CN104628794B - 一种对微生物发酵法生产的n‑乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法 - Google Patents

一种对微生物发酵法生产的n‑乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法 Download PDF

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本发明提供了一种对微生物发酵法生产的N‑乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法，其特征在于：以大肠杆菌发酵生产N‑乙酰神经氨酸的发酵液为原料，通过除菌、除蛋白、脱色、除盐、结晶等步骤获得了高纯度的N‑乙酰神经氨酸产品。经测试产品纯度至少为98％，可以满足其在食品、保健、医药和化妆品等领域的要求，且本发明的方法简单易操作，特别适合于工业化发酵生产N‑乙酰神经氨酸。

Description

一种对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸进行分离提纯的 方法
技术领域
本发明涉及一种对微生物发酵法生产的单体N-乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法，属于生化分离工程技术领域。
背景技术
微生物发酵法生产N-乙酰神经氨酸，已有很多文献报道。申请号为201310600843.0的中国发明专利公开了利用大肠杆菌工程菌通过微生物发酵法生产N-乙酰神经氨酸的方法，该方法获得了含产物的发酵液。
虽然微生物发酵法生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法和工艺已有很多报道，但对于下游阶段产物的分离提纯方法却鲜有报道，而下游的分离提纯方法和工艺直接决定了产品的品质和市场价格。目前市场需求领域如食品、保健和医药领域对N-乙酰神经氨酸产品品质要求较高，纯度均要求大于98％，而目前市场上纯度大于98％的产品价格非常昂贵，如Sigma公司销售的微生物发酵法来源的纯度98％的N-乙酰神经氨酸，售价约1000美元/克，即使是大众产品，98％的N-乙酰神经氨酸，售价也不低于6000元/千克。昂贵的价格和较高的品质需求，导致下游的分离提纯方法和工艺亟待研究和开发。
发明内容
为避免上述现有技术所存在的不足之处，本发明的主要目的是提供一种对微生物发酵法生产的单体N-乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法，旨在获得一种高纯度的质量稳定的N-乙酰神经氨酸，满足食品、保健、医药和化妆品等领域的应用需求。
本发明解决技术问题，采用如下技术方案：
本发明对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法，其特点在于按如下步骤进行：
a、以大肠杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的发酵液为原料，加入蒙脱石粉进行菌体絮凝沉淀，然后采用板框过滤器进行粗滤，对所得滤液进行离心分离，以去除发酵液中菌体，获得除菌发酵液；
b、在所述除菌发酵液中加入盐酸，调节pH至3.0～5.0，再在80～90℃条件下加热处理，以使杂蛋白沉淀，离心分离，去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
c、利用活性炭或凹土对所述除蛋白发酵液吸附脱色，获得脱色发酵液；
d、使用离子交换树脂对所述脱色发酵液进行离子交换，去除所述脱色发酵液中的无机盐，获得除盐发酵液；
e、将所述除盐发酵液进行减压蒸发浓缩，然后在所得浓缩液中加入有机溶剂进行降温结晶，离心分离获得晶体；
f、洗涤所述晶体，利用真空程序升温干燥法对洗涤后晶体进行干燥，即完成对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸的分离提纯，获得产物N-乙酰神经氨酸。
本发明对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法，其特点也在于：步骤a所述蒙脱石粉为钙基蒙脱石；所述蒙脱石粉的加入量为所述发酵液质量的10～20％；
步骤a所述板框过滤器中滤布孔径大小为1000～5000目。
步骤a所述的离心是通过管式高速离心机，以不低于10000rpm的转速进行离心，以使菌体沉淀。
步骤b所述的加热处理的时间不少于0.5h，以使杂蛋白彻底变性。
