CN112375020B - 荧光探针传感器、其制作方法及检测伏马毒素的方法 - Google Patents

荧光探针传感器、其制作方法及检测伏马毒素的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112375020B
CN112375020B CN202010524171.XA CN202010524171A CN112375020B CN 112375020 B CN112375020 B CN 112375020B CN 202010524171 A CN202010524171 A CN 202010524171A CN 112375020 B CN112375020 B CN 112375020B
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
fluorescent probe
reaction
probe sensor
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010524171.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN112375020A (zh
Inventor
曹建华
宫斌
吴子文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Zhenkai Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Qingdao Zhenkai Biomedical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Zhenkai Biomedical Technology Co ltd filed Critical Qingdao Zhenkai Biomedical Technology Co ltd
Priority to CN202010524171.XA priority Critical patent/CN112375020B/zh
Publication of CN112375020A publication Critical patent/CN112375020A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112375020B publication Critical patent/CN112375020B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/30—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/37—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups having the sulfur atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C311/38—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups having the sulfur atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring having sulfur atoms of sulfonamide groups and amino groups bound to carbon atoms of six-membered rings of the same carbon skeleton
    • C07C311/39—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups having the sulfur atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring having sulfur atoms of sulfonamide groups and amino groups bound to carbon atoms of six-membered rings of the same carbon skeleton having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to an acyclic carbon atom
