JP3131655B2 - Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法 - Google Patents
Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法Info
- Publication number
- JP3131655B2 JP3131655B2 JP04017206A JP1720692A JP3131655B2 JP 3131655 B2 JP3131655 B2 JP 3131655B2 JP 04017206 A JP04017206 A JP 04017206A JP 1720692 A JP1720692 A JP 1720692A JP 3131655 B2 JP3131655 B2 JP 3131655B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acetylneuraminic acid
- acetylglucosamine
- lyase
- reaction
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸の製造法に関する。
ン酸の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｎ−アセチルノイラミン酸は、シアル酸
類で最も普遍的な物質であり、生体の組織、体液、分泌
液等に広く分布し、赤血球凝集、細胞間認識、血清蛋白
質の代謝回転等に関与することが知られている重要な物
質である。
類で最も普遍的な物質であり、生体の組織、体液、分泌
液等に広く分布し、赤血球凝集、細胞間認識、血清蛋白
質の代謝回転等に関与することが知られている重要な物
質である。
【０００３】この様な、重要物質であるＮ−アセチルノ
イラミン酸は、従来、大腸菌の夾膜多糖の加水分解によ
り製造されている他、ウミツバメの巣、鶏卵及び牛乳な
どの天然物の加水分解によっても製造されている。
イラミン酸は、従来、大腸菌の夾膜多糖の加水分解によ
り製造されている他、ウミツバメの巣、鶏卵及び牛乳な
どの天然物の加水分解によっても製造されている。
【０００４】上記のような天然物を製造原料とする方法
は、製造原料の絶対量が限られているため、年々需要の
増加しているＮ−アセチルノイラミン酸を大量に供給す
ることが困難であること、天然物の加水分解後の他の夾
雑物からのＮ−アセチルノイラミン酸の分離精製が容易
でないこと及び製造コストが高くつくこと等の問題点を
有しており、Ｎ−アセチルノイラミン酸の安価な大量生
産技術は未開発の状況にある。
は、製造原料の絶対量が限られているため、年々需要の
増加しているＮ−アセチルノイラミン酸を大量に供給す
ることが困難であること、天然物の加水分解後の他の夾
雑物からのＮ−アセチルノイラミン酸の分離精製が容易
でないこと及び製造コストが高くつくこと等の問題点を
有しており、Ｎ−アセチルノイラミン酸の安価な大量生
産技術は未開発の状況にある。
【０００５】上記の問題を解決するため、酵素を用いる
合成法が種々検討されている。
合成法が種々検討されている。
【０００６】例えば、キム（Ｋｉｍ）ら［ジャーナル・
オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），１１０，６４８１〜６４８
６（１９８８）］は、Ｎ−アセチルマンノサミンとピル
ビン酸とをＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼの存在下
に反応させることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸を
製造する方法を報告している。しかし、この方法は、高
価で大量の入手が困難なＮ−アセチルマンノサミンを原
料として使用している点で実用性に欠ける。
オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），１１０，６４８１〜６４８
６（１９８８）］は、Ｎ−アセチルマンノサミンとピル
ビン酸とをＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼの存在下
に反応させることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸を
製造する方法を報告している。しかし、この方法は、高
価で大量の入手が困難なＮ−アセチルマンノサミンを原
料として使用している点で実用性に欠ける。
【０００７】Ｎ−アセチルマンノサミンは、Ｎ−アセチ
ルグルコサミンをｐＨ１２程度の強アルカリ性条件下で
異性化させて製造することもできるが［サイモン（Ｓｉ
ｍｏｎ）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル
・ソサエティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），１
１０，７１５９〜７１６３（１９８８）参照］、この方
法では平衡時のＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチ
ルマンノサミンの比率が、Ｎ−アセチルグルコサミン：
Ｎ−アセチルマンノサミン＝３：１であり、Ｎ−アセチ
ルマンノサミンの割合が小さいためその単離操作が容易
でない。
ルグルコサミンをｐＨ１２程度の強アルカリ性条件下で
異性化させて製造することもできるが［サイモン（Ｓｉ
ｍｏｎ）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル
・ソサエティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），１
１０，７１５９〜７１６３（１９８８）参照］、この方
法では平衡時のＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチ
ルマンノサミンの比率が、Ｎ−アセチルグルコサミン：
Ｎ−アセチルマンノサミン＝３：１であり、Ｎ−アセチ