步骤c所述的活性炭或凹土的加入量为所述除蛋白发酵液质量的1％～5％，所述的吸附温度为20～50℃，所述吸附时间不少于0.5h。
步骤d所述离子交换树脂为阳离子交换树脂，优选为D001型阳离子交换树脂。
步骤e中所述浓缩液的浓度为100～200g/L；所述有机溶剂为一元有机酸或一元醇和一元有机酸按体积比1:2～1:5构成的混合物；所述有机溶剂的加入量为所述浓缩液体积的2～5倍；所述降温结晶的温度为2～30℃，结晶时间为10～50h。
步骤f所述洗涤是以无水乙醇作为洗涤液进行洗涤；步骤f所述干燥是通过程序升温干燥法，在70～80℃真空烘干1～6h，再在80～90℃真空烘干1～6h。
本发明的技术效果体现在：
1、本发明根据蒙脱石粉能够絮凝菌体的性能，在大肠杆菌发酵液中加入少量蒙脱石，可以使菌体和蒙脱石粉迅速絮凝，利用板框分离即可达到很好的菌液分离效果，且对目标产物没有影响，分离前后发酵液中目标产物含量经高效液相色谱检测，几乎没有变化，如实施例1中证明了此效果；因大量菌体通过板框过滤除去后，就减轻了后续离心除菌体的压力，含少量菌体的发酵液通过高速离心，彻底分离菌体和液体，提高分离效率；
2、本发明在加热除杂蛋白前加入少量盐酸调节pH至3.0～5.0，然后在80～90℃条件下加热，可彻底去除变性的杂蛋白。一般蛋白变性温度在70℃左右，但因大肠杆菌发酵液比较复杂，除蛋白温度至少在70℃以上，80～90℃热处理效果更好，能够彻底使发酵液中的蛋白变性，减少了结晶液中的杂蛋白，就提高了产品的纯度，实施例2和对比实施例3通过比较证明了此效果，同样条件下，当90℃热处理时，产品纯度是98.3％，而70℃热处理时，产品纯度是97.9％；
3、因发酵液中含有少量的无机盐，采用离子交换法去除如钙、镁等阳离子盐，减少了结晶液中杂质含量，提高了产品纯度，实施例4和对比实施例5通过比较证明了此效果，同样条件下，除无机盐后结晶产品纯度是98.1％，未除无机盐结晶产品纯度是97.6％；
4、本发明采用低温溶剂结晶法，既可以提高产品纯度，又可以提高产品收率，产品纯度98％以上，此结晶步骤收率90％以上；
5、本发明采用程序升温真空干燥法，既提高了产品纯度，又提高了干燥效率；干燥过程实际是物质的吸附和脱附过程，当吸附脱附达到平衡时，干燥速率就会变得很慢，此时如果打破吸附和脱附平衡，即可提高干燥效率；一般干燥方式都是恒温干燥，恒温干燥过程平衡很难打破，而采用程序升温干燥目的就在于打破此平衡，残留在固体内的溶剂很容易挥发出来，从而提高干燥后产品的纯度和干燥效率，实施例6和对比实施例7通过比较证明了此效果，同样条件下，90℃恒温真空干燥6h，纯度97.7％；而程序升温干燥法，在80℃真空干燥3h，然后再90℃真空干燥2h，纯度是98.5％；
6、经高效液相色谱法检测，本发明方法所得产品的纯度高于98％，满足市场需求，且成本低。
附图说明
图1为本发明实施例1所得产品的外观形态；
图2为本发明实施例1所得产品的高效液相色谱检测图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明。但这些实施例仅用于说明本发明，而不构成对本发明范围的限制。
实施例1
本实施按如下步骤对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸进行分离提纯：
a、菌液分离：以申请号为201310600843.0的发明专利所公开的方法中，大肠杆菌基因工程菌发酵生产的含N-乙酰神经氨酸的发酵液为原料，加入占发酵液质量15％的钙基蒙脱石粉进行菌体絮凝沉淀，然后采用滤布孔径为2000目的板框进行挤压过滤，所得滤液通过管式高速离心机进行过滤，转速12000rpm，使菌体和发酵液彻底分离，获得除菌发酵液，经高效液相色谱检测，除菌前后发酵液中目标产物N-乙酰神经氨酸含量几乎没有变化，即采用蒙脱石粉絮凝菌体，不会对N-乙酰神经氨酸造成损失；
b、去除杂蛋白：在除菌发酵液中加入盐酸，调节pH至4.0，在85℃条件下加热0.5h，以使杂蛋白沉淀，离心分离，去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
c、脱色：向除蛋白发酵液中加入占除蛋白发酵液质量4％的活性炭，在30℃条件下进行吸附脱色0.5h，获得脱色发酵液；
d、去除无机盐：将脱色发酵液缓缓进入D001型阳离子交换树脂柱，连续交换，去除除蛋白发酵液中的钙、镁等影响产品纯度的无机盐，获得除盐发酵液；
e、结晶：将除盐发酵液进行减压蒸发浓缩，浓缩至200g/L，然后在浓缩液中加入3倍体积的甲醇和乙酸(甲醇和乙酸的混合比是1:4)的混合溶剂，降温至10℃，结晶20h，得晶体；
