CN103013999A - 一组特异识别伏马菌素b1的寡核苷酸适配子 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一组伏马菌素B1的单链DNA核酸适配子，是通过SELEX技术结合表面固定了伏马菌素B1的磁珠对原始单链DNA随机文库进行筛选、扩增、测序、亲和力及特异性分析得到的。该组DNA适配子作为伏马菌素B1的一种特异高效识别配体，为开发替代现有依赖抗体检测伏马菌素B1的方法提供了新的选择，可用于分析检测或分离富集食品、环境中的伏马菌素B1。所述核酸适配子分子量小，化学合成成本低且易于标记，亲和性和特异性强，变性与复性可逆且速度快，可反复使用、室温运输和长期保存。

Description

一组特异识别伏马菌素B1的寡核苷酸适配子

技术领域

本发明涉及一组特异识别伏马菌素B1的寡核苷酸适配子及其制备方法，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)制备一组特异结合伏马菌素B1的寡核苷酸适配子，属于生物技术领域。

背景技术

伏马菌素(Fumonisins)是串珠镰刀菌在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的水溶性次级代谢产物，在全世界范围内分布广泛，主要污染粮食作物及饲料尤其对玉米及其制品污染严重，还可存在于以谷物为原料的一些产品中，如面条、啤酒、调味品等。伏马菌素的热稳定性高，不易被破坏，对人畜具有神经毒性、肺毒性等多种毒性及致癌性，主要损伤肝脏和肾脏，严重危害人类和动物的健康。国际癌症研究院(The International Agency for Research onCancer)已将伏马菌素定为2B组致癌物质(可能是人类致癌物)，其中伏马菌素B1的毒性强且污染率高。加入WTO之后，农产品及相关食品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品生物安全性的要求也越来越高。为了保证这类产品的顺利进出口贸易和食用者的健康，出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门迫切需要一种特异、快速、简便的伏马菌素B1检测方法。

目前伏马菌素B1的测定方法有多种，如：薄层层析法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC/MS)、毛细管电泳法(CE)、液相色谱-质谱法(LC/MS)和酶联免疫测定法(ELISA)等方法。薄层层析法操作简单，适合于没有经过专门培训的人员操作，且成本低，无需价格昂贵的仪器；但其步骤较繁琐，灵敏度低。HPLC法准确度高，灵敏度性强，可作为定量检测方法，但是这种方法前处理过程繁琐，操作复杂，在实验时需要对伏马菌素进行柱前衍生化处理，而且通常需要专业人员进行操作，仪器设备昂贵，检测过程耗时且费用较高，不适于在基层推广及大量样品的现场快速检测。ELISA法特异性强，灵敏度高，准确性好，操作简便，适于大批量样品的检测；但检测的灵敏度和试剂盒的稳定性方面离实际应用还有一定的距离，此外免疫法需依赖于制备繁琐耗时且成本昂贵的抗体，且制得的抗体批次间稳定性不如寡核苷酸，抗体的储存条件也较寡核苷酸严苛。

近些年来，寡核苷酸适配子作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注目。寡核苷酸适配子是通过SELEX过程筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，系统进化指数富集技术)是20世纪90年代发展起来的一种新的组合化学技术，具有经济、简便、快速、适用范围广等特点。SELEX技术利用大容量的随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，使其得到指数级富集，经过多轮筛选最终获得高亲和力、高特异性的寡核苷酸适配子。与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸随机文库中筛选出的适配子具有很多优势：(1)寡核苷酸分子本身分子量很小，其化学结构和性质提供了易于标记的特性，易于合成及化学修饰使之便于后续试验；(2)不依赖于动物体内免疫，不存在抗体由于不同批次生产带来的差异性；(3)某些寡核苷酸适配子具有强于抗体的亲和性和特异性，无免疫原性；(4)核苷酸稳定性好，易于保存和运输，对高温和剧烈环境不如抗体敏感。