ルマンノサミンの割合が小さいためその単離操作が容易
でない。
【０００８】Ｎ−アセチルグルコサミンとピルビン酸と
をＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼ及びエピメラーゼ
の存在下に反応させてＮ−アセチルノイラミン酸を得る
方法も提案されている［例えば、キーグル（Ｋｉｅｇ
ｌ）ら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ
ｌ．，３０，８２７〜８２８（１９９１）参照］。この
方法では、Ｎ−アセチルグルコサミンがエピメラーゼの
作用により順次Ｎ−アセチルマンノサミンに変換され、
次いでこのＮ−アセチルマンノサミンがＮ−アセチルノ
イラミン酸リアーゼの作用を受けてＮ−アセチルノイラ
ミン酸に変換される。しかしながら、Ｎ−アセチルグル
コサミンを異性化するエピメラーゼの入手が困難であ
り、しかもＮ−アセチルグルコサミンのＮ−アセチルノ
イラミン酸への変換率が２５％と低く、この方法も実用
的であるとはいえない。
をＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼ及びエピメラーゼ
の存在下に反応させてＮ−アセチルノイラミン酸を得る
方法も提案されている［例えば、キーグル（Ｋｉｅｇ
ｌ）ら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ
ｌ．，３０，８２７〜８２８（１９９１）参照］。この
方法では、Ｎ−アセチルグルコサミンがエピメラーゼの
作用により順次Ｎ−アセチルマンノサミンに変換され、
次いでこのＮ−アセチルマンノサミンがＮ−アセチルノ
イラミン酸リアーゼの作用を受けてＮ−アセチルノイラ
ミン酸に変換される。しかしながら、Ｎ−アセチルグル
コサミンを異性化するエピメラーゼの入手が困難であ
り、しかもＮ−アセチルグルコサミンのＮ−アセチルノ
イラミン酸への変換率が２５％と低く、この方法も実用
的であるとはいえない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸の簡易かつ実用的な製造法を提供するこ
とを目的とする。
ルノイラミン酸の簡易かつ実用的な製造法を提供するこ
とを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
達成するために鋭意検討を重ねた結果、従来は酵素が失
活することを避けるため、およびＮ−アセチルノイラミ
ン酸リアーゼの至適ｐＨ（７．７）から離れるために使
用されていなかったアルカリ性、即ち、高いｐＨ領域で
Ｎ−アセチルグルコサミンとピルビン酸とをＮ−アセチ
ルノイラミン酸リアーゼの存在下に反応させると、基質
であるＮ−アセチルグルコサミン及びピルビン酸の保護
効果により酵素の失活が抑制され、Ｎ−アセチルグルコ
サミンが効果的にＮ−アセチルノイラミン酸に変換され
ることを見出した。
達成するために鋭意検討を重ねた結果、従来は酵素が失
活することを避けるため、およびＮ−アセチルノイラミ
ン酸リアーゼの至適ｐＨ（７．７）から離れるために使
用されていなかったアルカリ性、即ち、高いｐＨ領域で
Ｎ−アセチルグルコサミンとピルビン酸とをＮ−アセチ
ルノイラミン酸リアーゼの存在下に反応させると、基質
であるＮ−アセチルグルコサミン及びピルビン酸の保護
効果により酵素の失活が抑制され、Ｎ−アセチルグルコ
サミンが効果的にＮ−アセチルノイラミン酸に変換され
ることを見出した。
【００１１】即ち、本発明は、アルカリ性条件下、Ｎ−
アセチルグルコサミンおよびピルビン酸の存在下にＮ−
アセチルノイラミン酸リアーゼを作用させることを特徴
とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法を提供するも
のである。
アセチルグルコサミンおよびピルビン酸の存在下にＮ−
アセチルノイラミン酸リアーゼを作用させることを特徴
とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法を提供するも
のである。
【００１２】本発明の製造法において、アルカリ性条件
下とは、反応液のｐＨが通常８〜１２程度、好ましくは
９〜１２程度、より好ましくは１０〜１２程度、最も好
ましくは１０〜１１程度である。反応液のｐＨが低くな
り過ぎるとＮ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチル
マンノサミンへの変換がほとんど或いは全く起こらない
ため反応は進行せず、反応液のｐＨが高くなり過ぎると
Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼが失活するため反応
の収率が低下する。反応温度は、１０〜８０℃程度、好
ましくは２０〜５０℃程度であり、反応時間は３０分〜
２４０時間程度、好ましくは２０時間〜１２０時間程度
である。反応は、静置または攪拌状態で行う。
下とは、反応液のｐＨが通常８〜１２程度、好ましくは
９〜１２程度、より好ましくは１０〜１２程度、最も好
ましくは１０〜１１程度である。反応液のｐＨが低くな
り過ぎるとＮ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチル
マンノサミンへの変換がほとんど或いは全く起こらない
ため反応は進行せず、反応液のｐＨが高くなり過ぎると
Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼが失活するため反応
の収率が低下する。反応温度は、１０〜８０℃程度、好
ましくは２０〜５０℃程度であり、反応時間は３０分〜
２４０時間程度、好ましくは２０時間〜１２０時間程度
である。反応は、静置または攪拌状態で行う。
【００１３】反応液中の各成分の濃度としては、以下の
通りである。
通りである。
【００１４】（１）Ｎ−アセチルグルコサミンの使用量
は特に制限されず、飽和溶解度までのいずれの濃度でも
使用できるが、好ましくは１〜２０Ｗ／Ｖ％程度、より
好ましくは１０〜２０Ｗ／Ｖ％程度使用される。
は特に制限されず、飽和溶解度までのいずれの濃度でも
