CN108866060A - 一种特异性结合甲壳类精氨酸激酶的核酸适配体、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种特异性结合甲壳类精氨酸激酶的核酸适配体、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合甲壳类精氨酸激酶的核酸适配体、试剂盒及检测方法。所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。基于该核酸适配体，本发明建立了一种近场光波靶向传感器检测甲壳类精氨酸激酶的方法，具有高特异性、高灵敏度、稳定性高、重现性好等优势。核酸适配体易于合成，化学修饰简单，无免疫原性，能与精氨酸激酶特异性结合且亲和力高，可以提高生物传感器的稳定性，进而实现灵敏性高、特异性强、操作简单的检测。

Description

一种特异性结合甲壳类精氨酸激酶的核酸适配体、试剂盒及 检测方法
技术领域
本发明涉及食品分析技术领域和食品检测技术领域，特别是涉及一种特异性结合甲壳类精氨酸激酶的核酸适配体、试剂盒及检测方法。
背景技术
水产品蛋白质含量丰富，味道鲜美。随着其每年逐步上升的消费量，水产品在人们日常生活中占据着日益重要的地位。但是，作为八大主要过敏食品中的一种，甲壳类水产品极易引起特定人群的过敏反应。据统计，在亚洲国家中，大约有40％的成人和儿童会对甲壳类产生过敏反应。
目前，美国、欧盟和新西兰等国家均要求对过敏食品进行过敏原标示，以提醒消费者，避免误食。因此，过敏原含量的检测是进行过敏食品的生产、评估和标示工作的基础和首要任务。精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)和原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)广泛存在于虾、蟹等甲壳类中，是甲壳类中两种主要的过敏原。
目前，甲壳类精氨酸激酶检测方法主要有ELISA、PCR、RT-PCR等技术。这些技术存在检测时间长、灵敏度和精确度不高(易出现假阳性)等问题。为了保护消费者，帮助易感人群规避风险，建立对甲壳类精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)的高效、灵敏、准确的甲壳类精氨酸激酶检测技术在我国具有重要的应用价值。
公开号为CN107918018A的中国发明专利公开了一种基于抗体技术的近场光波靶向传感器检测甲壳类过敏原的方法，用Cy5.5荧光染料与过敏原单克隆抗体进行偶联，精氨酸激酶抗原包被光纤，待测样品与标记抗体先进行预反应，然后将混合液注入样品池，光纤探头插入样品池中，使光纤上的包被抗原与未反应的标记抗体进行结合，再利用近场光波靶向传感器采集和检测荧光强度变化，从而检测样品液中过敏原的含量。但单抗本身价格较高，制备繁琐且对保存条件较为严格。
核酸适配体(Apatamer)是一段具有特异性识别功能的单链核酸分子，可以识别蛋白、核酸以及其他无机、有机分子等。适配体具有特异性强、亲和力高、靶标范围广等特点，能够分辩出靶物质结构上的细微差别，被称为“人工抗体”。与传统的抗体相比，适配体作为新型的分子识别元件，具有热稳定性好、长期无限保存、无免疫原性、活性均一、变性后可复性等优点。
发明内容
本发明通过筛选获得了一种特异性结合甲壳类精氨酸激酶的核酸适配体，基于该核酸适配体建立了一种近场光波靶向传感器检测甲壳类精氨酸激酶的方法。
一种特异性结合甲壳类精氨酸激酶的核酸适配体，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该核酸适配体通过对甲壳类精氨酸激酶随机ssDNA文库进行一系列筛选，最终获得的与甲壳类精氨酸激酶结合效果最好的一个，可以用于特异性检测甲壳类精氨酸激酶。
本发明又提供了一种用于检测甲壳类精氨酸激酶的试剂盒，包含如权利要求1所述的核酸适配体。
所述核酸适配体上标记有荧光染料。所述荧光染料优选为Cy5.5，当然其他常用的荧光染料也可以使用。
本发明还提供了一种基于核酸适配体的近场光波靶向传感器检测甲壳类精氨酸激酶的方法，包括以下步骤：
