CN1861798A - N－乙酰－d－神经氨酸醛缩酶固定化法制备n－乙酰－d－神经氨酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用N－乙酰－D－神经氨酸醛缩酶固定化酶来生产N－乙酰神经氨酸的工艺。该工艺使用亲和载体固定化N－乙酰－D－神经氨酸醛缩酶(E.C.4.1.3.3)，以N－乙酰葡萄糖胺和丙酮酸钠为底物制备N－乙酰神经氨酸。

Description

N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化法制备N-乙酰-D-神经氨酸

技术领域

本发明涉及一种新颖的N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶、其固定化酶，以及使用该固定化酶制备转化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸钠获得N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的方法。

背景技术

唾液酸是一个含9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖。Neu5Ac是唾液酸的主要代表。这类化合物可结合到糖蛋白和糖脂的末端位置，在生物识别过程中起非常重要的作用。例如在流感病毒感染宿主细胞的过程之中，流感病毒的唾液酸酶可以识别N-乙酰神经氨酸及其衍生物，并通过与唾液酸结合感染细胞并释放出复制好的病毒。如果将其唾液酸酶进行抑制，那么就可以治疗病毒导致的疾病。根据唾液酸的结构，设计其类似物，利用这种类似物结合病毒的唾液酸酶，使之失去与宿主细胞表面唾液酸结合的机会，那么病毒就可以被有效的抑制。如葛兰素公司推出的抗病毒新药zanamavir就是N-乙酰神经氨酸的类似物，它具有良好的抗病毒活性。合成Neu5Ac类似物和含有寡糖的Neu5Ac在研究对神经氨酸苷酶、红血球凝集素以及选凝素介导的白细胞黏附的抑制中相当重要。

Neu5Ac可以从自然资源如牛奶、蛋黄中获得，但这些来源含量低，不适合大量制备。工业生产可采用化学方法或酶法合成Neu5Ac。然而，由于化学方法需要繁重重复的基团保护和去保护步骤，所以采用酶法制备Neu5Ac较为经济方便。

用酶法合成Neu5Ac的方法为：以N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸钠为底物，在N-乙酰神经氨酸醛缩酶催化下转化生成Neu5Ac。但目前的酶法制备Neu5Ac一般用菌体或粗酶转化，这种方法中的酶没有固定化酶稳定，不能反复利用，而且反应所用时间较长，效率低下。此外，采用菌体或粗酶转化不利于分离产物。

发明内容

为克服上述缺陷，一方面，本发明提供一种制备N-乙酰-D-神经氨酸的方法，该方法包括，以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸或其盐作为底物，使用N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的金属螯合亲和载体固定化酶进行催化，从而制得N-乙酰-D-神经氨酸。

在一个优选实施例中，所述亲和载体以琼脂粉或琼脂糖为基质制得，所述金属离子选自Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺。

在另一优选实施例中，所述N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的N末端具有4-8个组氨酸残基。特别优选的是，所述N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的N末端具有6个组氨酸残基。

本发明另一方面涉及一种N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶，它包括金属螯合亲和载体和与之结合的N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶，其中，该N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的N末端具有4-8个组氨酸残基。在一优选实施例中，所述N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的N末端具有6个组氨酸残基。

在一优选实施例中，所述金属螯合亲和载体包含选自Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺的金属离子。

本发明又一方面还涉及一种制备N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶的方法，该方法包括：在合适条件下使包含N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的溶液与金属螯合亲和载体接触；洗涤，得到所述N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶。

在一优选实施例中，所述溶液是含有N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的发酵液。

在另一优选实施例中，所述N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的N末端具有4-8个组氨酸残基。在一优选实施例中，所述金属螯合亲和载体是螯合了选自金属离子Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺的载体。

附图说明

图1显示Neu5Ac醛缩酶固定化酶不同时间不同梯度的转化率。

图2显示Neu5Ac醛缩酶固定化酶转化不同量的N-乙酰甘露糖胺的结果。

图3显示Neu5Ac醛缩酶固定化酶的转化反应。

图4显示Neu5Ac醛缩酶固定化酶的转化反应。

图5显示Neu5Ac醛缩酶固定化酶的转化反应。

图6显示SDS-PAGE分析本发明的Neu5Ac醛缩酶的结果。

图7显示本发明的Neu5Ac醛缩酶固定化酶连续反应的转化率。

图8显示本发明制得的Neu5Ac与市售的同类商品的HPLC分析比较结果。

图9显示该市售产品和本发明的产品的全波长扫描图谱。

具体实施方式

1.N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶

本发明所用的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，包括但不限于大肠杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、气杆菌属(Aerobacter)、变形杆菌属(Proteus)、微球菌属(Micrococcus)、八叠球菌属(Sarcina)、Brevibaterium、棒状杆菌属(Corynebacterium)、Arthrobater、芽胞杆菌属(Bacillus)、杆菌属(Bacterium)、弧菌属(Vibrio)、梭菌属(Clostridium)等细菌来源的基因编码得到的N-乙酰神经氨酸醛缩酶。较佳的是，所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶生成基因来自E.coli TG1株系的大肠埃希氏菌细胞。