使用できるが、好ましくは１〜２０Ｗ／Ｖ％程度、より
好ましくは１０〜２０Ｗ／Ｖ％程度使用される。
【００１５】（２）ピルビン酸の使用量は特に制限され
ず、飽和溶解度までのいずれの濃度でも使用できるが、
好ましくは１〜２０Ｗ／Ｖ％程度、より好ましくは１０
〜２０Ｗ／Ｖ％程度使用される。
ず、飽和溶解度までのいずれの濃度でも使用できるが、
好ましくは１〜２０Ｗ／Ｖ％程度、より好ましくは１０
〜２０Ｗ／Ｖ％程度使用される。
【００１６】（３）Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ
の使用量は特に制限されず、基質の量に応じて広い範囲
から選択できるが、好ましくは反応液１ｍｌ当たり０．
０１Ｕ以上、より好ましくは０．１Ｕ〜１００Ｕ程度、
最も好ましくは１Ｕ〜５０Ｕ程度である。
の使用量は特に制限されず、基質の量に応じて広い範囲
から選択できるが、好ましくは反応液１ｍｌ当たり０．
０１Ｕ以上、より好ましくは０．１Ｕ〜１００Ｕ程度、
最も好ましくは１Ｕ〜５０Ｕ程度である。
【００１７】基質であるＮ−アセチルグルコサミンおよ
びピルビン酸の濃度が低すぎると生産されるＮ−アセチ
ルノイラミン酸の絶対量が少なくなり、基質であるＮ−
アセチルグルコサミンおよびピルビン酸の濃度が高すぎ
ると反応終了時のＮ−アセチルノイラミン酸の割合が低
下するため精製が困難となる。
びピルビン酸の濃度が低すぎると生産されるＮ−アセチ
ルノイラミン酸の絶対量が少なくなり、基質であるＮ−
アセチルグルコサミンおよびピルビン酸の濃度が高すぎ
ると反応終了時のＮ−アセチルノイラミン酸の割合が低
下するため精製が困難となる。
【００１８】Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼの使用
量が少なすぎると反応に長時間を要することになり、Ｎ
−アセチルノイラミン酸リアーゼの使用量が多すぎても
反応時間、収率は変わらず不経済である。
量が少なすぎると反応に長時間を要することになり、Ｎ
−アセチルノイラミン酸リアーゼの使用量が多すぎても
反応時間、収率は変わらず不経済である。
【００１９】反応液のｐＨをアルカリ性に調整する方法
としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化
リチウム等のアルカリ金属水酸化物、水酸化カルシウ
ム、水酸化マグネシウム等のアルカリ土類金属水酸化
物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウ
ム、炭酸水素カリウム等のアルカリ金属炭酸塩または炭
酸水素塩、アンモニアなどのアルカリ性の物質を目的と
するｐＨの調整に必要な量だけ添加するか、またはリン
酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ベロナ
ール塩酸緩衝液、グッド緩衝液、ジエタノールアミン塩
酸緩衝液などのアルカリ性の緩衝液の使用により行うこ
とができる。
としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化
リチウム等のアルカリ金属水酸化物、水酸化カルシウ
ム、水酸化マグネシウム等のアルカリ土類金属水酸化
物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウ
ム、炭酸水素カリウム等のアルカリ金属炭酸塩または炭
酸水素塩、アンモニアなどのアルカリ性の物質を目的と
するｐＨの調整に必要な量だけ添加するか、またはリン
酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ベロナ
ール塩酸緩衝液、グッド緩衝液、ジエタノールアミン塩
酸緩衝液などのアルカリ性の緩衝液の使用により行うこ
とができる。
【００２０】Ｎ−アセチルグルコサミンは、遊離塩基及
び塩酸、硫酸等の塩のいずれの形態でも使用することが
できる。
び塩酸、硫酸等の塩のいずれの形態でも使用することが
できる。
【００２１】ピルビン酸は、遊離の酸及びナトリウム、
カリウム等の塩のいずれの形態でも使用することができ
る。
カリウム等の塩のいずれの形態でも使用することができ
る。
【００２２】Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼは、動
物起源及び植物起源のいずれの由来の酵素も用いること
ができ、酵素の純度にも余り影響されない。
物起源及び植物起源のいずれの由来の酵素も用いること
ができ、酵素の純度にも余り影響されない。
【００２３】本発明の方法により生成するＮ−アセチル
ノイラミン酸は、公知の手段により容易に反応液から分
離精製できる。例えば、イオン交換カラムクロマトグラ
フィーにより精製後、濃縮し、有機溶媒中で結晶体を得
ることができる。
ノイラミン酸は、公知の手段により容易に反応液から分
離精製できる。例えば、イオン交換カラムクロマトグラ
フィーにより精製後、濃縮し、有機溶媒中で結晶体を得
ることができる。
【００２４】
【発明の効果】本発明の方法によれば、基質の酵素保護
作用により従来では酵素が失活するとされているアルカ
リ性条件下で反応を行うことができるため、以下のよう
な優れた効果が達成される。
作用により従来では酵素が失活するとされているアルカ
リ性条件下で反応を行うことができるため、以下のよう
な優れた効果が達成される。
【００２５】（１）安価で大量入手が可能なＮ−アセチ
ルグルコサミンを原料とし、高い基質濃度で反応が行え
るため、Ｎ−アセチルノイラミン酸の大量合成が可能と
なった。
ルグルコサミンを原料とし、高い基質濃度で反応が行え
るため、Ｎ−アセチルノイラミン酸の大量合成が可能と
なった。
【００２６】（２）１段階で反応が進行するので、製造
工程の簡略化が図れるようになった。 （３）Ｎ−アセチルグルコサミンがアルカリ性条件下で
Ｎ−アセチルマンノサミンに異性化するため、エピメラ
ーゼを使用する必要がない。
工程の簡略化が図れるようになった。 （３）Ｎ−アセチルグルコサミンがアルカリ性条件下で
Ｎ−アセチルマンノサミンに異性化するため、エピメラ
ーゼを使用する必要がない。
