CN110850091A - 用于检测赭曲霉毒素a的荧光探针与成套试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针与成套试剂。本发明公开的用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针由四甲基罗丹明荧光染料分子标记赭曲霉毒素A得到，用于检测赭曲霉毒素A的成套试剂由用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针与赭曲霉毒素A抗体组成。实验证明，利用本发明的用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针以及由其与赭曲霉毒素A抗体组成的成套试剂可以成功检测赭曲霉毒素A，对赭曲霉毒素A检测限为1‑2500nM，并可以成功从赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素B，伏马毒素B1，伏马毒素B2，玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1中检测到赭曲霉毒素A，检测范围宽，灵敏度高，且操作简单，检测时间短，具有广泛的应用前景。

Description

用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针与成套试剂
技术领域
本发明涉及分析检测领域中，用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针与成套试剂。
背景技术
赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是一种典型的真菌毒素分子，由曲霉和青霉等真菌产生的有毒化合物。赭曲霉毒素A可造成多种谷物、坚果、水果等食品的污染，污染分布广泛。赭曲霉毒素A具有肾毒性、肝毒性和免疫毒性等，而且具有致癌性，因此摄入赭曲霉毒素A污染的食品对健康造成很到的威胁。农产品和多种食品中所允许的赭曲霉毒素A的含量有很严格的限制。灵敏检测赭曲霉毒素A对于食品安全、环境保护和维护身体健康都具有重要的意义。发展快速灵敏检测赭曲霉毒素A在赭曲霉毒素A的快速筛查方面有很大需求，采用免疫抗体等的生物传感分析方法，可克服常规大型仪器监测分析方法如色谱法和质谱法等在检测时间长、检测成本高、操作复杂等局限性。荧光分析方法具有很高的灵敏度、同时操作简单、检测所需时间短，因而荧光分析方法在快速灵敏检测赭曲霉毒素A方面显示出优势。免疫抗体能选择性地与目标分子结合，是常用的亲和配体，在检测赭曲霉毒素A方面具有很广的应用，如酶联分析等，但酶联分析相对来说仍需要多个检测步骤，检测时间较长。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的荧光标记赭曲霉毒素A的荧光探针及用于检测赭曲霉毒素A的成套试剂。
本发明提供的用于检测赭曲霉毒素A的成套试剂，记为成套试剂1，所述成套试剂1由赭曲霉毒素A荧光探针和赭曲霉毒素A抗体组成；
所述赭曲霉毒素A荧光探针由四甲基罗丹明荧光染料分子标记赭曲霉毒素A得到。
所述成套试剂1中，所述赭曲霉毒素A荧光探针可按照包括如下步骤的方法制备得到：
将赭曲霉毒素A、N-羟基琥珀酰亚胺、N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐与N,N-二甲基甲酰胺反应，然后加入带有氨基基团标记的四甲基罗丹明荧光染料分子衍生物进行反应,得到反应产物，从所述反应产物中分离得到所述赭曲霉毒素A荧光探针。
所述赭曲霉毒素A荧光探针的制备步骤中，赭曲霉毒素A、N-羟基琥珀酰亚胺、N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐与N,N-二甲基甲酰胺的配比可为1mg：1mg：1.3mg：500μL。
带有氨基基团标记的四甲基罗丹明荧光染料分子衍生物的添加量满足带有氨基基团标记的四甲基罗丹明荧光染料分子衍生物与赭曲霉毒素A的配比可为1.3mg：1mg。
氨基基团标记的四甲基罗丹明荧光染料分子衍生物，其英文名称Tetramethylrhodamine cadaverine，Invitrogen公司。
