CN113061158A - 一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法及其应用。该方法基于固定化酶的角度，以固定化酶进而提高蛋白的耐受性和重复利用性。其次本发明通过二价金属离子与组氨酸标签的结合实现对蛋白的纯化和固定化，进而提高目标蛋白的酶活。该方法的过程简单，价格低廉，用于含组氨酸标签的蛋白的分离纯化和固定化的操作简单，时间较短，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物固定化领域，具体涉及一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法及其应用。
背景技术
蛋白质固定化是指利用物理、化学或生物方法将蛋白质固定在材料表面，并使其保持活性的过程，由于蛋白质分子固有的不稳定性、易变性，使蛋白质的固定化显得尤其重要。
蛋白质的固定化主要分为定向固定和非定向固定两大类。传统的固定化方式主要为非定向，如物理吸附法，包埋法或利用蛋白质天然的基团如氨基、羧基与材料表面基团反应实现固定化。蛋白的非定向固定使蛋白的活性部位得不到充分暴露，从而降低蛋白的活性。
蛋白质的定向固定主要有：抗原/抗体的特异性亲和作用；通过分子生物学手段改造蛋白质从而进行固定化；通过材料表面与蛋白质之间相互反应的基团实现蛋白质在材料表面的定向固定。这些传统方法具有蛋白质需要纯化，需要外源催化剂，需要引入功能基团等。
L-赖氨酸脱羧酶（CadA）可以将L-赖氨酸直接转化为1，5-戊二胺，1，5戊二胺是一种重要的平台化学品，可用于生产聚酰胺，但L-赖氨酸脱羧酶的不可回收性和pH耐受性较差影响了其应用。
发明内容
针对蛋白质的pH耐受性较差和不可收性，以及现有固定化蛋白质技术的不足，本发明提供了一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法及其应用，本发明通过钴离子与L-赖氨酸脱羧酶上的组氨酸标签结合对其进行纯化和固定化，减少了对蛋白的纯化过程以及外源添加物的引入，使操作变得简单且成本低廉，同时提高了蛋白质的酶活， pH耐受性，以及通过介孔ZIF的再次包裹实现其重复利用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法，包括以下步骤：
步骤1，收集培养得到的表达含组氨酸标签的酶的菌株，用pH 5-9的缓冲液A重悬至10-30 OD后，超声破碎仪破碎，离心去除杂质，得到粗酶液；
步骤2，将粗酶液置于缓冲液B中配置成浓度为0.5-2.0g/l的粗酶液，搅拌均匀，加入20-80mmol/l的二价金属离子溶液B，继续搅拌，洗涤后，冻干得酶粉；
步骤3，取步骤2中酶粉5-20mg溶于去离子水中，加入高分子聚合物溶液，搅拌均匀，加入二价金属离子溶液A和二甲基咪唑溶液，继续搅拌，洗涤后，冻干得到所需纯化并固定化的蛋白粉，所述高分子聚合物：二价金属离子溶液A：二甲基咪唑溶液的摩尔比为7：100：400。
作为改进的是，步骤1中缓冲液A的pH为7.0-7.2，缓冲液A为Tris-盐酸缓冲液。
作为改进的是，步骤1中所述含组氨酸标签的酶的菌株为含组氨酸标签的α-碳酸酐酶或含组氨酸标签的L-赖氨酸脱羧酶。
作为改进的是，步骤1中超声破碎仪的功率为300W，破碎过程为间歇式破碎。
作为改进的是，步骤2中缓冲液B为Tris-盐酸缓冲液，粗酶液的终浓度为1g/l，二价金属离子溶液B为终浓度为40mM的钴离子溶液，搅拌时间为30 min。
作为改进的是，步骤3中酶粉溶解后酶液的终浓度为0.5 g/l，高分子聚合物为MW10000的聚乙烯吡咯烷酮，终浓度为35 mg/ml，金属离子A为钴离子、铜离子或锌离子，且终浓度为50mM，二甲基咪唑的终浓度为200mM，搅拌时间为30min。
上述纯化并固定化的蛋白粉在催化L-赖氨酸降解上的应用。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法及其应用，可以适用于多种含有组氨酸标签的蛋白质，通过利用金属离子与组氨酸标签的结合实现对含组氨酸标签蛋白高速，快捷的分离纯化，通过金属离子实现对蛋白的固定化，该方法时间短，成本低，操作简单，且对蛋白的酶活、耐受性、重复利用率都有提高；通过对金属离子螯合的蛋白再次进行包裹介孔ZIF提高酶的稳定性，在生物催化领域有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例1和实施例2中不同酶对L-赖氨酸的消耗量；