也可采用化学合成的方法获得本发明的N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶，所涉及的化学合成方法是本领域技术人员周知的。

该N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶中可存在一定数量(如1-20个氨基酸、1-10个氨基酸或更少)的变异，如缺失、插入、突变等。只要具有这些变异的N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶仍保留其天然形式所具备的催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸或其盐底物的活性即可。

本发明优选采用重组方法制备该N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶。通常，外源基因载体导入目标菌株后可以通过两种方式存在：一是重组遗传载体以质粒形式存在于宿主染色体外。另一种使重组遗传载体以整合形式整合于宿主染色体上。在本发明中，优选使重组载体以质粒形式存在于宿主染色体外，这样获得了较好的表达效果。

适用于本发明的外源重组载体首先应当具有复制起始点，其次应当具有较强的启动子。另外载体较佳还具有在宿主菌中进行筛选的遗传标记以及具有若干限制性内切酶位点等。适用于本发明的载体包括：pET28b(+)(t7启动子)，pDR540(tac启动子，组成型表达)，pBV220(含P_RP_L启动子)。这些载体可从市售途径获得，如可从Novagen购得pET质粒载体。优选的表达载体是PET28b(+)。

适用于本发明的宿主微生物也是本领域技术人员已知的，包括但不限于还有大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、科里氏杆菌属(Corynebacterium belfanti)等。本发明优选的宿主微生物是大肠埃希氏菌。

在本发明的一个优选实施例中，所使用的宿主微生物为大肠埃希氏菌，而且所用载体为T7启动子的表达载体。在进行发酵产酶的过程中，加入诱导剂诱导产酶。

本发明的N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的N末端带有4-8个组氨酸残基。在一个优选的实施例中，该酶的N末端带有6个组氨酸残基。该组氨酸残基可以是载体本身自带的，如pET载体系统，从而使该酶基因克隆入这类载体之后，能使所表达的蛋白N端带有组氨酸残基链。当使用不带有该组氨酸残基的载体系统时，可采用常规的方法，通过在引物中设计组氨酸残基链，并通过PCR扩增而得到本发明的在N末端带有组氨酸残基链的酶。

2.N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶

在本发明中，制备固定化酶所需的载体为亲和载体，酶与固定化载体结合的方式是通过重组菌表达的在N端带有组氨酸标记的酶与载体上的金属离子鳌和，从而达到固定化的目的。

用于本发明的亲和载体是本领域技术人员周知的，包括但不限于目前许多公司已经推出许多固定化金属螯合亲和层析载体，如Clontech、GE healthcare、Qiagen等公司。本发明优选的亲和载体以琼脂粉(Agar)为基质。琼脂粉可以从市场上购得，如上海双向西巴斯科技发展有限公司购得。通过也可由实验室自己用琼脂粉或琼脂糖制备亲和载体。这些制备技术是本领域技术人员周知的如可参见中国专利申请200410099305.9中描述的方法。

用于本发明的金属离子包括但不限于Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺等，优选的离子是Ni²⁺或Co²⁺。可使用这些金属离子的盐酸盐、硫酸盐等来提供这些金属离子。可采用本领域已知的螯合方法使金属离子与亲和载体螯合。这些方法包括但不限于使用如使用选自亚氨基二乙酸、氨三乙酸、N，N，N-三(羧甲基)乙二胺或羧甲基化天冬氨酸等的螯合剂将所述金属离子螯合到亲和载体上。螯合所需的条件如温度、离子强度等都是本领域已知的。

本发明制备N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶的方法包括，在适合于该醛缩酶与该金属螯合亲和载体结合的条件下使包含N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的溶液与金属螯合亲和载体接触；洗涤，得到所述N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶。

