のポリペプチドと融合していてもよい。ま
た、膜貫通領域を欠失していてもよい。
ードされるＳＡＴ−１のポリペプチドの全部又は部分か
らなるポリペプチド 本発明は、上記の本発明ＤＮＡによってコードされるＳ
ＡＴ−１のポリペプチドの全部又は部分からなるポリペ
プチドも提供する。本明細書において、上記のポリペプ
チドの「部分」とは、シアル酸転移酵素−１活性を有す
る、抗原性を有するなどの何らかの活性ないし機能を有
する部分を意味する。本ポリペプチドは単独であっても
よいし、他のポリペプチドと融合していてもよい。ま
た、膜貫通領域を欠失していてもよい。
【００４０】本ポリペプチドは、糖鎖を有していても有
していなくてもよい。また、糖鎖の種類にも特に限定は
ない。このようなポリペプチドは、例えば、後記のポリ
ペプチドの製造方法によって得ることができ、また、上
記の活性ないし機能の有無を判定することは、特開平７
−３２７６７８号公報記載の酵素活性測定法において、
宿主細胞に導入するｃＤＮＡと酵素の基質を変更するこ
とにより実施することが可能であり、例えば本明細書中
に具体的に記載されている方法により、当業者であれば
容易に行うことができる。
していなくてもよい。また、糖鎖の種類にも特に限定は
ない。このようなポリペプチドは、例えば、後記のポリ
ペプチドの製造方法によって得ることができ、また、上
記の活性ないし機能の有無を判定することは、特開平７
−３２７６７８号公報記載の酵素活性測定法において、
宿主細胞に導入するｃＤＮＡと酵素の基質を変更するこ
とにより実施することが可能であり、例えば本明細書中
に具体的に記載されている方法により、当業者であれば
容易に行うことができる。
【００４１】＜４＞本発明ＤＮＡを利用したＳＡＴ−１
のポリペプチドの製造方法 上記本発明ＤＮＡで形質転換された細胞を、好適な培地
で培養し、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドを培
養物中に生成蓄積させ、その培養物からＳＡＴ−１のポ
リペプチドを採取することによって、ＳＡＴ−１のポリ
ペプチドを製造することができる。
のポリペプチドの製造方法 上記本発明ＤＮＡで形質転換された細胞を、好適な培地
で培養し、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドを培
養物中に生成蓄積させ、その培養物からＳＡＴ−１のポ
リペプチドを採取することによって、ＳＡＴ−１のポリ
ペプチドを製造することができる。
【００４２】本発明ＤＮＡで形質転換された細胞は、公
知の発現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組換
えプラスミドを構築し、この組換えプラスミドを用いて
形質転換を行うことによって得ることができる。細胞と
しては大腸菌等の原核細胞や、哺乳類細胞等の真核細胞
が例示される。大腸菌などの原核細胞を用いた際は、本
発明ＤＮＡの発現によって生じるＳＡＴ−１のポリペプ
チドに糖鎖の付加が起こらないため、純粋にＳＡＴ−１
のポリペプチドのみを得ることが可能であり、また、哺
乳類細胞等の真核細胞を用いた際は、本発明ＤＮＡの発
現によって生じるＳＡＴ−１のポリペプチドに糖鎖の付
加がなされる。そのため、糖鎖も含む通常のＳＡＴ−１
と同様の形態で得ることが可能である。
知の発現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組換
えプラスミドを構築し、この組換えプラスミドを用いて
形質転換を行うことによって得ることができる。細胞と
しては大腸菌等の原核細胞や、哺乳類細胞等の真核細胞
が例示される。大腸菌などの原核細胞を用いた際は、本
発明ＤＮＡの発現によって生じるＳＡＴ−１のポリペプ
チドに糖鎖の付加が起こらないため、純粋にＳＡＴ−１
のポリペプチドのみを得ることが可能であり、また、哺
乳類細胞等の真核細胞を用いた際は、本発明ＤＮＡの発
現によって生じるＳＡＴ−１のポリペプチドに糖鎖の付
加がなされる。そのため、糖鎖も含む通常のＳＡＴ−１
と同様の形態で得ることが可能である。
【００４３】本製造方法においては、タンパク質の製造
に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することがで
きる。３ＬＬ−ＨＫ４６細胞、３ＬＬ−ＳＴ２８細胞又
はＣＯＳ−１細胞等の哺乳類由来の培養細胞とｐＣＥＶ
１８、ｐＭＥ１８Ｓ（丸山ら,Med. Immunol., 20, 27(1
990)）等の哺乳類細胞用発現ベクターとの組み合わせを
採用することが好ましいが、特に限定はされない。培地
や培養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜
選択される。
に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することがで
きる。３ＬＬ−ＨＫ４６細胞、３ＬＬ−ＳＴ２８細胞又
はＣＯＳ−１細胞等の哺乳類由来の培養細胞とｐＣＥＶ
１８、ｐＭＥ１８Ｓ（丸山ら,Med. Immunol., 20, 27(1
990)）等の哺乳類細胞用発現ベクターとの組み合わせを
採用することが好ましいが、特に限定はされない。培地
や培養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜
選択される。
【００４４】本発明ＤＮＡは全長を直接発現させてもよ
いが、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発
現させてもよい。また、本発明ＤＮＡの一部を部分ペプ
チドとして発現させてもよい。
いが、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発
現させてもよい。また、本発明ＤＮＡの一部を部分ペプ
チドとして発現させてもよい。
【００４５】上記融合ポリペプチドを発現する組み換え
プラスミドの構築の具体例としては以下の方法が挙げら
れる。すなわち、本発明のＤＮＡをｐＧＩＲ２０１ｐｒ
ｏｔＡ（Kitagawa,H. and Paulson,J.C., J. Biol. Che
m.. 269, 1394-1401(1994)）等のプラスミドに導入した
遺伝子を融合タンパクとして発現させるように構築され
たベクターに通常の方法により組み込み、複数のタンパ
ク質をの遺伝子を同一読み出し領域に有するベクターを
構築する。ついで、このベクターから融合タンパク質を
コードするＮｈｅＩ断片を切り出し、上記と同様の操作
によりｐＣＥＶ１８等の適当なベクターに連結させる。
プラスミドの構築の具体例としては以下の方法が挙げら
れる。すなわち、本発明のＤＮＡをｐＧＩＲ２０１ｐｒ
ｏｔＡ（Kitagawa,H. and Paulson,J.C., J. Biol. Che
m.. 269, 1394-1401(1994)）等のプラスミドに導入した
遺伝子を融合タンパクとして発現させるように構築され
たベクターに通常の方法により組み込み、複数のタンパ
ク質をの遺伝子を同一読み出し領域に有するベクターを
構築する。ついで、このベクターから融合タンパク質を
