KR100914525B1

KR100914525B1 - 신규 ｎ―아세틸글루코사민―２―에피머라아제 및 이를 이용한 ｃｍｐ―ｎ―아세틸뉴라민산의 제조방법

Info

Publication number: KR100914525B1
Application number: KR1020080088762A
Authority: KR
Inventors: 우진석; 송재경; 김병기; 강선엽; 김대희; 장경순; 양지영; 서원민; 길태건; 심상희; 허인강
Original assignee: 주식회사 진켐
Priority date: 2006-12-15
Filing date: 2008-09-09
Publication date: 2009-09-02
Also published as: WO2008072861A1; KR20080093087A; JP2010512741A; KR100888513B1; US8852891B2; US20110287488A1; KR20080055588A; CN101668850B; CN101668850A; JP5209639B2; EP2094840B1; EP2094840A1; EP2094840A4

Abstract

본 발명은 신규 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 및 CMP-N-아세틸뉴라민산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 박테로이드 프라질리스 NCTC 9343(Bacteroides fragilis NCTC 9343) 유래의 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 및 상기 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제를 이용하여 N-아세틸-D-만노사민, 뉴라민산 및 CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 저가 기질인 시티딘 모노포스페이트와 N-아세틸-D-글루코사민을 이용하여 한번의 반응에 의해 경제적으로 CMP-N-아세틸뉴라민산을 대량 생산할 수 있다.

Description

신규 Ｎ―아세틸글루코사민―２―에피머라아제 및 이를 이용한 ＣＭＰ―Ｎ―아세틸뉴라민산의 제조방법{Novel N-Acetylglucosamine-2-Epimerase and Method for Producing CMP-neuraminic acid Using the Same}

본 발명은 신규 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 및 CMP-N-아세틸뉴라민산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 박테로이드 프라질리스 NCTC 9343(Bacteroides fragilis NCTC 9343) 유래의 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 및 상기 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제를 이용하여 N-아세틸-D-만노사민, 뉴라민산 및 CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근, 당쇄에 관한 구조 및 기능에 관한 연구가 급속하게 진행되어 생리 활성을 갖는 올리고당, 당 지질, 당 단백질 등의 의약품 또는 기능성 소재로서의 용도 개발이 주목받고 있다. 그 중, 말단에 N-아세틸뉴라민산(NeuAc)을 함유하는 시알산 함유 당쇄는 세포 접착이나 바이러스 감염시 수용체가 되는 등 중요한 기능을 갖는 당쇄이다.

시알산 함유 당쇄는 일반적으로 시알산 전이효소의 촉매작용에 의해 합성된다. 시알산 전이효소는 CMP-N-아세틸뉴라민산(CMP-NeuAc)을 당 공급체로 하여 당쇄 등의 수용체에 시알산을 전이하는 효소이다. 그러나, 당 공급체로서 사용하는 CMP-NeuAc는 매우 비싸고 양적으로도 시약 수준의 적은 양으로밖에 공급되지 않는 것이 현실이다.

CMP-NeuAc의 제조방법으로는 시티딘 5'-트리인산(CTP)과 N-아세틸뉴라민산(NeuAc)을 기질로 하여 CMP-NeuAc 신타아제의 촉매에 의해 합성하는 방법이 알려져 있는데, 그 원료가 되는 CTP 및 NeuAc는 비싸기 때문에 직접 원료로 하여 합성된 CMP-NeuAc도 비쌀 수 밖에 없다.

최근, 오로틴산에서 우리딘 5'-트리인산(UTP)으로 변환하는 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) 균체, UTP에서 CTP로 변환하는 반응을 촉매하는 CTP 합성효소를 생산하는 재조합 대장균 및 CMP-NeuAc 합성효소를 생산하는 재조합 대장균을 조합하고, 오로틴산과 NeuAc를 원료로 하여 CMP-NeuAc를 합성하는 방법이 개발되었다. 상기 방법은 비싼 CTP를 사용하지 않는 방법이기는 하지만, 복수 종의 균체를 조제하지 않으면 안되는 등 공정이 번잡한 동시에 그것을 실시하기 위한 대형의 설비를 준비해야 하며, 비싼 NeuAc를 원료로 하고 있는 점에서 실용적인 방법이라고 하기 어려웠다.

한편, NeuAc의 제조방법에 관해서는 시알산의 다량체인 콜로민산을 미생물로부터 회수하고 이것을 화학 분해하여 회수하는 방법이 알려져 있지만, 최근 효소를 이용한 방법이 개발되었다.

CMP-N-아세틸뉴라민산(CMP-neuraminic acid, CMP-NeuAc)의 생산방법으로는 (1) N-아세틸뉴라민산 리아제 또는 N-아세틸뉴라민산 신타아제를 사용하여 N-아세틸만노사민(N-acetyl-D-mannosamine, ManNAc)으로부터 제조하는 방법(J. Am . Chem . Soc., 110:6481, 1988; J. Am . Chem . Soc., 110:7159, 1988; 일본공개특허 평 제10-4961호), (2) 알칼리 조건하에서 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 N-아세틸만노사민(ManNAc)으로 변환시키고, 여기에 N-아세틸뉴라민산 리아제 또는 N-아세틸뉴라민산 신타아제를 첨가하여 N-아세틸뉴라민산(NeuAc)을 제조하는 방법(일본공개특허 평 제5-211884호; Biotechnol . Bioeng ., 66:2, 1999; Enzyme Microb . Technol., 20, 1997), (3) GlcNAc에서 MamNAc로의 변환을 촉매하는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 2-에피머라아제와 NeuAc 리아제 또는 NeuAc 신타아제를 사용하여 GlcNAc에서 제조하는 방법 (WO95/26399; 일본공개특허 평3-180190호; 일본공개특허 2001-136982호), (4) 대장균과 효모 균체를 이용하여 CMP-N-아세틸뉴라민산을 합성하는 방법(WO 2004/009830) 등이 보고되고 있다.

그러나, (1)의 방법은 원료인 N-아세틸만노사민(ManNAc)이 고가이고, (2)의 방법은 저렴한 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 원료로 하는 방법이기는 하지만, GlcNAc과 N-아세틸만노사민(ManNAc)의 혼합물에서 ManNAc를 정제하는 공정이 복잡하다는 문제가 있다. 또한, (3)의 방법에서 사용하는 GlcNAc2-에피머라아제는 ATP가 필요하기 때문에 고가의 ATP를 첨가하거나, 미생물을 사용하여 ATP의 전구체인 아데닌에서 ATP를 생성시켜야 한다는 단점이 있고, (4)의 방법은 대장균과 효모 균체를 이용하는 방법이 공정상 복잡하다는 문제가 있다.