    • C07C311/41—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups having the sulfur atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring having sulfur atoms of sulfonamide groups and amino groups bound to carbon atoms of six-membered rings of the same carbon skeleton having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to an acyclic carbon atom to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1011—Condensed systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明提供一种荧光探针传感器、其制作方法及检测伏马毒素的方法。所述荧光探针传感器集阳离子型表面活性剂与荧光探针分子于一体，具有制备简单，易于操作，灵敏度高，选择性好，同时能够实时在线检等优点。采用荧光传感器对伏马毒素进行检测，同时考虑到伏马毒素的水溶性极好并且分子结构中含有多个羧基，所以实现了在水溶液中对FB1直接进行定量分析，即不需要对其进行衍生化，也不需要对其化学分解，而且检测的灵敏性高。

Description

荧光探针传感器、其制作方法及检测伏马毒素的方法
技术领域
本发明涉及显示领域，尤其涉及一种荧光探针传感器、其制作方法及检测伏马毒素的方法。
背景技术
伏马毒素是由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)在一定温度和湿度条件下繁殖产生的水溶性次级代谢产物，是由不同的多氢醇和丙三酸组成的结构类似的双酯化合物，其骨架结构是一条由19或20个碳原子组成的直链，各种羧基、羟基及酯键分布在骨架双侧所组成，主要污染玉米、大米、小麦等谷物及其制品。目前发现的伏马毒素主要有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4等11种，其中FB1是其主要成分。伏马毒素纯品为白色或淡黄色针状吸湿性粉末，易溶于水和乙腈、甲醇等极性溶剂；无紫外吸收基团和荧光特性；伏马毒素在乙腈-水(体积比为1:1)中-18℃能够稳定保存，对一般的加热处理很稳定，在100℃下的半衰期为175min，对串珠镰刀菌的培养基煮沸30min，在60℃烘干24h，结果发现，其含有的FBl没有任何损失，故伏马毒素是一种稳定性强，并且不利有常规方法检测和消除的有害物质。其中伏马毒素B1毒性最强，污染最普遍。伏马毒素通过抑制神经酰胺合成酶的活性，发挥其毒性作用，并可经食物链传播，严重危害畜禽和人类的健康。伏马毒素是动物饲料中常见的霉菌毒素之一，伏马毒素对不同种属动物的毒性不尽相同，能引起马脑白质软化症、猪肺水肿等疾病，给多种动物肝脏，肾脏造成损伤，甚至引起肿瘤发生，且人食管癌和神经管型缺陷病也可能与伏马毒素有关，对畜禽和人的健康造成很大的危害。国际癌症研究机构与加利福尼亚环境保护机构已宣布伏马毒素为人类潜在的致癌物质(2B级致癌物)。所以对伏马毒素的研究已成为当今关注的热点。并且深入研究伏马毒素的检测新手段，对人类的健康问题以及食品检验方面都具有重要意义。
伏马毒素主要损伤动物心脏、肝脏、肺脏、肾脏等器官。虽然FB1、FB2和FB3的结构非常相似，由于FB1的广泛性分布以及毒性最强，所以对伏马毒素毒性的研究主要集中于FB1。伏马毒素被发现以来，其检测方法便得到了快速发展。目前国内外常用检测伏马毒素的方法有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气谱质谱联用法(GC/MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)，免疫亲和柱-荧光法等方法。
对比以上方法发现，伏马毒素的检测主要是受限于伏马毒素既没有紫外吸收官能团，也没有荧光特性，所以现有伏马毒素的检测方法存在制作复杂，操作难度大，灵敏度低的技术问题。
发明内容
本发明提供一种荧光探针传感器、其制作方法及检测伏马毒素的方法，以解决伏马毒素的检测主要是受限于伏马毒素既没有紫外吸收官能团，也没有荧光特性，所以现有伏马毒素的检测方法存在制作复杂，操作难度大，灵敏度低的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供一种荧光探针传感器，集阳离子型表面活性剂与荧光探针分子于一体，其化学结构式为