コードするＮｈｅＩ断片を切り出し、上記と同様の操作
によりｐＣＥＶ１８等の適当なベクターに連結させる。
【００４６】培養物からの本発明ポリペプチドの採取
は、公知のポリペプチドの精製方法によって行うことが
できる。具体的には例えば、ラクトシルセラミドあるい
はＣＭＰ−シアル酸などを結合したセファロースカラム
を用いたアフィニティ−クロマトグラフィーが挙げられ
る。融合ポリペプチドとして発現させた場合は、宿主細
胞の培養物を上記アフィニティーカラムのほか、ＳＡＴ
−１と融合したポリペプチドに対し親和性の高い物質
（例えば抗体など）を結合したアフィニティークロマト
グラフィーなどによって精製することが可能である。さ
らに、融合ポリペプチド中のＳＡＴ−１と他のタンパク
質のポリペプチドとの間に、例えば特定のタンパク分解
酵素が認識して切断するアミノ酸配列を有するリンカー
を予め組み込んでおくことにより、融合ポリペプチドを
精製した後にリンカー部位で融合ポリペプチドを切断す
ることにより、従来精製が困難であったＳＡＴ−１を得
ることが可能である。上記特定のタンパク質分解酵素と
それが認識する特定の配列の組合せとしては例えばプロ
インスリンの合成時に働くシグナルペプチダーゼとイン
スリンのシグナルペプチドの組合せが挙げられる。なお
上記の培養物には、培地および当該培地中の細胞が包含
される。
は、公知のポリペプチドの精製方法によって行うことが
できる。具体的には例えば、ラクトシルセラミドあるい
はＣＭＰ−シアル酸などを結合したセファロースカラム
を用いたアフィニティ−クロマトグラフィーが挙げられ
る。融合ポリペプチドとして発現させた場合は、宿主細
胞の培養物を上記アフィニティーカラムのほか、ＳＡＴ
−１と融合したポリペプチドに対し親和性の高い物質
（例えば抗体など）を結合したアフィニティークロマト
グラフィーなどによって精製することが可能である。さ
らに、融合ポリペプチド中のＳＡＴ−１と他のタンパク
質のポリペプチドとの間に、例えば特定のタンパク分解
酵素が認識して切断するアミノ酸配列を有するリンカー
を予め組み込んでおくことにより、融合ポリペプチドを
精製した後にリンカー部位で融合ポリペプチドを切断す
ることにより、従来精製が困難であったＳＡＴ−１を得
ることが可能である。上記特定のタンパク質分解酵素と
それが認識する特定の配列の組合せとしては例えばプロ
インスリンの合成時に働くシグナルペプチダーゼとイン
スリンのシグナルペプチドの組合せが挙げられる。なお
上記の培養物には、培地および当該培地中の細胞が包含
される。
【００４７】シアル酸転移酵素の活性の測定方法として
は、一般的なガングリオシド合成の測定法（特開平７−
３２７６７８号公報など）において酵素の基質を変更す
ることにより実施することが可能である。例えば上記培
養物又は上記方法によって精製した酵素適量を、１００
ｍＭ カコジル酸ナトリウム、１０ｍＭ 塩化マンガ
ン、０．２ｍＭ ＣＭＰ−放射性物質標識シアル酸、
０．４ｍＭ ラクトシルセラミド、０．３％Ｔｒｉｔｏ
ｎ ＣＦ−５４を含む反応液をｐＨ６．５に調整し、３
７℃で２時間保温した後、一般的な薄層クロマトグラフ
ィーにより反応産物を展開し、フジックスＢＡＳ２００
０バイオ・イメージング・アナライザー（富士写真フィ
ルム（株）製）により活性の測定を行うことができる。
は、一般的なガングリオシド合成の測定法（特開平７−
３２７６７８号公報など）において酵素の基質を変更す
ることにより実施することが可能である。例えば上記培
養物又は上記方法によって精製した酵素適量を、１００
ｍＭ カコジル酸ナトリウム、１０ｍＭ 塩化マンガ
ン、０．２ｍＭ ＣＭＰ−放射性物質標識シアル酸、
０．４ｍＭ ラクトシルセラミド、０．３％Ｔｒｉｔｏ
ｎ ＣＦ−５４を含む反応液をｐＨ６．５に調整し、３
７℃で２時間保温した後、一般的な薄層クロマトグラフ
ィーにより反応産物を展開し、フジックスＢＡＳ２００
０バイオ・イメージング・アナライザー（富士写真フィ
ルム（株）製）により活性の測定を行うことができる。
【００４８】
【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに詳説する
が、本発明の目的を超えない限りこれに限定されるもの
ではない。 （１）ＨＬ−６０細胞の分化誘導とｃＤＮＡの構築 ＨＬ−６０をＴＰＡ ２４ｎＭを含むＲＰＭＩ−１６４
０（ニッスイ製）中で５vol％ＣＯ2、９５vol％空気、３
７℃の条件下で４８時間培養し、分化を誘導した。上記
細胞を１０００×ｇの遠心処理により回収し、グアニジ
ンチオシアネート−酸−フェノール−クロロホルム法
（ＡＧＰＣ法）により全ＲＮＡを調製した。５×１０6
個の分化した細胞から約４０μｇのＲＮＡが得られた。
このＲＮＡからオリゴｄＴセルロースカラムクロマトグ
ラフィーによりポリ(A)+ＲＮＡを精製した。
が、本発明の目的を超えない限りこれに限定されるもの
ではない。 （１）ＨＬ−６０細胞の分化誘導とｃＤＮＡの構築 ＨＬ−６０をＴＰＡ ２４ｎＭを含むＲＰＭＩ−１６４
０（ニッスイ製）中で５vol％ＣＯ2、９５vol％空気、３
７℃の条件下で４８時間培養し、分化を誘導した。上記
細胞を１０００×ｇの遠心処理により回収し、グアニジ
ンチオシアネート−酸−フェノール−クロロホルム法
（ＡＧＰＣ法）により全ＲＮＡを調製した。５×１０6
個の分化した細胞から約４０μｇのＲＮＡが得られた。
このＲＮＡからオリゴｄＴセルロースカラムクロマトグ
ラフィーによりポリ(A)+ＲＮＡを精製した。
【００４９】このポリ(A)+ＲＮＡを逆転写反応の鋳型と
し、ＤＮＡの一次鎖を構築し、更にこのＤＮＡを用いて
２本鎖ｃＤＮＡを合成した（Gubber, V. and Hoffman,
B.J., Gene, 25, 283(1983)）。
し、ＤＮＡの一次鎖を構築し、更にこのＤＮＡを用いて
２本鎖ｃＤＮＡを合成した（Gubber, V. and Hoffman,
B.J., Gene, 25, 283(1983)）。
【００５０】このようにして得られた２本鎖ｃＤＮＡ
に、制限酵素ＢＳＴＸ１アダプターを連結し、ｐＣＥＶ
１８のＢＳＴＸ１部位に導入してｃＤＮＡライブラリー
を構築した。
に、制限酵素ＢＳＴＸ１アダプターを連結し、ｐＣＥＶ
１８のＢＳＴＸ１部位に導入してｃＤＮＡライブラリー
を構築した。
【００５１】（２）ｃＤＮＡの３ＬＬ−ＨＫ４６細胞へ
のトランスフェクション 上記のｃＤＮＡライブラリーを３ＬＬ−ＨＫ４６細胞に
エレクトロポレーション法を用いて導入し、４８時間、
５vol％ＣＯ2、９５vol％空気、３７℃条件下で培養をし
た。
のトランスフェクション 上記のｃＤＮＡライブラリーを３ＬＬ−ＨＫ４６細胞に
エレクトロポレーション法を用いて導入し、４８時間、
５vol％ＣＯ2、９５vol％空気、３７℃条件下で培養をし
た。
【００５２】（３）ガングリオシドを発現した宿主細胞
の検出とｃＤＮＡの調製 培養後の３ＬＬ−ＨＫ４６細胞を抗ＧＭ3抗体であるＭ
２５９０とＦＩＴＣ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体によ
り免疫染色を行った。この染色した細胞をフローサイト
メーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）で蛍光が陽性の細
胞を検出した。陽性側の５％の細胞を回収し、プラスミ
ドＤＮＡを調製した後、さらに２回、３ＬＬ−ＨＫ４６
細胞へのエレクトロポレーション法による導入と４８時
間培養、免疫染色及びフローサイトメーターによる検
出、回収を繰り返した。
の検出とｃＤＮＡの調製 培養後の３ＬＬ−ＨＫ４６細胞を抗ＧＭ3抗体であるＭ
２５９０とＦＩＴＣ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体によ
り免疫染色を行った。この染色した細胞をフローサイト
メーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）で蛍光が陽性の細
胞を検出した。陽性側の５％の細胞を回収し、プラスミ
ドＤＮＡを調製した後、さらに２回、３ＬＬ−ＨＫ４６
細胞へのエレクトロポレーション法による導入と４８時
間培養、免疫染色及びフローサイトメーターによる検
出、回収を繰り返した。
【００５３】この方法で最終的に得られたプラスミド
を、ｐＢＫＣＭＶＧＤ3（ストラタジーン社製のｐＢＫ
ＣＭＶプラスミドベクターにヒトα２−８シアル酸転移
酵素（ＧＤ3合成酵素）を導入したプラスミド）と共に
３ＬＬ−ＨＫ４６細胞に導入した。この細胞を４８時間
培養した後、抗ＧＤ3抗体であるＲ２４とＦＩＴＣ標識
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体で免疫染色して、フローサイ
トメータにより蛍光の強い細胞の５％を検出し、回収し
た。
を、ｐＢＫＣＭＶＧＤ3（ストラタジーン社製のｐＢＫ
ＣＭＶプラスミドベクターにヒトα２−８シアル酸転移
酵素（ＧＤ3合成酵素）を導入したプラスミド）と共に
３ＬＬ−ＨＫ４６細胞に導入した。この細胞を４８時間
培養した後、抗ＧＤ3抗体であるＲ２４とＦＩＴＣ標識
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体で免疫染色して、フローサイ
トメータにより蛍光の強い細胞の５％を検出し、回収し
た。
【００５４】この細胞から、プラスミドＤＮＡを調製
し、エレクトロポレーション法により大腸菌ＤＨ１０Ｂ
（ギブコ社製）を形質転換した。トランスフェクション
とアンピシリンによる選別とを２回繰り返した後、陽性
コロニー群を９６穴マイクロプレート１穴あたり１００
コロニーの割合で小分けした。９枚のマイクロプレート
に植菌し、シブセレクション法を行い１穴に絞り込み、
この１穴に由来する２，４００コロニーを１穴あたり１
コロニーの割合で、９６穴マルチプレート２５枚に広
げ、更にシブセレクションを行い陽性クローン（ｐＣＥ
Ｖ４Ｃ７）を得た。このｐＣＥＶ４Ｃ７を３ＬＬ−ＨＫ
４６細胞に一過性に発現させて上記と同様に抗ＧＭ3抗
体（Ｍ２５９０）によるフローサイトメトリー解析を行
った。対照としてｐＣＥＶ１８を一過性に発現させた３
ＬＬ−ＨＫ４６細胞は細胞膜上にＧＭ 3を発現していな
かったが、ｐＣＥＶ４Ｃ７を一過性に発現させた３ＬＬ
−ＨＫ４６細胞は細胞膜上にＧＭ3を発現し、蛍光が検
出された。
し、エレクトロポレーション法により大腸菌ＤＨ１０Ｂ
（ギブコ社製）を形質転換した。トランスフェクション
とアンピシリンによる選別とを２回繰り返した後、陽性
コロニー群を９６穴マイクロプレート１穴あたり１００
コロニーの割合で小分けした。９枚のマイクロプレート
に植菌し、シブセレクション法を行い１穴に絞り込み、
この１穴に由来する２，４００コロニーを１穴あたり１
コロニーの割合で、９６穴マルチプレート２５枚に広
げ、更にシブセレクションを行い陽性クローン（ｐＣＥ
Ｖ４Ｃ７）を得た。このｐＣＥＶ４Ｃ７を３ＬＬ−ＨＫ
４６細胞に一過性に発現させて上記と同様に抗ＧＭ3抗
体（Ｍ２５９０）によるフローサイトメトリー解析を行
った。対照としてｐＣＥＶ１８を一過性に発現させた３
ＬＬ−ＨＫ４６細胞は細胞膜上にＧＭ 3を発現していな
かったが、ｐＣＥＶ４Ｃ７を一過性に発現させた３ＬＬ
−ＨＫ４６細胞は細胞膜上にＧＭ3を発現し、蛍光が検
出された。
【００５５】（４）塩基配列の決定 ｐＣＥＶ４Ｃ７の二本鎖ＤＮＡの塩基配列を、オートサ
イクルシークエンシングキット（ファルマシア社製）
と、ファルマシア A.L.F. ＤＮＡシークエンサー（フ
ァルマシア社製）を用いたデオキシチェーンターミネー
ション法により決定した。このように決定された塩基配
列とその塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番
号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。ｐＣＥ
Ｖ４Ｃ７が有するｃＤＮＡインサート４Ｃ７は約２．１
ｋｂｐであり、２０２番目の塩基を翻訳開始点とする３
５９アミノ酸残基を有するタンパク質（分子量４１，２
４４Ｄａ）をコードすることが明かとなった。アミノ酸
配列から予測される構造の模式図を図１に示す。ハイド
ロパシープロットによる解析の結果、Ｎ末端部１６番目
から２９番目のアミノ酸残基の領域に膜貫通領域（図１
中のＴＭ）が存在する２型膜タンパク質であることが判
明した。この配列をGenBankに登録されている遺伝子デ
ータベースで検索した結果、高度に相同性を示す配列は
認められなかった。しかし、シアル酸転移酵素の配列の
中央部及びＣ末端側領域に存在するシアル酸転移酵素相
同領域のシアリルモチーフ（Ｌ及びＳ）については、多
少の置換が見られたものの、比較的高い相同性が認めら
れた（図２）。比較に用いたシアル酸転移酵素は、h2,3
ST; 特開平５−３３６９６３号公報、rSTX; J. Biol. C
hem., 268, 11504-11507(1993)、rST3N-1; J. Biol. Ch
em., 267, 21011-21019(1992)、hST3N-2; J. Biol. Che
m., 268, 22782-22787(1993)、pST30-1; J. Biol.Che
m., 267, 21004-21010(1992)、mST30-2; Eur. J. Bioch
em.,216, 377-385(1993)、mST4'; NCBI Seq. ID 55853
2、hSAT4(a); Gycbiology, 5, 319-325(1995)、hST6N;
Nuc. Acids Res., 18, 667(1990)、rST6N; J. biol. Ch
em., 262, 17735-17743(1987)、h2,8ST; 特開平７−３
２７６７８号公報のそれぞれに記載の１１種である。こ
の結果から、ｐＣＥＶ４Ｃ７のインサート４Ｃ７がコー
ドするＳＡＴ−１はシアル酸転移酵素ファミリーに属す
ると考えられる。更にアミノ酸配列からＮ−グリコシレ
ーションサイトにコンセンサスな配列が４つ存在するこ
とが示された（図１中、△で示す）が、Ｎ末端側の二つ
の部位は、膜貫通領域の近傍及びシアリルモチーフ内に
存在するので、Ｃ末端側の二つの部位よりもＮ−グリコ
シル化されている可能性が低い。
イクルシークエンシングキット（ファルマシア社製）