【００２７】（４）反応液のｐＨ、酵素量、基質濃度等
の条件を適切に選択すると、対Ｎ−アセチルグルコサミ
ン５０％以上（モル比率）という高収率でＮ−アセチル
ノイラミン酸を製造することができる。
の条件を適切に選択すると、対Ｎ−アセチルグルコサミ
ン５０％以上（モル比率）という高収率でＮ−アセチル
ノイラミン酸を製造することができる。
【００２８】
【実施例】以下、実施例および比較例を用いて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定さ
れるものではない。
より詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定さ
れるものではない。
【００２９】
【実施例１】＊Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造 水にＮ−アセチルグルコサミン１８ｇおよびピルビン酸
１８ｇを溶解し、この溶液を１Ｎ−水酸化ナトリウム水
溶液を用いてｐＨ１０．５に調整後、これにＮ−アセチ
ルノイラミン酸リアーゼ２０００Ｕを加えて全量を１０
０ｍｌとし、３０℃で４８時間反応させた。ＨＰＬＣに
よる定量によれば、反応液中のＮ−アセチルノイラミン
酸量は１３ｇであり、使用したＮ−アセチルグルコサミ
ンに対する変換率は約５１％であった。
１８ｇを溶解し、この溶液を１Ｎ−水酸化ナトリウム水
溶液を用いてｐＨ１０．５に調整後、これにＮ−アセチ
ルノイラミン酸リアーゼ２０００Ｕを加えて全量を１０
０ｍｌとし、３０℃で４８時間反応させた。ＨＰＬＣに
よる定量によれば、反応液中のＮ−アセチルノイラミン
酸量は１３ｇであり、使用したＮ−アセチルグルコサミ
ンに対する変換率は約５１％であった。
【００３０】Ｄｏｗｅｘ １（登録商標、ダウケミカル
株式会社製）によるイオン交換クロマトグラフィーによ
り反応生成物を単離し、濃縮後、常法に従いＮ−アセチ
ルノイラミン酸の針状結晶を１０ｇ得た。
株式会社製）によるイオン交換クロマトグラフィーによ
り反応生成物を単離し、濃縮後、常法に従いＮ−アセチ
ルノイラミン酸の針状結晶を１０ｇ得た。
【００３１】
【実施例２】１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１０．０）
にＮ−アセチルグルコサミン１００ｇおよびピルビン酸
２００ｇを溶解し、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ
１５０００Ｕを加えて全量を１リットルとし、３５℃で
１２０時間反応させた。反応液中のＮ−アセチルノイラ
ミン酸の量は５６ｇであり、使用したＮ−アセチルグル
コサミンに対する変換率は約４０％であった。
にＮ−アセチルグルコサミン１００ｇおよびピルビン酸
２００ｇを溶解し、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ
１５０００Ｕを加えて全量を１リットルとし、３５℃で
１２０時間反応させた。反応液中のＮ−アセチルノイラ
ミン酸の量は５６ｇであり、使用したＮ−アセチルグル
コサミンに対する変換率は約４０％であった。
【００３２】Ｄｏｗｅｘ １（登録商標、ダウケミカル
株式会社製）によるイオン交換クロマトグラフィーによ
り反応生成物を単離し、濃縮後、常法に従いＮ−アセチ
ルノイラミン酸の針状結晶を約４２ｇ得た。
株式会社製）によるイオン交換クロマトグラフィーによ
り反応生成物を単離し、濃縮後、常法に従いＮ−アセチ
ルノイラミン酸の針状結晶を約４２ｇ得た。
【００３３】
【実施例３〜２３及び比較例１】Ｎ−アセチルグルコサ
ミンおよびピルビン酸の濃度、Ｎ−アセチルノイラミン
酸リアーゼの濃度、反応時間並びにリン酸緩衝液のｐＨ
を各々変更した以外は実施例２と同様な条件下で反応を
行った。
ミンおよびピルビン酸の濃度、Ｎ−アセチルノイラミン
酸リアーゼの濃度、反応時間並びにリン酸緩衝液のｐＨ
を各々変更した以外は実施例２と同様な条件下で反応を
行った。
【００３４】結果を、以下の第１表および第２表に示
す。
す。
【００３５】 第 １ 表 ＊Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ濃度：１０Ｕ／ｍｌ実施例 ｐＨ 基質濃度 ＮＡＮＡの濃度 （ｇ／１００ｍｌ） （ｍｇ／ｍｌ） ＧｌｃＮＡｃ Ｐｙｒ−Ｎａ １日反応後 ５日反応後 ３ ８．０ １８ １８ ０ １ ４ ９．０ １８ １８ １ ３ ５ ９．５ １８ １８ ２ ７ ６ １０．０ １８ １８ １９ ５０ ７ １０．５ １８ １８ ５５ １３０ ８ １１．０ １８ １８ ３０ ６０ ９ ９．０ ４．５ ４．５ ０ １ １０ ９．５ ４．５ ４．５ １ ２ １１ １０．０ ４．５ ４．５ ４ １１ １２ １０．５ ４．５ ４．５ ９ ２０１３ １１．０ ４．５ ４．５ ２ ３ 比較例１ ７．５ １８ １８ ０ ０ 第 ２ 表 ＊Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ濃度：１Ｕ／ｍｌ実施例 ｐＨ 基質濃度 ＮＡＮＡの濃度 （ｇ／１００ｍｌ） （ｍｇ／ｍｌ） ＧｌｃＮＡｃ Ｐｙｒ−Ｎａ １日反応後 ５日反応後 １４ ９．０ １８ １８ ０ １ １５ ９．５ １８ １８ １ ３ １６ １０．０ １８ １８ ２ １５ １７ １０．５ １８ １８ ７ ２６ １８ １１．０ １８ １８ ２ ６ １９ ９．０ ４．５ ４．５ ０ １ ２０ ９．５ ４．５ ４．５ １ ２ ２１ １０．０ ４．５ ４．５ ３ ９ ２２ １０．５ ４．５ ４．５ ６ １３２３ １１．０ ４．５ ４．５ １ １ なお、第１表および第２表中の略号の意味は、以下の通
りである。
りである。
【００３６】＊ＮＡＮＡ：Ｎ−アセチルノイラミン酸 ＊ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン ＊Ｐｙｒ−Ｎａ：ピルビン酸ナトリウム 上記第１表および第２表の結果から、本発明の方法によ
れば、Ｎ−アセチルグルコサミンから１段階でＮ−アセ
チルノイラミン酸に高い割合で変換できることが明かと
なった。