Figure GDA0003677606750000021
为实现上述目的，本发明提供一种荧光探针传感器的制作方法，其包括步骤：
制作第一化合物，所述第一化合物的化学结构式为
Figure GDA0003677606750000022
将所述第一化合物溶于三氯甲烷或甲醇(MeOH，Me表示-CH3)中，再加入碳酸钾和碘甲烷(MeI，Me表示-CH3)，在室温下充分反应；以及
待反应进行完全后，将反应液倒入水中，分离有机相，水相用三氯甲烷萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥浓缩，最后用柱层析纯化得到荧光探针传感器。
进一步地，所述制作第一化合物包括步骤：
制作第二化合物，所述第二化合物的化学结构式为
Figure GDA0003677606750000031
将所述第二化合物溶于二氯甲烷中，再加入三氟乙酸(TFA)，在氮气保护下于0℃充分反应；以及
待反应进行完全后，将反应液倒入水中，用饱和碳酸氢钠调节pH至9，分离有机相，水相用二氯甲烷(DCM)萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥浓缩，得到所述第一化合物。
进一步地，所述制作第二化合物包括步骤：
制作第三化合物，所述第三化合物的化学结构式为
Figure GDA0003677606750000032
将所述第三化合物溶于二氯甲烷中，依次加入丹黄酰氯、三乙胺(TEA)，在氮气保护下于室温充分反应；以及
待反应进行完全后，将反应液倒入水中，分离有机相，水相用二氯甲烷(DCM)萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥浓缩，得到所述第二化合物。
进一步地，所述制作第三化合物包括步骤：
制作第四化合物，所述第四化合物的化学结构式为
Figure GDA0003677606750000041
将所述第四化合物溶于无水乙醇(EtOH)中，依次加入钯炭催化剂(Pd/C)或者雷尼镍(Raney nickel)催化剂、乙酸，在氢气(H2)保护下于室温充分反应；以及
待反应进行完全后，抽滤除去钯炭催化剂(Pd/C)或者雷尼镍(Raney nickel)催化剂，收集滤液并浓缩得到粘稠油状液体，加入氢氧化钠溶液，用二氯甲烷(DCM)萃取两次，分液得到有机相以无水硫酸镁干燥浓缩，得到所述第三化合物。
进一步地，所述制作第四化合物包括步骤：
制作第五化合物，所述第五化合物的化学结构式为
Figure GDA0003677606750000042
将所述第五化合物溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，依次加入二碳酸二叔丁基甲酯(Boc2O)、三乙胺(TEA)，在氮气保护下于0～10℃充分反应；以及
待反应进行完全后，将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取三次，有机相依次用饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠溶液洗涤，收集有机相并用无水硫酸钠干燥浓缩，最后用柱层析纯化得到所述第四化合物。
进一步地，所述制作第五化合物包括步骤：
制作第六化合物，所述第六化合物的化学结构式为
Figure GDA0003677606750000043
将所述第六化合物加入到乙醇(EtOH)、四氢呋喃(THF)以及氢氧化钠的混合溶液中，然后加入雷尼镍(Raney nickel)催化剂，在氢气(H2)保护下于室温充分反应；以及
待反应进行完全后，抽滤除去雷尼镍(Raney nickel)催化剂，收集滤液并浓缩得到粘稠油状液体，加入蒸馏水，用二氯甲烷(DCM)萃取两次，分液得到有机相以无水硫酸镁干燥浓缩，得到所述第五化合物。
进一步地，所述制作第六化合物包括步骤：
制作第七化合物，所述第七化合物的化学结构式为
Figure GDA0003677606750000051
将所述第七化合物溶于正丁醇溶液中，滴加到苄胺、碳酸钾、碘化钾的混合溶液中，在110～120℃下充分反应；以及
待反应进行完全后，将反应液冷却至室温，抽滤，滤饼用甲基叔丁基醚淋洗，收集有机相，并用盐酸溶液萃取分液，收集水相，水相用饱和碳酸氢钠溶液调节pH到8，再用甲基叔丁基醚萃取分液，有机相以无水硫酸镁干燥浓缩，得到所述第六化合物。