(1)使用荧光染料标记核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
(2)将光纤探头表面连接包被精氨酸激酶，然后使用牛血清白蛋白封闭非特异性吸附点；
(3)配制一系列浓度梯度的精氨酸激酶标准溶液，分别与步骤(1)制备的经荧光染料标记的核酸适配体溶液等体积混合均匀，进行预反应，将预反应后的混合液通入样品池，将步骤(2)处理后的光纤探头安装在传感器上，插入样品池中，采集由近场光波激发的荧光信号值，将测试数据进行归一化处理，并使用Logistic模型模拟得到标准曲线；
(4)将待测样品按步骤(3)方法进行检测，测得信号值代入标准曲线得到待测样品中精氨酸激酶的浓度。
上述方法中，采集由近场光波激发的荧光信号值，将测试数据进行归一化处理，公式如下：
并使用4参数的Logistic模型进行模拟得到标准曲线。其公式为：
两式中，y为信号强度，x为抗原浓度，A1、A2分别为曲线的上、下渐近线，x0为曲线拐点(半抑制浓度)，液浓度作为横坐标绘制标准曲线；p是拐点处的曲线斜率。
所述的方法中，所述荧光染料为Cy5.5，当然其他常用的荧光染料也可以使用。
步骤(2)中精氨酸激酶的使用浓度为1～2mg/mL。
步骤(3)中预反应时间为5～10min。
步骤(3)中进样检测的反应时间为15～20min。
步骤(3)中经荧光染料标记的核酸适配体溶液的浓度为10～20nM。
本发明通过筛选获得了一条能够特异性与甲壳类精氨酸激酶结合的核酸适配体，可以用于特异性检测样品中的精氨酸激酶。本发明利用该核酸适配体建立了一种近场光波靶向传感器检测甲壳类精氨酸激酶的方法，具有高特异性、高灵敏度、稳定性高、重现性好等优势。核酸适配体易于合成，化学修饰简单，无免疫原性，能与精氨酸激酶特异性结合且亲和力高，可以提高生物传感器的稳定性，进而实现灵敏性高、特异性强、操作简单的检测。
由于传感器只能收集结合于探针的荧光信号，能够避免反应溶液中的荧光染料产生干扰，提高灵敏度和特异性，可以有效避免ELISA产生的假阳性。此外，此方法具有较好的特异性，适用于在成分复杂的水产制品中甲壳类精氨酸激酶的检测需求。
附图说明
图1为本发明核酸适配体筛选流程图。
图2为实施例5中标准曲线拟合结果图。
具体实施方式
实施例1
精氨酸激酶的制备：(1)取50g南美白对虾肌肉，去虾头、尾、壳及肠线。(2)将虾肌肉用小刀切成泥状，溶于buffer A(50mM NaCl、2mM NaHCO3、10mM EDTA)用均质机均质并于4℃静置2h。(3)8000r/min，4℃离心20min，取上清液，加入70％硫酸铵，于4℃静置8h。(4)8000r/min，4℃离心20min，取上清液，加入90％硫酸铵，于4℃静置6h。(5)8000r/min，4℃离心20min，取沉淀。沉淀溶于Buffer B(20mM Tris-HCL、1mM NaCl，pH 8.0)。(6)采用ANXSepharose Fast Flow阴离子交换柱，0.5M NaCl溶液梯度洗脱，收集洗脱产物，得到精氨酸激酶，备用。
实施例2
核酸适配体的筛选。
构建甲壳类精氨酸激酶随机ssDNA文库。(文库容量为1014片段长度为40bp，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
如图1所示，本发明采用三种模式交替筛选。
第一种筛选中，将ssDNA文库与精氨酸激酶(实施例1制备)于37℃孵育1h，然后加入到石墨烯溶液(石墨烯粉末，5mg/ml，购自阿拉丁试剂(上海)有限公司)。所得混合物在37℃培养吸附自由松散的ssDNA。将混合物在12000转/分钟转速下进行离心15min，分离去除沉淀中未结合的ssDNA和石墨烯，剩余的上清液含有与精氨酸激酶结合的ssDNA，进行不对称PCR扩增(限制性引物与非限制性引物比例为1∶50；序列分别是5’-CAG GGG AGC GAG CG-3’；5’-ATG AGG CAG GGG CCT CG-3’，扩增条件：95℃变1min；循环条件，95℃，30s；50℃，30s；72℃，1min；延长，72℃，3min。)。随后，对PCR产物进行纯化和ssDNA核酸外切酶消化制备。筛选出的核酸适配体结合缓冲液(BB：50mM Tris，150mM NaCl，2mM MgCl2，pH 7.4)于95℃加热5分钟并在冰上冷却15分钟以获得单链核苷酸的最佳构象结构。最后，进行纯化的单链DNA作为下一轮的子库。