N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제에 관해서는 돼지나 랫트의 신장, 간, 비장(spleen), 뇌, 장내 점막(intestinal mucosa), 갑상선(thymus), 이자(pancreas) 및 침샘(salivary gland)에 존재하는 것으로 알려져 있고, 돼지 유래의 효소에 대해서 그 특성이 조사되어 있으며, 주로 동물 유래 유전자 등에서 추출되어 연구되었다 (Biochemistry, 17:3363, 1970; Biochem . J., 210:21, 1983; Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A., 52:371, 1964). 또한, N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제의 유전자에 대해서는 돼지 유래의 유전자가 알려져 있다 (J. Biol . Chem., 271:16294, 1996). 미생물 중에서는 남조의 일종인 시네코시스티스 속 PCC 6803(Synechocystis sp. PCC 6803)은 그 게놈의 전체 서열이 결정되어 있는바, 게놈으로부터 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제를 확인하였다 (DNA Research, 3:109, 1996; Nucleic Acids Research, 26:63, 1998).

대한민국공개특허(제10-2001-0102019호)에서는 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 및 이 효소를 코딩하는 DNA에 관한 것으로, N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제를 코딩하는 DNA를 남조(Cyanobacteria) 중 시네코시스티스(Synechocystis)에서 발견하여 사용하였다.

또한, 대한민국공개특허(제10-2006-0010706호)에서는 CMP-N-아세틸뉴라민산의 제조방법에 대한 것으로, N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제를 코딩하는 유전자 및 N-아세틸뉴라민산 알도라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 공발현 벡터가 도입된 형질전환체에 시티딘 모노포스페이트(CMP), N-아세틸 글루코사민, 피루브산 및 효모를 첨가하여 뉴라민산을 합성한 후, CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소를 첨가하거나, N-아세틸뉴라민산 알도라제를 코딩하는 유전자 및 CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 공발현 벡터가 도입된 형질전환체에 시티딘 모노포스페이트(CMP), N-아세틸 글루코사민, 피루브산 및 효모를 첨가하여 CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는 방법에 관한 것이나, CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는데 있어 여러 단계를 거쳐야 하고, 기질로 사용되는 시티딘 모노포스페이트(CMP)가 시티딘 트리포스페이트(CTP)로 전환되는 수율이 낮은 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 CMP-N-아세틸뉴라민산을 경제적이고 간단한 방법으로 제조하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 박테로이드 프라질리스 NCTC 9343(Bacteroides fragilis NCTC 9343)에서 신규 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 효소를 확인하고, 상기 효소의 유전자를 재조합벡터로 형질전환하여 얻어진 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제, 저가의 기질인 시티딘 모노포스페이트(CMP) 및 극소량의 NTP를 사용하여 여러 기질과 효소를 한번에 섞어서 원-포트(one-pot) 연쇄반응을 통해 높은 수율로 CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 신규 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 및 상기 효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제를 이용하여 여러 기질과 효소를 한번에 섞어서 원-포트(one-pot) 연쇄반응에 의해 CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc 2-epimerase)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)을 포함하는 반응 혼합물을 상기 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제의 존재하에 반응시키는 것을 특징으로 하는 N-아세틸-D-만노사민(N-acetyl-D-mannosamine)의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 피루브산(pyruvic acid) 및 상기 N-아세틸-D-만노사민을 포함하는 반응 혼합물을 N-아세틸뉴라민산 알도라제(NeuNAc aldolase)의 존재하에 반응시키는 것을 특징으로 하는 뉴라민산(neuraminic acid)의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (ⅰ) 시티딘 5' 모노포스페이트(cytidine 5' monophosphate, CMP), (ⅱ) 뉴클레오티드 트리-포스페이트(nucleotide tri-phosphate, NTP) 또는 ATP, (ⅲ) 아세틸 포스페이트(acetyl Pi), (ⅳ) N-아세틸-D-글루코사민 및 (ⅴ) 피루브산을 포함하는 반응 혼합물을 (a) N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc 2-epimerase), (b) N-아세틸뉴라민산 알도라제(NeuNAc aldolase), (c) 시티딘 5' 모노포스페이트 키나아제(cytidine 5' monophosphate kinase, CMP kinase), (d) 아세테이트 키나아제(acetate kinase) 및 (e) CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소(CMP-NeuNAc synthetase)의 존재하에 반응시키는 것을 특징으로 하는 CMP-N-아세틸뉴라민산(CMP-neuraminic acid)의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 뉴클레오티드 트리-포스페이트(NTP) 또는 ATP는 아세틸 포스페이트(acetyl Pi) 및 아세테이트 키나아제(acetate kinase)에 의해 재생되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 뉴클레오티드 트리-포스페이트(NTP)는 시티딘 트리-포스페이트(cytidine tri-phosphate, CTP)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제, N-아세틸뉴라민산 알도라제, 시티딘 5' 모노포스페이트 키나아제, 아세테이트 키나아제 및 CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소는 담체에 고정화되어 있는 것임을 특징으로 할 수 있고, 상기 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제, N-아세틸뉴라민산 알도라제, 시티딘 5' 모노포스페이트 키나아제, 아세테이트 키나아제 및 CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소는 각각 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 11 및 서열번호 14의 염기서열에 의해 코딩되는 것임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 신규 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 및 CMP-N-아세틸뉴라민산을 경제적으로 대량생산할 수 있는 CMP-N-아세틸뉴라민산의 제조방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 의하면, 저가의 기질인 시티딘 모노포스페이트와 N-아세틸-D-글루코사민을 이용하여 한번의 반응으로 CMP-N-아세틸뉴라민산을 대량 생산할 수 있고, 뉴클레오티드 트리-포스페이트(NTP) 또는 ATP는 아세틸 포스페이트(acetyl Pi) 및 아세테이트 키나아제에 의해 재생되므로 저렴한 비용으로 CMP-N-아세틸뉴라민산을 생산할 수 있다.

도 1은 CMP-N-아세틸뉴라민산의 합성과정을 나타낸 모식도이다.

도 2는 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제를 코딩하는 유전자(nanE)를 함유하는 재조합벡터를 나타낸 것이다.

도 3은 N-아세틸뉴라민산 알도라제를 코딩하는 유전자(nan)를 함유하는 재조합벡터를 나타낸 것이다.

도 4는 시티딘 5' 모노포스페이트 키나아제를 코딩하는 유전자(cmk)를 함유하는 재조합벡터를 나타낸 것이다.

도 5는 아세테이트 키나아제를 코딩하는 유전자(ack)를 함유하는 재조합벡터를 나타낸 것이다.

도 6은 CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소를 코딩하는 유전자(neu)를 함유하는 재조합벡터를 나타낸 것이다.

도 7은 각 효소의 발현 여부를 SDS-PAGE 젤을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다 (1번째 레인: 마커, 2번째 레인: 시티딘 5' 모노포스페이트 키나아제, 3번째 레인: 아세테이트 키나아제, 4번째 레인: CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소, 5번째 레인: N-아세틸뉴라민산 알도라제, 6번째 레인: 아실글루코사민-2-에피머라아제).