进一步地，所述制作第七化合物包括步骤：
将1,8-二溴辛烷溶解到乙醇(EtOH)中，随后将上述溶液加热到60℃后，加入1当量的氰化钾或氰化钠，在60℃下充分反应；以及
待反应进行完全后，将反应液冷却至室温，并加入甲基叔丁基醚和正己烷(体积比为1:1)，用蒸馏水洗涤两次，收集有机相并用无水硫酸钠干燥浓缩，得到棕色粘稠状液体，最后用柱层析纯化得到所述第七化合物。
为实现上述目的，本发明提供一种检测伏马毒素FB1的方法，使用前文所述荧光探针传感器，包括步骤：
将所述荧光探针传感器溶于乙腈中，配成混合溶液，然后将其浓度调节为所述荧光探针传感器的临近胶束浓度(CMC)形成检测液；
向所述检测液中加入伏马毒素(FB1)，混合均匀后，用荧光仪测量荧光强度I0和I，其中I0为入射光强，I为透射光强；以及
根据I0/I值与加入伏马毒素含量FB1呈线性关系公式I0/I＝1.03+0.08[FB1]，对伏马毒素B1进行定量分析。
本发明的技术效果在于，提供一种荧光探针传感器、其制作方法及检测伏马毒素FB1的方法，其中所述荧光探针传感器集阳离子型表面活性剂与荧光探针分子于一体，具有制备简单，易于操作，灵敏度高，选择性好，同时能够实时在线检等优点。采用荧光传感器对伏马毒素进行检测，同时考虑到伏马毒素的水溶性极好并且分子结构中含有多个羧基，所以实现了在水溶液中对FB1直接进行定量分析，即不需要对其进行衍生化，也不需要对其化学分解，而且检测的灵敏性高。
附图说明
图1为本实施例随检测体系中伏马毒素含量与荧光强度关系的示意图；
图2为本实施例I0/I值与加入伏马毒素B1含量FB1呈线性关系的示意图；
图3为本实施例对不同毒素的检查结果对比的示意图。
具体实施方式
以下结合说明书附图详细说明本发明的优选实施例，以向本领域中的技术人员完整介绍本发明的技术内容，以举例证明本发明可以实施，使得本发明公开的技术内容更加清楚，使得本领域的技术人员更容易理解如何实施本发明。然而本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例，下文实施例的说明并非用来限制本发明的范围。
目前国内外常用检测伏马毒素的方法有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气谱质谱联用法(GC/MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)，免疫亲和柱-荧光法等方法。其中薄层层析法(TLC)法是较早用于伏马毒素检测的一种方法，用硅胶G板，经V(三氯甲烷)/V(甲醇)/V(水)/V(醋酸)＝55/36/8/1和V(三氯甲烷)/V(水)/V(醋酸)＝6/3/1两种展开剂展开后，用甲氧基苯甲醛或水合三酮氢茚作显色剂，在120℃条件下显色，分离FB1和FB2。FB1的Rf值分别为0.23和0.15，FB2的Rf值分别为0.30和0.20。该方法的优点是方法简单,使用的试剂价格便宜；缺点是灵敏度相对较差,所需试剂繁多、检测周期长、重现性不好、无法自动化等，已远远不能满足现代检测要求。GC法最早用于分析伏马毒素时，采用了熔融石英毛细管气相色谱检测技术。对于天然存在于玉米中的伏马毒素，可以通过酸性水解产生丙三羧酸，并且利用异丁醇与丙三羧酸的酯化作用验证该水解产物中含有丙三羧酸，从而证明伏马毒素的存在。丙三羧酸可以通过气相色谱-质谱联用方法进行检测。而气相色谱-质谱联用技术(GC/MS)通过在伏马毒素水解前用氚标记FB1使得精确度大大提高,检测限达到10ng/g。以GC技术为基础检测伏马毒素，由于需要通过水解产生丙三羧酸和利用氨基衍生增强挥发度等实验步骤,操作复杂。HPLC法是目前最常用于食品中伏马毒素检测的方法。伏马毒素是极性分子，能溶解于水中和极性溶剂中，因此样品较适合检测伏马毒素的方法反相HPLC方法进行测定。HPLC法检测伏马毒素的关键点包括：提取、纯化、衍生剂的选择和流动相的选择。所以色谱法普遍精确性及可重复性较好，然而操作相对繁琐,尤其是样品的处理要求较高,对检测结果的影响也较大。ELISA法采用酶联免疫吸附测定技术，其检测伏马毒素的主要原理是抗原-抗体特异性结合反应。伏马毒素是一种半抗原，可以利用伏马毒素研制出高特异性单克隆抗体。更可实现现场检测，十分利于大规模推广。但是其检测灵敏度低。重现性不好。伏马毒素还可以用荧光法进行检测，测定前用免疫亲和柱进行纯化。免疫亲和柱-荧光法首先将样品与提取液混合、均质、过滤，将滤液通过结合有伏马毒素特殊抗体的分离柱，伏马毒素即与分离柱中的抗体结合。免疫亲和柱-荧光法方法具有高效、快速、准确、安全的优点，缺点是免疫亲和柱中单抗的制作比较、昂贵，且检测结果需用HPLC等化学分析方法进行确证。
