CN105177009A - 一种与α-鹅膏毒肽特异结合的核酸适配体及应用 - Google Patents
一种与α-鹅膏毒肽特异结合的核酸适配体及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用selex技术得到的能够高亲和力高特异性结合α-鹅膏毒肽的核酸适配体，该核酸适配体是一种单链DNA，由84个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示；其二级结构含有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-15.36；该核酸适配体通过酶联寡核苷酸吸附试验能特异性检测到α-鹅膏毒肽。
Description
技术领域
本发明涉及一种与α-鹅膏毒肽特异结合的核酸适配体及应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
核酸适配体是一类能与靶分子特异性、高亲和力结合的寡核苷酸分子（DNA或RNA），可通过SELEX技术，从特定的寡核苷酸库中筛选得到。由于其具有靶分子范围广、分子质量小、免疫原性低、易于化学合成、改造和标记等优点，核酸适配体在临床诊断鉴定和疾病治疗等领域中具有重要的应用价值。
鹅膏菌毒素（amanitin）是从毒蘑菇中分离出来的一种多肽类物质，其中以α-鹅膏毒肽的毒性最强（α-amanitin）。人若误食含有α-鹅膏毒肽的鹅膏菌(Amanita)后，轻者可产生腹泻、腹痛、呕吐，重者可出现幻觉、昏迷等多种症状，致死率较高。α-鹅膏毒肽是从鹅膏菌中分离出来的一种八肽化合物，它是RNA聚合酶II的专一性抑制剂，能抑制真核细胞RNA聚合酶II的活性，从而阻碍mRNA转录和蛋白质的合成，这也是引起鹅膏毒素中毒，导致死亡的主要因素。因此，利用SELEX技术筛选α-鹅膏毒肽的特异性核酸适配体，进而及时、快速检测出食用野生菌中是否含有鹅膏毒素，对于降低误食蘑菇中毒及诊断治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；该核酸适配体为单链DNA，由84个核苷酸组成，拓扑学结构为直链状；预测的二级结构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-15.36。
本发明另一目的是将与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体应用在识别α-鹅膏毒肽或在制备检测α-鹅膏毒肽的试剂盒中。
本发明的技术方案如下：
1、α-鹅膏毒肽特异性核酸适配体（H06）的筛选、克隆、分离和测序
采用SELEX技术筛选出能够与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体群体，设计引物进行PCR扩增、克隆、分离和测序。利用酶联寡核苷酸吸附试验（ELONA）进行验证，得到适配体H06，它能够高亲和力高特异性的结合α-鹅膏毒肽。配体接头引物序列为：AptamerFw:GACATATTCAGTCTGACAGC；反向互补序列：CGCTGTCAGACTGAATATGTC；AptamerRv:GCTAGACGATATTCGTCCATC，反向互补序列：GATGGACGAATATCGTCTAGC。所获阳性单克隆进行核苷酸序列测定，测序结果表明与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体(H06)由84个核苷酸组成，其序列（5’端至3’端）为：
TGACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGGATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGCA；
2、核酸适配体（H06）单链DNA二级结构表征
使用MFOLD软件（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form）对与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体H06单链DNA分子进行二级结构预测，结果表明，其二级结构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-15.36，显示该结构具有较高的稳定性；其二级结构如下：
3、核酸适配体（H06）的特异性和对α-鹅膏毒肽的敏感性
