CN110031441B - 一种赭曲霉毒素的检测试剂盒及其检测赭曲霉毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种赭曲霉毒素的检测试剂盒及其检测赭曲霉毒素的方法，属于有害物质检测技术领域。本发明赭曲霉毒素的检测试剂盒，包括赭曲霉毒素的核酸适配体、与该核酸适配体不完全互补的cDNA、两个发卡序列H1和H2；其中，所述赭曲霉毒素的核酸适配体的序列如序列表SEQ ID NO.1所示；所述两个发卡序列H1和H2能够自组装成长链；所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA能够触发发卡序列H1和H2的自组装。本发明提供的试剂盒，具有很高的灵敏度与特异性，操作简单，检测快速，结果肉眼可见，适合所有实验室进行推广，无需专业培训即可实现对赭曲霉毒素的实时现场分析。

Description

一种赭曲霉毒素的检测试剂盒及其检测赭曲霉毒素的方法

技术领域

本发明属于有害物质检测技术领域，具体涉及一种赭曲霉毒素的检测试剂盒及其检测赭曲霉毒素的方法。

背景技术

赭曲霉毒素是属于真菌毒素组的天然污染物，由各种真菌类型的曲霉菌和青霉菌产生。赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)作为一种霉菌毒素，20世纪60年代在南非的玉米粉中被发现。多年的研究表明，OTA具有肾毒性、肝毒性、胚胎毒性、致畸性、神经毒性、免疫毒性、遗传毒性和致癌性。在6种已知的赭曲霉毒素类型中，赭曲霉毒素A显示出最高的毒性。国际癌症研究机构(Intemational Agency for Research on Cancer，IARC)根据几项动物研究中发现的大量致癌性证据，将OTA列为可能的人类致癌物(2B类)。由于OTA在自然界广泛存在，且性质非常稳定，不容易代谢，研究者陆续在动物肾脏、肝脏、猪肉、猪血、香肠、风干肉等动物源性食品中检测出OTA。国内相关检测方法主要有：GB 5009.96-2016、LS/T6126-2017、SN/T 4675.10-2016等，但是这些标准中都没有针对动物源性食品的检测方法。所以加快国家方法标准的建立非常必要。同时，国内也暂时没有制定动物源食品OTA限量要求，但是部分国家已经有了相关规定，丹麦规定猪肾脏及血液中最高允许量为10μg/kg和25μg/mL，罗马尼亚规定猪肉、肝脏及猪肾中不超过5μg/kg，意大利规定猪肉及熟肉制品中不超过lμg/kg。

目前动物源性食品中OTA的检测方法有薄层色谱法、液相色谱法、毛细管电泳一二极管阵列检测法、液相色谱一串联质谱法、酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析技术等。其中液相色谱和液相色谱。串联质谱法是目前比较主流的检测手段，而酶联免疫法虽然重现性差，但是操作简单、灵敏度较高，所以比较适合大批量样品的检测或初筛。从检测方法来看，虽然酶联免疫法是快速筛查OTA污染的理想手段，但是其特异性稍差，容易产生假阳性，目前利用HPLC荧光检测器对动物源性食品进行定量分析仍然是主流。根据样品基质的不同，其提取手段稍有差别，选择合适的提取溶剂、调节pH值、加入蛋白水解酶、OTA甲酯化、加入脱脂步骤都被证明可以有效提高回收率和重现性。利用LC/MS/MS的高特异性和灵敏度，研究者可以建立多种组分毒素分析方法进一步提高检测准确性和检测效率。对样品净化来说，商品化的免疫亲和柱是目前多数研究人员的首选，虽然其价格昂贵、保存要求高、上样量有限制，但其特异性强，可以更有效去除干扰物质，这对于痕量分析是非常有利的。

核酸适配体(Aptamer)是一段寡核苷酸，通过体外人工进化程序(Systematicevolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选得到，它可以高效、特异地结合各种配体，如蛋白、小分子化合物、细胞等，特异性如同抗体一样。由于它的易合成、易储存和易修饰等优点，在医学诊断治疗、药物分子设计及分析检测中具有良好的应用前景。但是，如何将核酸适配体更好的应用于赭曲霉毒素的检测之中，需要进一步的探索和研究。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供用于检测赭曲霉毒素的试剂盒，以及检测赭曲霉毒素的方法，以缓解现有技术中存在的赭曲霉毒素检测灵敏度低、操作不便的技术问题。

