CN115193422B - 基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱及其制备方法和应用 - Google Patents

基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于天然纳米盘SMALP的His‑tag键合型细胞膜色谱柱及其制备方法和应用，属于跨膜蛋白受体固定化工程技术领域。该方法首先水解苯乙烯马来酸酐共聚物得到SMA，将SMA增溶提取单个膜蛋白形成SMALP；接着制备乙烯砜键合硅胶，然后将乙烯砜键合硅胶与SMALP反应，膜蛋白上的His‑tag标签可特异性地与乙烯砜基发生共价键合反应，得到SMALP‑His‑tag键合型细胞膜固定相；最后将固定相通过湿法装柱得到细胞膜色谱柱。该方法制备的细胞膜色谱柱生物识别活性准确度高、蛋白活性位点朝向统一、与载体结合牢固，弥补了现有细胞膜色谱缺乏对蛋白的结构准确度和种类特异性控制的缺陷，提高了其生物识别的准确度、灵敏度和稳定性。

Description

基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱及其制 备方法和应用
技术领域
本发明属于跨膜蛋白受体固定化工程技术领域，具体涉及一种基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白质-蛋白质或蛋白质-配体相互作用在生物识别研究中具有广泛应用需求，生物识别的应用大多依赖于生物活性分子的固定，蛋白质的生化特性或活性被转移到材料表面，从而允许其与选择性靶标相互作用，如表面等离子共振的蛋白芯片、亲和色谱法的生物大分子固定相等。蛋白的活性、位点取向、偶联稳定性直接影响生物识别的效果，因此，选择合理的蛋白质固定化策略至关重要。
细胞膜色谱是一种将膜蛋白固定于固定相载体上的生物色谱分析技术，广泛应用于药物筛选、复杂体系活性组分识别、配体-受体相互作用研究等。细胞膜色谱技术常用的蛋白固定化策略有非共价吸附、位点非特异性化学键合、生物介导的固定化，然而目前的方法难以最大化兼顾蛋白活性、取向和偶联稳定性三个方面。其中，非共价吸附的蛋白结合可逆，造成蛋白易脱落；位点非特异性化学键合可发生在蛋白任意基团，蛋白取向随机使活性位点被掩蔽；生物介导的固定化使用的融合蛋白标签过大，表达过程中代谢负担高，干扰了目标蛋白活性。此外，目前吸附或键合到硅胶载体上的膜均为细胞膜片段，不可避免包含诸多非目标受体，尚未有一种方法实现种类单一的特异性膜蛋白的键合，这些缺陷的存在限制了细胞膜色谱生物识别的灵敏度和准确性。
近年来，发展出一种利用苯乙烯马来酸(SMA)共聚物的膜蛋白纯化技术，可将单个膜蛋白及其相关脂质从细胞膜上分离，并被SMA包围自发形成脂质颗粒(SMALP)，得到完整的膜蛋白并且保持其天然结构和活性。截至目前，SMA主要应用于蛋白的结构和功能研究，如利用SMALP和冷冻电镜测定膜蛋白高分辨率结构、膜蛋白的质谱分析等，将SMA用于蛋白固定化材料还需克服SMALP固定化的挑战。His-tag是一种0.84KD的蛋白融合标签，其分子量小几乎不影响蛋白质天然结构。因His-tag与金属离子形成的配位键是可逆的，所以常用于重组蛋白的纯化，将His-tag用于蛋白固定化、替代细胞膜色谱固定相中的大融合蛋白标签，以最大化保持蛋白质生物活性，需解决His-tag与固定基质的结合力弱的困难。
因此，基于目前尚无关于天然纳米盘SMALP与His-tag的跨膜蛋白受体固定化技术的报道，为提高细胞膜色谱固定相灵敏度和准确性，特此建立一种基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱制备方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱及其制备方法和应用，该细胞膜色谱固定相的蛋白结构更接近天然结构，活性高、位点特异性强、寿命更长，制备而成的色谱柱生物识别效能高、准确性强、稳定性好；该制备技术操作简单，易于实现。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱的制备方法，包括：通过水解苯乙烯马来酸酐共聚物得到SMA，将SMA加入到膜悬液中增溶提取单个膜蛋白形成SMALP，将SMALP与乙烯砜键合硅胶反应，使膜蛋白上的His-tag标签与乙烯砜基共价键合，得到SMALP-His-tag键合型细胞膜固定相，再经湿法装柱，制得基于天然纳米盘SMALP的键合型细胞膜色谱柱。
优选地，上述制备方法，具体包括以下步骤：
1)将苯乙烯马来酸酐共聚物水解成为苯乙烯马来酸共聚物SMA，将二乙烯基砜键合到氨基化硅胶上，制得乙烯砜基硅胶；
2)培养His-tag融合蛋白高表达细胞，当细胞计数达到107个时，离心去除培养基获得细胞，超声破碎后离心得到细胞膜，将细胞膜混悬于SMA增溶缓冲液中，加入SMA，室温反应后离心，得到SMALP溶液；