根据核酸适配体H06的序列，用体外转录方法合成生物素标记的核酸适配体，建立了一种新型的酶联寡核苷酸检测方法，通过此方法对H06的特异性和其对α-鹅膏毒肽的敏感性进行检测；结果显示，H06具有很高的特异性，其能检测到蘑菇毒素α-鹅膏毒肽的最低浓度为8ng/μL。
本发明的意义在于:
利用SELEX技术筛选出的配体H06能够高亲和力高特异性的识别并结合α-鹅膏毒肽；核酸适配体H06的鉴别对于食用野生菌中α-鹅膏毒肽的检测，进而降低α-鹅膏毒肽对人体的侵害具有重要意义。
附图说明
图1为本发明中CD圆二色谱法对K+浓度与核酸适配体H06的关系的分析；
图2为本发明中ELONA法对核酸适配体H06的特异性分析，图中：空白对照1为α-鹅膏毒肽+脱脂奶；空白对照2为α-鹅膏毒肽+不含配体的生物素；阴性对照1为苏丹红+标记有生物素的配体H06；阴性对照2为三聚氰胺+标记有生物素的配体H06；阴性对照3为草甘膦+标记有生物素的配体H06；阴性对照4为瘦肉精+标记有生物素的配体H06；阴性对照5为乙型脑炎NS1蛋白+标记有生物素的配体H06；阴性对照6为乙型脑炎core蛋白+标记有生物素的配体H06；α-鹅膏毒肽为α-鹅膏毒肽40ng/μL+标记有生物素的配体H06；
图3为本发明中DotBlot法对核酸适配体H06的特异性分析，图中：1：空白对照（α-鹅膏毒肽+脱脂奶）；2：空白对照（α-鹅膏毒肽+不含配体的生物素）；3：阴性对照（苏丹红+标记有生物素的配体H06）；4：阴性对照（三聚氰胺+标记有生物素的配体H06）；5：阴性对照（草甘膦+标记有生物素的配体H06）；6：阴性对照（瘦肉精+标记有生物素的配体H06）；7：阴性对照（乙型脑炎NS1蛋白+标记有生物素的配体H06）；8：阴性对照（乙型脑炎core蛋白+标记有生物素的配体H06）；9：α-鹅膏毒肽40ng/μL+标记有生物素的配体H06；
图4为本发明中ELONA法对核酸适配体H06的最佳浓度的分析，图中：空白对照1：α-鹅膏毒肽+脱脂奶；空白对照2：α-鹅膏毒肽+不含配体的生物素；配体H06：α-鹅膏毒肽+标记有生物素的配体H06；
图5为本发明中ELONA法对α-鹅膏毒肽灵敏度的分析，图中：空白对照1：α-鹅膏毒肽+脱脂奶；配体H06：α-鹅膏毒肽+标记有生物素的配体H06。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来进一步说明本发明的实质性内容，实施例仅为了更好理解本发明但不局限与本发明范围，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：α-鹅膏毒肽核酸适配体（H06）的筛选
一、配基（α-鹅膏毒肽）与基质（琼脂糖凝胶6B）的偶联
1、在3mL蒸馏水中悬浮1g的冻干粉末琼脂糖凝胶6B（1g冻干的粉末能够产生出大约3.0mL的最终的基质体积）；
2、立即在烧结玻璃滤器中（多空度G3）用大约每克粉末200mL的蒸馏水冲洗1小时；
3、用6mL的偶联缓冲溶液（0.05M，pH9.6的碳酸盐缓冲液）溶解6g的配基，使其最终浓度为1mg/mL，或者用脱盐柱将溶解的配基转移到偶联缓冲溶液中，调整水相的pH值；
4、将基质与上述步骤3中的浓度为1mg/mL溶解好配基的缓冲溶液的比例调整为体积比1:2，在25℃到40℃的水浴条件下，混合16h，并且37℃摇床过夜；
5、在40℃到50℃的条件下，用1M的氨基乙醇封闭过剩的基团，至少4h或者过夜；
6、用偶联缓冲液洗过剩的配基，4000rpm离心2min，吸取上清；用超纯水（每次7-8mL）清洗3次；紧接着用0.1MNaHCO3，0.5MNaCl，pH8.0的溶液清洗3-4次；然后用0.1MNaCl，0.1M醋酸盐，pH4.0的溶液清洗3-4次；最后用质量百分比浓度为20%乙醇6mL保存，放置于4℃冰箱，封口膜封口，竖直放置。
二、核酸适配体文库（ssDNA）的PCR
采用TaKaRa公司合成的ssDNA适配体文库；
1、94℃预热PCR仪；
2、将3μLssDNA、30.6μL去离子水、5μL10×Buffer、3μLMgCl2、4μLdNTP混合物（各2.5μM）、2μL正向扩增引物、2μL反向扩增引物以及0.4μLTaq酶离心管进行反应。正向扩增引物序列为5’–GACATATTCAGTCTGACAGC-3’，反向扩增引物序列为5’-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3’。
3、在PCR仪中按以下程序扩增
(1)预变性
94℃5分钟；
(2)40个循环
94℃45秒钟
58℃45秒钟
72℃30秒钟；
(3)后扩增
72℃7分钟。
三、配体库的纯化、上样及洗脱
1、配体库的纯化