れば、Ｎ−アセチルグルコサミンから１段階でＮ−アセ
チルノイラミン酸に高い割合で変換できることが明かと
なった。
【００３７】
【実施例２４】＊Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼの安定性 １００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１０．０）にＮ−アセチ
ルノイラミン酸リアーゼ１００Ｕ、Ｎ−アセチルグルコ
サミン１．８ｇおよびピルビン酸ナトリウム１．８ｇを
加えて全量を１０ｍｌとし、３５℃で１６時間反応させ
た。反応後のＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼの残存
率を、反応液を１００倍量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に透析後、基質（Ｎ−アセチルノイラミン
酸）と反応し、生成するＮ−アセチルマンノサミンを比
色定量することにより求めたところ１００％であった。
ルノイラミン酸リアーゼ１００Ｕ、Ｎ−アセチルグルコ
サミン１．８ｇおよびピルビン酸ナトリウム１．８ｇを
加えて全量を１０ｍｌとし、３５℃で１６時間反応させ
た。反応後のＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼの残存
率を、反応液を１００倍量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に透析後、基質（Ｎ−アセチルノイラミン
酸）と反応し、生成するＮ−アセチルマンノサミンを比
色定量することにより求めたところ１００％であった。
【００３８】
【実施例２５〜４３】Ｎ−アセチルグルコサミンおよび
ピルビン酸の濃度、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ
の濃度並びにリン酸緩衝液のｐＨを各々変更した以外は
実施例２４と同様な条件下でＮ−アセチルノイラミン酸
リアーゼの安定性を調べた。
ピルビン酸の濃度、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ
の濃度並びにリン酸緩衝液のｐＨを各々変更した以外は
実施例２４と同様な条件下でＮ−アセチルノイラミン酸
リアーゼの安定性を調べた。
【００３９】
【比較例２】Ｎ−アセチルグルコサミンおよびピルビン
酸ナトリウムを添加しないことを除いては実施例２４と
同様の条件で、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼの安
定性を調べた。
酸ナトリウムを添加しないことを除いては実施例２４と
同様の条件で、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼの安
定性を調べた。
【００４０】
【比較例３〜１１】Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ
の濃度およびリン酸緩衝液のｐＨを各々変更した以外は
比較例２と同様な条件下でＮ−アセチルノイラミン酸リ
アーゼの安定性を調べた。
の濃度およびリン酸緩衝液のｐＨを各々変更した以外は
比較例２と同様な条件下でＮ−アセチルノイラミン酸リ
アーゼの安定性を調べた。
【００４１】結果を、以下の第３表および第４表に示
す。
す。
【００４２】 第 ３ 表 ＊Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ濃度：１０Ｕ／ｍｌ 実施例又は ｐＨ 基質濃度（ｇ／１００ｍｌ） Ｎ−アセチルノイラミン酸 比較例 ＧｌｃＮＡｃ Ｐｙｒ−Ｎａ リアーゼの残存率（％） 実施例２４ ９．０ １８ １８ １００ 実施例２５ ９．５ １８ １８ １００ 実施例２６ １０．０ １８ １８ １００ 実施例２７ １０．５ １８ １８ ８０ 実施例２８ １１．０ １８ １８ ２２ 実施例２９ ９．０ ４．５ ４．５ １００ 実施例３０ ９．５ ４．５ ４．５ １００ 実施例３１ １０．０ ４．５ ４．５ １００ 実施例３２ １０．５ ４．５ ４．５ ８０ 実施例３３ １１．０ ４．５ ４．５ １０ 比較例２ ９．０ ０ ０ １００ 比較例３ ９．５ ０ ０ １００ 比較例４ １０．０ ０ ０ ２０ 比較例５ １０．５ ０ ０ ０比較例６ １１．０ ０ ０ ０ 第 ４ 表 ＊Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ濃度：１Ｕ／ｍｌ 実施例又は ｐＨ 基質濃度（ｇ／１００ｇ） Ｎ−アセチルノイラミン酸比較例 ＧｌｃＮＡｃ Ｐｙｒ−Ｎａ リアーゼの残存率（％） 実施例３４ ９．０ １８ １８ １００ 実施例３５ ９．５ １８ １８ １００ 実施例３６ １０．０ １８ １８ ９７ 実施例３７ １０．５ １８ １８ ７０ 実施例３８ １１．０ １８ １８ ３０ 実施例３９ ９．０ ４．５ ４．５ １００ 実施例４０ ９．５ ４．５ ４．５ １００ 実施例４１ １０．０ ４．５ ４．５ ９８ 実施例４２ １０．５ ４．５ ４．５ ６０ 実施例４３ １１．０ ４．５ ４．５ ８ 比較例７ ９．０ ０ ０ １００ 比較例８ ９．５ ０ ０ ９８ 比較例９ １０．０ ０ ０ １５ 比較例１０ １０．５ ０ ０ ０比較例１１ １１．０ ０ ０ ０ 上記第３表および第４表の結果から、基質であるＮ−ア
セチルグルコサミンおよびピルビン酸の存在により、よ
り広いｐＨ範囲で不安定なＮ−アセチルノイラミン酸リ
アーゼの安定化が図れることが明かとなった。
セチルグルコサミンおよびピルビン酸の存在により、よ
り広いｐＨ範囲で不安定なＮ−アセチルノイラミン酸リ
アーゼの安定化が図れることが明かとなった。
【００４３】
Claims (3)
- 【請求項１】ｐＨ９．５〜１２のアルカリ性条件下、Ｎ
−アセチルグルコサミンおよびピルビン酸の存在下にＮ
−アセチルノイラミン酸リアーゼを作用させることを特
徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。 - 【請求項２】ｐＨ８．０〜１２のアルカリ性条件下、Ｎ
