一种蛋白质芯片及其制备和检测方法
技术领域
本发明属于蛋白质芯片领域,尤其涉及一种通过组氨酸标签与固相载体上阳离子之间的亲和作用将待固定于芯片固相载体上的蛋白固定于所述固相载体的蛋白质芯片及其制备和检测方法。
背景技术
在人体或其他生物体生命活动中,蛋白质作为生物功能的主要执行者,参与和主导许多体内的生物活动,包括蛋白质-蛋白质相互作用,酶催化底物的反应并生成新的产物,抗体蛋白和多种不同来源的抗原之间的相互作用,蛋白质和核酸等生物大分子之间的相互作用。更为重要的是,蛋白质和不同小分子物之间的相互作用,主要体现在细胞信号传导过程中的激素和受体,细胞因子和受体蛋白等的相互作用。那些具有极强功能重要性并在病理分析过程中起着重要作用的蛋白质在疾病诊断和药物筛选中都是非常重要的目标蛋白。就药物筛选而言,可针对这些目标蛋白,通过不同方法找到具有高亲和力和目标蛋白结合的小分子药物。而对于疾病诊断,则需要将这些目标蛋白作为检测对象,测试其是否存在,而无论是疾病诊断还是药物筛选过程中,都需要高纯度的具有生物学活性的蛋白质,通常应用大肠杆菌或其他蛋白表达体系获得毫克级的蛋白高效表达,并应用色谱等一系列的蛋白纯化方法纯化出高纯度的蛋白。同时,必须进行相关生物功能实验来检测和保证获得的蛋白仍然具有生物学活性。
蛋白质芯片是指以生物分子作为配基,将其固定在固相载体的表面,形成的蛋白质微阵列(protein microarray)。根据其固定生物分子的不同,可以分为受体配体检测芯片,抗原芯片,抗体芯片等。根据芯片载体的不同,分为普通玻璃载玻片,多孔凝胶覆盖芯片和微孔芯片3种主要形式。目前应用最普遍的是玻璃片,另外PVDF膜,聚丙烯酰氨凝胶,硝化纤维素膜,聚苯乙烯微珠,磁性微珠等也有报道。近几年一种液相芯片逐渐受到人们的重视,该芯片由100种不同颜色的微球组成,每种颜色的微球可以携带一种生物探针。探针通过羧基结合到微球表面,通过鉴定微球颜色来确定反应类型,通过靶物质上的报告分子作定量分析。具有灵活性好、通量大的优点,可以对同一个样品中的多个不同的分子同时进行检测,现已被用在与各种抗原抗体反应相关的检测中。
蛋白质芯片在生物以及医药领域获得了广泛应用,目前蛋白质芯片主要用于以下方面(1)用于基因表达的筛选;(2)特异性抗原抗体的检测;(3)蛋白质的筛选及研究;(4)生化反应的检测;(5)药物筛选以及(6)疾病诊断。
蛋白质芯片技术主要包括四个基本要点:芯片阵列的构建,样品的制备,芯片生化反应,信号检测及分析。蛋白质芯片的核心技术是蛋白芯片的制备和反应信号的检测分析。由于蛋白质分子的活性依赖于不同的折叠方式,因此对芯片的表面修饰至关重要,要保证被点在芯片上的蛋白质不失活而又能牢固的固定在芯片上。对最普遍应用的玻璃片片基而言,用于制备蛋白质芯片的方法主要有戊二醛修饰法、聚赖氨酸修饰法、巯基修饰法和多糖修饰法等。但是这些方法普遍存在成本较高、操作复杂、效率较低等缺点。
本领域中需要能够进一步提高工作效率,同时大幅降低成本、简化操作的新的蛋白质芯片。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、易于实施的低成本高通量的蛋白质芯片及其制备和检测方法。
为了达到本发明的目的,采用了如下技术方案:
在第一方面,本发明提供了一种蛋白质芯片,其中待固定于芯片固相载体上的蛋白在N端连接组氨酸标签。
在本发明的蛋白质芯片中,所述待固定于芯片固相载体上的蛋白可通过所述组氨酸标签与固相载体上阳离子之间的亲和作用固定于所述固相载体,优选地所述阳离子为Cu2+、Fe3+、Zn2+、Co2+或Ni2+,更优选地为Ni2+。
在本发明的蛋白质芯片中,所述固相载体可以为96孔板。
本发明的蛋白质芯片,其可与质谱和/或表面等离子体共振联用。
在第二方面,提供了如第一方面所述的蛋白质芯片的制备方法,所述方法包括为所述待固定于芯片固相载体上的蛋白加上组氨酸标签。
本发明的蛋白质芯片的制备方法可以包括:
1)根据待固定于芯片固相载体上的蛋白的氨基酸序列,合成或克隆出相应的cDNA片段;
2)将所述cDNA片段以所述cDNA片段表达为蛋白质时在N端连接6*His-Tag的方式与表达载体可操作地连接;
3)将连接后的载体转化至表达宿主中;
4)挑选正确表达所述待固定于芯片固相载体上的蛋白的表达宿主进行培养,获得含有所述待固定于芯片固相载体上的蛋白的培养物;
5)利用组氨酸标签-阳离子亲和层析对所述培养物进行纯化,得到适用于蛋白质芯片固定的待固定于芯片固相载体上的蛋白;和
6)将所获得的待固定于芯片固相载体上的蛋白溶解后在固相载体上进行点样,获得蛋白芯片;
其中,所述表达载体优选为pQE-30;