3)将SMALP溶液与乙烯砜基硅胶混合，室温下振荡反应，得到SMALP-His-tag键合型细胞膜固定相；
4)将SMALP-His-tag键合型细胞膜固定相采用湿法装柱获得基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱。
进一步优选地，步骤1)中，苯乙烯马来酸共聚物SMA具体制备方法如下：在室温下，按照1g：10mL的用量比，将苯乙烯马来酸酐共聚物粉末与1M的NaOH溶液充分混匀，得到混合溶液，将该混合溶液加热至沸点后继续回流处理2h，结束后待其冷却，然后加入浓盐酸，充分混合以沉淀出聚合物，洗涤沉淀，采用0.6M的NaOH溶液溶解沉淀，并调节pH值至8.0，冷冻干燥得到苯乙烯马来酸共聚物即SMA粉末。
更进一步优选地，步骤1)中，采用二乙烯砜与氨基的迈克尔加成反应制备乙烯砜基硅胶，使用三苯基膦作为催化剂。
进一步优选地，步骤2)中，将离心去除培养基获得的细胞用含蛋白酶抑制剂的低渗缓冲液混悬后进行超声破碎，然后通过差速离心分离，得到细胞膜；其中，所述含蛋白酶抑制剂的低渗缓冲液，包括：20mM PBS，2mM EDTA和2μL/mL蛋白酶抑制剂PMSF，pH值为7.4。
进一步优选地，SMA增溶缓冲液包含：20mM PBS(pH 7.4)，2mM EDTA和2μL/mL蛋白酶抑制剂。
进一步优选地，所述His-tag融合蛋白高表达细胞采用ACE2-His-tag HEK293高表达细胞。
进一步优选地，步骤3)中，将乙烯砜基硅胶与SMALP溶液混合后，于室温下振荡反应12h，然后5000r离心处理10min，去除未结合的蛋白，再经过重悬处理，制得SMALP-His-tag键合型细胞膜固定相。
进一步优选地，将乙烯砜基硅胶加至SMALP溶液中，使其浓度为1.25％(w/v)。
本发明还公开了采用上述的制备方法制得的基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱。
本发明还公开了上述的基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱在筛选药物活性成分中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开的基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱将乙烯砜键合到硅胶上，再用SMA提取单个膜蛋白，利用膜蛋白上的His-tag标签特异性于乙烯砜基反应形成共价键，从而将SMALP-His-tag融合蛋白固定于硅胶载体表面。一方面，该技术使用的SMA分离得到单个膜蛋白，不含非目的蛋白，排除杂蛋白的非特异性干扰；且膜蛋白周围保留了稳定蛋白三维结构的磷脂双分子层，最大化地保留了天然膜蛋白的构象与功能，弥补了现有技术在蛋白特异性和结构准确性控制方面的空白。另一方面，本发明使用的His-tag标签分子量为0.84KD，几乎不影响目标蛋白表达，蛋白结构更接近与天然结构，生物活性更强。
附图说明
图1为SMALP-His-tag键合型细胞膜色谱柱制备流程图；
图2为苯乙烯马来酸酐共聚物(SMAnh)水解产生SMA的红外光谱验证；
图3为SMA增溶提取膜蛋白效率的Western blot验证；
图4为氨基硅胶(NH2-SiO2)，乙烯砜修饰硅胶(VS-NH-SiO2)、键合细胞膜硅胶(ACE2-His-SMALP@VS-NH-SiO2)的X射线光电子能谱图；其中，(a)为XPS的全谱扫描图；(b)为C的精细扫描图；(c)为N的精细扫描图；(d)为S的精细扫描图；(e)为O的精细扫描图；(f)为P的精细扫描图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
参见图1，本发明提供一种基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱的制备方法，首先水解苯乙烯马来酸酐共聚物得到SMA，将SMA加入到膜制剂溶液中增溶提取单个膜蛋白形成SMALP；接着制备乙烯砜键合硅胶，然后将乙烯砜键合硅胶与SMALP溶液混合反应，膜蛋白上的His-tag标签可特异性地与乙烯砜基发生共价键合反应，得到SMALP-His-tag键合型细胞膜固定相；最后将固定相通过湿法装柱得到天然纳米盘SMALP-His-tag键合型细胞膜色谱柱。
该天然纳米盘SMALP-His-tag键合型细胞膜色谱柱是经SMA分离得到的单个膜蛋白后通过His-tag键合于乙烯砜基硅胶上，SMALP形式保持了膜蛋白天然结构稳定，且排除了杂蛋白的干扰，his-tag相较于目前的大融合蛋白对目标膜蛋白表达和结构影响极小，该方法制备的细胞膜色谱柱生物识别活性准确度高、蛋白活性位点朝向统一、与载体结合牢固，弥补了现有细胞膜色谱柱缺乏对蛋白的结构准确度和种类特异性控制的缺陷，提高了其生物识别的准确度、灵敏度和稳定性。
1、基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱的制备