と、ファルマシア A.L.F. ＤＮＡシークエンサー（フ
ァルマシア社製）を用いたデオキシチェーンターミネー
ション法により決定した。このように決定された塩基配
列とその塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番
号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。ｐＣＥ
Ｖ４Ｃ７が有するｃＤＮＡインサート４Ｃ７は約２．１
ｋｂｐであり、２０２番目の塩基を翻訳開始点とする３
５９アミノ酸残基を有するタンパク質（分子量４１，２
４４Ｄａ）をコードすることが明かとなった。アミノ酸
配列から予測される構造の模式図を図１に示す。ハイド
ロパシープロットによる解析の結果、Ｎ末端部１６番目
から２９番目のアミノ酸残基の領域に膜貫通領域（図１
中のＴＭ）が存在する２型膜タンパク質であることが判
明した。この配列をGenBankに登録されている遺伝子デ
ータベースで検索した結果、高度に相同性を示す配列は
認められなかった。しかし、シアル酸転移酵素の配列の
中央部及びＣ末端側領域に存在するシアル酸転移酵素相
同領域のシアリルモチーフ（Ｌ及びＳ）については、多
少の置換が見られたものの、比較的高い相同性が認めら
れた（図２）。比較に用いたシアル酸転移酵素は、h2,3
ST; 特開平５−３３６９６３号公報、rSTX; J. Biol. C
hem., 268, 11504-11507(1993)、rST3N-1; J. Biol. Ch
em., 267, 21011-21019(1992)、hST3N-2; J. Biol. Che
m., 268, 22782-22787(1993)、pST30-1; J. Biol.Che
m., 267, 21004-21010(1992)、mST30-2; Eur. J. Bioch
em.,216, 377-385(1993)、mST4'; NCBI Seq. ID 55853
2、hSAT4(a); Gycbiology, 5, 319-325(1995)、hST6N;
Nuc. Acids Res., 18, 667(1990)、rST6N; J. biol. Ch
em., 262, 17735-17743(1987)、h2,8ST; 特開平７−３
２７６７８号公報のそれぞれに記載の１１種である。こ
の結果から、ｐＣＥＶ４Ｃ７のインサート４Ｃ７がコー
ドするＳＡＴ−１はシアル酸転移酵素ファミリーに属す
ると考えられる。更にアミノ酸配列からＮ−グリコシレ
ーションサイトにコンセンサスな配列が４つ存在するこ
とが示された（図１中、△で示す）が、Ｎ末端側の二つ
の部位は、膜貫通領域の近傍及びシアリルモチーフ内に
存在するので、Ｃ末端側の二つの部位よりもＮ−グリコ
シル化されている可能性が低い。
【００５６】（５）ＳＡＴ−１のｃＤＮＡを発現した細
胞のＧＭ3合成 上記ＳＡＴ−１をコードするｃＤＮＡ（４Ｃ７）を発現
ベクターｐＣＥＶ１８に導入したｐＣＥＶ４Ｃ７を、エ
レクトロポレーション法により３ＬＬ−ＨＫ４６に導入
し、４８時間培養後のこの細胞のＧＭ3合成活性を以下
の方法により測定した。０．１ｍＭ ＣＭＰ−[14C]−
シアル酸（２×１０3ＣＰＭ）、０．４ｍＭラクトシル
セラミド、０．３％(W/V) Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ−５
４、１０ｍＭＭｇＣｌ2、１００ｍＭ カコジル酸ナト
リウム、１５０μｇのｐＣＥＶ４Ｃ７を導入した３ＬＬ
−ＨＫ４６のホモジナイズ液及び１ｍＭのシアリダーゼ
阻害剤（2,3−デヒドロ-2-デオキシ-N-アセチルシアル
酸(2,3-dehydro-2-deoxy-NeuAc)：ベーリンガー・マン
ハイム社製）を含むｐＨ６．５の２０μｌの反応液を、
３７℃で２時間インキュベートした後、１０μｌのメタ
ノールを添加して反応を停止した。反応液８μｌをＣ１
８逆相系薄層クロマトグラフィープレート（ＲＰ−１８
Ｗ ＨＰＴＬＣプレート）（メルク社製）にかけ、水で
１０分間展開した。放射性物質標識反応産物を原点から
掻き取り、ＧＭ３をクロロホルム−メタノール（１：
１、V/V）３００μｌにて抽出回収した。抽出物を乾固
後、シリカゲル薄層クロマトグラフィー ６０ＨＰＴＬ
Ｃプレート（メルク社製）に共した。クロロホルム−メ
タノール−０．５％ＣａＣｌ2水溶液（55:45:10,V/V/
V）にて展開後、オルシノール硫酸により発色すると共
に、ガングリオシドに取り込まれた放射活性をフジック
スＢＡＳ２０００バイオ・イメージング・アナライザー
（富士写真フィルム（株）製）で測定した。その結果、
14ＣのガングリオシドＧＭ 3への取り込みが起こってい
ることが明らかとなり、ＳＡＴ−１によるＧＭ3合成が
ＳＡＴ−１ｃＤＮＡ導入細胞で検出された。
胞のＧＭ3合成 上記ＳＡＴ−１をコードするｃＤＮＡ（４Ｃ７）を発現
ベクターｐＣＥＶ１８に導入したｐＣＥＶ４Ｃ７を、エ
レクトロポレーション法により３ＬＬ−ＨＫ４６に導入
し、４８時間培養後のこの細胞のＧＭ3合成活性を以下
の方法により測定した。０．１ｍＭ ＣＭＰ−[14C]−
シアル酸（２×１０3ＣＰＭ）、０．４ｍＭラクトシル
セラミド、０．３％(W/V) Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ−５
４、１０ｍＭＭｇＣｌ2、１００ｍＭ カコジル酸ナト
リウム、１５０μｇのｐＣＥＶ４Ｃ７を導入した３ＬＬ
−ＨＫ４６のホモジナイズ液及び１ｍＭのシアリダーゼ
阻害剤（2,3−デヒドロ-2-デオキシ-N-アセチルシアル
酸(2,3-dehydro-2-deoxy-NeuAc)：ベーリンガー・マン
ハイム社製）を含むｐＨ６．５の２０μｌの反応液を、
３７℃で２時間インキュベートした後、１０μｌのメタ
ノールを添加して反応を停止した。反応液８μｌをＣ１
８逆相系薄層クロマトグラフィープレート（ＲＰ−１８
Ｗ ＨＰＴＬＣプレート）（メルク社製）にかけ、水で
１０分間展開した。放射性物質標識反応産物を原点から
掻き取り、ＧＭ３をクロロホルム−メタノール（１：
１、V/V）３００μｌにて抽出回収した。抽出物を乾固
後、シリカゲル薄層クロマトグラフィー ６０ＨＰＴＬ
Ｃプレート（メルク社製）に共した。クロロホルム−メ
タノール−０．５％ＣａＣｌ2水溶液（55:45:10,V/V/
V）にて展開後、オルシノール硫酸により発色すると共
に、ガングリオシドに取り込まれた放射活性をフジック
スＢＡＳ２０００バイオ・イメージング・アナライザー
（富士写真フィルム（株）製）で測定した。その結果、
14ＣのガングリオシドＧＭ 3への取り込みが起こってい
ることが明らかとなり、ＳＡＴ−１によるＧＭ3合成が
ＳＡＴ−１ｃＤＮＡ導入細胞で検出された。
【００５７】ＧＭ3合成活性は、ｐＨ６．０〜７．０、
特にｐＨ６．５付近で高く、また、１０ｍＭ Ｍｎ2+存
在下で１．５倍以上上昇した。
特にｐＨ６．５付近で高く、また、１０ｍＭ Ｍｎ2+存
在下で１．５倍以上上昇した。
【００５８】
【発明の効果】本発明によりラクトシルセラミドから細
胞分化を誘導するガングリオシドＧＭ 3を合成するα２
−３シアル酸転移酵素（ＳＡＴ−１）のＤＮＡが提供さ