本发明以食品及环境中常见的伏马菌素B1为靶标，利用竞争SELEX技术制备获得了与伏马菌素B1高特异性高亲和力结合的寡核苷酸适配子。该寡核苷酸适配子经修饰后可直接用于荧光或化学发光、发色方法检测伏马菌素B1以丰富实验室检测手段，也可用于开发伏马菌素B1试纸条或便携式小型仪器以实现家庭、农田、工厂快速检测，因此该发明可以在食品安全检测、环境监测等领域得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能与伏马菌素B1特异性结合的寡核苷酸适配子并用于快速、准确检测伏马菌素B1，为开发新型伏马菌素B1分析方法或检测工具奠定良好基础。

本发明采用以下技术方案：

体外合成一个长度为80nt的含40个随机序列的单链DNA文库，以及长度均为20nt的上下游引物及磷酸化下游引物；优化PCR条件及Lambda核酸外切酶消化磷酸化反义链制备单链次级文库的条件；将伏马菌素B1通过戊二醛二步偶联法固定在磁珠上作为筛选靶标，采用竞争SELEX技术筛选出具有高亲和力的伏马菌素B1寡核苷酸适配子；通过DNAMAN软件分析序列同源性将测序所得序列分为11个家族，并通过结构预测软件RNA StructureProgram分析预测寡核苷酸适配子的二级结构；合成生物素标记的11条寡核苷酸适配子，通过与伏马菌素B1磁珠的结合试验分析寡核苷酸适配子的亲和力，以及与链霉亲和素磁珠的竞争结合解离试验鉴定寡核苷酸适配子的特异性。

本发明的优点：

(1)以Lambda核酸外切酶消化磷酸化反义链制备单链次级文库，克服了变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳、非对称PCR或借助链霉亲和素磁珠分离单链方法中存在的操作繁琐、耗时长、效率低或易引入背景污染(如双链DNA模板、生物素化互补链或链霉亲和素分子)等不足，使其制备的ss DNA具有更高的纯度和效率。

(2)获得了能与伏马菌素B1高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸适配子，为进一步开发伏马菌素B1的新型分析方法或检测工具奠定了基础。

(3)因为是通过SELEX技术获得的小分子寡核苷酸适配子，本发明具有制备方法简单、周期短、无需动物体内免疫，且寡核苷酸适配子的合成简便、易于标记、稳定性好、成本低廉等优点，相对于抗体的优势显而易见。

附图说明

图1是Lambda核酸外切酶消化制备单链次级文库的变性PAGE电泳图；

图2是伏马菌素B1寡核苷酸适配子11个家族代表序列的二级结构分析图；

图3是伏马菌素B1寡核苷酸适配子1F、3F及8F的特异性试验结果图；

表1是SELEX筛选过程中每一轮筛选条件的说明；

表2是伏马菌素B1寡核苷酸适配子11条代表序列的解离常数Kd值。

具体实施方式：

以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。

实施例1：伏马菌素B1特异性结合寡核苷酸适配子的竞争SELEX筛选

1、体外化学合成初始随机单链DNA(ssDNA)文库及引物(由美国IDT公司完成)

序列如下：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG(40N)CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′(40N代表40个随机核苷酸)；

上游引物：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′

下游引物：5′-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3′

5′磷酸化下游引物：5′-P-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3′

将随机ssDNA文库和引物均用TE缓冲液配制成100μM贮存液存于-20℃备用。

2、PCR扩增条件及Lambda核酸外切酶消化制备单链次库的条件

将合成的随机单链文库(ssDNA)稀释作为PCR模板扩增出磷酸化的双链DNA(dsDNA)产物，研究Lambda核酸外切酶消化磷酸化反义链制备单链次库的影响因素，最终确定制备单链次库的最佳条件。