도 8은 정제된 각 효소의 발현 여부를 SDS-PAGE 젤을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다 (1번째 레인: 마커, 2번째 레인: 정제된 시티딘 5' 모노포스페이트 키나아제, 3번째 레인: 정제된 아세테이트 키나아제, 4번째 레인: 정제된 CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소, 5번째 레인: 정제된 N-아세틸뉴라민산 알도라제, 6번째 레인: 정제된 아실글루코사민-2-에피머라아제).

도 9는 CMP-N-아세틸뉴라민산을 H1 NMR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 CMP-N-아세틸뉴라민산을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태는 CMP-N-아세틸뉴라민산의 합성에 관여하는 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 효소에 관한 것이다. 상기 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제는 박테로이드 프라질리스 NCTC 9343(Bacteroides fragilis NCTC 9343) 유래의 효소이며, 시네코시스티스 속과 박테로이드 테타이오타오마이크론의 해당 유전자와 35.06~32.9%의 유사성을 보였다.

상기 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제를 코딩하는 유전자를 PCR법에 의해 증폭한 후, 플라스미드 pET28a(+) T4 DNA에 연결하여 재조합벡터를 제작하였다. 상기 재조합벡터를 E. coli XL-Blue에 도입하여 얻어진 카나마이신 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pNANEe를 분리한 후, E. coli/pNANe를 제조한 다음, 상기 형질전환체를 배양하여 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제를 수득하였다.

본 발명의 다른 양태는 상기 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제를 이용하여 원-포트(one-pot) 연쇄반응에 의해 CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 N-아세틸뉴라민산 알도라제, CMP-키나아제, 아세테이트 키나아제 및 CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소는 공지된 효소이며, 통상적인 방법에 의해 조제할 수 있으나, 상기 유전자의 클로닝, 클로닝한 DNA 단편을 포함하는 재조합벡터의 제작, 재조합벡터를 도입한 형질전환체의 제작, 형질전환체의 배양에 의한 목적 효소 단백질의 생산 등의 재조합 DNA법을 사용하는 것이 바람직하다. 형질전환에 사용되는 숙주는 특별히 한정되지 않지만 조작 및 간편성으로 인하여 대장균을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제는 박테로이드 프라질리스 NCTC 9343(Bacteroides fragilis NCTC 9343)으로부터 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제를 코딩하는 신규 유전자를 분리하여 사용하였다. 박테로이드 프라질리스의 게놈 DNA의 전체 서열은 결정되었지만(US 7,090,973), N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 유전자에 대한 기능은 전혀 알려지지 않았다.

본 발명에서는 고발현된 각 효소들을 정제한 후, 키토산 등의 고분자 비드를 사용하여 고정화함으로써 반복적인 합성 단계를 거치지 않고 한번에 합성할 수 있으므로 합성 단가를 크게 낮출 수 있다. 효소의 고정화 방법은 통상적인 효소의 고정화 수단(공유부착법, 다기능 시약을 이용한 가교, 흡착법, 미세캡슐화방법 등)을 사용할 수 있다. 효소의 정제방법은 통상적인 효소의 정제 수단(염석 처리, 등전점 침전 처리, 투석 처리, 각종 크로마토그래피 처리 등)을 사용할 수 있고, 상기 정제방법에 의해 얻어지는 조효소 또는 정제효소를 이용할 수 있으며, 상기 효소를 고분자 비드에 고정화하는 방법은 통상적인 효소 고정화 방법을 사용할 수 있다. 상기의 방법에 의하여 정제된 효소는 고분자 비드에 고정화하여 20회 이상 사용할 수 있기 때문에 효소를 회수하는 비용과 절차를 줄일 수 있다.

*본 발명에 따르면, 저가 기질인 시티딘 모노포스페이트(cytidine monophosphate, CMP)는 CMP-키나아제 및 아세테이트 키나아제(acetate kinase)에 의해 시티딘 다이포스페이트(cytidine diphosphate, CDP)를 거쳐 시티딘 트리포스페이트(cytidine tri-phosphate, CTP)로 97% 이상의 고수율로 합성된다. 상기 CDP에 사용되는 포스페이트의 공여체로는 극소량의 NTP를 사용하며, NDP는 과량의 아세틸 포스페이트(acetyl Pi)와 아세테이트 키나아제(acetate kinase)에 의해 다시 재사용되어 경제적이다. 특히, 본 발명에서는 CDP에 제공되는 포스페이트 공여체로 사용되는 ATP 대신에 CTP를 사용함으로써, 반응 종료 후 불순물로 존재하는 ADP를 제거해야 하는 번거로움을 해소할 수 있다.

또한, N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine, GlacNAc)은 본 발명에 따른 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(N-acetylglucosamine-2-epimerase)에 의해 N-아세틸-D-만노사민(N-acetyl-D-mannosamine, ManNAc)으로 전환되며, ManNAc와 피루브산은 N-아세틸뉴라민산 알도라제(NeuAc aldolase)에 의해 뉴라민산(neuraminic acid)으로 합성된다. 상기에서 합성된 CTP와 뉴라민산은 CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소(CMP-NeuAc synthetase)에 의해 CMP-N-아세틸뉴라민산으로 합성된다 (도 1).

본 발명에 따르면, 상기 여러 기질과 효소를 한번에 섞어서 원-포트(one-pot) 연쇄반응을 함으로써 각 효소의 반응성을 극대화하고, 적은 양의 효소 및 기질을 사용하더라도 CMP-N-아세틸뉴라민산을 90% 이상의 고수율로 합성할 수 있다. 즉, N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제의 경우, 에피머라아제 단독 반응을 하면 CMP-N-아세틸뉴라민산의 합성 수율은 50%도 되지 않지만, 원-포트(one-pot) 연쇄반응을 할 경우 90% 이상의 고수율로 CMP-N-아세틸뉴라민산을 합성할 수 있다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 Sambrook, et. al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann, et. al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능 하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 유전자의 클로닝 및 형질전환

실시예 1-1. N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제를 코딩하는 nanE 유전자(서열번호 1)의 클로닝 및 형질전환

CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는데 있어서 수율를 높이고 단가를 낮추기 위한 가장 큰 문제점으로 지적된 N-아세틸-D-글루코사민으로부터 N-아세틸-D-만노사민으로의 이성질화 단계를 해결하기 위하여, N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc 2-epimerase)를 다양한 source로부터 찾았다.

혐기성 미생물인 박테로이드 프라질리스 NCTC 9343(Bacteroides fragilis NCTC 9343, NC_003228)으로부터 3종류의 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 유사 유전자를 찾았다.

N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 후보 유전자 1번은 947856.~949034 구역에 있고, 1179bp으로 코팅되어 있으며, 리조비엄 멜리로티(Rhizobium meliloti)와 호모 사피언스( Homo sapiens)의 해당 효소 유전자와 23.68%~24.44%의 유사성을 보였다.