f、洗涤、烘干：结晶好的晶体采用无水乙醇进行洗涤，然后进行程序升温真空干燥烘干，真空干燥方法是75℃真空烘干3h，然后升温至85℃再真空烘干4h，烘干后的晶体(外观形态如图1所示)采用高效液相色谱法检测(结果如图2所示)，纯度为98.2％。
实施例2
本实施按如下步骤对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸进行分离提纯：
a、菌液分离：以申请号为201310600843.0的发明专利所公开的方法中，大肠杆菌基因工程菌发酵生产的含N-乙酰神经氨酸的发酵液为原料，加入占发酵液质量12％的钙基蒙脱石粉进行菌体絮凝沉淀，然后采用滤布孔径为2000目的板框进行挤压过滤，所得滤液通过管式高速离心机进行过滤，转速13000rpm，使菌体和发酵液彻底分离，获得除菌发酵液；
b、去除杂蛋白：在除菌发酵液中加入盐酸，调节pH至3.8，在90℃条件下加热0.5h，以使杂蛋白沉淀，离心分离，去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
c、脱色：向除蛋白发酵液中加入占除蛋白发酵液质量3％的活性炭在40℃条件下进行吸附脱色1h，获得脱色发酵液；
d、去除无机盐：将脱色发酵液进入D001型阳离子交换树脂柱，连续交换，去除除蛋白发酵液中的钙、镁等影响产品纯度的无机盐，获得除盐发酵液；
e、结晶：将除盐发酵液进行减压蒸发浓缩，浓缩至180g/L，然后在浓缩液中加入3倍体积的乙酸，降温至15℃，结晶30h，得晶体；
f、洗涤、烘干：结晶好的晶体采用无水乙醇进行洗涤，然后进行程序升温真空干燥烘干，真空干燥方法是80℃真空烘干4h，然后升温至90℃再真空烘干4h，烘干后的晶体采用高效液相色谱法检测，纯度为98.3％。
实施例3
本实施例按实施例2相同的方式对与实施例2相同的原料进行分离提纯，区别仅在于步骤b中的温度由90℃改为70℃，经测试本实施中最终产品纯度是97.9％，相比于实施例2较差。说明90℃热处理效果更好，能够彻底使发酵液中的蛋白变性，减少了结晶液中的杂蛋白，就提高了产品的纯度。
实施例4
本实施按如下步骤对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸进行分离提纯：
a、菌液分离：以申请号为201310600843.0的发明专利所公开的方法中，大肠杆菌基因工程菌发酵生产的含N-乙酰神经氨酸的发酵液为原料，加入占发酵液质量16％的钙基蒙脱石粉进行菌体絮凝沉淀，然后采用滤布孔径为3000目的板框进行挤压过滤，所得滤液通过管式高速离心机进行过滤，转速12000rpm，使菌体和发酵液彻底分离，获得除菌发酵液；
b、去除杂蛋白：在除菌发酵液中加入盐酸，调节pH至4.0，在85℃条件下加热1h，以使杂蛋白沉淀，离心分离，去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
c、脱色：向除蛋白发酵液中加入占除蛋白发酵液质量4％的活性炭在50℃条件下进行吸附脱色0.5h，获得脱色发酵液；
d、去除无机盐：将脱色发酵液进入D001型阳离子交换树脂柱，连续交换，去除除蛋白发酵液中的钙、镁等影响产品纯度的无机盐，获得除盐发酵液；
e、结晶：将除盐发酵液进行减压蒸发浓缩，浓缩至150g/L，然后在浓缩液中加入3倍体积的乙酸，降温至12℃，结晶35h，得晶体；
f、洗涤、烘干：结晶好的晶体采用无水乙醇进行洗涤，然后进行程序升温真空干燥烘干，真空干燥方法是70℃真空烘干5h，然后升温至85℃再真空烘干3h，烘干后的晶体采用高效液相色谱法检测，纯度为98.1％。
实施例5
本实施例按实施例4相同的方式对与实施例4相同的原料进行分离提纯，区别仅在于不进行步骤d，本实施例所得最终产品纯度97.6％，相比于实施例4较差，说明采用离子交换法去除阳离子盐，可以提高产品纯度。
实施例6
本实施按如下步骤对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸进行分离提纯：
a、菌液分离：以申请号为201310600843.0的发明专利所公开的方法中，大肠杆菌基因工程菌发酵生产的含N-乙酰神经氨酸的发酵液为原料，加入占发酵液质量18％的钙基蒙脱石粉进行菌体絮凝沉淀，然后采用滤布孔径为5000目的板框进行挤压过滤，所得滤液通过管式高速离心机进行过滤，转速11000rpm，使菌体和发酵液彻底分离，获得除菌发酵液；
b、去除杂蛋白：在除菌发酵液中加入盐酸，调节pH至3.5，在90℃条件下加热1h，以使杂蛋白沉淀，离心分离，去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