PCR反应体系为：稀释随机文库作为模板DNA1μL(100ng)，上游引物及磷酸化下游引物(20μM)各1μL，dNTP_mix(each25mM)1μL，10×PCR扩增缓冲液5μL，灭菌超纯水40μL，Taq酶1μL，总体积为50μL。PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；57℃退火30s；72℃延伸30s；循环25次；最后72℃延伸5min。通过8％非变性PAGE验证扩增效果。

将电泳条带位置正确且单一的PCR扩增产物汇集在一个2mL离心管中，加入与PCR产物溶液等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(V∶V∶V＝25∶24∶1)，旋涡混匀管内容物使呈乳状，12000rpm，4℃离心15s，将上层液体小心移入另一离心管，弃去两相界面和有机相。重复操作一次，直至两相界面上见不到蛋白质为止。向含样品的离心管中加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)溶液及2倍体积的无水乙醇，充分混匀后放-70℃冰箱内过夜。取出平衡，12000rpm，4℃离心15min。吸弃上清，用4℃预冷的70％乙醇0.5-1mL上下颠倒洗涤白色固体沉淀，12000rpm，4℃离心5min。吸弃上清，打开盖子将沉淀晾干后，重溶于适当体积的灭菌超纯水中，通过Thermo NanoDrop2000超微量分光光度计测定dsDNA浓度。

取确定浓度的纯化PCR产物溶液，往其中加入按酶活定义计算出的所需核酸外切酶(5U/μL)，加入1/10体积的10×反应液混合均匀，在37℃下反应30min～2h，75℃水浴10min使酶失活停止反应。通过7M尿素变性8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，置0.5μg/mL溴化乙锭溶液中染色后，将胶置于凝胶成像仪中观察验证酶切反应是否完全(结果如图1所示)，确定最佳酶切条件后再进行放大酶切。将酶切产物汇集在一个1.5mL离心管中，以酚氯仿乙醇沉降法提纯，将ssDNA沉淀物重溶于适当体积的缓冲液中，通过Thermo NanoDrop2000超微量分光光度计测定ssDNA浓度。

3、筛选所用靶标的获取与处理：

为了实现快速分离孵育体系中的与靶标结合ssDNA与不结合ssDNA的目的，将伏马菌素B1小分子以共价键结合的形式固定在氨基磁珠表面。伏马菌素B1分子本身有一个伯胺基，因而采用戊二醛二步偶联法。先用5％戊二醛-PBS溶液室温活化氨基磁珠2h，使氨基磁珠表面接上“连接臂”戊二醛分子，用PBS溶液洗涤3次后，加入伏马菌素B1溶液，继续室温反应24h。采用傅里叶红外光谱仪分析戊二醛偶联磁珠及伏马菌素B1偶联磁珠，定性验证偶联成功；并采用领苯二甲醛衍生化-HPLC法测定反应前后溶液中伏马菌素B1浓度的变化，定量验证偶联成功。将伏马菌素B1偶联磁珠及戊二醛偶联磁珠，用结合缓冲液BB(100mMNaCl，20mM Tris-HCl，2mM MgCl₂，5mM KCl，1mM CaCl₂，0.02％Tween20，pH7.4)清洗多次后重新分散在BB中(浓度为4mg磁珠/mL)保存于4℃冰箱中待用。

4、SELEX筛选13轮：

第一轮筛选时，取溶解在500μL结合缓冲液BB中的2nmol随机ssDNA文库，经94℃水浴加热7min，立即冰浴15min后室温放置10min(目的一是回温平衡，目的二是ssDNA与Ep管孵育以除去与Ep管结合的ssDNA序列)；此间取500μL伏马菌素B1靶标磁珠悬液，用BB冲洗6次，磁分离弃上清；将ssDNA溶液500μL从原管中转移到磁珠管中，在漩涡振荡混合仪上混合均匀，室温摇晃孵育1h。孵育结束后，用BB缓冲液反复洗涤磁珠-ssDNA复合物6次，每次500μL BB。最后将磁珠重新分散于100μL解离缓冲液(20mM Tris-HCl，2mM MgSO₄，10mM KCl，1mM CaCl₂，0.02％Tween20，pH7.4)中，于94℃水浴10min后迅速取出在漩涡震荡仪上震荡10s，加磁铁将上清液吸出即为解离液。重复解离操作3次，将多次解离液汇集在一管中混匀作为PCR扩增的模板DNA。

