CN105349516A - 苏氨酸脱氨酶、编码基因、载体、工程菌及应用 - Google Patents

苏氨酸脱氨酶、编码基因、载体、工程菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种苏氨酸脱氨酶、编码基因、载体、工程菌及应用，本发明中所述α-丁酮酸的制备方法具有催化能力高底物累积可达600g/L以上，转化率达95％以上、反应条件温和、环境友好等优点，在35℃条件下对L-苏氨酸脱氨酶的酶活达到10156.5U/g，L-苏氨酸的转化率达到100％，为α-丁酮酸的大规模生产并为其作为前体的系列关键手性中间体提供了良好的技术支持，具有较高的工业化应用潜力。

Description

苏氨酸脱氨酶、编码基因、载体、工程菌及应用
(一)技术领域
本发明涉及苏氨酸酶基因、载体，和产苏氨酸脱氨酶基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程领域。
(二)技术背景
苏氨酸脱氨酶(Threoninedeaminase，简称TD，EC4.3.1.19)，又称苏氨酸脱水酶，是生物体内氨基酸代谢的重要酶类，能够催化L-苏氨酸或L-丝氨酸脱氨生成α-丁酮酸或丙酮酸，尤其是在生物催化生产α-丁酮酸的工艺中具有关键的作用。α-丁酮酸是一种是生产L-2-氨基丁酸、L-异亮氨酸、正丙醇、D-2-羟基丁酸以及食品配料的重要原材料，尤其是L-2-氨基丁酸，作为抗癫痫药物左乙拉西坦和抗结核药物盐酸乙胺丁醇的重要前体，受到广泛的关注。
目前已经有一些苏氨酸脱氨酶的报道，例如来自于施氏假单胞菌PseudomonasstutzeriSDM的苏氨酸脱氨酶，其最高的底物浓度为30g/L。然而，这些苏氨酸脱氨酶对高底物浓度的耐受能力较弱，大大限制了其在工业生产中的应用。因此筛选出新型的表达耐高底物浓度的苏氨酸脱氨酶基因，并通过基因工程技术构建高表达的基因工程菌在α-丁酮酸的制备中具有重要的意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种新的能够催化L-苏氨酸制备α-丁酮酸的苏氨酸脱氨酶，而且该酶具有更高的催化活力和底物耐受能力，更适用于工业化制备该中间体，解决了一般的苏氨酸脱氨酶最适底物浓度低的问题；应用该菌种生产苏氨酸脱氨酶具有产量高、工艺简单、便于工业化应用等优点，该菌株可以直接用于α-丁酮酸的生产，而不需细胞破碎。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的苏氨酸脱水酶(记为EcTD)，所述苏氨酸脱水酶的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示。
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任何对SEQIDNO：1所示氨基酸序列中氨基酸进行缺失、插入或替换的处理获得的多肽片段或其变体，只要其与SEQIDNO：1所示氨基酸序列具有95％以上同源性，均属于本发明的保护范围。
进一步，为实现EcTD在大肠杆菌等原核生物中的可溶性异源表达，通过基因工程常规操作，以全合成的方法获得了对应于所述SEQIDNO：1氨基酸序列的该苏氨酸脱氨酶的核苷酸序列，如SEQIDNO：2所示。
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任何对SEQIDNO：2所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸序列具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。
本发明提供一种由所述重组苏氨酸脱氨酶编码基因构建的重组载体。
本发明还提供一种由所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
本发明涉及所述苏氨酸脱水酶编码基因在制备苏氨酸脱水酶中的应用，所述的应用为：构建含有所述苏氨酸脱氨酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，诱导培养，从培养液中分离得到含有重组苏氨酸脱氨酶的菌体细胞。
本发明将苏氨酸脱氨酶基因EcTD同表达载体pET-28b(+)连接，构建了含有苏氨酸脱氨酶基因的表达重组质粒。将表达重组质粒pET-28b(+)-EcTD转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，获得含有重组质粒pET-28b(+)-EcTD的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b(+)-EcTD。以重组菌为酶源，进行生物催化。具体地，将重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-EcTD接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃培养10h，再以1.5％接种量(v/v)接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600约0.8左右，再向LB液体培养基中加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养10h后，将培养液在4℃、10000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体，即为含有胞内表达重组苏氨酸脱氨酶的大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-EcTD湿菌体。
本发明还涉及所述的苏氨酸脱氨酶在生物催化L-苏氨酸制备α-丁酮酸中的应用，具体地，所述的应用为：以含苏氨酸脱水酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以L-苏氨酸为底物，以pH值4.0-10.0的缓冲液为反应介质，在15～50℃、150-200rpm条件下进行催化反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到α-丁酮酸。
反应式如下：
进一步，所述缓冲液优选pH7.0的磷酸钠缓冲液。
进一步，所述反应体系中底物初始浓度为100～600g/L，优选120～480g/L，最优选240g/L。