N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 후보 유전자 2번은 1996625.~1997809구역에 있고, 1185bp으로 코팅되어 있으며, 시네코시스티스 속(Synechocystis sp.)과 박테로이드 테타이오타오마이크론(Bacteroides thetaiotaomicron)의 해당 효소 유전자와 35.06%~32.9%의 유사성을 보였다.

N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 후보 유전자 3번은 4765592.~4766353구역에 있고, 762bp으로 코팅되어 있으며, 리도피레룰라 발티카(Rhodopirellula baltica)와 시네코시스티스 속(Synechocystis sp .)의 해당 효소 유전자와 48.18%~34.97%의 유사성을 보였다.

각 유전자를 pET 발현 벡터(Novagen)에 재조합하고, BL21(DE3), BL21(DE3) pLysS 발현 균주에 도입하여 형질전환하였다. 그 결과, N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 후보 유전자 1번 및 2번은 가용성 단백질(soluble protein)로 고발현하였으나, 후보 유전자 3번은 가용성 단백질로 발현이 되지 않고 비가용성(insoluble)으로 발현되는 것을 확인하였다.

고발현된 후보 유전자 효소 1번 및 2번의 활성을 알아보기 위하여, 기질로 N-아세틸-D-글루코사민 및 피루브산을 사용하고, N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 후보 유전자 1번, 2번 및 활성이 확인된 N-아세틸뉴라민산 알도라제를 사용하여 두 단계를 한번에 반응시켜 생성된 뉴라믹산(neuraminic acid)을 당 분석장치(Metrohm)를 이용하여 확인하였다.

그 결과, N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 후보 유전자 1번은 활성이 없었으며, N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 후보 유전자 2번이 활성이 뛰어나다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 인간 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(organism="Homo sapiens,ene="RENBP", coded_by="NM_002910.4:203..1456")와 같은 조건하에서(50mM N-아세틸D-글루코사민, 100~200mM 피루브산, 10mM MgCl2, 50mM~100mM Tris HCl, 30℃~40℃) 활성을 비교하였을 때, N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 후보 유전자 2번의 반응 속도 및 수율이 매우 높은 것으로 나타나, 상기 후보 유전자 2번을 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제로 확인하였다.

상기 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc 2-epimerase, 서열번호 2)를 코딩하는 nanE 유전자를 클로닝하기 위하여, 박테로이드 프라질리스 NCTC 9343(Bacteroides fragilis NCTC 9343) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 사용하여 PCR 법에 의해 nanE 유전자를 증폭하였다.

서열번호 3: 5'-ct gcc atg gtt atg aat act aca g

서열번호 4: 5'-aat gga tcc tta ttt ttc tga cag

PCR 조건은 주형 DNA(10 pmol) 1㎕, 프라이머 각각 1㎕, Primix(Genotech) 4㎕, 증류수 14㎕를 Mastercycler gradient PCR(Ependorf)을 이용하여 변성(denaturation, 96℃에서 1분), 결합(annealing, 40.2℃에서 1분), 연장(elongation, 72℃에서 2분) 단계를 총 30회 실시하였다.

*상기 증폭된 PCR 산물을 Plasmid mini-prep kit(Solgent)로 정제하고, 70% 에탄올을 첨가하여 DNA를 첨가시켰다. 침전된 DNA를 아가로스겔 전기영동에 의해 확인하고, 1.2kb 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 상기 정제된 DNA를 제한효소 NcoI 및 BamHI로 절단하고, 상기와 동일한 제한효소 NcoI 및 BamHI로 절단된 플라스미드 pET28a(＋)(Novagen) T4 DNA (Takara)에 리가아제를 사용하여 연결하였다 (도 2).

상기 재조합벡터를 E. coli XL-Blue에 도입하여 얻어진 카나마이신 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pNANEe를 분리하였다. 상기 pNANEe 플라스미드는 pET28a(＋)의 T7 프로모터 하류의 NcoI-BamHI 절단 부위에 박테로이드 프라질리스(Bacteroides fragilis)의 nanE 유전자의 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입된 것이다.

상기 재조합 유전자를 염화칼슘으로 처리하여 균체 내에 플라스미드를 도입하는 방법(J. Mol . Biol., 53:159, 1970)으로 고발현 균주 E. coli BL21(DE3)(Invitrogen)에 도입하고, 이를 E. coli/pNANe으로 명명하였다.

실시예 1-2. N-아세틸뉴라민산 알도라제를 코딩하는 nanA 유전자의 클로닝 및 형질전환

N-아세틸뉴라민산 알도라제(NeuNAc aldolase)를 코딩하는 nanA 유전자(서열번호 5)를 클로닝하기 위하여, 대장균 K-12(E. coli K-12 C600) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머를 사용하여 PCR 법에 의해 nanA 유전자를 증폭하였다.

서열번호 6: 5'-ggtatccatggcaacgaatttacg

서열번호 7: 5'-ggtaggctcgagcgaggggaaac

PCR 조건은 주형 DNA(10 pmol) 1㎕, 프라이머 각각 1㎕, Primix(Genotech) 4㎕, 증류수 14㎕를 Mastercycler gradient PCR(Ependorf)을 이용하여 변성(denaturation, 96℃에서 1분), 결합(annealing, 50.2℃에서 1분), 연장(elongation, 72℃에서 2분) 단계를 총 30회 실시하였다.

상기 증폭된 PCR 산물을 유전자 증폭 후, 반응액을 Plasmid mini-prep kit(Solgent)로 정제하고, 70% 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 침전 회수한 DNA를 아가로스겔 전기영동에 의해 확인하고, 0.9kb 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 상기 DNA를 제한효소 NcoI 및 XhoI로 절단하고, 상기와 동일한 제한효소 NcoI 및 XhoI로 절단된 플라스미드 pET32a(＋)(Novagen) T4 DNA(Takara)에 리가아제를 사용하여 연결하였다 (도 3). 상기 반응 유전체를 E. coli XL-Blue에 도입하여 얻어진 엠피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pNANa를 단리하였다. 상기 pNANa는 pET32a(＋)의 T7 프로모터 하류의 NcoI-XhoI 절단부위에 E. coli K-12 C600의 nanA 유전자의 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입된 것이다.

*상기 재조합 유전자를 염화칼슘 처리하여 균체 내에 플라스미드를 도입하는 방법(J. Mol . Biol., 53:159, 1970)으로 고발현 균주 E. coli BL21(DE3)pLysS(Invitrogen)에 도입하고, 이를 E. coli/pNANa으로 명명하였다.