本发明对固定化酶的条件并无特殊限制。例如，温度通常是室温，如15-25℃，较佳17-23℃，优选18℃。可使用40-150mM、pH7.0-8.0的磷酸缓冲液，较佳的是45-100mM，更佳的是50-80mM。在一优选实施例中，使用50mM的磷酸缓冲液，pH为7.5。也可使用Tric-HCl缓冲液，其pH可以是7.0-8.0，较佳的是7.5。

固定化过程中，所采用的转速可以是100-180转/分。较佳的是，转速为140-160转/分。在一优选实施例中，转速为150转/分。

包含N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的溶液包括溶解有N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的溶液，如其水溶液，或其发酵液。如采用上述宿主发酵法获得的含有N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的发酵液、细胞裂解液等。

在获得该溶液后，可将其与本领域已知的金属螯合亲和载体接触，然后洗涤，即可一步纯化制得用于本发明的N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶。

在本文中，“一步纯化”指在使使细胞培养物与亲和载体接触后，直接冲洗该亲和载体、勿需进一步的分离纯化就可得到本发明的N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶。

3.底物

用于生产Neu5Ac的底物通常是N-乙酰甘露糖胺。在生产Neu5Ac的过程中，对N-乙酰甘露糖胺的纯度并无特殊的限制，其纯度可以是如50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上甚至100％。

另一底物是丙酮酸或其盐。所述盐包括丙酮酸的钠盐、钾盐等。对丙酮酸或其盐的浓度也无特殊限定。本领域技术人员根据实际需要可进行合理选择。

4.Neu5Ac的制备

如上述制得N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶后，可将其与底物N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸或其盐接触，在适合于该酶催化活性的条件下制备Neu5Ac。

通常反应在20-30℃的温度中进行，较佳的是，该温度为22-30℃。在一优选实施例中，该温度为28℃。转速通常为120-180转/分钟。

通常可使用水来配制丙酮酸或其盐与N-乙酰甘露糖胺的溶液。当然，也可使用其它溶剂来配制。可用的溶剂是本领域技术人员周知的。

此外，本发明测定酶活的方法也是本领域周知的。例如，本发明采用的测酶活方法包括：

(1)用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)稀释一定量的酶液，取0.25ml，预热10分钟，加入0.25ml预热的Neu5Ac溶液37℃反应10分钟。

(2)用10％三氯乙酸0.3ml终止反应，加入0.2ml水，加入0.2％2，4-二硝基苯肼0.4ml，摇匀，静置10分钟。

(3)加入3N的氢氧化钠1.5ml，摇匀，静置15分钟，12000rpm离心5分钟取上清液在550nm比色测定光吸收值。

然后根据下式计算酶活：

    酶活力(U)＝k×O.D.550×稀释倍数(倍)/(t×D)式中，k是用丙酮酸钠标准曲线的斜率，t是反应时间10min。

可采用常规的方法制备标准曲线，如可如下制备(25℃)：

1)配4mM丙酮酸钠溶液母液称取220mg丙酮酸钠溶于pH8.5 0.1M焦磷酸钠缓冲液中定容到500毫升，稀释成系列梯度(从0.05-0.8mM)；

2)取2毫升丙酮酸钠溶液加2，4-二硝基苯肼0.8毫升，混匀后放置10分钟；

3)加3N氢氧化钠3毫升，混匀后放置15分钟；

4)4000rpm离心10-15分钟上清液在550nm比色；

将所得数值作图即可得到标准曲线。

也可采用本领域已知的其它测酶活方法来测定本发明的酶活力。测定转化率的方法也是本领域周知的。简言之，在转化反应根据产物和初始底物得摩尔浓度比计算既可得到转化率。

本发明的发明人经过研究发现，使用亲和载体一步纯化制备得到的N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶可以使转化反应的时间缩短1/5，终产物更易分离。并且所使用的固定化酶可以反复使用多次，保存时间长，在工业生产上的意义较为巨大。

为了便于理解本发明，特列举以下实施例。其作用应被理解为是对本发明的诠释而并非对本发明的任何形式的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人编著的《分子克隆实验室手册》(New York：Cold Spring Harbour Labotatory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：源于E.coli TG1总DNA的N-乙酰神经氨酸醛缩酶(E.C.4.1.3.3)生成基因的获得及重组质粒pNA1的构建

使用下列引物

1：5’gacgctaccatggcaacgaatttacgt  3’

2：5’gatccagtcgactcgcccgcgctcttg  3’以E.coli TG1总DNA为模板，进行PCR扩增，PCR结束之后将回收的0.9kb的片断进行酸化处理，克隆到经Hinc II酶切的pUC 118质粒，命名为pNA，转化进E.coli DH5α感受态细胞。由X-ga1蓝白斑挑选重组子，并且酶切鉴定出正向的重组子。