进一步，所述反应体系中生物催化剂的质量用量以湿菌体的重量计为5～50g/L，优选5～30g/L，最优选10g/L，所述湿菌体含水质量为70～90％。
进一步，所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液离心去除大肠杆菌细胞，上清液减压蒸馏至1/2体积，除去反应液中残留的氨，80℃保温40min，使蛋白质变性，离心去除变性蛋白；为了更好地去除培养基和细胞内含物残留的色素，加热时可以在反应中加入少量的活性炭脱色，再用循环水式真空泵进行抽滤，收集澄清的滤液；然后进行旋转蒸发除去水，得到α-丁酮酸。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种制备α-丁酮酸的苏氨酸脱氨酶；本发明中所述α-丁酮酸的制备方法具有催化能力高底物累积可达600g/L以上，转化率达95％以上、反应条件温和、环境友好等优点，在35℃条件下对L-苏氨酸脱氨酶的酶活达到10156.5U/g，L-苏氨酸的转化率达到100％，为α-丁酮酸的大规模生产并为其作为前体的系列关键手性中间体提供了良好的技术支持，具有较高的工业化应用潜力。
(四)附图说明
图1为pET28b-EcTD重组质粒物理图谱。
图2为苏氨酸脱氨酶SDS-PAGE图；其中泳道2为蛋白质分子量Marker，泳道1为细胞破碎上清液。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实施例所用主要实验材料来源为：
大肠杆菌宿主菌株E.coliBL21(DE3)购自Invitrogen公司，表达载体pET28b(+)购自Novagen公司，限制性内切酶NcoI和XhoI购自Fermentas公司，T4DNA连接酶和卡那霉素均购自大连宝生物有限公司，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)为Promega公司产品，DNAMarker和染色剂GoldView购自TaKaRa公司，AxygenDNA凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、PCR纯化试剂盒购自Axygen生物技术有限公司。
本发明实施例所述LB平板培养基组成为(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，琼脂20，溶剂为水，pH值自然。
本发明所述LB液体培养基组成为(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，溶剂为水，pH值自然。
实施例1：苏氨酸脱氨酶EcTD氨基酸序列、核酸序列的获得
利用蛋白质PDB和NCBI数据库数据对苏氨酸脱氨酶基因序列进行筛选，得到一个苏氨酸脱氨酶基因。该苏氨酸脱氨酶来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)，根据该苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列，并依据大肠杆菌偏好的密码子进行密码子优化，根据表达载体pET28b(+)的特点设计了酶切位点XhoI和NcoI，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了该段苏氨酸脱氨酶基因EcTD(SEQIDNO：2所示)，编码酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。
实施例2：重组表达载体pET28b(+)-EcTD的构建以及重组工程菌的构建
利用XhoI和NcoI限制性内切酶对实施例1合成的苏氨酸脱氨酶基因EcTD片段进行双酶切以及回收处理，并利用T4DNA连接酶将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pET28b(+)在16℃下进行连接16h，从而构建得到胞内重组表达载体pET28b(+)-EcTD，结果见图1所示。将构建的胞内表达载体pET28b(+)-EcTD转化至E.coliBL21(DE3)(Invitrogen)受体菌中，涂布于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB琼脂平板上，37℃下培养过夜，第二天于平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图2所示，筛选获得重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-EcTD。
实施例3：含有苏氨酸脱氨酶基因EcTD菌体细胞的制备
将实施例2构建的重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-EcTD接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃培养10h，再以1.5％接种量(v/v)接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600约0.8左右，再向LB液体培养基中加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养10h后，将培养液在4℃、10000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体，即为含有胞内表达重组苏氨酸脱氨酶的大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-EcTD湿菌体。
实施例4：重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-EcTD在α-丁酮酸制备中的应用
在本实施例中，按照实施例3方法获得含有胞内表达重组苏氨酸脱氨酶的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-EcTD湿菌体作为酶源，以L-苏氨酸为底物，进行生物转化反应制备α-丁酮酸。转化体系组成及转化操作如下：在10mL磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)中加入0.1g湿菌体和2.40gL-苏氨酸构成反应体系。35℃、180rpm条件下反应，每隔1h取样，每次取300μL样品，离心(12000×g，2min)，吸取上清，样品稀释后供氨基酸分析仪分析。反应10h，L-苏氨酸转化率达到为99.5％。