图2为不同pH对L-赖氨酸消耗的影响；
图3为不同温度对L-赖氨酸消耗的影响；
图4为不同离子螯合的固定化酶的酶活比较情况；
图5为不同浓度的钴离子对固定化酶的活性的影响；
图6为实施例3中制备的固定化酶的重复利用情况；
图7为碳酸酐酶固定后的催化情况；
图8为组氨酸标签纯化后与未用组氨酸标签纯化的蛋白胶图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方法做进一步的详细说明。
需要说明的是，以下实施例中所用到的材料均为市售可购买的，且操作中未具体撰写的步骤如培养菌株的方法、催化、以及酶活测定等等都为本领域常规手段，无需特殊说明。
实施例1 L-赖氨酸脱羧酶消耗L-赖氨酸
收集培养得到表达大肠杆菌来源L-赖氨酸脱羧酶的BL21（DE3）/pCDF-duet-CadA菌株（已在专利CN201810195975.2中发表公开），用pH 5-9的缓冲液重悬至20 OD后，超声破碎仪破碎；离心去除杂质，得到粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度。反应体系为1ml，将酶粉溶于pH 7的Tris-Hcl缓冲液中，L-赖氨酸脱羧酶的终浓度为0.2g/l，加入终浓度为0.1mM的PLP，放于37℃的水浴锅中预热2-3 min，加入终浓度为100 g/l的L-赖氨酸盐酸盐溶液，放入37℃的摇床中反应5 min，然后煮沸5 min停止反应。
实施例2 固定化L-赖氨酸脱羧酶消耗L-赖氨酸
2.1 固定化酶制备
收集培养得到表达大肠杆菌来源L-赖氨酸脱羧酶的BL21（DE3）/pCDF-duet-CadA菌株（已在专利CN201810195975.2中发表公开），用pH 5-9的缓冲液重悬后，超声破碎仪破碎；离心去除杂质，得到粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度。
反应体系为12 ml，加入终浓度为1g/l的粗酶液，再加入Tris-Hcl缓冲液调节反应的pH为7.2，以300rpm搅拌1-2min，使反应溶液混合均匀，再加入终浓度为40 mM的钴离子，提高搅拌速度到500rpm搅拌30min，取部分上清测定蛋白浓度，对沉淀用Tris-Hcl缓冲液洗涤2-3次，使用真空冷冻干燥机进行干燥得到酶粉。
2.2 介孔ZIF再次固定化
反应体系为10ml，将酶粉溶解于去离子水中得终浓度为0.5g/l的酶粉，加入终浓度为35 mg/ml的PVP溶液，以300rpm搅拌1-2min，加入终浓度为50mM的钴离子和终浓度为200 mM的二甲基咪唑，以500rpm搅拌30 min，离心，用Tris-Hcl缓冲液洗涤2-3次，使用真空冷冻干燥机进行干燥得到纯化并固定化的蛋白粉。
2.3固定化酶催化L-赖氨酸
反应体系为1ml，将纯化并固定化的蛋白粉溶于pH 7的Tris-Hcl缓冲液中，L-赖氨酸脱羧酶的终浓度为0.2g/l，加入终浓度为0.1mM的PLP，放于37℃的水浴锅中预热2-3min，加入终浓度为100g/l的L-赖氨酸盐酸盐溶液，放入37℃的摇床中反应5min，然后煮沸5min停止反应。
实施例3 分析方法进行比较
利用SBA-40E 双通道生物传感仪检测L-赖氨酸的消耗量，1,5-戊二胺浓度测定采用安捷伦 1290液相色谱系统和安捷伦TC-C18 色谱柱（4.6×250mm)。柱温40±1℃，流速1.0mL· min-1; 进样量10μl;荧光检测器激发波长为350nm,发射波长为520nm。紫外检测器波长250nm。
1、 L-赖氨酸的消耗量
比较实施例1中游离的L-赖氨酸脱羧酶与实施例2中固定化的L-赖氨酸脱羧酶对L-赖氨酸的消耗量，比较两者在催化过程中关于最终产量、热稳定性、pH耐受性方面的性能。
图1中实施例1中游离酶对L-赖氨酸的消耗量为27g/l，而实施例2中固定化酶对L-赖氨酸的消耗量为36.5g/l。1mg的L-赖氨酸脱羧酶每分钟消耗1g/l的L-赖氨酸为1U。
2、 耐受性检测
对于温度的耐受性检测，控制反应温度在 25-55℃之间，探究不同温度对L-赖氨酸消耗的影响，结果如同3所示，其中相对活性以实施例1中37℃的L-赖氨酸消耗量为100%。
对于pH的耐受性检测，控制反应的pH在5-9之间，探究不同pH对L-赖氨酸消耗的影响，结果如图2所示，其中相对活性以实施例1中在pH 7的L-赖氨酸消耗量为100%。