以下列引物

1：5’ggaattccatatggcaacgaatttacgtggcg  3’

2：5’cgggatcctcacccgcgctcttgcatc  3’为引物，以质粒pNA为模板，进行PCR扩增，PCR结束之后将回收的0.9kb的片断经Nde I和BamH I双酶切，克隆进pET28b(+)载体质粒，使表达的目的蛋白N-端带有6个His。将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。在含有卡那霉素的LB平板上筛选，重组子DNA经测序验证与Genbank中N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因(编号：D00067)吻合。重组质粒命名为pNA1。提取重组质粒转化进E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到表达型工程菌BL21(DE3)/pNA1。

实施例2：工程菌BL21(DE3)/pNA1的发酵及N-乙酰神经氨酸醛缩酶亲和载体(Agar)固定化酶的制备

使用3L TB培养基(配制每升高浓度肉汤，在900ml去离子水中加入：细菌培养用蛋白胨12g；细菌培养用酵母提取物24g；甘油4ml。高压灭菌20分钟，然后使该溶液降温至60℃或60℃以下，再加入100ml经灭菌的0.17mol/LKH₂PO₄、0.72mol/L K₂HPO₄溶液)在5L发酵罐中发酵工程菌BL21(DE3)/pNA1，37℃培养约1h后，加入终浓度为1％的乳糖诱导，同时降温至22℃，诱导后2h再补加终浓度为0.5％的乳糖诱导，发酵约20小时左右收罐，8000rpm离心10分钟收集菌体。

将BL21(DE3)/pNA1发酵20h收得的菌体称取10g，加入20ml 0.5M pH7.5的磷酸钠缓冲液，重悬后压榨，压力为1500psi，共压榨两次，压榨后12000rpm离心40min，得到25ml N-乙酰神经氨酸醛缩酶粗酶液。

采用前述方法测定粗酶液酶活为320U/ml。

根据中国专利申请200410099305.9制备固定化载体Agar。具体而言，可如下制备本发明所使用的固定化载体Agar。

称取30克琼脂粉，按1g琼脂粉加50ml缓冲液的比例加入pH4.0、0.04mol/L醋酸缓冲液(醋酸钠—醋酸缓冲液)搅拌抽提，隔3小时更换一次缓冲液，二次抽提后过滤沉淀物，水洗3次后放置过夜。第二天，再按照上述比例用pH 9.0、0.05mol/L碳酸钠—碳酸氢钠缓冲液抽提，搅拌6小时并放置过夜。第三天，过滤沉淀物水洗沥干，再重复前一天的方法，水洗至中性，沥干，得到175g湿琼脂粉，再在其中加入175ml、1.6mol/L氢氧化钠溶液(含4g硼氢化钠)，于25℃边搅拌边加入57ml丙酮和28.5ml环氧氯丙烷，继续搅拌反应至2小时、4小时和8小时再分别加入28.5ml环氧氯丙烷。总共反应12小时后，用去离子水洗净至中性，沥干得到260g EPI-ARG。260g EPI-ARG中加入520ml、0.1mol/L碳酸钠溶液(含9％亚氨基二乙酸)，用6mol/L氢氧化钠调pH至11，25℃搅拌反应12小时，用去离子水充分洗净，沥得EPI-ARG-IDA。取20g EPI-ARG-IDA，加入80ml、50mmol/L、pH6.0磷酸钠缓冲液(含5mg/ml氯化钴、1mol/L氯化钠)，25℃搅拌反应12小时，用去离子水充分洗净沥干，即得到载体EPI-30-ARG-IDA-Co²⁺。

按照600U/g载体投上述固定化载体Agar，一步纯化固定化。放入三角瓶中密封充氮气于18℃、150rpm结合20小时。

取出固定化酶，使用0.5M pH7.5的磷酸钠缓冲液冲洗，抽干，得到固定化N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶颗粒。测定得酶活力为30U/g。

实施例3：SDS-PAGE分析

为测定全菌体中N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶可溶性蛋白的表达量，在TB发酵BL21(DE3)/pNA1的过程中取样，加SDS凝胶加样缓冲液，煮沸5分钟裂解细胞，12000rpm离心10min，取上清液20μl进行SDS-PAGE分析。去除上清液，以缓冲液重悬沉淀部分，并取20μl进行SDS-PAGE分析。

