CN111896508A - 一种基于核酸染料Genefinder快速检测赭曲霉毒素A的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测赭曲霉毒素A的新方法，主要是基于非标记核酸染料Genefinder检测赭曲霉毒素A。该方法是将赭曲霉毒素A适配体与其互补链结合形成双链结构，造成Genefinder染料荧光增强，当加入赭曲霉毒素A后，双链解开，适配体与赭曲霉毒素A形成四链体结构，导致Genedinder染料荧光降低，通过检测荧光强度来实现对赭曲霉毒素A的快速、定量检测。本发明提供的方法简单、特异性强、检测速度快，能够满足现场快速、准确的检测要求。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体是涉及一种基于非标记核酸染料Genefinder的赭曲霉毒素A的快速检测方法。
背景技术
赭曲霉毒素是由曲霉属和青霉属的真菌产生的有毒次级代谢产物，常见的赭曲霉毒素有赭曲霉毒素A（Ochratoxin A, OTA）、赭曲霉毒素B（Ochratoxin B, OTB）及赭曲霉毒素C（Ochratoxin C, OTC），其中毒性最大且最受关注的是OTA，广泛存在粮食及其制品中，具有致畸、致癌、致突变等多种毒性，已被国际癌症研究机构列为2B类致癌物。目前检测OTA的方法有高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、免疫法(Immunoassay)、生物传感器法等。其中色谱法准确度高，但样品前处理复杂，需要专业人员操作以及大型仪器，不能满足目前食品安全快速检测的要求。ELISA法具有高效、快速的特点，但其会出现假阳性问题，并且抗体的制备周期较长、稳定性差，限制了该方法的进一步应用。
适配体是指对目标物具有高特异性结合能力的DNA或RNA。与抗体相比，适配体可体外合成，且制备价格低，稳定性好，以适配体为识别元件的生物传感器在食品安全检测领域显示了巨大的应用前景。Genefinder染料是一种花青素类的染料，具有安全环保、毒性低、灵敏度高等特点。该染料与双链DNA作用后荧光会增强800-1000倍。常用于电泳中核酸染色，而在检测方面相关应用报道较少。因此，本研究利用核酸适配体的特异性，结合荧光染料Genefinder特殊的荧光特性构建荧光传感体系，用于简单、高灵敏、快速检测赭曲霉毒素A。
发明内容
有鉴于此，本发明创造旨在提出一种基于核酸染料Genefinder快速检测赭曲霉毒素A的新方法。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
提供一种基于核酸染料Genefinder快速检测赭曲霉毒素A的新方法，赭曲霉毒素A的适配体与其互补链形成双链结构，Genefinder染料荧光增强，当加入赭曲霉毒素A后，双链打开，适配体与赭曲霉毒素形成四链体结构，导致Genefinder染料荧光减弱。通过检测荧光强度实现对赭曲霉毒素A的快速检测。
本发明具体包括以下步骤：
赭曲霉毒素A适配体及互补链序列分别为：5'-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGGGAG CAT CGG ACA-3'；5'-TGT AAG ATG CTC ACT TTA TAA CAC TCA CAC TAG ATC-3'。赭曲霉毒素A适配体与其互补链水浴90℃变性10min，自然冷却后，以10mM PBS（pH 7.4）缓冲液为反应溶液，将50nM适配体及相同浓度互补链混合，再加入终浓度为0.4×Genefinder染料，嵌合其中形成复合物，导致Genefinder荧光强度显著增强。加入不同浓度赭曲霉毒素A溶液，35℃水浴孵育60min，适配体识别赭曲霉毒素A，与其形成四链体结构，双链打开，嵌合染料复合物解离，荧光减弱，激发波长为500nm，根据荧光强度的变化检测赭曲霉毒素A含量。
相对于现有技术，本发明创造所述的赭曲霉毒素A的检测方法具有以下优势：
本发明利用非标记核酸荧光染料Genefinder与双链嵌合显著增强荧光的特性，同时以适配体作为分子识别元件，构建赭曲霉毒素A的荧光快速检测方法。具有较高的灵敏度和特异性，操作简单方便。
附图说明
构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：
图1为本发明创造实施例所述的原理。
图2为为本发明创造实施例所述的赭曲霉毒素A与Genefinder染料的荧光强度拟合曲线。
图3为本发明创造实施例所述的快速检测方法对赭曲霉毒素A的特异性。
具体实施方式
为了使本发明上述特征和优点更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。
实施例1
赭曲霉毒素A的快速检测方法
赭曲霉毒素A适配体及互补链水浴90℃处理10 min，逐渐冷却至室温备用。以10mM PBS（pH 7.4）缓冲液为反应溶液，将赭曲霉毒素A适配体与等体积等浓度互补链混合（终浓度为50nM），加入终浓度为0.4×Genefinder，再加入一定浓度赭曲霉毒素A溶液，35℃水浴孵育60min，测定荧光光谱（激发波长500 nm）。以赭曲霉毒素A浓度的对数为横坐标，以1-F/F0为纵坐标做拟合曲线，其中F0和F分别表示没有赭曲霉毒素A及添加不同浓度赭曲霉毒素A后Genefinder染料的荧光强度（如图2所示）。
实施例2
选择黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2（AFB2）、黄曲霉毒素M1（AFM1）、黄曲霉毒素G1（AFG1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和T-2毒素作为竞争物，研究该方法的特异性。配制浓度为5μg/L赭曲霉毒素A和浓度为10μg/L竞争毒素。分别利用该方法检测竞争毒素，利用荧光分光光度仪测其荧光值。如图2所示，赭曲霉毒素A可以强烈的降低Genefinder染料的荧光。而竞争毒素对其荧光影响较小。说明该方法对赭曲霉毒素A具有特异性（如图3所示）。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种基于核酸染料Genefinder快速检测赭曲霉毒素A的新方法，其特征在于：
（1）赭曲霉毒素A适配体与其互补链形成双链结构，Genefinder染料嵌入其中形成复合物；
（2）适配体对赭曲霉毒素A特异性识别，双链结构打开。通过检测Genefinder染料荧光强度来实现对赭曲霉毒素A的定量检测。
2.权利要求1所述一种快速检测赭曲霉毒素A的新方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以10mM PBS（pH 7.4）为反应缓冲溶液，终浓度为50nM赭曲霉毒素A适配体与相同浓度互补链混合，再加入终浓度为0.4×Genefinder染料，形成双链结构与染料的复合物；
（2）向上述混合溶液中加入赭曲霉毒素A溶液，35℃水浴孵育60min，用荧光分光光度仪检测非标记核酸染料Genenfinder的荧光强度，激发波长为500nm。
3.根据权利要求2所述的一种快速检测赭曲霉毒素A的新方法，其特征在于：赭曲霉毒素A适配体序列为5'-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3'，其互补链序列为5'-TGT AAG ATG CTC ACT TTA TAA CAC TCA CAC TAG ATC-3'。
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