为了达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种赭曲霉毒素的检测试剂盒，包括赭曲霉毒素的核酸适配体、与该核酸适配体不完全互补的cDNA、两个发卡序列H1和H2；

其中，所述赭曲霉毒素的核酸适配体的序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

所述两个发卡序列H1和H2能够自组装成长链；

所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA能够触发发卡序列H1和H2的自组装。

在上述方案的基础上，所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA一端具有与发卡序列H1环部序列互补的序列；这段序列通过与发卡序列H1的环部序列互补配对，打开发卡序列H1的茎环结构，以此触发发卡序列H1和H2的自组装。

在上述方案的基础上，所述发卡序列H1的茎部序列与发卡序列H2的环部序列互补，被打开的发卡序列H1通过序列互补打开发卡序列H2的茎环结构；发卡序列H2的茎部序列与发卡序列H1环部序列完全互补或不完全互补；被打开的发卡序列H2通过序列互补进一步打开另一个发卡序列H1的茎环结构；以此完成自组装过程。

在上述方案的基础上，所述发卡序列H1和H2的3’端和5’端分别具有能够形成G-四聚体结构的部分前体核苷酸序列。

在上述方案的基础上，所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA与所述赭曲霉毒素核酸适配体之间不互补的碱基个数为3-7个。

在上述方案的基础上，所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

在上述方案的基础上，所述发卡序列H1和H2的序列如序列表SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。

在上述方案的基础上，所述赭曲霉毒素的检测试剂盒还包括高铁血红素和过氧化物酶HRP的催化底物。

一种赭曲霉毒素的检测方法，步骤为：

(1)将赭曲霉毒素核酸适配体和与该核酸适配体不完全互补的cDNA混合后，95℃水浴5min后，置于室温自然冷却，使两者通过核酸互补配对形成双链；

(2)向体系中加入待测样品，室温反应30min，使得赭曲霉毒素与双链中的赭曲霉毒素核酸适配体结合并打开双链结构；使与该核酸适配体不完全互补的cDNA游离成单链；

(3)向2)中反应体系中加入发卡序列H1和H2的混合液，室温反应1小时，进行自组装反应；

(4)向3)中反应体系中加入高铁血红素，室温反应10min；

(5)向4)中反应体系中加入过氧化物酶HRP的催化底物，室温反应5-10分钟，终止反应；

其中，所述赭曲霉毒素的核酸适配体的序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA一端具有与发卡序列H1环部序列互补的序列；这段序列通过与发卡序列H1的环部序列互补配对，打开发卡序列H1的茎环结构，以此触发发卡序列H1和H2的自组装；

所述发卡序列H1的茎部序列与发卡序列H2的环部序列互补，被打开的发卡序列H1通过序列互补打开发卡序列H2的茎环结构；发卡序列H2的茎部序列与发卡序列H1环部序列完全互补或不完全互补；被打开的发卡序列H2通过序列互补进一步打开另一个发卡序列H1的茎环结构；以此完成自组装过程；

所述发卡序列H1和H2的3’端和5’端分别具有能够形成G-四聚体结构的部分前体核苷酸序列；

所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA与所述赭曲霉毒素核酸适配体之间不互补的碱基个数为3-7个。

在上述方案的基础上，

所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

所述发卡序列H1和H2的序列如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明技术方案的优点：

本发明提供的核酸适配体，能够特异性的识别赭曲霉毒素，能够用于赭曲霉毒素的检测；本发明提供的试剂盒，具有很高的灵敏度与特异性，操作简单，检测快速，结果肉眼可见，适合所有实验室进行推广，无需专业培训即可实现对赭曲霉毒素的实时现场分析。

附图说明

图1本发明检测方法的原理图；

图2为不同浓度的靶标赭曲霉毒素的检测结果图；

图3为赭曲霉毒素浓度与吸光度线性图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非特别说明，本发明涉及的“aptamer”即为“核酸适配体”。