具体包括以下步骤：
1)SMA的制备
方程式如下：
在室温下，将5g SMAnh共聚物(SMA 2000，Cray Valley，2000-P)粉末与50mL 1MNaOH溶液混合于100mL圆底烧瓶，磁力搅拌过夜使其溶解。在通风橱中，用电热套加热烧瓶，温和地达到沸点后，降低热量并保持沸腾，继续回流2h，结束后待其冷却。逐渐向溶液加入浓盐酸，充分混合以沉淀出聚合物，然后用三蒸水洗涤沉淀四次。向溶液中加入60mL 0.6MNaOH溶解聚合物，调节pH值至8.0，冷冻干燥得到SMA粉末，密封室温下保存。
SMA制备的验证：对反应物SMAnh共聚物(SMA 2000)粉末和产物SMA粉末进行傅里叶变换红外光谱分析，图2显示了未水解的SMAnh共聚物(红色)和水解后的SMA共聚物钠盐(蓝色)的红外光谱。SMAnh共聚物中的1778cm-1处是马来酸酐羰基的特征峰，而在水解后的SMA共聚物下该信号不存在，取而代之的是羧酸羰基的1577和1408cm-1特征峰，表明SMAnh共聚物已经成功水解为SMA共聚物。
2)SMALP的制备
将培养的ACE2-His-tag HEK293高表达细胞计数不小于107个，用0.25％胰蛋白酶消化，用PBS洗涤一遍除去培养基，再5000r离心，将细胞沉淀重悬于3mL预冷低渗缓冲液(20mM PBS，pH 7.4，2mM EDTA和2uL/mL蛋白酶抑制剂PMSF)中，超声破碎细胞30min，4℃，1500g离心10min离心收集上清。将沉淀重悬于2mL缓冲液，4℃匀浆20min，4℃，1500g离心10min，上清液合并于10mL离心管，12000g，4℃离心20min，得细胞膜，并计算膜湿重。
将细胞膜重悬于SMA增溶缓冲液(20mM Tris-HCl，盐酸调pH 8，150mM NaCl，10％(v/v)甘油)，得到膜悬液(30mg/mL)。将SMA粉末添加至膜悬液中，使其终浓度为2.5％(w/v)。室温25℃下孵育2h，4℃，100000g离心20min，收集含有SMALP的上清液。
SMA增溶提取膜蛋白的验证：通过蛋白免疫印迹分别检测沉淀和上清中的ACE2蛋白，结果如图3所示，SMA共聚物对ACE2蛋白的提取率为99.59±0.03％，表明SMA可用高效增溶提取ACE2膜蛋白。
3)乙烯砜键合硅胶固定相的制备
在0℃下，将0.5g氨基硅胶和114μL二乙烯基砜(DVS)加入20mL DMF中，加2％催化剂PPh3 5.98mg，于0℃搅拌反应12h，用乙腈和三蒸水洗涤，85℃烘干，制得乙烯基砜化硅胶，乙烯基砜化硅胶和氨基硅胶的元素分析对照结果，如下表1所示：
表1乙烯基砜化硅胶元素分析
4)SMALP-His-tag键合型细胞膜固定相的制备
将100mg乙烯基砜化硅胶(VS-氨基硅胶)加到SMALP溶液中，室温25℃下搅拌12h，5000r离心10min，除去未结合的蛋白，加2mL生理盐水重悬，即得SMALP-His-tag键合型细胞膜色谱固定相。
对SMALP-His-tag键合型细胞膜色谱固定相进行表征：采用X射线光电子能谱对氨基硅胶(NH2-SiO2)，乙烯砜修饰硅胶(VS-NH-SiO2)、键合细胞膜硅胶(ACE2-His-SMALP@VS-NH-SiO2)进行元素种类和化学结构分析。结果如图4所示，图4为氨基硅胶(NH2-SiO2)，乙烯砜修饰硅胶(VS-NH-SiO2)、键合细胞膜硅胶(ACE2-His-SMALP@VS-NH-SiO2)的X射线光电子能谱图。可以看出，与NH2-SiO2相比，VS-NH-SiO2和ACE2-His-SMALP@VS-NH-SiO2在S的高分辨谱中出现了位于168eV的砜的特征峰，此外经乙烯基砜修饰后，VS-NH-SiO2的氧和碳元素含量明显上升，综上表明乙烯基砜成功修饰到氨基硅胶的表面；在ACE2-His-SMALP@VS-NH-SiO2的XPS图谱中，出现了C＝O((284.6eV)、C-O(286.0eV)和C-C(288.5eV)的特征峰，这是由于苯乙烯马来酸共聚物的马来酸和膜蛋白中氨基酸所致，且检测出磷元素，表明苯乙烯马来酸共聚物包绕的膜蛋白成功键合于VS-NH-SiO2。
5)细胞膜色谱柱的制备
取1mL SMALP-His-tag键合型细胞膜色谱固定相的悬液装柱，湿法装入2.0×10mm(I.D.×L)的柱芯中，即可得基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱。
2、基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱的效果验证
柱内与柱间重复性主要以地氯雷他定的保留时间为指标，柱寿命以地氯雷他定的保留时间衰减曲线半衰期为指标。制备一根ACE2-SMALP-His-tag键合型细胞膜色谱柱，置于液相色谱中，充分平衡后，连续进5μL 1mg/mL的地氯雷他定样品5次，分别记录每次进样的保留时间。柱间差异性为按照同样的方法分别同时制备3根ACE2-SMALP-His-tag键合型细胞膜色谱柱，置于液相色谱仪内应用相同的色谱条件充分平衡后，分别进5μL 1mg/mL的地氯雷他定样品，分别记录每根色谱柱的保留时间。柱寿命实验使用1根ACE2-SMALP-His-tag键合型细胞膜色谱柱，连续每日进样记录保留时间，直至保留时间衰减殆尽。结果如表2所示，可以看出，SMALP-His-tag键合型细胞膜色谱柱的重复性良好，满足分析需求，生物活性保持时间显著延长。
