CN114577886B - 一种检测中药中外源有害物质的试剂、试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种检测中药中外源有害物质的试剂、试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测中药中外源有害物质的试剂、试剂盒和检测方法，属于中药污染物检测技术领域。本发明所述试剂包括有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA；所述有害物质包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷；所述有害物质的适配体分别如SEQ ID NO.1～3所示；所述有害物质的核酸适配体的互补单链DNA分别如SEQ ID NO.4～6所示。本发明所述试剂能够实现中药中有害物质的高效检测，操作简单，成本低，准确性高且能够实现有害物质的定量检测。

Description

一种检测中药中外源有害物质的试剂、试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及中药污染物检测技术领域，具体涉及一种检测中药中外源有害物质的试剂、试剂盒和检测方法。
背景技术
中药材多来源于天然动植物，极易受有害物质污染，如真菌毒素、农药残留等。同时中药物质基础高度复杂，干扰物质种类繁多，污染物难以通过预处理去除。因此，实现中药样品中有害物质的有效检测具有很大难度。现有对于中药中外源污染物的检测手段主要有高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)等。HPLC、TLC等色谱技术检测前处理过程复杂，且难以精确定量；MS操作复杂，检测成本高。针对现有检测技术，其可靠性、灵敏度和检测通量上仍有较大提升空间。因此，中药有害物质检测领域需要一项操作相对简便，成本较低的高效检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测中药中外源有害物质的试剂、试剂盒和检测方法。本发明所述试剂能够实现中药中有害物质的高效检测，操作简单，成本低，准确性高且能够实现有害物质的定量检测。
本发明提供了一种检测中药中外源有害物质的试剂，所述试剂包括有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA；所述有害物质包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷；所述有害物质的核酸适配体包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的黄曲霉毒素B1适配体、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的赭曲霉毒素A适配体和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的甲拌磷适配体；所述有害物质的核酸适配体的互补单链DNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的黄曲霉毒素B1适配体互补单链DNA、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的赭曲霉毒素A适配体互补单链DNA和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的甲拌磷适配体互补单链DNA；
所述有害物质的核酸适配体的5'端标记荧光淬灭基团BHQ1；
所述有害物质的核酸适配体的互补单链DNA的3'端标记荧光基团FAM。
优选的是，所述试剂的溶剂包括TE缓冲溶液。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述试剂的毛细管电泳检测中药中外源有害物质的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述试剂、水、甲醇、毛细管检测用凝胶缓冲液和毛细管检测用运行缓冲液。
优选的是，所述毛细管检测用凝胶缓冲液包括ssDNA 100-R Gel。
优选的是，所述毛细管检测用运行缓冲液包括三硼酸尿素缓冲液。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述试剂或上述技术方案所述试剂盒的毛细管电泳检测中药中外源有害物质的方法，包括以下步骤：
1)在黑暗环境下，将浓度均为0.001～10ng/mL的黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷与上述技术方案所述试剂中有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA混合反应后，得到毛细管电泳加标样品溶液；设定激发波长为488nm，测得发射波长520nm下各类有害物质对应的荧光峰高度；将各浓度梯度有害物质对照荧光峰高度作线性回归，获得标准曲线；
2)将中药粉末与甲醇水溶液混合，离心取上清，得到中药样品溶液；