反应液中L-苏氨酸的含量由自动氨基酸分析仪测定。氨基酸分析仪的型号为S-433D(SYKAM，Germany)，所用分离柱为钠系统分离柱(蛋白水解用)。色谱条件为：进样量50.0μL，采用标准蛋白水解分离程序。
酶活单位定义：在一定的反应条件下，每min催化1μmolL-苏氨酸所需的酶量为1U。
实施例5：重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-EcTD在α-丁酮酸制备中的应用
在本实施例中，以按照实施例3方法获得的重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-EcTD为酶源，在100mLTris-HCl缓冲液(pH＝6.5)中加入0.5g湿菌体(终浓度5g/L)和24.0gL-苏氨酸构成反应体系。40℃、180rpm条件下反应，每隔1h取样，每次取300μL样品，离心(12000×g，2min)，吸取上清，样品稀释后供氨基酸分析仪分析。反应14h，转化率达到99.0％。
实施例6：重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-EcTD在α-丁酮酸制备中的应用
在本实施例中，以按照实施例3方法获得的重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-EcTD为酶源，在10mL磷酸钠缓冲液(pH＝6.0)中加入0.1g湿菌体(终浓度10g/L)和4.8gL-苏氨酸构成反应体系。25℃、200rpm条件下反应，每隔1h取样，每次取300μL样品，离心(12000×g，2min)，吸取上清，样品稀释后供氨基酸分析仪分析。反应20h，转化率达到95％。
实施例7：重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-EcTD在α-丁酮酸制备中的应用
在本实施例中，以按照实施例3方法获得的重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-EcTD为酶源，在10mLTris-HCl缓冲液(pH＝7.0)中加入0.05g湿菌体(终浓度5g/L)和1.2gL-苏氨酸构成反应体系。45℃、180rpm条件下反应，每隔1h取样，每次取300μL样品，离心(12000×g，2min)，吸取上清，样品稀释后供氨基酸分析仪分析。反应3h，转化率达到98％。
实施例8：重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-EcTD在α-丁酮酸制备中的应用
在本实施例中，按照实施例3方法获得的重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-EcTD作为生物催化剂，在20mLTris-HCl缓冲液(pH＝6.0)中加入0.6g湿菌体(终浓度分别为30g/L)，底物L-苏氨酸12g构成反应体系。35℃、180rpm条件下反应，每隔1h取样，每次取300μL样品，离心(12000×g，2min)，吸取上清，样品稀释后供氨基酸分析仪分析。反应30h，转化率分别达到95.0％。
实施例9：α-丁酮酸的提取
按照实施例5获得的转化液，离心去除大肠杆菌细胞，上清液减压蒸馏至1/2体积，除去反应液中残留的氨。80℃保温40min，使蛋白质变性，离心去除变性蛋白；为了更好地去除培养基和细胞内含物残留的色素，加热时可以在反应中加入少量的活性炭脱色，再用循环水式真空泵进行抽滤，收集澄清的滤液。然后进行旋转蒸发除去水，得到α-丁酮酸，纯度在98％以上。
由上述实验结果可知，本发明得到的含有苏氨酸脱氨酶基因的重组大肠杆菌具有较强的催化水解能力，可直接以含酶的菌体细胞为酶源进行生物催化或者转化反应。苏氨酸脱氨酶EcTD作为生物催化剂，可以利用L-苏氨酸为底物，进行生物转化反应制备α-丁酮酸。针对本发明得到的重组基因工程菌可通过发酵，进一步扩大反应体系，具有很大的工业化应用前景。
上述实施例只为说明本发明的技术特点以及构思，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种苏氨酸脱水酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示。
2.一种权利要求1所述苏氨酸脱水酶的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO：2所示。
3.一种由权利要求2所述苏氨酸脱水酶编码基因构建的重组载体。
4.一种由权利要求3所述重组载体转化获得的重组基因工程菌。
5.一种权利要求2所述苏氨酸脱水酶编码基因在制备苏氨酸脱水酶中的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述苏氨酸脱氨酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，诱导培养，从培养液中分离得到含有重组苏氨酸脱氨酶的菌体细胞。
6.一种权利要求1所述苏氨酸脱水酶在催化L-苏氨酸制备α-丁酮酸中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用以含苏氨酸脱水酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以L-苏氨酸为底物，以pH值4.0-10.0的缓冲液为反应介质，在15～50℃、150-200rpm条件下进行催化反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到α-丁酮酸。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为5～50g/L，所述底物用量以缓冲液体积计为100～600g/L。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述缓冲液为pH值7.0的磷酸钠缓冲液。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液离心，上清液减压蒸馏至1/2体积，80℃保温40min，离心，上清液旋转蒸发除去水，取浓缩物得到α-丁酮酸。
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