第二种筛选中，先将新的ssDNA文库与石墨烯溶液在37℃孵育1h，将混合物在12000转/分钟转速下进行离心15min，将沉淀洗涤再离心，重复三次。沉淀复溶后加入精氨酸激酶，混合培养得到与精氨酸激酶结合的ssDNA，进行不对称PCR扩增(方法同第一种筛选)，随后，对PCR产物进行纯化和ssDNA核酸外切酶消化制备。最后，进行纯化的单链DNA作为下一轮的子库。
第三种筛选中，将ssDNA与卵清蛋白、木瓜蛋白、原肌球蛋白在37℃孵育1h，混合液中加入石墨烯继续孵育，混合物在12000转/分钟转速下进行离心15min，去上清，将沉淀中的ssDNA与石墨烯分离进行不对称PCR扩增，扩增后得到的ssDNA即是最后得到的核酸适配体。
经过多次筛选后，得到8条核苷酸序列。标记Cy5.5荧光染料的核酸适配体(浓度为0～200nM，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成)与1μM的精氨酸激酶于黑暗处孵育2h，在10000r/min，4℃条件下离心15min，取上清液测试其荧光值。数据分析得到解离常数(Kd)，解离常数小则亲和性强，其中，最强亲和性的核苷酸序列为所需序列，命名为核酸适配体A1，标记Cy5.5荧光染料的核酸适配体A1的核苷酸序列：
5’-Cy5.5-CCAGGCCGCCAACGTTGACCTAGAAGCACTGCCAGACCCG-3’。
实施例3
先用piraha溶液(H2SO4∶H2O2＝3∶1)浸泡光纤探头600μm石英光纤(NA＝0.22，南京春辉)30min，超纯水充分清洗，氮气吹干，使探头表面羟基化；然后用2％(v/v)甲苯溶液浸泡光纤探头1h，甲苯充分清洗，氮气吹干，接下来用5％(v/v)戊二醛溶液在37℃下浸泡光纤探头2h，甲苯充分清洗，120℃烘箱烘干，使探头表面硅烷化；将处理好的光纤探头放入精氨酸激酶溶液(浓度为1mg/mL)中浸泡，4℃浸泡过夜，以连接包被精氨酸激酶；用超纯水冲洗光纤探头，然后置于4mg/mL BSA(牛血清白蛋白)溶液中浸泡2h以封闭非特异性吸附点。包被好的光纤探头可在4℃下保存数月。
实施例4
基于核酸适配体的近场光波靶向传感器(专利申请号201711037844.3)检测甲壳类精氨酸激酶的方法体系建立。
将待检测样品与实施例1中标记Cy5.5荧光染料的核酸适配体(浓度为10～20nM)等体积(15μL)混合均匀，进行预反应(室温下避光反应)，预反应时间为5～10min，然后将预反应后的混合液加入样品池，进样，将实施例2制备的包被好的光纤探头安装在传感器上，插入样品池中，反应15min～20min，采集由近场光波激发的荧光信号值。
检测完成一个样品后，使用0.5％SDS溶液(pH 1.9)和10mM PBS(pH 7.4)对光纤进行再生和清洗，用于检测下一个样品。
实施例5
标准曲线制定。按实施例3中方法进行检测。
将浓度为10nM、15μL的标记Cy5.5荧光染料的核酸适配体(实施例1)与不同浓度(0、0.1、0.5、1、5、10、50、100μg/mL)的精氨酸激酶溶液(15μL)混合孵育，预反应10min；进样后反应15min。
检测所得数据通过Logistic回归模型进行分析，并得到线性拟合方程。如图2所示，回归方程为y＝98.6+101.7/(1+x/2.79)，R2＝0.996，最低检出限为0.03μg/mL，定量限为0.09μg/mL。
实施例6
样品的制备：：取2g南美白对虾肌肉，用液氮研磨成粉，然后采用凯基全蛋白提取试剂盒提取蛋白浸液。具体步骤如下：(1)在预冷的1mL Lysis Buffer中分别加入1μL蛋白酶抑制剂、10μL磷酸酶抑制剂及5μL 100mM PMSF，混匀后置冰上保存数分钟待用；(2)取一只新鲜南美白对虾，去虾头、尾、壳及肠线。将虾肌肉用小刀切成泥状，置于研钵中，加入液氮研磨，直至粉末状。(3)快速称取0.1g虾粉置于1.5mL预冷离心管中，加入1mL上述混合液，混匀后4℃静置2h；(4)10000r/min，4℃离心5min，取上清液，分装保存于-80℃，应避免反复冻融。将提取的虾全蛋白浸液采用ANX Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，用0.2～0.4M NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱产物，PBS透析后得到南美白对虾的杂蛋白混合液。