3)在黑暗环境下，将步骤2)得到的样品溶液与上述技术方案所述试剂中有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA混合反应后，得到毛细管电泳样品溶液；
4)将步骤3)得到的毛细管电泳样品溶液进行毛细管电泳，设定激发波长为488nm，测得发射波长520nm各荧光峰高度；
5)将步骤4)测得的荧光峰高度对照步骤1)标准曲线，计算获得中药样品溶液中有害物质的浓度。
优选的是，步骤2)所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为(0.25～9)：1；所述中药粉末与甲醇水溶液的质量比为1：(2～500)。
优选的是，步骤3)中，各有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA的终浓度分别为0.01nM～1mM。
优选的是，步骤3)所述反应的时间为1～120min。
优选的是，步骤4)所述毛细管电泳条件为：进样时间0.2～30s，进样电压0.2～10kV；分离时间2～180min，分离电压0.5～50kV。
本发明提供了一种检测中药中外源有害物质的试剂。本发明所述试剂能够用于快速、高通量、前处理简单、准确性高的有害物质毛细管电泳检测。本发明毛细管电泳检测时，样品前处理方法简单，分离能力强，且操作简单，可在短时间内完成复杂有害物质体系成分分离。此外，本发明毛细管电泳检测结合荧光原理，基于荧光基团间荧光淬灭与恢复准确测定目标荧光信号，并将相同浓度的目标物信号强度放大数百倍，能够得到更精确的目标物定量结果并减少样品用量，灵敏度高。本发明还能够同时检测出中药中不同种类真菌毒素与农药残留，与传统检测方法相比，具有高通量检测特性，并可以对有害物质进行定量，具有很高的检测效率。
附图说明
图1为本发明提供的中药中外源有害物质黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷毛细管电泳检测原理示意图；
图2为本发明提供的毛细管电泳检测待测目标物、核酸适配体与互补单链DNA混合反应后荧光淬灭与恢复效果图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测中药中外源有害物质的试剂，所述试剂包括有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA；本发明所述有害物质包括黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)和甲拌磷(Phorate)；所述有害物质的核酸适配体包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的黄曲霉毒素B1适配体：5'-BHQ1-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-3'、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的赭曲霉毒素A适配体：5'-BHQ1-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3'和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的甲拌磷适配体：5'-BHQ1-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3'。所述有害物质的核酸适配体的互补单链DNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的黄曲霉毒素B1适配体互补单链DNA：5'-TTCACGTGCCCAAC-FAM-3'、核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示的赭曲霉毒素A适配体互补单链DNA：5'-AAGTTACCACACCCGATC-FAM-3'和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的甲拌磷适配体互补单链DNA：5'-TTATATAGCAAGCT-FAM-3'；所述有害物质的核酸适配体的5'端标记荧光淬灭基团BHQ1；所述有害物质的核酸适配体的互补单链DNA的3'端标记荧光基团FAM。本发明对所述核酸适配体的合成方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的基因合成公司进行合成即可，如Sangon Biotech(中国上海)合成并优选通过HPLC纯化，-20℃保存。
在本发明中，所述试剂的溶剂优选包括TE缓冲溶液。本发明所述核酸适配体均是用TE缓冲溶液进行溶解，本发明优选配制成核酸适配体浓度为0.01μM～10mM的储备样品进行保存，待检测前是用TE缓冲溶液稀释至所需浓度即可。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述试剂的毛细管电泳检测中药中外源有害物质的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述试剂、水、甲醇、毛细管检测用凝胶缓冲液和毛细管检测用运行缓冲液。在本发明中，所述水优选为双蒸水(ddH2O)。本发明所述甲醇优选为分析纯。在本发明中，所述毛细管检测用凝胶缓冲液优选包括ssDNA 100-RGel(购自SCIEX公司试剂盒ssDNA 100-R Kit)。在本发明中，所述毛细管检测用运行缓冲液优选包括三硼酸尿素缓冲液(Tris-Borate-Urea buffer)由Tris-Borate Buffer与7MUrea混合配制(购自SCIEX公司试剂盒ssDNA 100-R Kit)。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述试剂或上述技术方案所述试剂盒的毛细管电泳检测中药中外源有害物质的方法，包括以下步骤：