(1)核酸适配体文库PCR产物直接与胶回收试剂盒里的溶液按体积比1:1比例混合，进行DNA片段回收；
(2)DNA片段回收后，95℃水浴10min，冰浴10min；经过此变性处理，使双链DNA变成单链DNA。
2、亲和层析
(1)用偶联缓冲液洗脱偶联过的基质：先吸取上层酒精，加偶联缓冲液至6mL，混匀，离心，弃去上清液，此步骤重复3次；
(2)将上述第1步中的单链DNA加入到偶联过的基质中，于37℃温育并40rpm轻柔转动2h；
(3)加入前述样品到层析柱中，用2-3柱体积的超纯水冲洗柱子；
(4)然后用3-4柱体积的洗脱缓冲液（0.1MNaCl，0.1M醋酸盐，pH4.0）进行线性梯度洗脱，收集洗脱组分；
(5)洗脱组分与胶溶液等体积混合，回收后用TE溶液溶解，得到selex溶液。
四、PCR优化和大量扩增核酸适配体
以上述selex溶液作为模板，按如下步骤操作：
1、94℃预热PCR仪；
2、将5μL模板、28.6μL去离子水、5μL10×Buffer、3μLMgCl2、4μLdNTP混合物（各2.5uM）、2μL正向扩增引物、2μL反向扩增引物、0.4μLTaq酶，于PCR离心管中进行反应。正向扩增引物序列为5’–GACATATTCAGTCTGACAGC-3’，反向扩增引物序列为5’-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3’。
3、在PCR仪中按以下程序扩增：
(1)预变性
94℃5分钟；
(2)37个循环：
94℃45秒钟
58℃45秒钟
72℃30秒钟；
(3)后扩增
72℃7分钟；
4、循环结束后，将PCR产物用TIANGEN公司的DNA产物纯化试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
(1)将PCR产物与等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液；
(2)加入700μL的漂洗液（含乙醇）于离心纯化柱中，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液；
(3)重复步骤（2）；
(4)12000rpm离心3分钟；
(5)将离心纯化柱置于新的离心管中；
(6)加入30μL超纯水，在室温下静置5分钟；
(7)12000rpm离心1分钟，管底溶液即为纯化过的核酸适配体的PCR产物。
实施例2：核酸适配体的克隆和测序以及单链DNA二级结构的预测
一、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
1、挑取单个DH5α菌落，接种于3mL不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50mL液体LB培养基中，37℃振荡2小时；当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物；
2、将细菌培养物转移到一个50mL预冷的无菌聚丙烯管中，冰上放置10min，使培养物冷却；
3、于4℃下4000rpm离心10min，弃去培养液，并将管倒置lmin以使残留的培养液流尽；
4、各加150μL冰预冷的0.1mMCaCl2溶液，合并两管，冰浴10min；
5、于4℃下4000rpm离心10min，弃去上清液，并将管倒置lmin以使残留的液体流尽；
6、先加入800μL冰预冷的0.1MCaCl2溶液重悬细胞，再加入25μL预冷的75%的甘油，之后于-80℃贮存备用。
二、连接及连接产物的转化
1、在微量离心管中加入0.5μLTakarapMD19-Tsimple载体、4.5μL核酸适配体PCR产物及5μL的连接酶缓冲混合物；
2、16℃反应3小时；
3、全量（10μL）加入至100μLDH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟；
4、42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟；
5、加入37℃温浴过的LB培养基890μL，37℃缓慢振荡培养60分钟；
6、取200μL涂布于含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养16小时以形成单菌落。
三、核酸适配体的克隆筛选和测序以及单链DNA二级结构预测