表1人工添加样品检测结果(n＝6)
实际浓度(μg/mL) 样品检出值(μg/mL) 回收率％
5 5.32±0.03 106
10 9.84±0.02 98
20 19.23±0.12 96
50 46.06±0.10 92
100 95.13±0.06 95
取1mL南美白对虾的杂蛋白混合液，分别加入不同量的AK，使AK浓度为5、10、20、50和100μg/mL，每个浓度6个平行样，进行样品检测(利用实施例3中检测方法)和回收率测定。检测结果如表1所示，在5～100μg/mL浓度添加范围内，回收率在92％～106％，表明该方法可以用于实际样品的检测。
序列表
<110> 浙江工商大学
<120> 一种特异性结合甲壳类精氨酸激酶的核酸适配体、试剂盒及检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
ccaggccgcc aacgttgacc tagaagcact gccagacccg 40
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
caggggagcg agcg 14
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
atgaggcagg ggcctcg 17

Claims (10)

1.一种特异性结合甲壳类精氨酸激酶的核酸适配体，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No.1所示。
2.一种用于检测甲壳类精氨酸激酶的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的核酸适配体。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸适配体上标记有荧光染料。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为Cy5.5。
5.一种基于核酸适配体的近场光波靶向传感器检测甲壳类精氨酸激酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用荧光染料标记核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
(2)将光纤探头表面连接包被精氨酸激酶，然后使用牛血清白蛋白封闭非特异性吸附点；
(3)配制一系列浓度梯度的精氨酸激酶标准溶液，分别与步骤(1)制备的经荧光染料标记的核酸适配体溶液等体积混合均匀，进行预反应，将预反应后的混合液通入样品池，将步骤(2)处理后的光纤探头安装在传感器上，插入样品池中，采集由近场光波激发的荧光信号值，将测试数据进行归一化处理，并使用Logistic模型模拟得到标准曲线；
(4)将待测样品按步骤(3)方法进行检测，测得信号值代入标准曲线得到待测样品中精氨酸激酶的浓度。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光染料为Cy5.5。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中精氨酸激酶的使用浓度为1～2mg/mL。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中预反应时间为5～10min。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中进样检测的反应时间为15～20min。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中经荧光染料标记的核酸适配体溶液的浓度为10～20nM。
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