CN1226628C - 一种蛋白质芯片及其制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属分子生物学技术领域，具体涉及一种蛋白质芯片及其制备方法。该蛋白质芯片是在固体基质表面通过共价结合交联金属离子螯合物，在碱性条件下金属离子螯合物与金属离子螯合，蛋白质分子通过其末端的组氨酸标记(His-tag)与上述金属离子螯合，定向结合于固体基质表面而构成。这种非共价的结合方式是可逆反应，因此固体基质可以重复利用。固定于这种蛋白质芯片上的蛋白质可以进行各种生化反应，可应用于生命科学研究、疾病诊断和药物筛选等领域，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种蛋白质芯片及其制作方法。具体讲，涉及一种利用金属离子螯合物(nitrilotriacetic acid(NTA))定向固定带有组氨酸标记蛋白质的蛋白质芯片及其制作方法，这种芯片可以进行各种生化反应，可用于生命科学研究、疾病诊断和药物筛选等。
背景技术
近年来，飞速发展的生物技术带动了传统的疾病诊断方式以及药物筛选方式的革新。由于芯片技术具有快速、微量、准确、便捷和高通量等优点，从而受到高度重视。生物芯片有基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室三类。基因芯片可测定基因表达情况或基因突变情况，通常需要使用核酸体外扩增技术。蛋白质芯片是检测蛋白质之间相互作用的生物芯片，目前研究中的蛋白质芯片技术大多基于受体配体特异结合的原理，将多种蛋白质结合在固相基质上，检测生物中所含有的可与之专一性结合的对应蛋白质。在药物筛选方面，蛋白质芯片有其不可取代的优势。
蛋白质芯片制作的关键是如何将活性蛋白质以定向固定于基质表面，现在常用的固相支持物有玻片、塑料、多孔硅、聚苯乙烯、硝酸纤维膜、尼龙膜等材料，常见的固着方式有吸附，基质表面改性等方法。其中，塑料材质多利用分子吸附的性质固定大分子，如聚苯乙烯及聚氯乙烯膜均因具有静电吸引力而利于较大分子的吸附，但这种吸附的固着效果不佳，易造成大分子的剥离。硝酸纤维膜及尼龙膜主要是具有微孔的特性，有助于蛋白质分子的吸附，但硝酸纤维膜及尼龙膜不具透光性，不易应用于芯片，且蛋白质以任意方向吸附于膜上，使其固定方向多样，不利于配体受体作用位点的暴露。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种蛋白质芯片，利用金属离子螯合物和组氨酸标记(His-tag)方便地定向固定目标蛋白质。
本发明的另一目的在于提供一种有效的节省成本的蛋白质芯片的制作方法，克服了现有方法制作的蛋白质芯片中蛋白质定位方向各异、蛋白质结合强度较小等缺点，使用较简便的方法即可把带有组氨酸标记的蛋白质定向固定于固体基质表面。
本发明提出的蛋白质芯片，由固体基质和蛋白质结合组成，其中，在固体基质表面交联有金属离子螯合物，蛋白质带有组氨酸标记，并通过金属离子介导定位于固体基质上。这里金属离子螯合物通过其C末端的三个羧基与金属离子螯合。蛋白质的组氨酸标记(His-tag)可以是在蛋白质的N端或C端，蛋白质N端或C端的组氨酸标记可与上述金属离子螯合，从而使蛋白质定向固定于玻片上。
本发明的蛋白质芯片中，金属离子螯合物可以是一类N端为-NH2，C端为-CH(COOH)N(CH2COOH)2，中间为任何有机基团(包括苯基)的化合物；固体基质可以选自玻片、聚苯乙烯、硝酸纤维膜、尼龙膜、塑料、多孔硅等；金属离子可以是Ni2+、Cu2+、Fe3+等之一种。
本发明的蛋白质芯片，蛋白质表面的组氨酸标记通过金属离子介导与金属离子螯合物结合，从而定向固定于固体基质(如玻片)表面。固体基质表面接有有机化合物金属离子螯合物，使蛋白质与玻片之间有一定的空间距离，而且该螯合物为亲水化合物，利于蛋白质以正确的立体构象存在；此种结合蛋白质的方式有一定的选择性，减少了非特异结合的情况；通过金属离子与带有6个组氨酸的蛋白质螯合的结合强度较大，蛋白质不易脱落；此种结合方式是可逆的，高浓度咪唑可将结合于玻片上的蛋白质洗脱下来，使得本发明制得的蛋白质芯片具有另一优点，即制作好的芯片可以重复利用，有效节省成本。
本发明还提出上述蛋白质芯片的制作方法。在金属离子螯合物固定于固体基质表面之前，可先对基质进行预处理，预处理的方法可以是将基质醛基化或羧基化，然后金属离子螯合物N端的氨基与预处理后的基质(如玻片)进行反应从而共价结合于玻片表面。具体的步骤如下：
(1)将经清洗的固体基质进行醛基化或羟基化预处理，具体可先后经硅烷化剂、还原剂和氧化剂处理，使其表面形成活性基团(Nathalie Zammatteo，Laurent Jeanmart，Sandrine Hamels，Stephane Courtois，Pierre Louette，Laszlo Hevesi，and Jose Remacle(2000)Comparison betweenDifferent Strategies of Covalent Attachment of DNA to Glass Sufaces to Build DNA Microarrays.Analytical Biochemistry.280，143-150)；(2)将经活化的基质浸于5mM-50mM的所述金属离子螯合物溶液中，室温孵育0.5-2小时；(3)再浸于5mM-0.1M的所述金属离子溶液中5-30分钟；(4)用pH7.5以上的缓冲液平衡10-30分钟；(5)然后即可把带有组氨酸标记的蛋白质点于其上，置于20℃水浴箱温育30-60分钟，蛋白质即可结合于固体基质上。此过程中，为保证蛋白样品的活性，在样品中可加入其40-60％重量的甘油。温育结束后即可利用芯片进行下一步的检测。