PCR反应体系为：单链DNA解离液5μL，上游引物及磷酸化下游引物(20μM)各1μL，含Mg²⁺dNTP_mix1μL(25mM)，10×PCR缓冲液5μL，Taq聚合酶(5U/μL)1μL，加灭菌超纯水至50μL。反应程序为：95℃，5min；95℃，30s；57℃，30s；72℃，30s；循环25次；72℃，5min。第1-13轮筛选的PCR产物，均通过非变性8％聚丙烯酰胺凝胶电泳验证扩增效果，然后将PCR总体积扩大为100μL/管进行大批量扩增纯化，并用Lambda核酸外切酶消化法制备单链次库作为下一轮SELEX筛选投入的次库。

第二轮筛选时，将溶解在BB中的200pmol单链次库(第1-13轮ssDNA文库投入量见表1)，经94℃水浴加热7min，立即冰浴15min后室温放置10min；此间取500μL戊二醛偶联磁珠悬液，用BB冲洗6次，磁分离弃上清；将ssDNA溶液500μL从原管中转移到磁珠管中，在漩涡振荡混合仪上混合均匀，室温摇晃孵育1h。孵育结束后，磁分离用移液枪小心吸取溶液，加入到事先准备好的装有伏马菌素B1靶标磁珠悬液的离心管中，室温摇晃孵育1h。孵育结束后，用BB缓冲液反复洗涤磁珠-ssDNA复合物6次，每次500μL BB。最后将磁珠重新分散于100μL解离缓冲液中，于94℃水浴10min后迅速取出在漩涡震荡仪上震荡10s，立刻加磁铁将上清液吸出即为解离液。将多次解离液汇集在一管中混匀作为扩增模板进行PCR扩增(非变性8％PAGE电泳验证)，核酸纯化；Lambda酶切(尿素变性8％PAGE电泳验证)制备单链次库，核酸纯化后Thermo NanoDrop2000超微量分光光度计测定ssDNA浓度计算下一轮文库投入体积。

第三轮筛选时，将溶解在BB中的200pmol单链次库，经94℃水浴加热7min，立即冰浴15min后室温放置10min；此间取500μL戊二醛偶联磁珠，用BB冲洗6次，磁分离弃上清；将ssDNA溶液500μL从原管中转移到磁珠管中，在漩涡振荡混合仪上混合均匀，室温摇晃孵育1h。孵育结束后，磁分离用移液枪小心吸取溶液，加入到事先准备好的装有2mg伏马菌素B1靶标磁珠的离心管中，室温摇晃孵育1h。孵育结束后，用BB缓冲液反复洗涤磁珠-ssDNA复合物6次，每次500μL BB。最后将磁珠重新分散于100μL解离缓冲液中，于94℃水浴10min后迅速取出在漩涡震荡仪上震荡10s，加磁铁将上清液吸出即为解离液。重复解离操作3次，将300μL解离液加入到伏马菌素B2偶联磁珠中，室温孵育30min后，磁分离用移液器小心吸出上清液即为第三轮筛选获得的与伏马菌素B1结合但是不与戊二醛偶联磁珠及伏马菌素B2磁珠结合的寡核苷酸适配子。