−アセチルグルコサミンおよびピルビン酸の存在下にＮ
−アセチルノイラミン酸リアーゼを５日間以上作用させ
ることを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造
法。 - 【請求項３】ｐＨ９．０〜１２のアルカリ性条件下、各
々０．１８ｇ／ｍｌ以上のＮ−アセチルグルコサミンお
よびピルビン酸の存在下にＮ−アセチルノイラミン酸リ
アーゼを作用させることを特徴とするＮ−アセチルノイ
ラミン酸の製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04017206A JP3131655B2 (ja) | 1992-02-03 | 1992-02-03 | Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法 |
| PCT/JP1992/000757 WO1993015214A1 (en) | 1992-02-03 | 1992-06-12 | Process for producing n-acetylneuraminic acid |
| EP92911831A EP0578825B1 (en) | 1992-02-03 | 1992-06-12 | Process for producing n-acetylneuraminic acid |
| AU19067/92A AU656979B2 (en) | 1992-02-03 | 1992-06-12 | Process for producing N-acetylneuraminic acid |
| DE69217923T DE69217923T2 (de) | 1992-02-03 | 1992-06-12 | Verfahren zur herstellung von n-acetylneuraminsäure |
| US08/122,555 US5472860A (en) | 1992-02-03 | 1992-06-12 | Method for preparing N-acetylneuraminic acid by N-acetylneuraminic acid lysase at a pH of 10-12 |
| US08/528,120 US5665574A (en) | 1992-02-03 | 1995-09-14 | Method for preparing N-acetylneuraminic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04017206A JP3131655B2 (ja) | 1992-02-03 | 1992-02-03 | Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05211884A JPH05211884A (ja) | 1993-08-24 |
| JP3131655B2 true JP3131655B2 (ja) | 2001-02-05 |
Family
ID=11937470
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04017206A Expired - Lifetime JP3131655B2 (ja) | 1992-02-03 | 1992-02-03 | Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5472860A (ja) |
| EP (1) | EP0578825B1 (ja) |
| JP (1) | JP3131655B2 (ja) |
| AU (1) | AU656979B2 (ja) |
| DE (1) | DE69217923T2 (ja) |
| WO (1) | WO1993015214A1 (ja) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9311873D0 (en) * | 1993-06-09 | 1993-07-28 | Glaxo Group Ltd | Process |
| US6156544A (en) * | 1993-06-09 | 2000-12-05 | Glaxo Group Limited | Process for the preparation of N-acetylneuraminic acid |
| US6846656B1 (en) * | 1999-08-30 | 2005-01-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing N-acetylneuraminic acid |
| CN1301330C (zh) | 2002-07-18 | 2007-02-21 | 雅玛山酱油株式会社 | Cmp－n－乙酰神经氨酸的制造方法 |
| JP2006271372A (ja) * | 2005-03-01 | 2006-10-12 | Yamasa Shoyu Co Ltd | 糖鎖の製造法 |
| NZ596626A (en) | 2006-02-09 | 2013-04-26 | Centre Nat Rech Scient | Synthesis of sialic acid in plants |
| NO325867B1 (no) * | 2006-10-17 | 2008-08-04 | Impec As | Apparat for retting av anodenipler for elektrolyseovner |
| KR100888513B1 (ko) | 2006-12-15 | 2009-03-12 | 주식회사 진켐 | 신규 ｎ―아세틸글루코사민―２―에피머라아제 및 이를이용한 ｃｍｐ―ｎ―아세틸뉴라민산의 제조방법 |
| WO2011086834A1 (ja) * | 2010-01-15 | 2011-07-21 | 味の素株式会社 | Ｎ－アセチル－ｄ－ノイラミン酸の製造方法 |