实施例4
除用其他金属离子（如铜离子、锌离子、钙离子、镁离子等）替换钴离子，其余同实施例2。反应结束后，通过SBA-40E 双通道生物传感仪检测L-赖氨酸的消耗量,不同离子螯合的酶活如图4。1mg的L-赖氨酸脱羧酶每分钟消耗1g/l的L-赖氨酸为1U。
实施例5
除将钴离子浓度调整为10-100mM，其余同实施例2。反应结束后，通过SBA-40E双通道生物传感仪检测L-赖氨酸的消耗量,不同离子螯合的相对活性如图5。其中相对活性采取40 mM的为100%。
实施例6 重复利用率
固定化酶重复使用，用实施例3中的酶粉按照实施例4的反应体系，在每批次结束后，回收固定化酶，用于下一批次的反应，实验结果如图6所示，重复5次后，活性保持在75%以上。
实施例7 固定化碳酸酐酶
除将含有组氨酸标签的L-赖氨酸脱羧酶的菌株替换为含有组氨酸标签的α-碳酸酐酶的大肠杆菌（嗜热细菌偶氮硫氢杆菌来源的α-碳酸酐酶的BL21（DE3）/pET-duet-SazCA（由通用生物公司合成）菌株）外，其余同实施例2。利用钴离子可以固定化碳酸酐酶，通过与PNPA反应检测碳酸酐酶酶活，固定化酶的酶活比游离酶的酶活提高48%。
实施例8 组氨酸标签纯化前后酶含量
取步骤1和步骤2中的酶配置成1g/l的酶液，每个取20μl，进行SDS-PAGE凝胶电泳，实验结果如图8所示，泳道1为蛋白Mark，泳道2为步骤1中的粗酶液，泳道3为步骤2中组氨酸标签结合后的酶液，组氨酸标签纯化后的L-赖氨酸脱羧酶含量是粗酶液中的2.1倍。
综上所述，本发明一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法及其应用，即通过组氨酸标签固定L-赖氨酸脱羧酶可以提高其耐受性以及其催化活性，利用介孔ZIF的二次包裹可以提高L-赖氨酸脱羧酶的重复利用性。该方法操作简单，成本低廉，且催化效率好，重复利用率高，对其它含组氨酸标签的蛋白同样适用，在生物催化领域有广泛的应用前景。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，收集培养得到的表达含组氨酸标签的酶的菌株，用pH 5-9的缓冲液A重悬至10-30 OD后，超声破碎仪破碎，离心去除杂质，得到粗酶液；
步骤2，将粗酶液置于缓冲液B中配置成浓度为0.5-2.0g/l的粗酶液，搅拌均匀，加入20-80mmol/l的二价金属离子溶液B，继续搅拌，洗涤后，冻干得酶粉；
步骤3，取步骤2中酶粉5-20mg溶于去离子水中，加入高分子聚合物溶液，搅拌均匀，加入二价金属离子溶液A和二甲基咪唑溶液，继续搅拌，洗涤后，冻干得到所需纯化并固定化的蛋白粉，所述高分子聚合物：二价金属离子溶液A：二甲基咪唑溶液的摩尔比为7：100：400。
2.根据权利要求1所述的一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法，其特征在于，步骤1中缓冲液A的pH为7.0-7.2，缓冲液A为Tris-盐酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法，其特征在于，步骤1中所述含组氨酸标签的酶的菌株为含组氨酸标签的α-碳酸酐酶或含组氨酸标签的L-赖氨酸脱羧酶。
4.根据权利要求1所述的一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法，其特征在于，步骤1中超声破碎仪的功率为300W，破碎过程为间歇式破碎。
5.根据权利要求1所述的一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法，其特征在于，步骤2中缓冲液B为Tris-盐酸缓冲液，粗酶液的终浓度为1g/l，二价金属离子溶液B为终浓度为40mM的钴离子溶液，搅拌时间为30 min。
6.根据权利要求1所述的一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法，其特征在于，步骤3中酶粉溶解后酶液的终浓度为0.5 g/l，高分子聚合物为MW 10000的聚乙烯吡咯烷酮，终浓度为35 mg/ml，金属离子A为钴离子、铜离子或锌离子，且终浓度为50mM，二甲基咪唑的终浓度为200mM，搅拌时间为30min。
7.基于权利要求1所得纯化并固定化的蛋白粉在催化L-赖氨酸降解上的应用。
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