通过对以上方法研究对比发现，伏马毒素的检测主要是受限于伏马毒素既没有紫外吸收官能团，也没有荧光特性，所以现有伏马毒素的检测方法存在制作复杂，操作难度大，灵敏度低的技术问题。
本申请开创性地提出一种利用荧光传感器的方法来克服上述困难，荧光传感器具有制作简单，易于操作，灵敏度高，选择性好，同时能够实时在线检等优点。采用荧光传感器对伏马毒素进行检测，同时考虑到伏马毒素的水溶性极好并且分子结构中含有多个羧基，所以实现在水溶液中对其的检测尤为重要。综上所述，本申请合成了一种集阳离子型表面活性剂与荧光探针于一体的新型荧光探针传感器，实现了在水溶液中对FB1即不需要对其进行衍生化，也不需要对其化学分解而高选择性以及高灵敏性检测。
本发明实施例提供一种荧光探针传感器，集阳离子型表面活性剂与荧光探针分子于一体，其化学结构式为
Figure GDA0003677606750000081
本发明实施例还提供一种荧光探针传感器的制作方法，其合成路线为
Figure GDA0003677606750000082
其中Target Product代表荧光探针传感器，Cpd.8代表第一化合物，Cpd.7代表第二化合物，Cpd.6代表第三化合物，Cpd.5代表第四化合物，Cpd.4代表第五化合物，Cpd.3代表第六化合物，Cpd.2代表第七化合物，Cpd.1代表第八化合物。
所述荧光探针传感器的制作方法具体包括步骤Step 1-Step 8。
Step 1.称取20g 1,8-二溴辛烷溶解到50mL 50％(v)乙醇(EtOH)中，随后将上述溶液加热到60℃后，加入1当量的氰化钾或氰化钠，在60℃下反应进行12h，薄层色谱法(TLC)监测反应进行完全，待反应进行完全后，将反应体系冷却至室温，并加入400mL甲基叔丁基醚和正己烷(体积比为1:1)，用蒸馏水洗涤两次，收集有机相并用无水硫酸钠干燥浓缩，得到棕色粘稠状液体，最后用柱层析纯化得到10g Cpd.2为无色油状液体。
Step 2.称取2.5g苄胺，9.7g碳酸钾，1.35g碘化钾于三口烧瓶中，并加热到115℃后，将10g Cpd.2溶解在100mL正丁醇的溶液滴加到上述反应体系中，反应体系在115℃下进行20h，薄层色谱法(TLC)监测反应进行完全，待反应进行完全后，将反应体系冷却至室温，抽滤，滤饼用甲基叔丁基醚淋洗，收集有机相，并用3N盐酸溶液萃取分液，收集水相，水相用饱和碳酸氢钠溶液调节pH到8，再用甲基叔丁基醚萃取分液，有机相以无水硫酸镁干燥浓缩，得到8g Cpd.3为淡黄色油状液体。
Step 3.称取8.0g Cpd.3加入到带有100mL乙醇(EtOH)，25mL四氢呋喃(THF)以及20mL 2N的氢氧化钠的混合溶液的氢化瓶中，然后加入8.0g雷尼镍(Raney nickel)催化剂，反应体系在H2(50psi)，室温下进行20h后，薄层色谱法(TLC)监测反应进行完全，待反应进行完全后，抽滤除去雷尼镍(Raney nickel)催化剂，收集滤液并浓缩得到粘稠油状液体，加入100mL蒸馏水，用二氯甲烷(DCM)萃取两次，分液得到有机相以无水硫酸镁干燥浓缩，得到8gCpd.4为浅黄色油状液体。
Step 4.称取8g Cpd.4溶于80mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，依次加入二碳酸二叔丁基甲酯(Boc2O)、三乙胺(TEA)，在氮气保护下，将反应体系降温至0～10℃反应12h，薄层色谱法(TLC)监测反应进行完全，待反应进行完全后，将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取三次，有机相依次用饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠溶液洗涤，收集有机相并用无水硫酸钠干燥浓缩，最后用柱层析纯化得到7.2g Cpd.5为无色油状液体。
Step 5.称取7.2g Cpd.5溶于300mL无水乙醇(EtOH)中，加入10％钯炭催化剂(Pd/C)或者雷尼镍(Raney nickel)催化剂、5mL乙酸，反应体系在H2(50psi)，室温下进行3h后，薄层色谱法(TLC)监测反应进行完全，待反应进行完全后，抽滤除去钯炭催化剂(Pd/C)或者雷尼镍(Raney nickel)催化剂，收集滤液并浓缩得到粘稠油状液体，加入300mL 2N的氢氧化钠溶液，用二氯甲烷萃取两次，分液得到有机相以无水硫酸镁干燥浓缩，得到6g Cpd.6为无色油状液体。