所述从所述反应产物中分离得到所述赭曲霉毒素A荧光探针可包括利用高效液相色谱从所述反应产物中分离得到所述赭曲霉毒素A荧光探针。所述赭曲霉毒素A荧光探针可为保留时间为6.3分钟、8分钟和/或9.3分钟下的物质，三者具有相同的分子量(900.33-900.34g/mole之间)，为同分异构体。
所述成套试剂1中，所述赭曲霉毒素A抗体可为赭曲霉毒素A单克隆抗体。所述赭曲霉毒素A单克隆抗体可为OTA的的小鼠单克隆免疫抗体(Abcam公司)。
所述成套试剂1中各物质均可独立包装。所述成套试剂1中所述赭曲霉毒素A荧光探针与所述赭曲霉毒素A抗体的配比可为1:1。
本发明还提供了另一种用于检测赭曲霉毒素A的成套试剂，记为成套试剂2，所述成套试剂2由所述赭曲霉毒素A荧光探针、所述赭曲霉毒素A抗体与赭曲霉毒素A组成。
所述成套试剂2中各物质均可独立包装。
所述赭曲霉毒素A荧光探针，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了用于检测赭曲霉毒素A的试剂盒，所述试剂盒含有所述成套试剂1、所述成套试剂2或所述赭曲霉毒素A荧光探针。
本发明还提供了检测赭曲霉毒素A的方法，所述方法包括：向待测样品中添加所述赭曲霉毒素A荧光探针和所述赭曲霉毒素A抗体，得到待测体系；混合所述赭曲霉毒素A荧光探针和所述赭曲霉毒素A抗体，得到对照体系，所述待测体系与所述对照体系中的所述赭曲霉毒素A荧光探针和所述赭曲霉毒素A抗体均相等；按照包括如下b1)或b2)或b3)的方法确定待测样品中是否含有赭曲霉毒素A：
b1)检测所述对照体系与所述待测体系的荧光强度，如所述待测体系与所述对照体系的荧光强度相等，所述待测样品中不含有或候选不含有赭曲霉毒素A；如所述待测体系的荧光强度小于所述对照体系的荧光强度，所述待测样品中含有或候选含有赭曲霉毒素A；
b2)检测所述对照体系与所述待测体系的荧光偏振值，如所述待测体系与所述对照体系的荧光偏振值相等，所述待测样品中不含有或候选不含有赭曲霉毒素A；如所述待测体系的荧光偏振值小于所述对照体系的荧光偏振值，所述待测样品中含有或候选含有赭曲霉毒素A；
b3)检测所述对照体系与所述待测体系的荧光各向异性值，如所述待测体系与所述对照体系的荧光各向异性值相等，所述待测样品中不含有或候选不含有赭曲霉毒素A；如所述待测体系的荧光各向异性值小于所述对照体系的荧光各向异性值，所述待测样品中含有或候选含有赭曲霉毒素A。
上述方法中，所述待测体系与所述对照体系中所述赭曲霉毒素A荧光探针和所述赭曲霉毒素A抗体的摩尔比均可为1:1。
上述方法中，荧光强度的检测的激发波长为550纳米，发射波长为575纳米。
上述方法中，荧光偏振值的检测的激发波长为550纳米，发射波长为575纳米。
上述方法中，荧光各向异性值的检测的激发波长为550纳米，发射波长为575纳米。
所述成套试剂1，或所述成套试剂2，或所述赭曲霉毒素A荧光探针，或所述试剂盒在定性或定量检测待测样品中赭曲霉毒素A中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述成套试剂1，或所述成套试剂2，或所述赭曲霉毒素A荧光探针在制备定性或定量检测待测样品中赭曲霉毒素A试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述待测样品可为食品。所述食品可为酒，如啤酒或红酒。
实验证明，利用本发明的赭曲霉毒素A荧光探针以及由其与赭曲霉毒素A抗体组成的成套试剂可以成功检测赭曲霉毒素A，对赭曲霉毒素A检测限为1-2500nM，并可以成功从赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素B，伏马毒素B1，伏马毒素B2，玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1中检测到赭曲霉毒素A，检测范围宽，灵敏度高，且操作简单，检测时间短，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为利用TMR标记的OTA荧光探针和免疫抗体基于荧光强度变化检测OTA。A：荧光光谱曲线随着不同浓度OTA的变化情况，曲线由上至下，对应的OTA的浓度分别为0,1,2,3.9,7.8,15.6,31.2,62.5,125,250,500nM；B：发射波长为575纳米处对应的发射荧光的荧光强度与OTA的浓度的关系。