挑取上述白色的单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃缓慢振荡培养4小时，进行PCR扩增；扩增引物及扩增条件同前述核酸适配体的扩增条件。将经PCR确证的阳性克隆进行质粒提取后，以美国AppliedBiosystems3730A全自动核苷酸序列测定仪进行核苷酸序列的测定；结构表明，与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体（命名为H06）其序列自5’端至3’端为:
TGACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGGATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGCA
与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体H06的序列长度：84个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：ssDNA。
通过MFOLD软件设置温度为26℃、Na+浓度为150mM，Mg2+浓度为1mM（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form）和QGRS映射（http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/analyze.php）对与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体H06单链DNA分子进行二级结构预测。结果表明，适配体含有突出的环和茎，存在G-四链体结构，其吉布斯自由能DG=-15.36，该结构具有较高的稳定性。
实施例3：圆二色谱法对K
+
浓度与核酸适配体H06的关系的探究
1、将适配体用20mMTris-HCl缓冲液(pH7.2)稀释至20μM后，于94℃变性0.5min以0.5℃/min的速度冷却至25℃；
2、用含有不同浓度(0、5、10、20、50mM)KCl的20mMTris-HCl缓冲液(pH7.2)将核酸适配体H06稀释至2.5μM；
3、于25℃，220–340nm波长处用圆二色谱仪进行检测（结果见图1），结果显示在不同浓度K+溶液中均有275nm处的峰值出现，说明核酸配体H06具有茎环结构和G-四链体结构。
实施例4：核酸适配体（H06）的特异性和对α-鹅膏毒肽的敏感性
一、核酸适配体H06特异性检测
1、ELONA方法
在传统的ELISA方法的基础上加以改进，用筛选出来的适配体来代替抗体，采用生物素-亲和素放大系统用以检测待测样品的一种方法。
(1)适配体-生物素的包被
筛选出来的特异性识别α-鹅膏毒肽的核酸适配体送到TaKaRa公司合成，得到用生物素标记的适配体。使用时先短暂离心，使生物素标记的适配体聚集在试管底部。根据说明书，用灭菌水或TEbuffer(pH7.5-8.0)充分溶解成存储溶液，一般浓度为10-4或10-5M，置于-20℃保存。为避免反复冻融，可分装成小份。将生物素标记的适配体用1×PBS稀释到工作浓度，每个孔加100μL，用不干胶或封口膜密封，于37℃、150rpm振荡器上孵育1-2h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2min，每次都要在干净的吸水纸上拍干。
(2)加α-鹅膏毒肽孵育
按核酸适配体结合缓冲液与α-鹅膏毒肽体积比1:1的比例加入到包被有生物素标记的适配体的酶标板中，每个孔加100μL，用不干胶密封，于37℃、150rpm振荡器上孵育1-2h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2min，同样的每次都要在于净的吸水纸上拍干。（对照组则将α-鹅膏毒肽换成非靶标蛋白，方法同上）。
(3)加酶结合物孵育
往每孔中加入100μL辣根过氧化物酶结合物，用不干胶密封，于37℃、150rpm振荡器上孵育1h，洗涤3次，每次2min。
(4)显色
每孔加入TMB100μL，于37℃避光显色l0min，拍照保存。
(5)终止
加25μL终止液（2M硫酸），并在反应终止10min以内用酶标仪测各孔450nm处吸光度值OD450。
结果显示，适配体H06能够与α-鹅膏毒肽特异性的结合（结果见图2），核酸适配体H06不与其他蛋白反应，能够快速检测到α-鹅膏毒肽。
2、DotBlot方法
(1)将5微升的α-鹅膏毒肽(40ng/μL)点至圆形NC膜(半径为0.25cm)中心，待NC膜干燥后，置于2mL的冻存管，同时设立空白对照和阴性对照；
(2)加入100微升封闭液，与37℃孵育2h，用含0.05％Tween-20的PBS溶液洗膜3次，每次3min；