れる。また、本発明により、ＧＭ3合成酵素であるα２
−３シアル酸転移酵素が、上記ＤＮＡを使用することで
容易に得られる。
胞分化を誘導するガングリオシドＧＭ 3を合成するα２
−３シアル酸転移酵素（ＳＡＴ−１）のＤＮＡが提供さ
れる。また、本発明により、ＧＭ3合成酵素であるα２
−３シアル酸転移酵素が、上記ＤＮＡを使用することで
容易に得られる。
【００５９】本発明により、ＳＡＴ−１をコードするＤ
ＮＡが得られたので、その発現機構を解明することによ
る細胞分化のメカニズムの解明が期待される。
ＮＡが得られたので、その発現機構を解明することによ
る細胞分化のメカニズムの解明が期待される。
【００６０】
配列番号：1 配列の長さ：2121 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ヒト セルライン：骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０ 配列の特徴 特徴を示す記号：CDS 存在位置：202..1278 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を表す記号：transmembrane domain 存在位置：247..288 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：871..879 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：1201..1209 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を示す記号：sialyl-motif 存在位置：616..750 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を示す記号：sialyl-motif 存在位置：1048..1116 特徴を決定した方法：S 配列 CCCGGGCTGG CGGCTTGCCA GCGCTCCCTC CCTAGCATGC ACACAGAGGC GGTGGGCGGC 60 GCGGCGCGGA GGCCCCAGAA GCTGCGAAGC CAAGCAGCGG CACCTGCCTG CCGAGCAATG 120 CCAAGTGAGT TCACCTCTGC AAAGCTGAGA AGTGATTGCT CAAGGACCTC CCTGCAATGG 180 TACACCCGAA CCCAGCACAA G ATG AGA AGA CCC AGC TTG TTA ATA AAA GAC 231 Met Arg Arg Pro Ser Leu Leu Ile Lys Asp 1 5 10 ATC TGC AAG TGC ACG TTG GTT GCA TTT GGA GTC TGG CTC CTG TAC ATC 279 Ile Cys Lys Cys Thr Leu Val Ala Phe Gly Val Trp Leu Leu Tyr Ile 15 20 25 CTC ATT TTG AAT TAC ACC GCT GAA GAA TGT GAC ATG AAA AGA ATG CAC 327 Leu Ile Leu Asn Tyr Thr Ala Glu Glu Cys Asp Met Lys Arg Met His 30 35 40 TAT GTG GAC CCT GAC CGG ATA AAG AGA GCT CAG AGC TAT GCT CAG GAA 375 Tyr Val Asp Pro Asp Arg Ile Lys Arg Ala Gln Ser Tyr Ala Gln Glu 45 50 55 GTC TTG CAG AAG GAA TGT CGG CCC AGG TAC GCG AAG ACG GCT ATG GCT 423 Val Leu Gln Lys Glu Cys Arg Pro Arg Tyr Ala Lys Thr Ala Met Ala 60 65 70 CTG TTA TTT GAG GAC AGG TAC AGC ATC AAC TTG GAG CCT TTT GTG CAG 471 Leu Leu Phe Glu Asp Arg Tyr Ser Ile Asn Leu Glu Pro Phe Val Gln 75 80 85 90 AAG GTC CCC ACG GCC AGT GAA GCT GAG CTC AAG TAT GAC CCG CCT TTT 519 Lys Val Pro Thr Ala Ser Glu Ala Glu Leu Lys Tyr Asp Pro Pro Phe 95 100 105 GGA TTC CGG AAG TTC TCC AGT AAA GTC CAG AGC CTC TTG GAT ATG CTG 567 Gly Phe Arg Lys Phe Ser Ser Lys Val Gln Ser Leu Leu Asp Met Leu 110 115 120 CCC GAA CAT GAC TTT CCT GAA CAC TTG AGA GCC AAG GCC TGC AAG CGC 615 Pro Glu His Asp Phe Pro Glu His Leu Arg Ala Lys Ala Cys Lys Arg 125 130 135 TGT GTG GTT GTT GGG AAC GGG GGC ATC CTG CAC GGA CTA GAG CTG GGT 663 Cys Val Val Val Gly Asn Gly Gly Ile Leu His Gly Leu Glu Leu Gly 140 145 150 CAC GCC CTC AAC CAG TTC GAT GTG GTA ATA AGG TTG AAC AGT GCG CCA 711 His Ala Leu Asn Gln Phe Asp Val Val Ile Arg Leu Asn Ser Ala Pro 155 160 165 170 GTT GAG GGT TAC TCT GAA CAC GTT GGG AAT AAA ACT ACT ATA AGG ATG 759 Val Glu Gly Tyr Ser Glu His Val Gly Asn Lys Thr Thr Ile Arg Met 175 180 185 ACT TAC CCA GAG GGT GCG CCA CTG TCG GAC GTT GAA TAC TAC GCC AAT 807 Thr Tyr Pro Glu Gly Ala Pro Leu Ser Asp Val Glu Tyr Tyr Ala Asn 190 195 200 GAT TTG TTC GTT ACT GTT TTA TTT AAG AGT GTT GAT TTC AAG TGG CTT 855 Asp Leu Phe Val Thr Val Leu Phe Lys Ser Val Asp Phe Lys Trp Leu 205 210 215 CAA GCA ATG GTA AAA AAT GAA AGC CTG CCC TTT TGG GTT CGC CTC TTC 903 Gln Ala Met Val Lys Asn Glu Ser