本发明用核酸适配体Aptamer作为分子识别元件，捕获目标菌后，通过构建的DNA自组装非酶信号扩增系统，用于对赭曲霉毒素的超灵敏可视化检测。本发明提供的方案的设计原理和思路具体如下：

(1)特异性识别赭曲霉毒素Apatmer的筛选

本实验中目标菌富集和信号扩增都依赖于所选核酸适配体的亲和力及特异性。通过应用赭曲霉毒素为正筛菌，沙门氏菌、李斯特菌和大肠杆菌为负筛菌进行Cell-SELEX筛选，从而筛选出能特异性识别赭曲霉毒素的特异性核酸适配体，为下一步的检测奠定基础。通过流式细胞仪分析计算出筛选出来的核酸适配体与目的菌体的解离常数Kd值，从中选择两条结合力最强的核酸序列，则为所需Aptamer。获得的Aptamer序列用于下一步内容(2)的链置换反应。

(2)赭曲霉毒素介导的Aptamer链置换反应

以赭曲霉毒素Aptamer为识别分子，设计与Aptamer互补的DNA序列，分析赭曲霉毒素介导的链置换反应。在Aptamer和互补DNA中的临近末端修饰相应的荧光基团和淬灭基团，当目标菌存在时，可以将Aptamer从互补双链中置换下来，通过分析荧光强度来评价链置换效果。当赭曲霉毒素与Aptamer特异性稳定结合后，被封闭的互补DNA则暴露出来，从而启动下一步内容(3)的DNA自组装信号放大过程。

(3)DNA自组装通用型信号扩增体系的构建

基于茎环发卡结构(Hairpin)的DNA自组装，设计一种通用型的信号扩增体系。这部分需要分析Hairpin的结构，通过荧光法评价Hairpin与cDNA结合启动自组装过程，评价cDNA在循环扩增中的作用。研究启动链的长度对自组装反应的影响，可通过比色法观察颜色变化强弱进行分析自组装效率。通过对Hairpin的茎环长度、序列进行改变，来比较信号扩增前后比色法中响应值的变化，以优化Hairpin的自组装效率。分析Hairpin自组装时间、反应体系缓冲液以及反应温度对扩增体系的影响。这样的自组装可以将痕量的赭曲霉毒素信号高效放大，产生的大量自组装DNA产物将用于启动下一步内容(4)的可视化分析。

(4)可视化分析平台的设计与实现

利用G-quadruplex的过氧化物酶活性特征，以G-quadruplex作为可视化分析的传感元件，将G-四聚体序列设计在内容(3)中的Haripin茎部，使内容(2)中产生的单链DNA能打开Hairpin的茎环结构而激活G-四聚体。激活后的G-四聚体具有DNAzyme催化活性，将无色底物氧化成蓝色的可溶性产物，直接通过肉眼观察实验结果，适于现场快速检测分析。对市面上购买的实际样品进行分析，并将检测结果与传统的生化培养方法、仪器分析方法等进行比较，验证该核酸传感平台的准确性，进行误差分析，并进一步优化实验中的主要参数，稳定核酸传感。

与现有技术相比，本发明提供的检测赭曲霉毒素的方案具有如下优势：

(1)本发明体系中无需加入聚合酶进行信号扩增，减少了背景信号。

(2)本发明体系中无需对靶标序列进行任何修饰，而且当赭曲霉毒素混在实际水产样品中仍然可以检测到信号，该方法可以用于实际样品的定量检测。

(3)本发明中用DNA自组装形成的双链作为信号放大方式，反应快速方便，缩短了操作时间。

(4)本发明所述的DNA自组装非酶检测方法具有很高的灵敏度，检测限为0.1fM，比已报道的方法高出10多倍，线性范围0.1fM-1nM。检测迅速方便，直接肉眼分析，节约了检测成本。