Step 6.称取6g Cpd.6溶于80mL二氯甲烷中，依次加入丹黄酰氯，三乙胺(TEA)，反应体系在氮气保护，室温下反应12h，薄层色谱法(TLC)监测反应进行完全，待反应进行完全后，将反应液倒入水中，分离有机相，水相用二氯甲烷(DCM)萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥浓缩，最后用柱层析纯化得到5.8g Cpd.7为蓝色荧光固体。
Step7.称取5.8g Cpd.7溶于60mL二氯甲烷中，加入三氟乙酸(TFA)，反应体系在氮气保护，0℃下反应12h，薄层色谱法(TLC)监测反应进行完全，待反应进行完全后，将反应液倒入水中，用饱和碳酸氢钠调节pH至9，分离有机相，水相用二氯甲烷(DCM)萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥浓缩，得到4.6g Cpd.8为黄色粘稠液体。
Step8.称取4.6g Cpd.6溶于80mL三氯甲烷或甲醇(MeOH，Me表示-CH3)中，再加入碳酸钾和碘甲烷(MeI，Me表示-CH3)，室温反应20h，薄层色谱法(TLC)监测反应进行完全，待反应进行完全后，将反应液倒入水中，分离有机相，水相用三氯甲烷萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥浓缩，最后用柱层析纯化得到1.2g最终产物荧光探针传感器。
本发明实施例还一种检测伏马毒素FB1的方法，使用前文所述荧光探针传感器，包括步骤：
将所述荧光探针传感器溶于乙腈中，配成混合溶液，然后将其浓度调节为所述荧光探针传感器的临近胶束浓度(CMC)形成检测液；
向所述检测液中加入伏马毒素B1，混合均匀后，用荧光仪测量荧光强度I0和I，其中I0为入射光强，I为透射光强；以及
根据I0/I值与加入伏马毒素B1含量FB1呈线性关系公式I0/I＝1.03+0.08[FB1]，对伏马毒素B1进行定量分析。
更具体的步骤为，称取阳离子型表面活性剂荧光探针分子溶于乙腈中，配成1.0M的阳离子型表面活性剂荧光探针分子的乙腈溶液，然后用水稀释成2.5mM的阳离子型表面活性剂荧光探针分子水溶液，此浓度为阳离子型表面活性剂荧光探针分子的临近胶束浓度(CMC)。向2.5mM的阳离子型表面活性剂荧光探针分子的水溶液中依次加入5ug，7ug，10ug，15ug，20ug，30ug，50ug，100ug伏马毒素B1，混合均匀后，用荧光仪测量荧光强度，绘制标准曲线。由图1可见，随检测体系中伏马毒素含量的增加，检测体系的荧光强度明显下降，同时对检测数据进一步分析，以I0/I值与加入伏马毒素B1含量FB1做线性分析，证明加入伏马毒素B1含量FB1为5ug～100ug时呈现线性关系，如图2所示，在图2中，I0/I值与加入伏马毒素B1(FB1)含量呈线性关系，线性方程为：
y＝1.03+0.08[FB1]；
式中y为I0/I的比值。
相关系数r为0.998，相关系数r按相关系数的计算公式计算：
Figure GDA0003677606750000111
由相关系数r可见，I0/I值与伏马毒素B1的含量FB1的呈现良好的线性关系，可对伏马毒素B1进行定量分析。
为了证明本发明的有益效果，采取对浓度为5、7、10、15、20、30，50μg的伏马毒素B1、呕吐毒素、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲霉素A、展青霉素、黄曲霉素B1、黄曲霉素M1分别进行了检测，测试结果见图3。由图3可见，在相同条件下，加入8种不同的氨基酸，只有伏马毒素B1能够发生明显的猝灭，而其他真菌毒素荧光强度未发生明显变化，说明本发明的荧光探针能够在水溶液中可以很好的选择性对伏马毒素B1响应，然后进一步根据不同浓度下对应的(I0/I)-1值，结合伏马毒素B1标准曲线的线性方程即可定性定量的检测伏马毒素B1。
本发明的技术效果在于，提供一种荧光探针传感器、其制作方法及检测伏马毒素的方法，其中所述荧光探针传感器集阳离子型表面活性剂与荧光探针分子于一体，具有制备简单，易于操作，灵敏度高，选择性好，同时能够实时在线检等优点。采用荧光传感器对伏马毒素进行检测，同时考虑到伏马毒素的水溶性极好并且分子结构中含有多个羧基，所以实现了在水溶液中对FB1直接进行定量分析，即不需要对其进行衍生化，也不需要对其化学分解，而且检测的灵敏性高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种荧光探针传感器，其特征在于，集阳离子型表面活性剂与荧光探针分子于一体，其化学结构式为
Figure FDA0003677606740000011
2.一种荧光探针传感器的制作方法，其特征在于，包括步骤：