表2基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱重复性和活性考察
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱的制备方法，其特征在于，包括：通过水解苯乙烯马来酸酐共聚物得到SMA，将SMA加入到膜悬液中增溶提取单个膜蛋白形成SMALP，将SMALP与乙烯砜键合硅胶反应，使膜蛋白上的His-tag标签与乙烯砜基共价键合，得到SMALP-His-tag键合型细胞膜固定相，再经湿法装柱，制得基于天然纳米盘SMALP的键合型细胞膜色谱柱。
2.根据权利要求1所述的基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将苯乙烯马来酸酐共聚物水解成为苯乙烯马来酸共聚物SMA，将二乙烯基砜键合到氨基化硅胶上，制得乙烯砜基硅胶；
2)培养His-tag融合蛋白高表达细胞ACE2-His-tag HEK293，当细胞计数达到107个时，离心去除培养基获得细胞，超声破碎后离心得到细胞膜，将细胞膜混悬于SMA增溶缓冲液中，加入SMA，室温反应后离心，得到SMALP溶液；
3)将SMALP溶液与乙烯砜基硅胶混合，室温下振荡反应，得到SMALP-His-tag键合型细胞膜固定相；
4)将SMALP-His-tag键合型细胞膜固定相采用湿法装柱获得基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱。
3.根据权利要求2所述的基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱的制备方法，其特征在于，步骤1)中，苯乙烯马来酸共聚物SMA具体制备方法如下：在室温下，按照1g：10mL的用量比，将苯乙烯马来酸酐共聚物粉末与1M的NaOH溶液充分混匀，得到混合溶液，将该混合溶液加热至沸点后继续回流处理2h，结束后待其冷却，然后加入浓盐酸，充分混合以沉淀出聚合物，洗涤沉淀，采用0.6M的NaOH溶液溶解沉淀，并调节pH值至8.0，冷冻干燥得到苯乙烯马来酸共聚物即SMA粉末。
4.根据权利要求2所述的基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱的制备方法，其特征在于，步骤1)中，采用二乙烯砜与氨基的迈克尔加成反应制备乙烯砜基硅胶，使用三苯基膦作为催化剂。
5.根据权利要求2所述的基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱的制备方法，其特征在于，步骤2)中，将离心去除培养基获得的细胞用含蛋白酶抑制剂的低渗缓冲液混悬后进行超声破碎，然后通过差速离心分离，得到细胞膜；其中，所述含蛋白酶抑制剂的低渗缓冲液，包括：20mM PBS，2mM EDTA和2μL/mL蛋白酶抑制剂PMSF，pH值为7.4。
6.根据权利要求2所述的基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱的制备方法，其特征在于，步骤3)中，将乙烯砜基硅胶与SMALP溶液混合后，于室温下振荡反应12h，然后5000r离心处理10min，去除未结合的蛋白，再经过重悬处理，制得SMALP-His-tag键合型细胞膜固定相。
7.根据权利要求6所述的基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱的制备方法，其特征在于，将乙烯砜基硅胶加至SMALP溶液中，使其浓度为1.25％w/v。
8.采用权利要求1～7中任意一项所述的制备方法制得的基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱。
9.权利要求8所述的基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱在筛选药物活性成分中的应用。
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Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1381723A (zh) * 2002-05-16 2002-11-27 复旦大学 一种蛋白质芯片及其制作方法
CN101605591A (zh) * 2007-02-09 2009-12-16 通用电气健康护理生物科学股份公司 交联的纤维素膜