图2为利用TMR标记的OTA荧光探针基于荧光强度变化检测OTA的特异性结果。
图3为利用TMR标记的OTA荧光探针和免疫抗体基于荧光偏振或荧光各向异性变化检测OTA。A：荧光偏振值变化，B：荧光各向异性值变化。
图4为利用TMR标记的OTA荧光探针和免疫抗体检测OTA的特异性结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
带有氨基基团标记的四甲基罗丹明荧光染料分子衍生物，英文名称Tetramethylrhodamine cadaverine，Invitrogen公司(货号A1318)。
N-羟基琥珀酰亚胺：英文N-hydroxysuccinimide，简写NHS。
N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐：英文名N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride，简写EDC。
N,N-二甲基甲酰胺：N,N-dimethylformamide，简写DMF。
OTA的单克隆免疫抗体：Abcam公司。
PBS溶液由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在PBS溶液中的浓度分别为：10mMNa2HPO4,1.75mM KH2PO4,137mM NaCl,2.7mM KCl,pH 7.4。
赭曲霉毒素A，英文名为Ochratoxin A，简写为OTA，青岛普瑞邦生物工程有限公司。
赭曲霉毒素B，英文名为Ochratoxin B，简写为OTB，青岛普瑞邦生物工程有限公司。
伏马毒素B1：英文名为fumonisin B1，简写为FB1，青岛普瑞邦生物工程有限公司。
伏马毒素B2：英文名为fumonisin B2，简写为FB2，青岛普瑞邦生物工程有限公司。
玉米赤霉烯酮：英文名为zearalenone，简写为ZAE，青岛普瑞邦生物工程有限公司。
黄曲霉毒素B1，英文名为Aflatoxin B1，简写为AFB1，青岛普瑞邦生物工程有限公司。
实施例1：制备四甲基罗丹明荧光染料分子标记的赭曲霉毒素A荧光探针
利用氨基基团标记的四甲基罗丹明荧光染料分子衍生物(英文名称Tetramethylrhodamine cadaverine，这里将tetramethylrhodamine简称为TMR)中的伯氨基基团与OTA分子的羧基基团，进行化学反应，将两者偶联键合，将四甲基罗丹明荧光染料分子标记到OTA分子上。具体反应条件如下：
将1mg OTA、1mg NHS和1.3mg EDC加入到500μL DMF中室温下反应1小时，然后加入1.3mg氨基基团标记的四甲基罗丹明荧光染料分子衍生物室温反应1小时，得到反应产物。
利用高效液相(HPLC)色谱对反应产物进行分离。由于带有氨基基团标记的四甲基罗丹明荧光染料分子衍生物分子是两种同分异构体的混合物，实验中得到了三种TMR标记的OTA分子同分异构体，质谱表征显示其分子量相同，在HPLC纯化过程中，三种分子的保留时间不同，对应的保留时间分别为6.3分钟、8分钟、9.3分钟，分别命名为探针1、探针2和探针3。具体HPLC分离纯化条件如下：采用HPLC仪器型号为Hitachi 2000，色谱柱为SymmetryShield C18柱(5μm,250×4.6mm,GL Sciences Inc.)。流动相为1‰(v/v)甲酸水溶液(溶剂A)和甲醇(溶剂B)。HPLC分离时采用65％(v/v)溶剂A与35％(v/v)溶剂B进行等度洗脱，通过560纳米处吸光度进行检测，其中流速为1.0mL/min。采用质谱仪(6540quadrupole time-offlight(Q-TOF)mass spectrometer(Agilent Technologies,USA))对得到的探针1、探针2和探针3进行表征，所对应的分子离子峰质荷比(m/z)分别为900.3365,900.3326和900.3381与所用荧光染料和OTA的共价偶联物对应的理论值接近(分子式C50H50N5O9Cl,m/z：900.337)。
实施例2：利用TMR标记的OTA荧光探针和免疫抗体基于荧光强度变化检测OTA