1)在黑暗环境下，将浓度均为0.001～10ng/mL的黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷与上述技术方案所述试剂中有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA混合反应后，得到毛细管电泳加标样品溶液；设定激发波长为488nm，测得发射波长520nm下各类有害物质对应的荧光峰高度；将各浓度梯度有害物质对照荧光峰高度作线性回归，获得标准曲线；
2)将中药粉末与甲醇水溶液混合，离心取上清，得到中药样品溶液；
3)在黑暗环境下，将步骤2)得到的样品溶液与上述技术方案所述试剂中有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA混合反应后，得到毛细管电泳样品溶液；
4)将步骤3)得到的毛细管电泳样品溶液进行毛细管电泳，设定激发波长为488nm，测得发射波长520nm各荧光峰高度；
5)将步骤4)测得的荧光峰高度对照步骤1)标准曲线，计算获得中药样品溶液中有害物质的浓度。
本发明在黑暗环境下，将浓度均为0.001～10ng/mL的黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷与上述技术方案所述试剂中有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA混合反应后，得到毛细管电泳加标样品溶液；设定激发波长为488nm，测得发射波长520nm下各类有害物质对应的荧光峰高度；将各浓度梯度有害物质对照荧光峰高度作线性回归，获得标准曲线。
本发明将中药粉末与甲醇水溶液混合，离心取上清，得到中药样品溶液。在本发明中，所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比优选为(0.25～9):1，更优选为7:3；所述中药粉末与甲醇水溶液的质量比优选为1：(2～500)，更优选为1:9。所述离心条件转速优选为8000r/min，离心时间优选为2min。在本发明中，所述离心后，优选进行过滤，所述过滤优选使用孔径为0.22μm或0.45μm膜过滤器进行过滤。
得到中药样品溶液后，本发明在黑暗环境下，将样品溶液与上述技术方案所述试剂中有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA混合反应后，得到毛细管电泳样品溶液。在本发明中，各适配体的终浓度优选为0.01nM～1mM，更优选为10nM。在本发明中，所述反应的时间优选为1～120min，更优选为30min。本发明优选人工添加有害物质进行本发明检测方法的验证，具体的，本发明优选使用甲醇去离子水(甲醇和水体积比为(0.25～9):1)制备黄曲霉毒素B1，赭曲霉毒素A和甲拌磷储备样品溶液(浓度为0.01～10μg/mL)，更优选在具体检测时，以1.0ng/mL加入中药样品溶液中。
得到毛细管电泳样品溶液后，本发明将毛细管电泳样品溶液进行毛细管电泳，设定激发波长为488nm，测得发射波长520nm各荧光峰高度，对照上述标准曲线，计算获得中药样品溶液中有害物质的浓度；与实际已知加标浓度对照，获得样品检测回收率。本发明在中药样品各有害物质的加标检测中回收率均于89％～125％之间，证实本发明切实可行。
本发明对所述毛细管电泳系统没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的毛细管电泳常规系统即可，如P/ACETMMDQ plus Capillary Electrophoresis Systems(SCIEX)。在本发明中，所述毛细管电泳条件为：进样时间0.2～30s，更优选为5s，进样电压0.2～10kV，更优选为3kV；分离时间2～180min，更优选为15min，分离电压0.5～50kV，更优选为20kV。
测得各荧光峰高度后，本发明将测得的荧光峰高度对照标准曲线，计算获得中药样品溶液中有害物质的浓度。本发明具有优选按照上述条件分别对含有0.001ng/mL,0.01ng/mL,0.05ng/mL,0.1ng/mL,0.5ng/mL,1ng/mL,3ng/mL,5ng/mL,7ng/mL,9ng/mL,10ng/mL的黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷标准溶液的样品进行检测，得到毛细管电泳样品溶液后，将毛细管电泳样品溶液进行毛细管电泳，在0.05～7.0ng/mL浓度范围内各物质与相应的荧光强度具有良好的线性关系。黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷的检测限分别为0.02ng/mL，0.025ng/mL，0.034ng/mL(表1)。记录各物质产生的荧光强度值，对标准溶液中黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷浓度作图获得标准曲线，未知样品中黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷所产生的荧光强度与标准曲线对照量化其浓度。