(3)将制备好的标记有生物素的配体于95℃变性5min，迅速降至4℃，将适配体加到制备好的NC膜上，37℃孵育2h后，用含0.05％Tween-20的PBS溶液洗膜3次，每次3min；
(4)将辣根过氧化物酶结合物加到NC膜上，37℃孵育1h后，用含0.05％Tween-20的PBS溶液洗膜3次，每次3min；
(5)加入TMB到NC膜，于37℃避光显色10min，观察适配体与蘑菇毒素的结合情况，拍照保存（结果见图3），结果表明核酸适配体H06具有很高的特异性，能够快速检测到α-鹅膏毒肽。
二、核酸适配体H06最佳浓度的检测
1、将生物素标记的适配体用1×PBS稀释到不同的工作浓度，每个孔加100μL，用不干胶或封口膜密封，于37℃、150rpm振荡器上孵育1-2h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2min，每次都要在干净的吸水纸上拍干；
2、按适配体结合缓冲液与40ng/μL的α-鹅膏毒肽溶液体积比1:1比例加入到包被有生物素标记的适配体的酶标板中，每个孔加100μL，用不干胶密封，于37℃、150rpm振荡器上孵育1-2h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2min，同样的每次都要在于净的吸水纸上拍干；
3、往每孔中加入100μL辣根过氧化物酶结合物，用不干胶密封，于37℃、150rpm振荡器上孵育1h，洗涤3次，每次2min；
4、每孔加入TMB100μL，于37℃避光显色l0min；
5、加25μL终止液（2M硫酸），并在反应终止10min以内用酶标仪测各孔450nm处吸光度值OD450；
6、结果表明，适配体H06的最佳浓度为80nM（结果见图4）。
三、核酸适配体H06对α-鹅膏毒肽的灵敏度的检测
1、将生物素标记的适配体用1×PBS稀释到工作浓度，每个孔加100μL，用不干胶或封口膜密封，于37℃、150rpm振荡器上孵育1-2h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2min，每次都要在干净的吸水纸上拍干；
2、按适配体结合缓冲液与不同浓度的α-鹅膏毒肽溶液体积比1:1比例加入到包被有生物素标记的适配体的酶标板中，每个孔加100μL，用不干胶密封，于37℃、150rpm振荡器上孵育1-2h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2min，同样的每次都要在于净的吸水纸上拍干；
3、往每孔中加入100μL辣根过氧化物酶结合物，用不干胶密封，于37℃、150rpm振荡器上孵育1h，洗涤3次，每次2min；
4、每孔加入TMB100μL，于37℃避光显色l0min；
5、加25μL终止液（2M硫酸），并在反应终止10min以内用酶标仪测各孔450nm处吸光度值OD450；
6、结果表明，适配体H06能检测到蘑菇毒素α-鹅膏毒肽的最低浓度为8ng/μL（结果见图5）。
序列表
<110>昆明理工大学
<120>一种与α-鹅膏毒肽特异结合的核酸适配体及应用
<160>3
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tgacatattcagtctgacagcggaagcgggtcagtccaactcacggtctcggatgcacgg60
gagatggacgaatatcgtctagca84
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gacatattcagtctgacagc20
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gctagacgatattcgtccatc21
Claims (3)
1.一种与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
2.根据权利要求1所述核酸适配体，其特征在于：其二级结构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-15.36。
3.权利要求1所述核酸适配体在识别α-鹅膏毒肽或在制备检测α-鹅膏毒肽的试剂盒中的应用。
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105177009B (zh) | 2018-05-25 |
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