SDS-PAGE结果显示，还原条件下，N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶蛋白分子量为33KD。

图6显示了E.coli BL21(DE3)/pNA1表达产物的SDS-PAGE分析，其中，泳道1显示乳糖诱导前的E.coli BL21(DE3)/pNA1；泳道2显示无乳糖诱导的E.coli BL21(DE3)/pNA1泳道3显示MW标记物；泳道4显示乳糖泳道的E.coli BL21(DE3)/pNA1；泳道5显示声裂处理后的E.coli BL21(DE3)/pNA1的上清液；泳道6显示声裂处理后的E.coli BL21(DE3)/pNA1的沉积物。

实施例4：结晶

在上述固定化酶反应终止后，抽滤反应液，滤液12000rpm离心5min，去除颗粒杂质，加入7倍体积冰醋酸，加入稍许晶种，4℃放置4天。过滤收集结晶，丙酮淋洗，40℃干燥恒重。

菌体转化反应终止后，12000rpm离心5min去除菌体，加入1倍体积冰醋酸，12000rpm离心5min去除蛋白沉淀，再加入6倍体积(反应液)冰醋酸，加入稍许晶种，4℃放置4天。过滤收集结晶，丙酮淋洗，40℃干燥恒重。

实施例5：亲和载体(Agar)固定化酶转化实验

设定了四个梯度以亲和载体Agar进行N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的固定化，分别为：1000U/g载体，800U/g载体，600U/g载体，400U/g载体。该亲和载体是实施例2制得的固定化载体Agar。

固定化载体梯度	上清残留酶活(U/ml)	固定化酶活U/g载体	表观酶活(减上清)％	表观酶活(不减上清)％
					400U/g载体	2.3893	28.77	7.6	7.2
600U/g载体	6.3787	30.39	6.1	5.1
					800U/g载体	11.5957	34.00	6.0	4.3
1000U/g载体	14.9275	36.28	6.0	3.6

以这四个梯度的N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶进行转化反应。

反应条件：固定化酶∶底物＝1∶10(W/V)。各称取30mg固定化酶，加入0.3ml底物，底物中丙酮酸的浓度为1.2M，N-乙酰甘露糖胺的浓度为0.8M，pH7.5，28℃、160rpm反应，每小时取样。图1显示了试验结果。

		固定化酶梯度
						400U/g	600U/g	800U/g	1000U/g
		转化率(％)	1h	42.77	54.13					62.03	62.77
2h	69.86					80.24	86.01	87.16
			3h	84.35	90.09				92.05	92.82
4h	90.21					92.72	93.35	93.61
			5h	92.77	93.25				93.26	93.70

实施例6：亲和载体(Agar)固定化酶与以纯度100％N-乙酰甘露糖胺为底物不同比例下的转化反应

反应条件：以水配制底物丙酮酸钠和N-乙酰甘露糖胺，pH7.5，28℃，转速150转/分反应条件：底物为1.2M丙酮酸钠，0.8M100％N-乙酰甘露糖胺，载体为实施例5制得的600U/g N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶。图2显示了试验结果。

1)固定化酶0.5g∶底物5ml(1∶10，W/V)，转化反应6小时结束，转化率为92.85％

2)固定化酶0.5g∶底物10ml(1∶20，W/V)，转化反应10小时结束，转化率为93.31％

3)固定化酶0.5g∶底物15ml(1∶30，W/V)，转化反应14小时结束，转化率为93.06％

实施例7：亲和载体(Agar)固定化酶与以80％N-乙酰甘露糖胺为底物不同比例下的转化反应

在三个5ml底物反应体系里，底物为1.2M丙酮酸钠，0.8M 80％N-乙酰甘露糖胺以及0.8M 20％N-乙酰葡萄糖胺，分别投入实施例5制得的N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶(Agar)(600U/g)湿重0.5g，0.25g及0.125，使得投入的固定化酶与底物的体积比例分别为1∶10、1∶20以及1∶40。以3N NaOH调pH至7.5。

如图3所示：

固定化酶∶底物为1∶10的反应，在24小时反应达到平衡，转化率为93.4％。

固定化酶∶底物为1∶20的反应，在40小时反应达到平衡，转化率为94.65％。

固定化酶∶底物为1∶40的反应，在72小时反应达到平衡，转化率为91.21％。

实施例8：亲和载体(Agar)固定化酶在不同底物浓度下的转化反应

在两个5ml底物反应体系里，投入实施例5制得的(600U/g)N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶湿重均为0.5g。其中一份底物为1.2M丙酮酸钠、0.8M80％N-乙酰甘露糖胺以及0.8M 20％N-乙酰葡萄糖胺；另一份底物为1.2M丙酮酸钠、0.8M纯度100％N-乙酰甘露糖胺。以3N NaOH调pH至7.5。