表1毛细管电泳同时检测黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷定量分析数据
本发明运用基于核酸适配体的毛细管电泳技术，中药样品前处理步骤简单易操作，检测方法简单，通过毛细管电泳可在15min内检出样品内污染物(有害物质)相关信号峰，可通过毛细管电泳结果直接进行DNA定量，且本发明方法检测限低至0.02ng/mL，0.025ng/mL，0.034ng/mL，提高了检测灵敏度。此外，本发明运用基于核酸适配体的毛细管电泳技术，可同时测定三种及以上不同种类小分子/离子型外源有害物质，检测效率高，扩大了基于核酸适配体的有害物质检测手段应用途径。
本发明检测原理示意图如图1所示，本发明将黄曲霉毒素B1适配体、赭曲霉毒素A适配体和甲拌磷适配体的5'末端标记BHQ1荧光淬灭基团；将黄曲霉毒素B1适配体互补链、赭曲霉毒素A适配体互补链和甲拌磷适配体互补链的3'末端标记FAM荧光基团。将各适配体与互补链与黑暗环境下混合反应，若反应体系中无有害物质黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷，各适配体与互补链结合形成双链寡核苷酸稳定结构，BHQ1荧光淬灭基团与FAM荧光基团距离足够接近，致使体系荧光完全淬灭，毛细管电泳检测无荧光信号产生。当体系中存在有害物质黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷，各有害物质与其对应的核酸适配体优先结合，致使适配体互补链游离，BHQ1荧光淬灭基团远离FAM荧光基团，体系荧光恢复，毛细管电泳检测对应三种荧光信号产生。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种检测中药中外源有害物质的试剂、试剂盒和检测方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1.仪器与材料
双蒸馏水(ddH2O)。
TE缓冲液(上海源叶生物有限公司)。
毛细管电泳系统P/ACETM MDQ plus Capillary Electrophoresis Systems(SCIEX)。
真菌毒素：黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)，赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)
农药：甲拌磷(phorate)，吡虫啉(imidacloprid)
核酸适配体及其互补单链DNA：黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)，赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)，甲拌磷；相关核酸适配体于Sangon Biotech(中国上海)合成。
薏苡仁原料药材。
2.方法流程
2.1样品准备
使用甲醇去离子水(70:30v/v)制备真菌毒素、农药储备样品(0.5μg/mL)；
对应核酸适配体及互补单链DNA使用TE缓冲溶液溶解，配制100μM核酸适配体及互补单链DNA储备样品；
所有样品分析前使用TE缓冲溶液稀释至所需浓度；
薏苡仁标准原料药材打细粉，用甲醇去离子水(70:30v/v)溶解，料液比1:9，离心取上清，通过0.22μm膜滤器过滤。
2.2检测方法
将黄曲霉毒素B1，赭曲霉毒素A，甲拌磷均以1.0ng/mL加入标准品药材醇提液中；吡虫啉以1.0ng/mL加入标准品药材醇提液中；
各适配体与其互补单链DNA以1:1体积比混合，于黑暗环境下静置30min，完成荧光淬灭过程，配制适配体混合检测溶液。然后将上述混合检测溶液与上述加标原料药材醇提液以9:1体积比混合，配制毛细管电泳样品溶液100μL，各适配体及互补单链DNA组分均采用10nM终浓度进行检测。室温下，将各样品与适配体混合检测溶液在黑暗环境下反应30min后，对样品进行毛细管电泳。
毛细管电泳条件：凝胶缓冲液：ssDNA 100-R Gel
运行缓冲液：三硼酸尿素缓冲液(Tris-Borate-Urea buffer)
采用LIF检测器，毛细管电泳分离方法设置：进样时间5s，进样电压3kV；分离时间15min，分离电压20kV；
针对毛细管电泳检测结果得到的各荧光信号的荧光强度与标准曲线对照，计算得到样品中黄曲霉毒素B1，赭曲霉毒素A和甲拌磷的浓度。
重复三次，以获得回收率和相对标准偏差(RSD)。
3.试验结果
当检测体系中无有害物质黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷存在时，致使体系荧光完全淬灭，毛细管电泳检测无荧光信号产生(图2中的A)；当检测体系中存在有害物质黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷时，体系荧光恢复，且通过毛细管电泳可在15min内检出样品内有害物质信号峰，并可通过毛细管电泳结果对照标准曲线直接进行定量。