| AT510299B1 (de) | 2010-12-22 | 2012-03-15 | Univ Wien Tech | Verfahren und mittel zur herstellung von n-acetylneuraminsäure (neunac) |
| KR101525230B1 (ko) | 2013-05-31 | 2015-06-01 | 주식회사 진켐 | 시알산 유도체의 제조방법 |
| EP3149188A1 (en) | 2014-05-27 | 2017-04-05 | Universitetet I Tromsø - Norges Arktiske Universitet | Use of a n-acetylneuraminate lyase derived from the bacterium aliivibrio salmonicida in the production of neuraminic acid and derivatives thereof |
| CN104628794B (zh) * | 2015-03-10 | 2017-05-10 | 武汉中科光谷绿色生物技术有限公司 | 一种对微生物发酵法生产的n‑乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法 |
| CN106188167B (zh) * | 2016-07-04 | 2018-12-11 | 扬州日兴生物科技股份有限公司 | 一种从氨糖发酵液中分离提取n-乙酰基-d-氨基葡萄糖和d-氨基葡萄糖的方法 |
| EP3473644A1 (en) | 2017-10-17 | 2019-04-24 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Fermentative production of n-acetylneuraminic acid |
| EP3486326A1 (en) | 2017-11-21 | 2019-05-22 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Method for the purification of n-acetylneuraminic acid from a fermentation broth |
| CN109293612B (zh) * | 2018-10-18 | 2022-07-26 | 武汉中科光谷绿色生物技术有限公司 | 一种通过调节溶液氢离子浓度制备n-乙酰神经氨酸水合物的方法 |
| CN118103494A (zh) | 2021-10-08 | 2024-05-28 | 协和发酵生化株式会社 | 具有生产n-乙酰神经氨酸和/或含n-乙酰神经氨酸的糖质的能力的微生物以及使用该微生物的n-乙酰神经氨酸和/或含n-乙酰神经氨酸的糖质的制造方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3937891A1 (de) * | 1989-11-15 | 1991-05-16 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Enzymatisches verfahren zur herstellung von n-acetylneuraminsaeure |
| US5162513A (en) * | 1991-09-20 | 1992-11-10 | The Scripps Research Institute | L-isomeric sugars having formed stereogenic centers of R configuration: methods and compositions |
-
1992
- 1992-02-03 JP JP04017206A patent/JP3131655B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-12 DE DE69217923T patent/DE69217923T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-12 AU AU19067/92A patent/AU656979B2/en not_active Expired
- 1992-06-12 US US08/122,555 patent/US5472860A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-12 WO PCT/JP1992/000757 patent/WO1993015214A1/ja active IP Right Grant
- 1992-06-12 EP EP92911831A patent/EP0578825B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-09-14 US US08/528,120 patent/US5665574A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1993015214A1 (en) | 1993-08-05 |
| AU656979B2 (en) | 1995-02-23 |
| DE69217923T2 (de) | 1997-06-12 |
| JPH05211884A (ja) | 1993-08-24 |
| EP0578825B1 (en) | 1997-03-05 |
| US5472860A (en) | 1995-12-05 |
| AU1906792A (en) | 1993-09-01 |
| EP0578825A1 (en) | 1994-01-19 |
| US5665574A (en) | 1997-09-09 |
| DE69217923D1 (de) | 1997-04-10 |
| EP0578825A4 (en) | 1995-07-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3131655B2 (ja) | Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法 | |