上述方法中，pH7.5以上的缓冲液可以采用PBS(磷酸缓冲液)、TBS(三羟甲基氨基甲烷缓冲液)或Hepes(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸缓冲液)等缓冲液。
具体实施方式
实施例1醛基化固定NTA制作蛋白质芯片
(一)玻片清洁
1、将玻片浸于溶液(1/330％H2O2，2/3 18M H2SO4)中30分钟。
2、用去离子水漂洗1次。
3、于沸水中煮10分钟。
4、氩气干燥。
(二)醛基化
1、玻片浸于1mM TETU(CL3Si(CH2)10COOCH2CF3，溶于甲苯)中1小时，于新鲜甲苯中连续超声波洗三次(10分钟/次)。
2、氩气干燥。
3、于200mM LiALH4(溶于无水乙醚)中浸2小时。
4、于10％HCL中浸1小时。
5、去离子水中漂洗2次，丙酮中漂洗一次。
6、120℃烘10分钟。
7、于100mM PCC(氯铬酸吡啶(pyridinium chlorochromate，溶于二氯甲烷)中浸2小时。
8、于新鲜二氯甲烷中连续超声波洗三次(10分钟/次)。
9、于去离子水中超声波洗5分钟。
10、氩气干燥。
(三)NTA的固定
1、玻片浸于5mM NTA(氨三乙酸)(溶于0.1M pH6.5的MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸)缓冲液)中，于20℃水浴箱中温育1小时。
2、大量去离子水漂洗。
(四)NTA化后蛋白质的固定
NTA化的玻片浸于5mM NiSO410分钟，大量去离子水浸洗后，PBS平衡10分钟，带有组氨酸标记的蛋白质点于其表面，置于20℃水浴箱中温育30-60分钟，蛋白质即可结合于玻片上。
实施例2羧基化固定NTA制作蛋白质芯片
1.将玻片浸于溶液(1/330％H2O2，2/3 18M H2SO4)中30分钟。
2.用去离子水漂洗1次。
3.于沸水中煮10分钟。
4.氩气干燥。
5.玻片浸于10mM TETU(CL3Si(CH2)10COOCH2CF3)中1小时，于新鲜甲苯中连续超声波洗三次(10分钟/次)。
6.氩气干燥。
7.浸于8M HCL中95℃反应2小时。
8.于去离子水中超声波洗三次(10分钟/次)。
9.氩气干燥。
10.玻片浸于5mM NTA(NTA溶于0.1M pH6.5的MES缓冲液中，MES缓冲液中包括5mM EDC(碳化二胺)，0.33mM NHSS(N-hydroxysulfosuccini-mide，N羧磺酰琥珀酰亚胺)中，于20℃水浴箱中温育2小时，固定NTA。
11.大量去离子水漂洗。
蛋白质的固定方式同实施例1。
Claims (6)
1、一种蛋白质芯片，由固体基质和蛋白质结合组成，其特征在于固体基质表面上交联有金属离子螯合物，蛋白质带有组氨酸标记，并通过金属离子介导定位于固体基质上；金属离子螯合物通过其C末端的三个羧基与金属离子螯合；蛋白质的组氨酸标记在蛋白质的N端或C端，蛋白质N端或C端的组氨酸标记与上述金属离子螯合，使蛋白质定向固定于玻片上；所述金属离子螯合物是N端为-NH2，C端为-CH(COOH)N(CH2COOH)2，中间为任何有机基团的化合物。
2、根据权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于固态体基质选自玻片、塑料、多孔硅、尼龙膜、聚苯乙烯、硝酸纤维膜之一种。
3、根据权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于金属离子是Ni2+、Cu2+、Fe3+之一种。
4、一种如权利要求1所述的蛋白质芯片的制作方法，其特征在于以简便的方式将带有组氨酸标记的蛋白质定向固定于芯片表面，具体步骤如下：(1)将经清洗的固体基质进行醛基化或羟基化预处理，具体先后经过烷化剂、还原剂和氧化剂处理，使其表面形成活性基团；(2)将经活化的基质浸于5mM-50mM的金属离子螯合物溶液中5-30分钟，室温孵育0.5-2小时；
(3)将此基质浸于5mM-0.1M金属离子溶液中5-30分钟；(4)用pH7.5以上的缓冲液平衡10-30分钟；(5)然后把带有组氨酸标记的蛋白质点于其上，置于20℃水浴箱温育30-60分钟。
5、根据权利要求4所述的蛋白质芯片的制作方法，其特征在于蛋白质样品中加有其40-60％重量的甘油。
6、根据权利要求4所述的蛋白质芯片的制作方法，其特征在于所述pH7.5以上的缓冲液为磷酸缓冲液，三羟甲基氨基甲烷缓冲液或N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸缓冲液。
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