실시예 1-3. 시티딘 5' 모노포스페이트 키나아제를 코딩하는 cmk 유전자의 클로닝 및 형질전환

시티딘 5' 모노포스페이트 키나아제(cytidine 5'monophosphate kinase)를 코딩하는 cmk 유전자(서열번호 8)를 클로닝하기 위하여, 대장균 K-12(E. coli K-12) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머를 사용하여 PCR 법에 의해 cmk 유전자를 증폭하였다.

서열번호 9: 5'-cat atg acggca att gcc ccg gtt att ac

서열번호 10: 5'-gaa ttc ggt cgc tta tgc gag agc c

PCR 조건은 주형 DNA (10 pmol) 1㎕, 프라이머 각각 1㎕, Primix(Genotech) 4㎕l, 증류수 14㎕를 Mastercycler gradient PCR(Ependorf)을 이용하여 변성(denaturation, 96℃에서 1분), 결합(annealing, 55.7℃에서 1분), 연장(elongation, 72℃에서 2분) 단계를 총 30회 실시하였다.

상기 증폭된 PCR 산물을 반응액을 Plasmid mini-prep kit(Solgent)로 정제하고, 70% 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 상기 침전 회수한 DNA를 아가로스겔 전기영동에 의해 확인하고, 0.7kb 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 상기 정제된 DNA를 제한효소 NdeI 및 EcoRI로 절단하고, 상기와 동일한 제한효소 NdeI 및 EcoRI로 절단한 플라스미드 pET22b(＋)(Novagen) T4 DNA(Takara)에 리가아제를 사용하여 연결하였다 (도 4). 상기 반응 유전체를 E. coli XL-Blue에 도입하여 얻어진 엠피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pCMK를 단리하였다. 상기 pCMK는 pET22b(＋)의 T7 프로모터 하류의 NdeI 및 EcoRI 절단부위에 E. coli K-12 C600의 cmk 유전자의 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입된 것이다.

상기 재조합 유전자를 염화칼슘 처리하여 균체 내에 플라스미드를 도입하는 방법(J. Mol . Biol., 53:159, 1970)으로 고발현 균주 E. coli BL21(DE3)pLysS (Invitrogen)에 도입하고, 이를 E. coli/pCMK로 명명하였다.

실시예 1-4. 아세테이트 키나아제를 코딩하는 ack 유전자의 클로닝 및 형질전환

아세테이트 키나아제(acetate kinase)를 코딩하는 ack 유전자(서열번호 11)를 클로닝하기 위하여, 대장균 K-12(E. coli K-12) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머를 사용하여, PCR 법에 의해 ack 유전자를 증폭하였다.

서열번호 12: 5'-catatgtcgagtaagttagtttctg

서열번호 13: 5'-gaatcctcaggcagtcaggcggctcgcgtc

PCR 조건은 주형 DNA(10pmol) 1㎕, 프라이머 각각 1㎕, Primix(Genotech) 4㎕, 증류수 14㎕를 Mastercycler gradient PCR(Ependorf)을 이용하여 변성(denaturation, 96℃에서 1분), 결합(annealing, 58.7℃에서 1분), 연장(elongation, 72℃에서 2분) 단계를 총 30회 실시하였다.

상기 증폭된 PCR 산물을 반응액을 Plasmid mini-prep kit(Solgent)로 정제하고, 70% 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 상기 침전 회수한 DNA를 아가로스겔 전기영동에 의해 확인하고, 1.2kb 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 상기 정제된 DNA를 제한효소 NdeI 및 EcoRI로 절단하고, 상기와 동일한 제한효소 NdeI 및 EcoRI로 절단한 플라스미드 pET24ma(＋)(Novagen) T4 DNA(Takara)에 리가아제를 사용하여 연결하였다 (도 5). 상기 반응 유전체를 E. coli XL-Blue에 도입하여 얻어진 카나마이신 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pACKa를 단리하였다.

상기 pACKa는 pET24ma(＋)의 T7 프로모터 하류의 NdeI 및 EcoRI 절단부위에 E. coli K-12 C600의 ackA 유전자의 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입된 것이다.

상기 재조합 유전자를 염화칼슘 처리하여 균체 내에 플라스미드를 도입하는 방법(J. Mol . Biol., 53:159, 1970)으로 고발현 균주 E. coli BL21(DE3)pLysS (Invitrogen)에 도입하고, 이를 E. coli/pACKa로 명명하였다.

실시예 1-5. CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소를 코딩하는 neu 유전자의 클로닝 및 형질전환

CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소(CMP-NeuNAc synthetase)를 코딩하는 neu 유전자(서열번호 14)를 클로닝하기 위하여, 네이세리아 메니기티디스(Neisseria meningitidis, Koram Biotech) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 DNA를 사용하여 PCR 법에 의해 neu 유전자를 증폭하였다.

서열번호 15: 5'-aagcatatggaaaaacaaaatattgcg

서열번호 16: 5'-gtggaattcttagctttccttgtg

PCR 조건은 주형 DNA(10pmol) 1㎕, 프라이머 각각 1㎕, Primix(Genotech) 4㎕, 증류수 14㎕를 Mastercycler gradient PCR(Ependorf)을 이용하여 변성(denaturation, 96℃에서 1분), 결합(annealing, 57.7℃에서 1분), 연장(elongation, 72℃에서 2분) 단계를 총 30회 실시하였다.

상기 증폭된 PCR 산물을 반응액을 Plasmid mini-prep kit(Solgent)로 정제하고, 70% 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 상기 침전 회수한 DNA를 아가로스겔 전기영동에 의해 확인하고, 0.7kb 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 상기 정제된 DNA를 제한효소 NdeI 및 EcoRI로 절단하고, 상기와 동일한 제한효소 NdeI 및 EcoRI로 절단한 플라스미드 pET32a(＋)(Novagen) T4 DNA(Takara)에 리가아제를 사용하여 연결하였다 (도 6). 상기 반응 유전체를 E. coli XL-Blue 에 도입하여 얻어진 엠피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pSYNb를 단리하였다. 상기 pSYNb는 pET24ma(＋)의 T7 프로모터 하류의 NdeI 및 EcoRI 절단부위에 네이세리아 메니기티디스(Neisseria meningitidis)의 synB 유전자의 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입된 것이다.

상기 재조합 유전자를 염화칼슘 처리하여 균체 내에 플라스미드를 도입하는 방법(J. Mol . Biol., 53:159, 1970)으로 고발현 균주 E. coli BL21(DE3) (Invitrogen)에 도입하고, 이를 E. coli/pSYNb로 명명하였다.

실시예 2. 효소 발현 확인

상기 형질전환체 E. coli/pNANe, E. coli/pNANa, E. coli/pCMK, E. coli/pACKa 및 E. coli/pSYNb를 LB 배지에서 배양한 종균 500㎖를 본배양 LB 배지 5ℓ에 접종하고, 세포 밀도(OD₆₀₀)가 약 3~5일 때 세포를 수확하였다. 각 효소의 형질전환체의 배양 조건을 표 1에 나타내었다. 상기 수득된 세포를 초음파 파쇄기 또는 프렌치프레스로 파쇄한 후, SDS-PAGE 젤을 통해 각각의 효소 발현 정도를 확인하였다 (도 7).