c、脱色：向除蛋白发酵液中加入占除蛋白发酵液质量3％的活性炭在35℃条件下进行吸附脱色0.5h，获得脱色发酵液；
d、去除无机盐：将脱色发酵液进入D001型阳离子交换树脂柱，连续交换，去除除蛋白发酵液中的钙、镁等影响产品纯度的无机盐，获得除盐发酵液；
e、结晶：将除盐发酵液进行减压蒸发浓缩，浓缩至200g/L，然后在浓缩液中加入4倍体积的乙酸，降温至8℃，结晶40h，得晶体；
f、洗涤、烘干：结晶好的晶体采用无水乙醇进行洗涤，然后进行程序升温真空干燥烘干，真空干燥方法是80℃真空烘干3h，然后升温至90℃再真空烘干2h，烘干后的晶体采用高效液相色谱法检测，纯度为98.5％。
实施例7
本实施例按实施例6相同的方式对与实施例6相同的原料进行分离提纯，区别仅在于：步骤f干燥时不采用真空程序升温干燥法，仅在90℃恒温真空干燥6h，本实施例所得最终产品纯度97.7％，相比于实施例6较差，说明采用真空程序升温干燥法可以提高产品纯度。

Claims (10)

1.一种对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法，其特征在于按如下步骤进行：
a、以大肠杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的发酵液为原料，加入蒙脱石粉进行菌体絮凝沉淀，然后采用板框过滤器进行粗滤，对所得滤液进行离心分离，以去除发酵液中菌体，获得除菌发酵液；
b、在所述除菌发酵液中加入盐酸，调节pH至3.0～5.0，再在80～90℃条件下加热处理，以使杂蛋白沉淀，离心分离，去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
c、利用活性炭或凹土对所述除蛋白发酵液吸附脱色，获得脱色发酵液；
d、使用离子交换树脂对所述脱色发酵液进行离子交换，去除所述脱色发酵液中的无机盐，获得除盐发酵液；
e、将所述除盐发酵液进行减压蒸发浓缩，然后在所得浓缩液中加入有机溶剂进行降温结晶，离心分离获得晶体；
f、洗涤所述晶体，利用真空程序升温干燥法对洗涤后晶体进行干燥，即完成对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸的分离提纯，获得产物N-乙酰神经氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a所述蒙脱石粉为钙基蒙脱石；所述蒙脱石粉的加入量为所述发酵液质量的10～20％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a所述板框过滤器中滤布孔径大小为1000～5000目。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a所述的离心是通过管式高速离心机，以不低于10000rpm的转速进行离心，以使菌体沉淀。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b所述的加热处理的时间不少于0.5h，以使杂蛋白彻底变性。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c所述的活性炭或凹土的加入量为所述除蛋白发酵液质量的1％～5％，所述的吸附温度为20～50℃，所述吸附时间不少于0.5h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤d所述离子交换树脂为阳离子交换树脂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述阳离子交换树脂为D001型阳离子交换树脂。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤e中所述浓缩液的浓度为100～200g/L；所述有机溶剂为一元有机酸或一元醇和一元有机酸按体积比1:2～1:5构成的混合物；所述有机溶剂的加入量为所述浓缩液体积的2～5倍；所述降温结晶的温度为2～30℃，结晶时间为10～50h。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤f所述洗涤是以无水乙醇作为洗涤液进行洗涤；步骤f所述干燥是通过程序升温干燥法，在70～80℃真空烘干1～6h，再在80～90℃真空烘干1～6h。
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