实施例1所制得的探针1、探针2和探针3都能与OTA的单克隆免疫抗体高亲和力结合，实验表明TMR标记的OTA荧光探针与免疫抗体结合时，与不和抗体结合时相比，与免疫抗体结合的TMR标记的OTA荧光探针呈现出高的荧光强度。根据荧光探针与不同浓度抗体结合时荧光强度变化,可以测定荧光探针与抗体的亲和力。在PBS溶液中室温(25℃)测定的探针1、探针2和探针3的解离常数分别为2.8±0.2nM、2.4±0.3nM、3.3±0.3nM，表现出相似的亲和特性。
而且基于以上特性，可以利用TMR标记的OTA的荧光探针和OTA的单克隆免疫抗体，发展建立检测OTA的荧光分析方法。
向PBS溶液中添加实施例1所得探针1、OTA的单克隆免疫抗体和待测OTA，得到反应体系，反应体系中探针1的浓度为10nM，OTA的单克隆免疫抗体的浓度为10nM，待测OTA的浓度设置为0,0.5，1,2,3.9,7.8,15.6,31.2,62.5,125,250,500，1000,2000,5000nM。将所得反应体系在室温(25℃)下温育15分钟，然后采用荧光光度计测定荧光光谱或测定荧光强度(Jasco，FP-8300,日本)，其中激发波长为550纳米。测定荧光强度时，选取的发射波长为575纳米。每种浓度设置3个重复处理，测定结果取平均值。
实验结果如图1所示，随着OTA浓度的增加，荧光强度逐渐下降。图1中A显示了典型的发射荧光光谱曲线随着不同浓度OTA的变化情况，曲线由上至下，对应的OTA的浓度分别为0,1,2,3.9,7.8,15.6,31.2,62.5,125,250,500nM。图1中B给出了发射波长为575纳米处对应的发射荧光的荧光强度与OTA的浓度的关系。OTA的检测限为1nM OTA，检测范围为1nM到1000nM。
实施例3：利用TMR标记的OTA荧光探针基于荧光强度变化检测OTA的特异性
待测样品：赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素B，伏马毒素B1，伏马毒素B2，玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1。
向PBS溶液中添加实施例1所得探针1、OTA的单克隆免疫抗体和待测样品，得到反应体系，反应体系中探针1的浓度为10nM，OTA的单克隆免疫抗体的浓度为10nM，待测样品的浓度均为200nM，每种反应体系一种待测样品。将所得反应体系在室温(25℃)下温育15分钟，然后采用荧光光度计测定荧光强度(Jasco，FP-8300,日本)，激发波长为550纳米，发射波长为575纳米。每种样品设置3个重复处理，测定结果取平均值。并设置不含有待测样品的反应体系作为空白对照(Blank)。
检测结果如图2所示，当OTA样品存在时，测得的荧光强度信号显著下降，而其他待测样品(赭曲霉毒素B，伏马毒素B1，伏马毒素B2，玉米赤霉烯酮或黄曲霉毒素B1)存在时，对应的荧光强度信号与空白对照对应的荧光强度信号无显著差异，说明利用TMR标记的OTA荧光探针检测OTA具有很好的特异性。利用这种方法可以实现稀释的啤酒样品中OTA的检测。
实施例4：利用TMR标记的OTA荧光探针和免疫抗体基于荧光偏振或荧光各向异性变化检测OTA
向PBS溶液中添加实施例1所得探针1、OTA的单克隆免疫抗体和待测OTA，得到反应体系，反应体系中探针1的浓度为2nM，OTA的单克隆免疫抗体的浓度为2nM，不同浓度待测OTA。OTA不同浓度样品由5000nM OTA依次2倍稀释得到，最大浓度为5000nM,最低浓度为0.3nM，该范围中另一个浓度为1.2nM。同时还包括空白样品，其溶液中不包含OTA。将所得反应体系在室温(25℃)下温育15分钟，然后采用荧光光度计测定荧光偏振(或荧光各向异性)(Jasco，FP-8300,日本)，其中激发波长为550纳米，发射波长为575纳米。每种浓度设置3个重复处理，测定结果取平均值。
结果显示，OTA不存在时，反应体系具有高的荧光偏振(荧光各向异性)值，随着OTA浓度的增加，体系的荧光偏振(荧光各向异性)值逐渐下降，直到达到平台期(图3中A为荧光偏振值变化，图3中B为荧光各向异性值变化)。荧光偏振(荧光各向异性)分析检测法的检测限为1.2nM OTA,检测范围为1.2-2500nM。检测中荧光各向异性信号最大变化为0.228，对应的荧光偏振信号最大变化为0.294。
实施例5：利用TMR标记的OTA荧光探针和免疫抗体基于荧光偏振或荧光各向异性变化检测OTA的特异性