그 결과, 각각의 형질전환체에서 삽입된 유전자에 의해 코딩되는 효소가 과발현되는 것을 확인할 수 있었다.

각 효소 생산 균주의 배양 조건

효소의 종류	종균 배양 조건	본 배양 조건	IPTG첨가 농도(5L 배양)	발현 유도 조건
시티딘 5'모노포스페이트 키나아제(CMK)	37℃(암피실린)	37℃, pH 7.0	1M IPTG 5㎖	37℃, 12시간(OD₆₀₀=3~5)
세테이트 키나아제(ACK)	37℃(카나마이신)	37℃, pH 7.0	1M IPTG 5㎖	37℃, 12시간(OD₆₀₀=3~5)
CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소(NEU)	37℃(암피실린)	37℃, pH 7.0	1M IPTG 2㎖	20℃, 12시간(OD₆₀₀=3~5)
N-아세틸뉴라민산 알도라아제(NAN)	37℃(암피실린)	37℃, pH 7.0	1M IPTG 5㎖	37℃, 12시간(OD₆₀₀=3~5)
N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제	37℃(카나마이신)	37℃, pH 7.0	1M IPTG 5㎖	37℃, 12시간(OD₆₀₀=3~5)

실시예 3. 효소의 정제

상기 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcAc 2-epimerase), N-아세틸뉴라민산 알도라제(NeuAc aldolase), 시티딘 5' 모노포스페이트 키나이제(cytidine 5' monophosphate kinase), 아세테이트 키나제(acetate kinase) 및 CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소(CMP-NeuAc synthetase)를 황산암모늄(ammonium sulfate)을 이용한 침전 및 이온교환 수지 컬럼으로 정제하였다 (Protein purification techniqes 제2판, Oxford University Press, 2001).

각 효소 침전에 사용되는 황산암모늄의 농도는 30~80%의 범위에서 적절히 사용할 수 있다. 상기 각각의 효소를 황산암모늄이 포함된 상태로 10℃ 이하, 바람직하게는 3~5℃ 냉장고에서 1~5시간 동안 교반하며 침전하였다.

상기 효소 침전물을 최소량의 완충용액 50mM Tris HCl(pH7.5)에 녹인 후, 투석용 막을 이용하여 탈염하였다. 정제 및 농축된 효소액은 강이온 교환수지 UNO sphere Q(Bio-RAD)가 충진된 컬럼에 용출액 A(20mM Tris HCl(pH7.5)), 용출액 B(20mM Tris HCl/1M NaCl(pH7.5))를 사용한 A액-B액의 그래디언트에 의해 정제하였다. 상기에서 정제된 효소를 SDS-PAGE 젤로 확인하였다 (도 8).

실시예 4. 효소의 고정화

고분자 비드 1kg(약 1ℓ)에 2.5% 글루타알데하이드(glutaraldehyde) 3ℓ를 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 교반하여 고분자 비드를 활성화시켰다. 상기 활성화된 비드를 여과한 후 세척하고, 상기 실시예 3에서 정제된 각각의 효소를 고분자 비드 1g당 3㎎ 혼합한 다음, 상온에서 6시간 동안 교반하여 효소를 고정화하였다. 효소의 고정화 정도 및 정량은 브래드포드 방법(Bradford method , Anal . Biochem., 72:248, 1976)을 사용하여 확인하였다.

실시예 5. CMP -N- 아세틸뉴라민산(CMP-Neuraminic acid)의 합성

반응 혼합액(20~80mM 시티딘 5' 모노포스페이트(CMP, Shanghai QZU Bioscience & Biotechnology) 20~100g, 20~80mM N-아세틸-D-글루코사민(Shanghai Jiubang Chemical) 34.15~136.6g, 40~120mM 피루브산 33.9~101.7g, 20mM MgCl₂·H₂O(Duksan) 30.9g, 1mM CTP(sigma) 3.72g, 80~500mM 아세틸 포스페이트(sigma) 84~525g, 50mM Tris ＨCl 버퍼(pH 7.0) 7ℓ, 37℃ 2M NaOH를 사용하여 pH 6.5~8.0 유지)을 상기 실시예 4에서 제조한 시티딘 모노포스페이트 키나아제(cytidine monophosphate kinase, CMK), 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK), N-아세틸뉴라민 알도라제(NeuAc aldolase, NAN), CMP-N-아세틸뉴라민 합성 효소(CMP-NeuAc synthetase, NEU) 및 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase)가 각각 고정된 고분자 비드와 혼합한 후, 반응기에서 교반하여 5~12시간 동안 반응시켰다.

상기 반응 상등액을 분리, 검출하기 위하여 Thermo 42 칼럼(Thermo electron corporation)을 사용하였고, 용출액은 A액(100mM KH₂PO₄/K₂HPO₄)과 B액(메탄올)을 사용하여, A액(90%):B액(10%)에 의해 HPLC를 실시하였다. 그 결과, 약 90%의 수율로 CMP-N-아세틸뉴라민산이 합성되었다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. CMP -N- 아세틸뉴라민산(CMP-Neuraminic acid)의 정제