(5)本发明所述的核酸适配体识别靶标菌具有很高的特异性，其他物质对检测不产生影响。

(6)通过改变核酸序列，本发明所述的方法可以用于检测一系列不同的食源性病原微生物。

实施例1用于检测赭曲霉毒素的试剂盒

本实施例提供了一种用于检测赭曲霉毒素的试剂盒，试剂盒中包括以下物质：

赭曲霉毒素的核酸适配体，具有如SEQ ID NO.1所示的序列：

5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’(SEQ ID NO.1)；

与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA，具有如SEQ ID NO.2所示的序列：

5’-TGTCCGTAGCTCCCAATTCACCTCCGTCACCCGATC-3’(SEQ ID NO.2)；

发卡序列H1，具有如SEQ ID NO.3所示的序列：

5’-AGGGCGGGGGTGTGGGGGCGTCTAACGGAGGTGAATTGGGTTT-3’(SEQ ID NO.3)；

发卡序列H2，具有如SEQ ID NO.4所示的序列：

5’-TGGGTAGACGCCCCCACACCAAGAAGAAGAATGCCTCCACTTAACCCTA-3’(SEQ ID NO.4)

高铁血红素；

四甲基联苯胺(TMB)。

其中，赭曲霉毒素核酸适配体与cDNA不完全互补结合，H1和H2各自形成发卡结构。

实施例2检测赭曲霉毒素的方法

本实施例提供了实施例1提供的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)将赭曲霉毒素核酸适配体和与该核酸适配体不完全互补的cDNA混合后，95℃水浴5min后，置于室温自然冷却，使两者通过核酸互补配对形成双链；

(2)向体系中加入2μL的PBS稀释赭曲霉毒素待测样品，室温反应30min，使得赭曲霉毒素与双链中的赭曲霉毒素核酸适配体结合并打开双链结构；使与该核酸适配体不完全互补的cDNA游离成单链；

(3)向2)中反应体系中加入发卡序列H1和H2的混合液，室温反应1小时，进行自组装反应；

(4)向体系中加入高铁血红素，室温反应10min，让高铁血红素充分掺入自组装双链中。

(5)向体系中加入过氧化物酶HRP的催化底物(即底物混合液A+B，其中，A为四甲基联苯胺TMB，B为双氧水)，室温反应5-10分钟，可见颜色由无色变成蓝色，当颜色不再加深时，加入H₂SO₄终止反应。检测原理如图1所示。

实施例3不同浓度的靶标赭曲霉毒素的检测

本实施例针对不同浓度的靶标赭曲霉毒素进行了检测，具体包括以下内容：

配制赭曲霉毒素的标准溶液，终浓度分别为10μg/mL，100μg/mL，500μg/mL，1mg/mL室温保存。

将不同浓度的赭曲霉毒素分别按照实施例2中的方法进行检测，充分反应，检测450nm处吸光强度和肉眼观察颜色变化。

从图2的检测结果可以看出，当存在赭曲霉毒素时，颜色由无色变成蓝色(图中未示出)，吸光值明显增加；且随着赭曲霉毒素浓度的增加，吸光值增加。其中，Hemin空白组为只有高铁血红素加磁珠，不加前期自组装的DNA产物，磁珠空白组为只有磁珠，不加前期自组装的DNA产物。

为了评估这个检测方法的灵敏度，配置了不同浓度的赭曲霉毒素，从10μg/mL到1mg/mL，并测定检测的吸光值。从图3的检测结果可以看出，当10μg/mL的赭曲霉毒素存在时，吸光值是阴性对照读数的三倍以上，说明该方法对赭曲霉毒素的检测限10μg/mL，比传统的检测方法高出10多倍。并且，随着赭曲霉毒素浓度的增加(从10μg/mL到1mg/mL)，吸光值也随着增加，菌体浓度的对数(log₁₀)与吸光值呈很好的线性关系，其线性范围是从10μg/mL到1mg/mL。

其中，图3的横坐标表示赭曲霉毒素浓度的对数(log₁₀)，图2和图3的纵坐标中的“Abs”表示吸光值。

针对赭曲霉毒素污染范围广、爆发率高、危害大的特点，本发明用核酸适配体Aptamer作为分子识别元件，捕获目标污染物分子后通过构建的DNA自组装非酶信号扩增系统，用于对赭曲霉毒素的超灵敏可视化检测。该核酸传感器可在常温下使用、简单易操作、检测成本较低、结果肉眼可见，适用于现场快速分析食品中赭曲霉毒素的污染情况；该比色法分析体系在食品安全检测中具有广泛的应用前景。而目前还没有报道DNA自组装技术用于赭曲霉毒素的检测，并且本发明技术方案符合现代赭曲霉毒素现场检测的要求。