Leu Pro Phe Trp Val Arg Leu Phe 220 225 230 TTT TGG AAG CAA GTG GCA GAA AAA GTC CCA CTC CAG CCA AAG CAC TTC 951 Phe Trp Lys Gln Val Ala Glu Lys Val Pro Leu Gln Pro Lys His Phe 235 240 245 250 AGG ATT TTG AAC CCA GTT ATC ATC AAA GAA ACT GCC TTC GAC ATC CTT 999 Arg Ile Leu Asn Pro Val Ile Ile Lys Glu Thr Ala Phe Asp Ile Leu 255 260 265 CAG TAC TCA GAG CCT CAG TCA AGA TTC TGG GGC CAT GAT AAG AAC ATC 1047 Gln Tyr Ser Glu Pro Gln Ser Arg Phe Trp Gly His Asp Lys Asn Ile 270 275 280 CCC ACG ATC GGC GTC ATT GCC GTT GTC TTG GCT ACA CAT CTG TGT GAT 1095 Pro Thr Ile Gly Val Ile Ala Val Val Leu Ala Thr His Leu Cys Asp 285 290 295 GAA GTC AGC CTG GCA GGC TTT GGC TAC GAC CTC AGT CAA CCC AGG ACC 1143 Glu Val Ser Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Asp Leu Ser Gln Pro Arg Thr 300 305 310 CCT CTG CAC TAC TTT GAC AGT CAG TGC ATG GGC GCC ATG CAC TGG CAG 1191 Pro Leu His Tyr Phe Asp Ser Gln Cys Met Gly Ala Met His Trp Gln 315 320 325 330 GTC ATG CAC AAT GTG ACC ACA GAG ACC AAG TTC CTC CTG AAG CTC CTC 1239 Val Met His Asn Val Thr Thr Glu Thr Lys Phe Leu Leu Lys Leu Leu 335 340 345 AAG GAG GGC GTG GTG GAG GAC CTC AGC GGC GGC ATC CAC TGAGAACTCG 1288 Lys Glu Gly Val Val Glu Asp Leu Ser Gly Gly Ile His 350 355 GAACACGGCA AACCTCACCC AGCACCGCAG CTGAGAGCGT GGTGAGCAGC CTCCACAGGG 1348 ACTTCACCCT GCAGCTGCTT CGATGTGCAG CTAGTGTTTT CAAACTCCAC ATTTTTTTTA 1408 AAAAAGGAAA AGAAAGAACA ACAGCAACAA CAAAAGCTCT GCTCTGTGCA CCTCTTCGTC 1468 CTATTTATTT GAAGTCAGTG TTGGATTTTG CACAGTTTTG TAAGTTAATC TTAAGAATGG 1528 GATTGGAAGG ACTTTTCAAA GAGAATTGTA TAGTTTATTG TTTTTTAAGG AAGTAATTTA 1588 ATTTGCAGAA ACTGTACACA CGTACTCTGC TCAGGTGTTG AGGTGGGAGG AGAGGGGCTT 1648 CTGGCCCCTG GATGATGGCT GTGATGCCCG ATACTGGGGT CTGCTGCTCT GTTTGGTAGA 1708 ACTGATGGCA GAGAAACTTC CTGCCTCCAG GATAAAGGGC TTACTCATCA CCTCTGGCAG 1768 CTGCTAGACA AGTTCATAAC CCCTTTCTGC TAGTCCATCT GCCAGCTGGC TCGCAGGACT 1828 CAGGCAGGGC AGCTGTCCCG GAGGCTGCTG GTTGGTGAGC CACTGTCAGC TGAGCGCCGT 1888 GATGTTGCCC CAGGGTGGAA GAAGCCACAC TTCCTACACT GTCAGGGCAC TTTTAAACTT 1948 CTGGAGGGGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT 2008 GTTCATTCTG CCCTTCCAAA TCATCTAAGT GTTATTTAAG GCACTCTGCT GTTTGTATGA 2068 GATGGTTCAT AGAAATTATG ACAAAGCCTT TGTTATCCAG GCCATGGGAA GAG 2121
【００６１】配列番号：2 配列の長さ：359 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Arg Arg Pro Ser Leu Leu Ile Lys Asp Ile Cys Lys Cys Thr Leu 1 5 10 15 Val Ala Phe Gly Val Trp Leu Leu Tyr Ile Leu Ile Leu Asn Tyr Thr 20 25 30 Ala Glu Glu Cys Asp Met Lys Arg Met His Tyr Val Asp Pro Asp Arg 35 40 45 Ile Lys Arg Ala Gln Ser Tyr Ala Gln Glu Val Leu Gln Lys Glu Cys 50 55 60 Arg Pro Arg Tyr Ala Lys Thr Ala Met Ala Leu Leu Phe Glu Asp Arg 65 70 75 80 Tyr Ser Ile Asn Leu Glu Pro Phe Val Gln Lys Val Pro Thr Ala Ser 85 90 95 Glu Ala Glu Leu Lys Tyr Asp Pro Pro Phe Gly Phe Arg Lys Phe Ser 100 105 110 Ser Lys Val Gln Ser Leu Leu Asp Met Leu Pro Glu His Asp Phe Pro 115 120 125 Glu His Leu Arg Ala Lys Ala Cys Lys Arg Cys Val Val Val Gly Asn 130 135 140 Gly Gly Ile Leu His Gly Leu Glu Leu Gly His Ala Leu Asn Gln Phe 145 150 155 160 Asp Val Val Ile Arg Leu Asn Ser Ala Pro Val Glu Gly Tyr Ser Glu 165 170 175 His Val Gly Asn Lys Thr Thr Ile Arg Met Thr Tyr Pro Glu Gly