상기 실시예 5에서 합성한 CMP-N-아세틸뉴라민산 반응액을 음이온 교환수지 다우엑스 염소형(Dowex-1×2, Cl^--form) 컬럼의 상부에 주입하고, 염의 농도 구배를 이용하여 분리하였다. 상기 목적물이 포함된 용출액을 다시 재농축하여 세파덱스 지-10(Sephadex G-10) 젤 투과법을 이용하여 염을 제거하여, 고순도의 최종 생성물을 얻었고, 이를 동결건조하여 농축하였다. 각 정제 단계를 거쳐 최종적으로 81%의 CMP-N-아세틸뉴라민산을 수득하였고, NMR 및 HPLC를 사용하여 최종 수득물을 확인하였다 (도 9 및 도 10).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Genechem <120> NOVEL N-ACETYLGLUCOSAMINE-2-EPIMERASE AND METHOD FOR PRODUCING CMP-NEURAMINIC ACID USING THE SAME <150> KR10-2006-0128422 <151> 2006-12-15 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1185 <212> DNA <213> Bacteroides fragilis <400> 1 atgaatacta cagaatattt acagacttgg tctgactctt ataaaaatga catgataagc 60 aacatcatgc ccttttggat gaaatatggt tgggatcgca agaacggagg tgtttatacc 120 tgcgtcgacc gtgatggtca gttgatggat accaccaaat ctgtttggtt ccaagggaga 180 tttgctttta catgttcata tgcatataat cacattgagc gtaatactga atggttggca 240 gctgcgaaaa gcactctcga tttcatagaa gcacattgtt ttgatacgga tggacgtatg 300 ttttttgaag taaccgagac cggattacct attcgtaaac gtcgttatgt cttttctgaa 360 acatttgctg ctattgcaat gtccgaatat gccattgcat caggagatca tagttatgct 420 gtaaaagctt tgaaattgtt caatgatatc cgtcacttcc tttcgactcc gggaatcctg 480 gagcccaaat attgtgaacg tgtacagatg aagggacatt ctattattat gattcttatc 540 aatgtagctt cccgcattcg cgccgctatt aacgatccgg ttttggatcg gcaaatagag 600 gagtctatag caattctgca caaagacttt atgcatccgg agtttaaagc tctgcttgag 660 actgtaggtc ccaatggaga gtttatagat acgaacgcca ctcgtaccat taatcccggt 720 cattgtatcg agacctcatg gtttattttg gaagaagcca agaaccgcaa ttgggataag 780 gaaatggttg atacagcact tacgattctg gattggtcgt gggagtgggg ctgggacaaa 840 gaatacgggg gtattataaa tttccgtgat tgtcgaaacc tgccttcaca ggattatgcc 900 catgacatga agttctggtg gccacagacc gaagcgatta tcgcaactct atatgcgtat 960 caagctacta aaaatgaaaa atatctggct atgcataaac agatcagtga ctggacttat 1020 gcccattttc ctgatgcaga gtttggtgaa tggtatgggt atctccatcg tgacggaacg 1080 atttctcagc ctgcgaaagg aaatctgttt aagggaccat tccacattcc tagaatgatg 1140 acgaaaggct acgcactttg tcaggaatta ctgtcagaaa aataa 1185 <210> 2 <211> 394 <212> PRT <213> Bacteroides fragilis <400> 2 Met Asn Thr Thr Glu Tyr Leu Gln Thr Trp Ser Asp Ser Tyr Lys Asn 1 5 10 15 Asp Met Ile Ser Asn Ile Met Pro Phe Trp Met Lys Tyr Gly Trp Asp 20 25 30 Arg Lys Asn Gly Gly Val Tyr Thr Cys Val Asp Arg Asp Gly Gln Leu 35 40 45 Met Asp Thr Thr Lys Ser Val Trp Phe Gln Gly Arg Phe Ala Phe Thr 50 55 60 Cys Ser Tyr Ala Tyr Asn His Ile Glu Arg Asn Thr Glu Trp Leu Ala 65 70 75 80 Ala Ala Lys Ser Thr Leu Asp Phe Ile Glu Ala His Cys Phe Asp Thr 85 90 95 Asp Gly Arg Met Phe Phe Glu Val Thr Glu Thr Gly Leu Pro Ile Arg 100 105 110 Lys Arg Arg Tyr Val Phe Ser Glu Thr Phe Ala Ala Ile Ala Met Ser 115 120 125 Glu Tyr Ala Ile Ala Ser Gly Asp His Ser Tyr Ala Val Lys Ala Leu 130 135 140 Lys Leu Phe Asn Asp Ile Arg His Phe Leu Ser Thr Pro Gly Ile Leu 145 150 155 160 Glu Pro Lys Tyr Cys Glu Arg Val Gln Met Lys Gly His Ser Ile Ile 165 170 175 Met Ile Leu Ile Asn Val Ala Ser Arg Ile Arg Ala Ala Ile Asn Asp 180 185 190 Pro Val Leu Asp Arg Gln Ile Glu Glu Ser Ile Ala Ile Leu His Lys 195 200 205 Asp Phe Met His Pro Glu Phe Lys Ala Leu Leu Glu Thr Val Gly Pro 210 215 220 Asn Gly Glu Phe Ile Asp Thr Asn Ala Thr Arg Thr Ile Asn Pro Gly 225 230 235 240 His Cys Ile Glu Thr Ser Trp Phe Ile Leu Glu Glu Ala Lys Asn Arg 245 250 255 Asn Trp Asp Lys Glu Met Val Asp Thr Ala Leu Thr Ile Leu Asp Trp 260 265 270 Ser Trp Glu Trp Gly Trp Asp Lys Glu Tyr Gly Gly Ile Ile Asn Phe 275 280 285 Arg Asp Cys Arg Asn Leu Pro Ser Gln Asp Tyr Ala His Asp Met Lys 290 295 300 Phe Trp Trp Pro Gln Thr Glu Ala Ile Ile Ala Thr Leu Tyr Ala Tyr 305 310 315 320 Gln Ala Thr Lys Asn Glu Lys Tyr Leu Ala Met His Lys Gln Ile Ser 325 330 335 Asp Trp Thr Tyr Ala His Phe Pro Asp Ala Glu Phe Gly Glu Trp Tyr 340 345 350 Gly Tyr Leu His Arg Asp Gly Thr Ile Ser Gln Pro Ala Lys Gly Asn 355 360 365 Leu Phe Lys Gly Pro Phe His Ile Pro Arg Met Met Thr Lys Gly Tyr 370 375 380 Ala Leu Cys Gln Glu Leu Leu Ser Glu Lys 385 390 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctgccatggt tatgaatact acag 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aatggatcct tatttttctg acag 24 <210> 5 <211> 893 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 5 atggcaacga atttacgtgg cgtaatggct gcactcctga ctccttttga ccaacaacaa 60 gcactggata aagcgagtct gcgtcgcctg gttcagttca atattcagca gggcatcgac 120 ggtttatacg tgggtggttc gaccggcgag gcctttgtac aaagcctttc cgagcgtgaa 180 caggtactgg aaatcgtcgc cgaagagggc aaaggtaaga ttaaactcat cgcccacgtc 240 ggttgcgtca cgaccgccga aagccaacaa cttgcggcat cggctaaacg ttatggcttc 300 gatgccgtct ccgccgtcac gccgttctac tatcctttca gctttgaaga acactgcgat 360 cactatcggg caattattga ttcggcggat ggtttgccga tggtggtgta caacattcca 420 gccctgagtg gggtaaaact gaccctggat cagatcaaca cacttgttac attgcctggc 480 gtaggtgcgc tgaaacagac ctctggcgat ctctatcaga tggagcagat ccgtcgtgaa 540 catcctgatc ttgtgctcta taacggttac ggagaaatct tcgcctctgg tctgctggcg 600 ggcgctgatg gtggtatcgg cagtacctac aacatcatgg gctggcgcta tcaggggatc 660 gttaaggcgc tgaaagaagg cgatatccag accgcgcaga aactgcaaac tgaatgcaat 720 aaagtcattg atttactgat caaaacgggc gtattccgcg gcctgaaaac tgtcctccat 780 tatatggatg tcgtttctgt gccgctgtgc cgcaaaccgt ttggaccggt agatgaaaaa 840 tatcagccag aactgaaggc gctggcccag cagttgatgc mgagcgcggg tga 893 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggtatccatg gcaacgaatt tacg 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggtaggctcg agcgagggga aac 23 <210> 8 <211> 663 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 8 atgaagacat acaagattgc cgttgatggg cctgctgcga gcggaaaaag cagcacatcc 60 gacttggttg caaggaaact ggggttttcc catctgatat ctggaaatct gtatagagct 120 gtgacatatg gtctggtaag gcgctttgga gaggtgcgtc caggagacga ggaacagaaa 180 agatttgttc ttgagctgag tatagaggta aggaacaaca gggtattcct agacggagag 240 gacgtgtcgg agagcctccg taaggaggtg gtcgaccgcc acgttgtttc tgttgcaagg 300 gagaaatata tccgggaaaa agtgtttaca attcagaggt cggtgataga ccttgagaag 360 aggggaatag ttgtggatgg aagagatata gccaccagga taatgccaaa tgcagatctg 420 aaggtgtttc ttacagcaag cccggagacg agggccagaa gaagatacat ggaaggcggg 480 tctgagtcct acgaggaact gctcgagtcc ataaaaaaaa gagatcacaa cgatagaaca 540 agggagcatg atccccttgt tgccacctgc gattctattg ttatcgaaaa tgacagcatg 600 acattggagg aaacagccga cgaaatcata aggctcttca gaagagtaga gtcttttaat 660 taa 663 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 catatgacgg caattgcccc ggttattac 29 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gaattcggtc gcttatgcga gagcc 25 <210> 11 <211> 1203 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 11 atgtcgagta agttagtact ggttctgaac tgcggtagtt cttcactgaa atttgccatc 60 atcgatgcag taaatggtga agagtacctt tctggtttag ccgaatgttt ccacctgccc 120 gaagcacgta tcaaatggaa aatggacggc aataaacagg aagcggcttt aggtgcaggc 180 gccgctcaca gcgaagcgct caactttatc gttaatacta ttctggcaca aaaaccagaa 240 ctgtctgcgc agctgactgc tatcggtcac cgtatcgtac acggcggcga aaagtatacc 300 agctccgtag tgatcgatga gtctgttatt cagggtatca aagatgcagc ttcttttgca 360 ccgctgcaca acccggctca cctgatcggt atcgaagaag ctctgaaatc tttcccacag 420 ctgaaagaca aaaacgttgc tgtatttgac accgcgttcc accagactat gccggaagag 480 tcttacctct acgccctgcc ttacaacctg tacaaagagc acggcatccg tcgttacggc 540 gcgcacggca ccagccactt ctatgtaacc caggaagcgg caaaaatgct gaacaaaccg 600 gtagaagaac tgaacatcat cacctgccac ctgggcaacg gtggttccgt ttctgctatc 660 cgcaacggta aatgcgttga cacctctatg ggcctgaccc cgctggaagg tctggtcatg 720 ggtacccgtt ctggtgatat cgatccggcg atcatcttcc acctgcacga caccctgggc 780 atgagcgttg acgcaatcaa caaactgctg accaaagagt ctggcctgct gggtctgacc 840 gaagtgacca gcgactgccg ctatgttgaa gacaactacg cgacgaaaga agacgcgaag 900 cgcgcaatgg acgtttactg ccaccgcctg gcgaaataca tcggtgccta cactgcgctg 960 atggatggtc gtctggacgc tgttgtattc actggtggta tcggtgaaaa tgccgcaatg 1020 gttcgtgaac tgtctctggg caaactgggc gtgctgggct ttgaagttga tcatgaacgc 1080 aacctggctg cacgtttcgg caaatctggt ttcatcaaca aagaaggtac ccgtcctgcg 1140 gtggttatcc caaccaacga agaactggtt atcgcgcaag acgcgagccg cctgactgcc 1200 tga 1203 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 catatgtcga gtaagttagt ttctg 25 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gaatcctcag gcagtcaggc ggctcgcgtc 30 <210> 14 <211> 687 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 14 atggaaaaac aaaatattgc ggttatactt gcgcgccaaa actccaaagg attgccatta 60 aaaaatctcc ggaaaatgaa tggcatatca ttacttggtc atacaattaa tgctgctata 120 tcatcaaagt gttttgaccg cataattgtt tcgactgatg gcgggttaat tgcagaagaa 180 gctaaaaatt tcggtgtcga agtcgtccta cgccctgcag agctggcctc cgatacagcc 240 agctctattt caggtgtaat acatgcttta gaaacaattg gcagtaattc cggcacagta 300 accctattac aaccaaccag tccattacgc acaggggctc atattcgtga agctttttct 360 ctatttgatg agaaaataaa aggatccgtt gtctctgcat gcccaatgga gcatcatcca 420 ctaaaaaccc tgcttcaaat caataatggc gaatatgccc ccatgcgcca tctaagcgat 480 ttggagcagc ctcgccaaca attacctcaa gcatttaggc ctaatggtgc aatttacatt 540 aatgatactg cttcactaat tgcaaataat tgttttttta tcgccccaac caaactttat 600 attatgtctc atcaagactc tatcgatatt gatactgagc ttgatttaca acaggcagaa 660 aacattctta atcacaagga aagctaa 687 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 aagcatatgg aaaaacaaaa tattgcg 27 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gtggaattct tagctttcct tgtg 24