WO2011004158A1 (en) * 2009-07-08 2011-01-13 The University Of Birmingham Solubilisation of membrane proteins
KR20130037023A (ko) * 2011-10-05 2013-04-15 경희대학교 산학협력단 히스티딘 태그를 가진 단백질의 정제를 위한 고형 지지체 및 이를 이용한 정제 방법
CN106824140A (zh) * 2015-12-04 2017-06-13 中国科学院大连化学物理研究所 一种以二乙烯基砜为模板制备色谱固定相的方法
CN107064394A (zh) * 2017-02-23 2017-08-18 西安交通大学 一种双靶标细胞膜色谱柱及其制备方法和应用
CN110201418A (zh) * 2019-05-09 2019-09-06 西安交通大学 一种基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱及其制备方法
CN110201419A (zh) * 2019-05-09 2019-09-06 西安交通大学 一种以聚乙烯醇微球为载体的细胞膜色谱柱及其制备方法
CN110308233A (zh) * 2019-06-28 2019-10-08 江苏大学 P-糖蛋白生物亲和色谱柱的制备方法及其应用
CN113061158A (zh) * 2021-03-30 2021-07-02 南京工业大学 一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法及其应用
WO2021252236A2 (en) * 2020-06-10 2021-12-16 Virginia Commonwealth University Native cell membrane nanoparticle and methods of use thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020129027A1 (en) * 2018-12-21 2020-06-25 King Abdullah University Of Science And Technology Sliding clamp-based affinity purification systems, methods of making and use thereof

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1381723A (zh) * 2002-05-16 2002-11-27 复旦大学 一种蛋白质芯片及其制作方法
CN101605591A (zh) * 2007-02-09 2009-12-16 通用电气健康护理生物科学股份公司 交联的纤维素膜
WO2011004158A1 (en) * 2009-07-08 2011-01-13 The University Of Birmingham Solubilisation of membrane proteins
KR20130037023A (ko) * 2011-10-05 2013-04-15 경희대학교 산학협력단 히스티딘 태그를 가진 단백질의 정제를 위한 고형 지지체 및 이를 이용한 정제 방법
CN106824140A (zh) * 2015-12-04 2017-06-13 中国科学院大连化学物理研究所 一种以二乙烯基砜为模板制备色谱固定相的方法
CN107064394A (zh) * 2017-02-23 2017-08-18 西安交通大学 一种双靶标细胞膜色谱柱及其制备方法和应用
CN110201418A (zh) * 2019-05-09 2019-09-06 西安交通大学 一种基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱及其制备方法
CN110201419A (zh) * 2019-05-09 2019-09-06 西安交通大学 一种以聚乙烯醇微球为载体的细胞膜色谱柱及其制备方法
CN110308233A (zh) * 2019-06-28 2019-10-08 江苏大学 P-糖蛋白生物亲和色谱柱的制备方法及其应用
WO2021252236A2 (en) * 2020-06-10 2021-12-16 Virginia Commonwealth University Native cell membrane nanoparticle and methods of use thereof
CN113061158A (zh) * 2021-03-30 2021-07-02 南京工业大学 一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法及其应用

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