Ala 180 185 190 Pro Leu Ser Asp Val Glu Tyr Tyr Ala Asn Asp Leu Phe Val Thr Val 195 200 205 Leu Phe Lys Ser Val Asp Phe Lys Trp Leu Gln Ala Met Val Lys Asn 210 215 220 Glu Ser Leu Pro Phe Trp Val Arg Leu Phe Phe Trp Lys Gln Val Ala 225 230 235 240 Glu Lys Val Pro Leu Gln Pro Lys His Phe Arg Ile Leu Asn Pro Val 245 250 255 Ile Ile Lys Glu Thr Ala Phe Asp Ile Leu Gln Tyr Ser Glu Pro Gln 260 265 270 Ser Arg Phe Trp Gly His Asp Lys Asn Ile Pro Thr Ile Gly Val Ile 275 280 285 Ala Val Val Leu Ala Thr His Leu Cys Asp Glu Val Ser Leu Ala Gly 290 295 300 Phe Gly Tyr Asp Leu Ser Gln Pro Arg Thr Pro Leu His Tyr Phe Asp 305 310 315 320 Ser Gln Cys Met Gly Ala Met His Trp Gln Val Met His Asn Val Thr 325 330 335 Thr Glu Thr Lys Phe Leu Leu Lys Leu Leu Lys Glu Gly Val Val Glu 340 345 350 Asp Leu Ser Gly Gly Ile His 355
【００６２】配列番号：3 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGAAAAGAA TGCACTA 17
【００６３】配列番号：4 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCAGTGGATG CCGCTGA 17
【００６４】配列番号：5 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Leu Leu Lys Leu Leu Lys Glu Gly Val Val Glu Asp Leu Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ile His
【００６５】配列番号：6 配列の長さ：48 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Cys Lys Arg Cys Val Val Val Gly Asn Gly Gly Ile Leu His Gly Leu 1 5 10 15 Glu Leu Gly His Ala Leu Asn Gln Phe Asp Val Val Ile Arg Leu Asn 20 25 30 Ser Ala Pro Val Glu Gly Tyr Ser Glu His Val Gly Asn Lys Thr Thr 35 40 45
【図１】 本発明のα２−３シアル酸転移酵素（ＳＡＴ
−１）の構造の模式図。△は、アミノ酸配列から推定さ
れるＮ−グリコシレーション部位である。ＴＭはアミノ
酸配列から推定される膜貫通領域である。
−１）の構造の模式図。△は、アミノ酸配列から推定さ
れるＮ−グリコシレーション部位である。ＴＭはアミノ
酸配列から推定される膜貫通領域である。
【図２】 ＳＡＴ−１のシアリルモチーフ（Ｌ及びＳ）
領域のアミノ酸配列と、他のシアル酸転移酵素のシアリ
ルモチーフ領域との対比を示す図。配列の下に付した*
は他のシアル酸転移酵素のシアリルモチーフに見られる
共通配列である。配列の上に付した*はSAT-1の、当該シ
アリルモチーフの共通配列とアミノ酸が同一の部分であ
り、-は異なる部分である。
領域のアミノ酸配列と、他のシアル酸転移酵素のシアリ
ルモチーフ領域との対比を示す図。配列の下に付した*
は他のシアル酸転移酵素のシアリルモチーフに見られる
共通配列である。配列の上に付した*はSAT-1の、当該シ
アリルモチーフの共通配列とアミノ酸が同一の部分であ
り、-は異なる部分である。
【図３】 本発明ＤＮＡから推定したＳＡＴ−１のアミ
ノ酸配列のハイドロパシープロット。
ノ酸配列のハイドロパシープロット。
Claims (10)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するシアル酸転
移酵素。 作用：シアル酸供与体から、シアル酸受容体であるラ
クトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の３位水
酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシドＧＭ
3を生成する。 至適反応ｐＨ：ｐＨ６．０〜７．０。 阻害及び活性化：１０ｍＭのＭｎ2+により活性が１．
５倍以上に上昇する。 - 【請求項２】 下記の理化学的性質を有し、アミノ酸
配列のＣ末端に配列番号５のアミノ酸配列を有するシア
ル酸転移酵素。 作用：シアル酸供与体から、シアル酸受容体であるラ
クトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の３位水
酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシドＧＭ
3を生成する。 - 【請求項３】 下記の理化学的性質を有し、配列番号
６のアミノ酸配列を有するシアル酸転移酵素。 作用：シアル酸供与体から、シアル酸受容体であるラ
クトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の３位水
酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシドＧＭ
3を生成する。 - 【請求項４】 シアル酸供与体が、シチジン−５−モノ
リン酸−シアル酸（ＣＭＰ−シアル酸）である請求項１
〜３のいずれか一項記載のシアル酸転移酵素。 - 【請求項５】 ヒト由来である請求項１〜４のいずれか
一項記載のシアル酸転移酵素。 - 【請求項６】 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド
を含むシアル酸転移酵素。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数
個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミ
ノ酸配列からなり、かつシアル酸供与体からシアル酸受
容体であるラクトシルセラミドに含まれるガラクトース
残基の３位水酸基へ選択的にシアル酸を転移してガング
リオシドＧＭ3を生成する酵素活性を有するポリペプチ
ド。 - 【請求項７】 請求項１〜６記載のシアル酸転移酵素を