如图2中的B所示，15min内依次检出了真菌毒素AFB1、OTA和甲拌磷三种外源污染物。特异性检测结果显示吡虫啉的加入对检测结果无干扰。不同已知浓度的有害物质回收率均在90.0～120.5％之间，RSD在2.5～8.7％范围内。
高选择性：精确检出小分子污染物AFB1、OTA和甲拌磷对外加干扰物质吡虫啉无响应，具有很高的选择性。
高灵敏度：可以检出浓度低至1.0ng/mL的AFB1、OTA和甲拌磷，具有很高的灵敏度。
高检测效率：可以在15min内完成对三种小分子污染物AFB1、OTA和甲拌磷的同时检测，具有很高的检测效率。
实施例2
1.仪器与材料
双蒸馏水(ddH2O)。
TE缓冲液(上海源叶生物有限公司)。
毛细管电泳系统P/ACETM MDQ plus Capillary Electrophoresis Systems(SCIEX)。
真菌毒素：黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)，赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)，玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)
农药：甲拌磷(phorate)
核酸适配体及其互补单链DNA：黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)，赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)，甲拌磷；相关核酸适配体于Sangon Biotech(中国上海)合成。
柏子仁原料药材。
2.方法流程
2.1样品准备
使用甲醇去离子水(70:30v/v)制备真菌毒素、农药储备样品(0.5μg/mL)；
对应核酸适配体及互补单链DNA使用TE缓冲溶液溶解，配制100μM核酸适配体及互补单链DNA储备样品；所有样品分析前使用TE缓冲溶液稀释至所需浓度；
柏子仁标准原料药材打细粉，用甲醇去离子水(70:30v/v)溶解，料液比1:9，离心取上清，通过0.22μm膜滤器过滤。
2.2检测方法
将黄曲霉毒素B1，赭曲霉毒素A，甲拌磷均以1.0ng/mL加入标准品药材醇提液中；玉米赤霉烯酮以1.0ng/mL加入标准品药材醇提液中；
将各适配体与其互补单链DNA以1:1体积比混合，于黑暗环境下静置30min，完成荧光淬灭过程，配制适配体混合检测溶液。然后将上述适配体混合检测溶液与上述加标原料药材醇提液以9:1体积比混合，配制毛细管电泳样品溶液100μL，各适配体及互补单链DNA组分均采用10nM终浓度进行检测。室温下，将各样品与适配体混合检测溶液与黑暗条件下反应30min后，对样品进行毛细管电泳。
毛细管电泳条件：凝胶缓冲液：ssDNA 100-R Gel
运行缓冲液：三硼酸尿素缓冲液(Tris-Borate-Urea buffer)
采用LIF检测器，毛细管电泳分离方法设置：进样时间5s，进样电压3kV；分离时间15min，分离电压20kV。
针对毛细管电泳检测结果得到的各荧光信号的荧光强度与标准曲线对照，计算得到样品中黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷的浓度。
重复三次，以获得回收率和相对标准偏差(RSD)。
3.试验结果
15min内依次检出了真菌毒素AFB1、OTA和甲拌磷三种外源污染物。特异性检测结果显示玉米赤霉烯酮的加入对检测结果无干扰。不同已知浓度的有害物质回收率均在91.5～120.0％之间，RSD在2.7～9.1％范围内。
高选择性：精确检出小分子污染物AFB1、OTA和甲拌磷对外加干扰物质玉米赤霉烯酮无响应，具有很高的选择性。
高灵敏度：可以检出浓度低至1.0ng/mL的AFB1、OTA和甲拌磷。具有很高的灵敏度。
高检测效率：可以在15min内完成对三种小分子污染物AFB1、OTA和甲拌磷的同时检测，具有很高的检测效率。
实施例3
1.仪器与材料
双蒸馏水(ddH2O)。
TE缓冲液(上海源叶生物有限公司)。
SYBR Green 1荧光染料(上海源叶生物有限公司)。
毛细管电泳系统P/ACETM MDQ plus Capillary Electrophoresis Systems(SCIEX)。
真菌毒素：黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)，赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)，展青毒素(patulin)
农药：甲拌磷(phorate)
核酸适配体及其互补单链DNA：黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)，赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)，甲拌磷；相关核酸适配体于Sangon Biotech(中国上海)合成。
五味子原料药材
2.方法流程
2.1样品准备