之后每一轮SELEX筛选均按照类似操作进行，但随着筛选的推进，解离前BB洗涤靶标磁珠-ssDNA复合物的次数由6次增加到9次。同时，为了筛选到富集快速且亲和力高的寡核苷酸适配子序列，在随后的筛选中逐渐缩短孵育时间及减少对解离ssDNA的扩增循环次数。此外，从第3轮开始，加入伏马菌素B2磁珠、玉米赤霉烯酮磁珠、黄曲霉毒素AFB1磁珠或黄曲霉毒素AFB2磁珠的反筛；并且从第11轮开始，往孵育体系中加入竞争结合的因素(伏马菌素B2、黄曲霉毒素AFB1、黄曲霉毒素AFB2及玉米赤霉烯酮ZEN溶液)，并在解离缓冲液中加入微量伏马菌素B1，以提高寡核苷酸适配子对伏马菌素B1的特异性。13轮筛选的条件控制说明如表1所示：

5、克隆测序及序列分析

将第13轮筛选得到的寡核苷酸适配子扩增产物，送至上海生工生物技术公司，经纯化、连接克隆载体、转化并经“蓝-白斑筛选”后，随机挑选阳性克隆进行测序，共获得45条寡核苷酸适配子序列。用DNAMAN软件对该寡核苷酸适配子序列进行一级结构分析，获得同源性信息；并用RNA Structure4.2软件对寡核苷酸适配子序列的二级结构进行分析。根据伏马菌素B1寡核苷酸适配子的一、二级结构特征，将45条序列分为11个家族，从每个家族中选出1条能级较低、结构稳定的序列为代表(11条代表序列二级结构图如图2所示)由上海生工合成以作进一步的亲和力和特异性分析。

6、伏马菌素B1寡核苷酸适配子亲和力和特异性分析

6.1亲和力分析

将11条伏马菌素B1寡核苷酸适配子分别用BB稀释为不同的浓度梯度(10、50、100、400、700、1000、1300、1600nM)各200μL，与伏马菌素B1偶联磁珠(1mg)室温孵育1h，用BB洗涤三次，95℃加热解离10min，用Thermo NanoDrop2000超微量分光光度计测定解离液核酸浓度(测三次取平均值)，利用GraphPad Prism5软件计算各寡核苷酸适配子的解离常数Kd值。表2为11条代表序列的Kd值说明：

6.2特异性分析

根据6.1的分析结果，挑选出与伏马菌素B1亲和力较强的3条寡核苷酸适配子(1F、3F、8F)进行特异性分析，将5′生物素标记的寡核苷酸适配子偶联到链霉亲和素磁珠，取一定量寡核苷酸适配子-磁珠复合物用于杂交化FAM标记的短链(5′-FAM-CACGATGGCACTT-3′)。用BB洗涤2次后，将复合物悬液均分为6管，磁分离弃上清后重新悬浮在400μL BB中，并分别加入100μL一定浓度的伏马菌素B1、伏马菌素B2、玉米赤霉烯酮ZEN、黄曲霉毒素AFB1、黄曲霉毒素AFB2及BB溶液；于37℃避光孵育1h后终止反应，取上清置于避光Ep管中，用日立F-7000荧光光谱仪测定荧光值(测三次取平均值)。荧光强度值越大，说明毒素分子特异竞争结合寡核苷酸适配子的能力越强。由图3所示，1F、3F、8F寡核苷酸适配子与伏马菌素B1的结合率高于与其他四种真菌毒素，表明这3条寡核苷酸适配子均可特异识别伏马菌素B1。

本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或局部该进，都将视为在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一组特异识别伏马菌素B1的寡核苷酸适配子，其核苷酸序列为：

1)序列表1～3所示的核苷酸序列；

2)序列表1～3所示核苷酸序列经替换、缺失和/或者插入一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的序列；或，

3)含有序列表1～3所示核苷酸序列为核心序列并两边延长的序列。

2.权利要求1所述的伏马菌素B1适配子，其特征在于其5′端或3′端可以进行生物素、FITC、地高辛等化学修饰，其特征还在于单独或联合使用修饰或不修饰适配子均能用于伏马菌素B1的分析检测。

3.权利要求1所述伏马菌素B1适配子在分析检测或分离富集伏马菌素B1中的应用。

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