形成するポリペプチド。 - 【請求項８】 以下の（ａ）もしくは（ｂ）のポリペプ
チド又はその部分からなるポリペプチド。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数
個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミ
ノ酸配列からなり、かつシアル酸供与体からシアル酸受
容体であるラクトシルセラミドに含まれるガラクトース
残基の３位水酸基へ選択的にシアル酸を転移してガング
リオシドＧＭ3を生成する酵素活性を有するポリペプチ
ド。 - 【請求項９】 少なくとも膜貫通領域を欠失し、かつシ
アル酸供与体からシアル酸受容体であるラクトシルセラ
ミドに含まれるガラクトース残基の３位水酸基へ選択的
にシアル酸を転移してガングリオシドＧＭ3を生成する
酵素活性を有する請求項７又は８記載のポリペプチド。 - 【請求項１０】 請求項７〜９のいずれか一項記載のポ
リペプチドの全部又は部分をコードするＤＮＡ。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9184184A JPH1118778A (ja) | 1997-07-09 | 1997-07-09 | シアル酸転移酵素及びそれをコードするｄｎａ |
| EP98305422A EP0890645A3 (en) | 1997-07-09 | 1998-07-08 | Sialyltransferase and DNA encoding the same |
| US09/425,488 US6555371B1 (en) | 1997-07-09 | 1999-10-22 | Sialyltransferase and DNA encoding the same |
| US10/309,389 US7256278B2 (en) | 1997-07-09 | 2002-12-03 | Sialyltransferase and DNA encoding the same |
| US11/771,606 US20080227172A1 (en) | 1997-07-09 | 2007-06-29 | Sialyltransferase and dna encoding the same |
| US12/841,909 US8202705B2 (en) | 1997-07-09 | 2010-07-22 | Sialyltransferase and DNA encoding the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9184184A JPH1118778A (ja) | 1997-07-09 | 1997-07-09 | シアル酸転移酵素及びそれをコードするｄｎａ |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006148878A Division JP2006314320A (ja) | 2006-05-29 | 2006-05-29 | シアル酸転移酵素及びそれをコードするｄｎａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1118778A true JPH1118778A (ja) | 1999-01-26 |
Family
ID=16148840
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9184184A Pending JPH1118778A (ja) | 1997-07-09 | 1997-07-09 | シアル酸転移酵素及びそれをコードするｄｎａ |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0890645A3 (ja) |
| JP (1) | JPH1118778A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005067971A1 (ja) * | 2004-01-16 | 2005-07-28 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 動脈硬化の予防・治療用医薬 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6280989B1 (en) | 1999-06-17 | 2001-08-28 | Dmitri Kapitonov | Sialyltransferases |
| WO2001055410A2 (en) * | 2000-01-28 | 2001-08-02 | Musc Foundation For Research Development | Ceramidase compositions and methods based thereon |
| EP1797898A4 (en) * | 2004-09-08 | 2009-09-09 | Takeda Pharmaceutical | MEDICAMENT FOR THE PREVENTION / TREATMENT OF ARTERIOSCLEROSIS |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5962294A (en) * | 1992-03-09 | 1999-10-05 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for the identification and synthesis of sialyltransferases |
| CA2284550A1 (en) * | 1997-03-21 | 1998-10-01 | Human Genome Sciences, Inc. | 87 human secreted proteins |
-
1997
- 1997-07-09 JP JP9184184A patent/JPH1118778A/ja active Pending
-
1998
- 1998-07-08 EP EP98305422A patent/EP0890645A3/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005067971A1 (ja) * | 2004-01-16 | 2005-07-28 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 動脈硬化の予防・治療用医薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0890645A3 (en) | 2000-08-30 |
| EP0890645A2 (en) | 1999-01-13 |
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| A02 | Decision of refusal |
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