Claims

(ⅰ) 시티딘 5' 모노포스페이트(cytidine 5' monophosphate, CMP), (ⅱ) 뉴클레오티드 트리-포스페이트(nucleotide tri-phosphate, NTP) 또는 ATP, (ⅲ) 아세틸 포스페이트(acetyl Pi), (ⅳ) N-아세틸-D-글루코사민 및 (ⅴ) 피루브산을 포함하는 반응 혼합물을 담체에 고정된 하기(a)~(e) 효소의 존재하에 반응시키는 것을 특징으로 하는 CMP-N-아세틸뉴라민산(CMP-neuraminic acid)의 제조방법:

(a) N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc 2-epimerase), (b) N-아세틸뉴라민산 알도라제(NeuNAc aldolase), (c) 시티딘 5' 모노포스페이트 키나아제(cytidine 5' monophosphate kinase, CMP kinase), (d) 아세테이트 키나아제(acetate kinase) 및 (e) CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소(CMP-NeuNAc synthetase).
제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 트리-포스페이트(NTP) 또는 ATP는 아세틸 포스페이트(acetyl Pi) 및 아세테이트 키나아제(acetate kinase)에 의해 재생되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 트리-포스페이트(NTP)는 시티딘 트리-포스페이트(cytidine tri-phosphate, CTP)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것임을 특징으로 하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제, N-아세틸뉴라민산 알도라제, 시티딘 5' 모노포스페이트 키나아제, 아세테이트 키나아제 및 CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소는 각각 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 11 및 서열번호 14의 염기서열에 의해 코딩되는 것임을 특징으로 하는 방법.