| JP2019213532A (ja) | ガラクト−オリゴサッカライドの製造 | |
| Chambon et al. | Efficient chemoenzymatic synthesis of lipo-chitin oligosaccharides as plant growth promoters | |
| EP0096547B1 (en) | Process for preparing uridine diphosphate-n-acetylgalactosamine | |
| US5501965A (en) | Process for producing fructose 2,6-bisphosphate and purification process thereof | |
| JPH0630599B2 (ja) | フルクトース―１，６―二リン酸の製造法 | |
| JP2002017392A (ja) | Ｄ−キシロース・イソメラーゼを用いるアルドヘキソースの製造方法 | |
| Potter et al. | α-L-Glucose-1-phosphate | |
| US5679787A (en) | Process for isomerization of compound of aldose structure into compound of ketose structure, and isomerization agent or accelerator used therein | |
| DE3626915A1 (de) | Verfahren zur enzymatischen synthese eines n-acetylneuraminsaeure-haltigen trisaccharids | |
| JPH06253878A (ja) | ラクト−Ｎ−ビオースＩ及び２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−ガラクトピラノースの製造法 | |
| JP2006314223A (ja) | グルクロン酸及び／又はグルクロノラクトンの製造方法 | |
| JPS63279798A (ja) | Ｓ−アデノシルメチオニンの製造法 | |
| US5877311A (en) | Process for isomerization of compound of aldose structure into compound of ketose structure, and isomerization agent or accelerator used therin | |
| US6353095B1 (en) | Ketoaldonic acids having formed stereogenic centers of R configuration: methods and compositions | |
| JPS6224076B2 (ja) | ||
| JPS5818075B2 (ja) | アデノ−５′−三燐酸の製造法 | |
| Adlersberg et al. | Synthesis of 3-deoxy-d-arabino-2-heptulosonic acid 7-phosphate by phosphorylation of methyl (methyl 3-deoxy-d-arabino-heptulopyranosid) onate | |
| JP3045509B2 (ja) | マンノース含有オリゴ糖の製造法 | |
| CA2117472C (en) | Process for isomerization of compound of aldose structure into compound of ketose structure, and isomerization agent or accelerator used therein | |
| JP3100559B2 (ja) | ラクト−ｎ−ネオテトラオースの製造法 | |
| JPH0254077B2 (ja) | ||
| KR940009047B1 (ko) | 아스콜빈산-2-인산 또는 이소 아스콜빈산-2-인산과 글루타민의 제조방법 | |
| JPS60248191A (ja) | フオスフイノスリシンの製造方法 | |
| JP2582810B2 (ja) | Ｌ−イソロイシンの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091124 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101124 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111124 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111124 Year of fee payment: 11 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111124 Year of fee payment: 11 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111124 Year of fee payment: 11 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111124 Year of fee payment: 11 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111124 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121124 Year of fee payment: 12 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121124 Year of fee payment: 12 |