所述表达宿主优选为大肠杆菌,更优选的为E.coli M15菌株,所述E.coliM15菌株含有卡那霉素抗性的质粒pREP4,同时带有表达lac抑制子的基因;并且
所述组氨酸标签-阳离子亲和层析中所用的阳离子优选为铜离子、铁离子、锌离子、钴离子或镍离子,更优选地为镍离子。
在第三方面,提供了如第一方面所述的蛋白质芯片的检测方法,所述方法包括采用质谱和/或表面等离子体子共振对所述蛋白芯片上待测物的结合进行检测。
本发明的蛋白质芯片的检测方法可包括:
a)配制待测物溶液;
b)将待测物溶液与所述蛋白芯片接触;
c)使用质谱检测所述蛋白芯片上待测物的结合和/或使用表面等离子体共振检测所述蛋白芯片上待测物与所述固定于芯片固相载体上的蛋白的结合常数/解离常数。
在本发明的蛋白质芯片的检测方法中,所述待测物可以为化合物、蛋白或核酸。
在第四方面,本发明提供了如第一方面所述的蛋白质芯片在基因表达筛选、特异性抗原抗体、蛋白质筛选、药物筛选或用于疾病诊断的药物的制备中的用途。
本发明的有益效果:
(1)本发明所述蛋白质芯片基于质谱及表面等离子共振检测(SPR)技术的蛋白质芯片利用组氨酸标签与镍离子的亲和作用将待固定于芯片固相载体上的蛋白固定在芯片载体上,该结合方式对于蛋白质的功能基本上不产生影响。
(2)组氨酸标签的携带简化了蛋白质的分离纯化及在SPR芯片上的固定方法。在应用质谱进行检测时,不需要在待测物上携带特定荧光探针,大大降低了制备待测物的成本,可以保持生物分子的天然活性,使检测结果更加接近实际情况。
(3)使用质谱方法检测蛋白质芯片将大大提高检测的灵敏度,从而降低了对固定于芯片固相载体上的蛋白和待测物的量的需求。通过表面等离子共振检测技术,可计算得出化合物与蛋白质的结合、解离常数,该数据可为后续药物设计提供非常重要的信息。
附图说明
图1:小分子化合物与固定于芯片固相载体上的蛋白结合情况质谱检测结果图。
图2:小分子化合物与固定于芯片固相载体上的蛋白结合情况表面等离子共振检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例:以血小板源性生长因子(PDGF)为固定于芯片固相载体上的蛋白的蛋白质芯片制备以及利用所述芯片筛选与其具有高效结合的小分子化合物的实验方法。
1、试剂和仪器:
人肝癌细胞系(SMC-7721)、E.coli M15细胞株、pQE-30载体为本公司保藏,Taqplus DNA polymerase购自天根生化,限制性内切酶购自Promega公司,HBS-EP缓冲液(0.01mol/L HEPES,pH=7.4,0.15mol/L NaCl,3mmol/L EDTA,质量分数为0.005%的Surfactant P20)、Glycine-HCl、[N-乙基-N′-(3-二乙氨基丙酸)]碳二亚胺(EDC)、基琥珀酰亚胺(NHS)和盐酸乙醇胺购自Amersham Biosciences公司,胰蛋白酶(Trypsin)、基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、三氟乙酸(TFA)、3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(SA)购自Sigma公司,乙腈为国产分析纯试剂。
质谱仪为Bruker公司的Bruker MALDI-TOF-MS系统,表面等离子共振仪为Amersham Biosciences公司的BIA core3000系统,全自动点样仪为PerkinElmer公司PELSBiochip Array系统。小分子化合物库由美国科罗拉多大学化学实验中心馈赠,蛋白质芯片载体采用德国Qiagen公司的Ni NTA HisSorb Plates,SPR芯片载体采用美国BIAcore公司的biosensor chip NTA。
2、构建一套带有组氨酸标签的PDGF表达、纯化系统:
1)根据GeneBank中PDGF的cDNA序列,设计相应引物,以人肝癌细胞系(SMC-7721)的总RNA为模板克隆出相应的cDNA片段;
2)将克隆出的cDNA片段与载体pQE-30连接,该载体表达蛋白质时可在N端添加6*His-Tag;
3)将载体转化至E.coli M15菌株,该菌株含有卡那霉素抗性的质粒pREP4,同时它带有表达lac抑制子的基因,可以高效表达lac抑制子,阻遏外源蛋白的表达;
4)使用卡那霉素抗性挑选转化子进行培养,对阳性克隆进行培养,抽提质粒进行酶切验证及蛋白质电泳检测,获得3株表达PDGF的菌株;
5)以兔抗PDGF血清为一抗,辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔Ig为二抗,TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)为显色底物,以PDGF为参比对照检测所表达蛋白的抗原性;