使用甲醇去离子水(70:30v/v)制备真菌毒素、农药储备样品(0.5μg/mL)；
对应核酸适配体及互补单链DNA使用TE缓冲溶液溶解，配制100μM核酸适配体及互补单链DNA储备样品；所有样品分析前使用TE缓冲溶液稀释至所需浓度；所有样品分析前使用TE缓冲溶液稀释至所需浓度；
五味子标准原料药材打细粉，用甲醇去离子水(70:30v/v)溶解，料液比1:9，离心取上清，通过0.22μm膜滤器过滤。
2.2检测方法
将黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、甲拌磷均以1.0ng/mL加入标准品药材醇提液中；展青毒素以1.0ng/mL加入标准品药材醇提液中；
将各适配体与其互补单链DNA以1:1体积比混合，于黑暗环境下静置30min，完成荧光淬灭过程，配制适配体混合检测溶液。然后将上述适配体混合检测溶液与上述加标原料药材醇提液以9:1体积比混合，配制毛细管电泳样品溶液100μL，各适配体及互补单链DNA组分均采用10nM终浓度进行检测。室温下，将各样品与适配体混合检测溶液与黑暗条件下反应30min后，对样品进行毛细管电泳。
毛细管电泳条件：凝胶缓冲液：ssDNA 100-R Gel
运行缓冲液：三硼酸尿素缓冲液(Tris-Borate-Urea buffer)
采用LIF检测器，毛细管电泳分离方法设置：进样时间5s，进样电压3kV；分离时间15min，分离电压20kV。
针对毛细管电泳检测结果得到的各荧光信号的荧光强度与标准曲线对照，计算得到样品中黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷的浓度。
重复三次，以获得回收率和相对标准偏差(RSD)。
3.试验结果
15min内依次检出了真菌毒素AFB1、OTA和甲拌磷三种外源污染物。特异性检测结果显示展青毒素的加入对检测结果无干扰。不同已知浓度的有害物质回收率均在90.5～121.0％之间，RSD在2.8～9.3％范围内。
高选择性：精确检出小分子污染物AFB1、OTA和甲拌磷对外加干扰物质展青毒素无响应，具有很高的选择性。
高灵敏度：可以检出浓度低至1.0ng/mL的AFB1、OTA和甲拌磷。具有很高的灵敏度。
高检测效率：可以在15min内完成对三种小分子污染物AFB1、OTA和甲拌磷的同时检测，具有很高的检测效率。
对比例1
现有检测外源有害物质的手段主要以色谱及其联用技术为主。王丽娟等(王丽娟，李超，陈嘉杰，等.QuEChERS结合高效液相色谱-串联质谱法测定粮谷中16种真菌毒素[J].酿酒科技:1-9)运用高效液相色谱-串联质谱仪(HPLC-MS/MS)测定粮谷中16种真菌毒素，该方法样品经乙腈-水-乙酸(84:15:1，v/v)溶液超声提取，运用QuEChERS手段进行样品前处理，提取液采用C18、MgSO4净化，净化液用HPLC-MS/MS分析检测，甲醇/乙腈(4+6)-0.1％甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾正负离子模式同时电离，多反应监测(MRM)模式检测，外标法定量，该方法得到检测限为为0.3μg/kg～3.5μg/kg。该技术样品前处理步骤繁琐，需要采用有机溶剂体系对样品溶液中真菌毒素进行提取净化，且分析过程流动相的选择、流速的设置及质谱条件的选择过程比较复杂，操作成本高，难度较大，检测限相对较高。本发明运用基于核酸适配体的毛细管电泳技术，样品前处理步骤简单易操作，检测方法简单，通过凝胶毛细管电泳可在30min内检出样品内污染物相关信号峰，可通过毛细管电泳结果直接进行DNA定量，且本方法检测限低至0.1ng/mL，提高了检测灵敏度。
对比例2
基于核酸适配体的其它检测手段普遍只针对单一有害物质进行检测，不能同时检测多种有害物质，应用途径相对局限。王超等(Wang,C,Li,Y,Zhou,C,et al.Fluorometricdetermination of aflatoxin B1 using a labeled aptamer and gold nanoparticlesmodified with a complementary sequence acting as a quencher[J].MicrochimicaActa,2019,186(11))使用基于核酸适配体的荧光检测方法测定黄曲霉毒素B1。以荧光团标记的核酸适配体作为探针，以cDNA修饰的金纳米粒子作为荧光猝灭剂。基于AFB1的结合从而诱导金纳米颗粒释放荧光适体探针，引起荧光增加，从而对样品中黄曲霉毒素进行检测和定量。本发明运用基于核酸适配体的毛细管电泳技术，可同时测定三种及以上不同种类真菌毒素与农药残留，检测效率高，扩大了基于核酸适配体的有害物质检测手段应用途径。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津中医药大学
<120> 一种检测中药中外源有害物质的试剂、试剂盒和检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggccc 47
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcttgctgc agcgattctt gatcgccaca gagct 35