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种赭曲霉毒素的检测试剂盒及其检测赭曲霉毒素的方法

<130> 2019

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(ochratoxins)

<400> 1

gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(ochratoxins)

<400> 2

tgtccgtagc tcccaattca cctccgtcac ccgatc 36

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(ochratoxins)

<400> 3

agggcggggg tgtgggggcg tctaacggag gtgaattggg ttt 43

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(ochratoxins)

<400> 4

tgggtagacg cccccacacc aagaagaaga atgcctccac ttaacccta 49

Claims (7)

1.一种赭曲霉毒素的检测试剂盒，其特征在于：包括赭曲霉毒素的核酸适配体、与该核酸适配体不完全互补的cDNA、两个发卡序列H1和H2；

其中，所述赭曲霉毒素的核酸适配体的序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

所述两个发卡序列H1和H2能够自组装成长链；

所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA能够触发发卡序列H1和H2的自组装；

所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA一端具有与发卡序列H1环部序列互补的序列；这段序列通过与发卡序列H1的环部序列互补配对，打开发卡序列H1的茎环结构，以此触发发卡序列H1和H2的自组装；

所述发卡序列H1的茎部序列与发卡序列H2的环部序列互补，被打开的发卡序列H1通过序列互补打开发卡序列H2的茎环结构；发卡序列H2的茎部序列与发卡序列H1环部序列完全互补或不完全互补；被打开的发卡序列H2通过序列互补进一步打开另一个发卡序列H1的茎环结构；以此完成自组装过程；

所述发卡序列H1和H2的3’端和5’端分别具有能够形成G-四聚体结构的部分前体核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述赭曲霉毒素的检测试剂盒，其特征在于：

所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA与所述赭曲霉毒素核酸适配体之间不互补的碱基个数为3-7个。

3.根据权利要求2所述赭曲霉毒素的检测试剂盒，其特征在于：所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述赭曲霉毒素的检测试剂盒，其特征在于：

所述发卡序列H1和H2的序列如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求1所述赭曲霉毒素的检测试剂盒，其特征在于：还包括高铁血红素和过氧化物酶HRP的催化底物。

6.一种赭曲霉毒素的检测方法，其特征在于：步骤为：

(1)将赭曲霉毒素核酸适配体和与该核酸适配体不完全互补的cDNA混合后，95℃水浴5min后，置于室温冷却，使两者通过核酸互补配对形成双链；

(2)向体系中加入待测样品，室温反应30min，使得赭曲霉毒素与双链中的赭曲霉毒素核酸适配体结合并打开双链结构；使与该核酸适配体不完全互补的cDNA游离成单链；

(3)向2)中反应体系中加入发卡序列H1和H2的混合液，室温反应1小时，进行自组装反应；

(4)向3)中反应体系中加入高铁血红素，室温反应10min；

(5)向4)中反应体系中加入过氧化物酶HRP的催化底物，室温反应5-10分钟，终止反应；

其中，所述赭曲霉毒素的核酸适配体的序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA一端具有与发卡序列H1环部序列互补的序列；这段序列通过与发卡序列H1的环部序列互补配对，打开发卡序列H1的茎环结构，以此触发发卡序列H1和H2的自组装；

所述发卡序列H1的茎部序列与发卡序列H2的环部序列互补，被打开的发卡序列H1通过序列互补打开发卡序列H2的茎环结构；发卡序列H2的茎部序列与发卡序列H1环部序列完全互补或不完全互补；被打开的发卡序列H2通过序列互补进一步打开另一个发卡序列H1的茎环结构；以此完成自组装过程；

所述发卡序列H1和H2的3’端和5’端分别具有能够形成G-四聚体结构的部分前体核苷酸序列；

所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA与所述赭曲霉毒素核酸适配体之间不互补的碱基个数为3-7个。

7.根据权利要求6所述赭曲霉毒素的检测方法，其特征在于：

所述与赭曲霉毒素核酸适配体不完全互补的cDNA序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

所述发卡序列H1和H2的序列如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

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