待测样品：赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素B，伏马毒素B1，伏马毒素B2，玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1。
向PBS溶液中添加实施例1所得探针1、OTA的单克隆免疫抗体和待测样品，得到反应体系，反应体系中探针1的浓度为2nM，OTA的单克隆免疫抗体的浓度为2nM，待测样品的浓度均为100nM。将所得反应体系在室温(25℃)下温育15分钟，然后采用荧光光度计测定荧光偏振(或荧光各向异性)(Jasco，FP-8300,日本)，其中激发波长为550纳米，发射波长为575纳米。每种待测样品设置3个重复处理，测定结果取平均值。
结果显示(图4)，利用TMR标记的OTA荧光探针检测OTA具有很好的特异性，赭曲霉毒素B(OTB)，伏马毒素B1(FB1)，伏马毒素B2(FB2)，玉米赤霉烯酮(ZAE)和黄曲霉毒素B1(AFB1)等不干扰检测OTA。该方法可以用于稀释红酒样品中OTA的检测。

Claims (10)

1.用于检测赭曲霉毒素A的成套试剂，由赭曲霉毒素A荧光探针和赭曲霉毒素A抗体组成；
所述赭曲霉毒素A荧光探针由四甲基罗丹明荧光染料分子标记赭曲霉毒素A得到。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述赭曲霉毒素A荧光探针按照包括如下步骤的方法制备得到：
将赭曲霉毒素A、N-羟基琥珀酰亚胺、N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐与N,N-二甲基甲酰胺反应，然后加入带有氨基基团标记的四甲基罗丹明荧光染料分子衍生物进行反应，得到反应产物，从所述反应产物中分离得到所述赭曲霉毒素A荧光探针。
3.根据权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：所述赭曲霉毒素A抗体为赭曲霉毒素A单克隆抗体。
4.用于检测赭曲霉毒素A的成套试剂，由权利要求1-3中任一所述赭曲霉毒素A荧光探针和所述赭曲霉毒素A抗体与赭曲霉毒素A组成。
5.权利要求1或2中所述的赭曲霉毒素A荧光探针。
6.用于检测赭曲霉毒素A的试剂盒，含有权利要求1-4中任一所述成套试剂或权利要求1或2中所述的赭曲霉毒素A荧光探针。
7.检测赭曲霉毒素A的方法，包括：向待测样品中添加权利要求1-3中任一所述赭曲霉毒素A荧光探针和所述赭曲霉毒素A抗体，得到待测体系；混合权利要求1-3中任一所述赭曲霉毒素A荧光探针和所述赭曲霉毒素A抗体，得到对照体系，所述待测体系与所述对照体系中的所述赭曲霉毒素A荧光探针和所述赭曲霉毒素A抗体均相等；按照包括如下b1)或b2)或b3)的方法确定待测样品中是否含有赭曲霉毒素A：
b1)检测所述对照体系与所述待测体系的荧光强度，如所述待测体系与所述对照体系的荧光强度相等，所述待测样品中不含有或候选不含有赭曲霉毒素A；如所述待测体系的荧光强度小于所述对照体系的荧光强度，所述待测样品中含有或候选含有赭曲霉毒素A；
b2)检测所述对照体系与所述待测体系的荧光偏振值，如所述待测体系与所述对照体系的荧光偏振值相等，所述待测样品中不含有或候选不含有赭曲霉毒素A；如所述待测体系的荧光偏振值小于所述对照体系的荧光偏振值，所述待测样品中含有或候选含有赭曲霉毒素A；
b3)检测所述对照体系与所述待测体系的荧光各向异性值，如所述待测体系与所述对照体系的荧光各向异性值相等，所述待测样品中不含有或候选不含有赭曲霉毒素A；如所述待测体系的荧光各向异性值小于所述对照体系的荧光各向异性值，所述待测样品中含有或候选含有赭曲霉毒素A。
8.权利要求1-4中任一所述成套试剂，或权利要求1或2中所述的赭曲霉毒素A荧光探针，或权利要求6所述试剂盒在定性或定量检测待测样品中赭曲霉毒素A中的应用。
9.权利要求1-4中任一所述成套试剂，或权利要求1或2中所述的赭曲霉毒素A荧光探针在制备定性或定量检测待测样品中赭曲霉毒素A试剂盒中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述待测样品为食品。
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