结果显示在图4中。图中，底物N-乙酰甘露糖胺纯度为100％，在7个小时反应达到平衡，转化率为93.37％；底物N-乙酰甘露糖胺纯度为80％，20％N-乙酰葡萄糖胺，在24小时反应达到平衡，转化率为93.4％。

实施例9：亲和载体(Agar)固定化酶与EupergitC固定化酶的比较

为了比较亲和载体制备的固定化酶与非亲和载体制备的固定化酶在固定化过程中，吸附效率及转化反应效率之间的差异，以亲和载体(Agar)固定化酶与EupergitC固定化酶(购自Degussa，德国)的比较为例。本发明亲和载体(Agar)固定化酶的制备如实施例2所述。

两种载体均按600U/g固定化酶投粗酶，粗酶酶活310.168U/ml。

亲和载体(Agar)：10g载体+20ml粗酶

Eupergitc：1.5g干载体+9ml粗酶+18ml pH8.0 1.25M磷酸钾缓冲液

两者都在18℃，150转/分，结合20h。

固定化酶载体	固定化酶活(U/g)	上清残留总酶活(U)	洗脱后总酶活(U)	表观酶活(％)
					Agar	29.9424	27.09312	11.96174	4.857
EupergitC	3.69957	2426.544	26.33688	4.916

反应条件：

底物：1.2M丙酮酸钠，0.8M 80％N-乙酰甘露糖胺和0.8M 20％N-乙酰葡萄糖胺

Agar固定化酶∶底物＝1∶4，即：0.5gAgar固定化酶∶2ml底物

EupergitC∶底物＝1∶4，即：0.5g EupergitC∶2ml底物

结果显示在图5中，其中，亲和载体Agar制备的固定化酶的转化反应在6小时结束，转化率为95.48％。Eupergitc载体制备的固定化酶的转化反应在72小时结束，转化率为94.58％。

实施例10：固定化酶连续反应转化率

在2ml底物反应体系里(底物为1.2M丙酮酸钠，0.8M 80％N-乙酰甘露糖胺以及0.8M 20％N-乙酰葡萄糖胺)投入实施例5制得的(600U/g)固定化酶0.5g，转化5次。

结果显示在图7中。

实施例11：酶法合成Neu5Ac的HPLC分析

82.3％纯度的ManNAc-Z粗品经酶促合成(采用实施例5制得的固定化酶制得，600U/g)得到的Neu5Ac晶体恒重后，与Sigma公司的同类商品(纯度95％)，作HPLC图谱比较，结果表明两者的出峰时间一致(7.77分)。但在本法制备的Neu5Ac结晶图谱中，除了Neu5Ac吸收峰外，7.24分处未发现存在有Sigma产品的杂质小峰(图8)。通过全波长扫描分析，表明Sigma产品和实验室结晶品的全波长扫描图谱有相同的特征(图9)。

本发明所涉及的多个方面已经作如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明之精神与范围的前提下，对上述描述的任何修饰都是允许的。同样，类似的情况也包括在权利要求中。

Claims (10)

1.一种制备N-乙酰-D-神经氨酸的方法，其特征在于，该方法包括，以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸或其盐作为底物，使用N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的金属螯合亲和载体固定化酶进行催化，从而制得N-乙酰-D-神经氨酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和载体用琼脂粉制得，所述金属离子选自Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的N末端具有4-8个组氨酸残基。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的N末端具有6个组氨酸残基。

5.一种N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶，其特征在于，它包括金属螯合亲和载体和与之结合的N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶，其中，该N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的N末端具有4-8个组氨酸残基。

6.如权利要求5所述的N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶，其特征在于，所述N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的N末端具有6个组氨酸残基。

7.如权利要求5所述的N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶，其特征在于，所述金属螯合亲和载体包含选自Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺的金属离子。

8.一种制备权利要求5所述的N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶的方法，其特征在于，该方法包括：

使包含N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的溶液与金属螯合亲和载体接触；

洗涤，得到所述N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述溶液是含N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的发酵液。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的N末端具有4-8个组氨酸残基，所述金属螯合亲和载体是螯合了选自金属离子Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺的亲和载体。

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