6)将活化后的表达菌株按1%接种至1L的LB培养液中,诱导表达后的菌液8000r/min离心10min收获菌体,用溶菌缓冲液溶解沉淀,超声波充分破碎后离心。取上清液过Ni-NTA(已用溶菌缓冲液平衡)。洗涤缓冲液(50mmol·L-1NaH2PO4,300mmol/L NaCl,20mmol/L咪唑)将杂蛋白洗去,最后用洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4,300mmol/L NaCl,250mmol/L咪唑)将目标蛋白洗脱。得到100mg纯度为99.6%的PDGF蛋白。
3、将带有组氨酸标签的PDGF固定在Ni NTA HisSorb Plates96孔板上:
1)将蛋白质溶解至PBS缓冲液,检测溶液OD值,并根据检测结果确定蛋白质浓度;
2)将蛋白质溶液稀释至1μg/μL,使用PELS Biochip Array全自动点样仪按照每微孔100μL的体积将蛋白质溶液点样至Ni NTA HisSorb Plates96孔板上;
3)室温下静置30min,将上溶液吸弃,此时每微孔内可固定蛋白质1-5μg。
4、化合物库的点样
1)将小分子化合物溶解至PBS缓冲液中,控制终浓度为1×10-12mol;
2)使用PELS Biochip Array全自动点样仪,将化合物溶液点入每一微孔,并使用甲磺酸伊马替尼溶液作为阳性对照,使用去离子水作为阴性对照;
3)室温下静置30min后将上溶液吸弃;
4)使用PBS缓冲液清洗微孔2-3次,洗去非特异性结合的化合物。
5、质谱检测
1)采用10mmol/L Glycine-HCl(pH=2.5)作为基质喷雾加到芯片表面,采用C18ZipTipTM脱盐,并进行干燥;
2)使用Bruker MALDI-TOF-MS飞行时间质谱仪检测芯片。氮气激光源(337nm,脉冲宽度3ns),加速电压为25kV,Grid设为92.5%,延迟时间为1000ns,质谱信号单次扫描累加100次,PMF测定时,使用反射模式,加速电压为20kV,Grid设为64.5%,延迟时间为100ns,质谱信号单次扫描累加50次。使用标准肽混合物Angiotensin1(Mr=1296.6853)和ACTH18-39片段(Mr=2465.1989)作为外标校正,均为正离子模式。
检测结果参考图1:
其中,上图为甲磺酸伊马替尼的检测结果,Mass值为588.7,其实际分子量为587.7差别的1个道尔顿是由于质谱检测前需使样品带有一个电荷的缘故;下图为KA0086412号化合物的检测结果,结果显示,Mass值为565.3,与其实际分子量564.3相吻合。此外共有12个样品具有不同程度的结合(图略)。
6、表面等离子共振检测:
1)按操作说明书将PDGF耦联到biosensor chip NTA芯片的FC1通道上,活化条件相同但表面没有固定PDGF的FC2通道设为空白对照,偶联后使用60μL盐酸乙醇胺(pH=8.0)封闭芯片。整个实验使用HBS-EP缓冲液为工作液,温度为25℃;
2)小分子化合物用HBS-EP缓冲液稀释成5种不同浓度(40nmol/L,60nmol/L,80nmol/L,100nmol/L,200nmol/L),每次进样30μL,流速为5μL/min。
检测结果参考说明书附图2:
其中,上图为甲磺酸伊马替尼与PDGF结合与解离的动力学曲线;下图为KA0086412号化合物与PDGF的结合与解离的动力学曲线。
计算公式参考:Rep/Mr=cRmax/(c+KD)
采用BIA evaluation(Version3.1)软件,使用1∶1(Langmuir)Binding模型,计算动力学参数(Ka,Kd)。结果显示:甲磺酸伊马替尼与PDGF的Ka=2.76×105,Kd=1.21×10-3,KA0086412号化合物与PDGF的Ka=1.35×105,Kd=2.47×10-3。
由以上结果可以得知,在本发明的蛋白质芯片中,可以利用组氨酸标签与镍离子的亲和作用成功地将蛋白固定在芯片载体上,并且这种结合方式对于蛋白质的功能基本上不产生影响。并且本发明的蛋白质芯片可以定量定性检测待测物与芯片上蛋白的结合情况,为后续的应用提供了更多更准确的数据信息。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征以及方法,但本发明并不局限于上述详细结构特征以及方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。