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcacgtgcc caac 14
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagttaccac acccgatc 18
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttatatagca agct 14

Claims (10)

1.一种试剂盒在毛细管电泳同时检测中药中外源有害物质黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括试剂，所述试剂包括有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA；所述有害物质的核酸适配体包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的黄曲霉毒素B1适配体、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的赭曲霉毒素A适配体和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的甲拌磷适配体；所述有害物质的核酸适配体的互补单链DNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的黄曲霉毒素B1适配体互补单链DNA、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的赭曲霉毒素A适配体互补单链DNA和核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的甲拌磷适配体互补单链DNA；
所述有害物质的核酸适配体的5'端标记荧光淬灭基团BHQ1；
所述有害物质的核酸适配体的互补单链DNA的3'端标记荧光基团FAM。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂的溶剂包括TE缓冲溶液。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括水、甲醇、毛细管检测用凝胶缓冲液和毛细管检测用运行缓冲液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述毛细管检测用凝胶缓冲液包括ssDNA100-R Gel。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述毛细管检测用运行缓冲液包括三硼酸尿素缓冲液。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述毛细管电泳同时检测中药中外源有害物质黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷的方法，包括以下步骤：
1）在黑暗环境下，将浓度均为0.001~10 ng/mL的黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和甲拌磷与权利要求1或2所述试剂中有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA混合反应后，得到毛细管电泳加标样品溶液；设定激发波长为488 nm，测得发射波长520nm下各类有害物质对应的荧光峰高度；将各浓度梯度有害物质对照荧光峰高度作线性回归，获得标准曲线；
2）将中药粉末与甲醇水溶液混合，离心取上清，得到中药样品溶液；
3）在黑暗环境下，将步骤2）得到的样品溶液与权利要求1或2所述试剂中有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA混合反应后，得到毛细管电泳样品溶液；
4）将步骤3）得到的毛细管电泳样品溶液进行毛细管电泳，设定激发波长为488 nm，测得发射波长520 nm各荧光峰高度；
5）将步骤4）测得的荧光峰高度对照步骤1）标准曲线，计算获得中药样品溶液中有害物质的浓度。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2）所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为（0.25~9）:1；所述中药粉末与甲醇水溶液的质量比为1：（2~500）。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤3）中，各有害物质的核酸适配体和有害物质的核酸适配体的互补单链DNA的终浓度分别为0.01 nM~1 mM。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤3）所述反应的时间为1~120 min。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤4）所述毛细管电泳条件为：进样时间0.2~30 s，进样电压0.2~10 kV；分离时间2~180 min，分离电压0.5~50 kV。
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