制作第一化合物，所述第一化合物的化学结构式为
Figure FDA0003677606740000012
将所述第一化合物溶于三氯甲烷或者甲醇中，再加入碳酸钾和碘甲烷，在室温下充分反应；以及
待反应进行完全后，将反应液倒入水中，分离有机相，水相用三氯甲烷萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥浓缩，最后用柱层析纯化得到荧光探针传感器。
3.如权利要求2所述的荧光探针传感器的制作方法，其特征在于，所述制作第一化合物包括步骤：
制作第二化合物，所述第二化合物的化学结构式为
Figure FDA0003677606740000013
将所述第二化合物溶于二氯甲烷中，再加入三氟乙酸，在氮气保护下于0℃充分反应；以及
待反应进行完全后，将反应液倒入水中，用饱和碳酸氢钠调节pH至9，分离有机相，水相用二氯甲烷萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥浓缩，得到所述第一化合物。
4.如权利要求3所述的荧光探针传感器的制作方法，其特征在于，所述制作第二化合物包括步骤：
制作第三化合物，所述第三化合物的化学结构式为
Figure FDA0003677606740000021
将所述第三化合物溶于二氯甲烷中，依次加入丹黄酰氯、三乙胺，在氮气保护下于室温充分反应；以及
待反应进行完全后，将反应液倒入水中，分离有机相，水相用二氯甲烷萃取两次，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥浓缩，得到所述第二化合物。
5.如权利要求4所述的荧光探针传感器的制作方法，其特征在于，所述制作第三化合物包括步骤：
制作第四化合物，所述第四化合物的化学结构式为
Figure FDA0003677606740000022
将所述第四化合物溶于无水乙醇中，依次加入钯炭催化剂或者雷尼镍催化剂、乙酸，在氢气保护下于室温充分反应；以及
待反应进行完全后，抽滤除去钯炭催化剂或者雷尼镍催化剂，收集滤液并浓缩得到粘稠油状液体，加入氢氧化钠溶液，用二氯甲烷萃取两次，分液得到有机相以无水硫酸镁干燥浓缩，得到所述第三化合物。
6.如权利要求5所述的荧光探针传感器的制作方法，其特征在于，所述制作第四化合物包括步骤：
制作第五化合物，所述第五化合物的化学结构式为
Figure FDA0003677606740000031
将所述第五化合物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，依次加入二碳酸二叔丁基甲酯、三乙胺，在氮气保护下于0～10℃充分反应；以及
待反应进行完全后，将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取三次，有机相依次用饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠溶液洗涤，收集有机相并用无水硫酸钠干燥浓缩，最后用柱层析纯化得到所述第四化合物。
7.如权利要求6所述的荧光探针传感器的制作方法，其特征在于，所述制作第五化合物包括步骤：
制作第六化合物，所述第六化合物的化学结构式为
Figure FDA0003677606740000032
将所述第六化合物加入到乙醇、四氢呋喃以及氢氧化钠的混合溶液中，然后加入雷尼镍催化剂，在氢气保护下于室温充分反应；以及
待反应进行完全后，抽滤除去雷尼镍催化剂，收集滤液并浓缩得到粘稠油状液体，加入蒸馏水，用二氯甲烷萃取两次，分液得到有机相以无水硫酸镁干燥浓缩，得到所述第五化合物。
8.如权利要求7所述的荧光探针传感器的制作方法，其特征在于，所述制作第六化合物包括步骤：
制作第七化合物，所述第七化合物的化学结构式为
Figure FDA0003677606740000033
将所述第七化合物溶于正丁醇溶液中，滴加到苄胺、碳酸钾、碘化钾的混合溶液中，在110～120℃下充分反应；以及
待反应进行完全后，将反应液冷却至室温，抽滤，滤饼用甲基叔丁基醚淋洗，收集有机相，并用盐酸溶液萃取分液，收集水相，水相用饱和碳酸氢钠溶液调节pH到8，再用甲基叔丁基醚萃取分液，有机相以无水硫酸镁干燥浓缩，得到所述第六化合物。
9.一种检测伏马毒素FB1的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的荧光探针传感器，包括步骤：
将所述荧光探针传感器溶于乙腈中，配成混合溶液，然后将其浓度调节为所述荧光探针传感器的临近胶束浓度形成检测液；
向所述检测液中加入伏马毒素，混合均匀后，用荧光仪测量荧光强度I0和I，其中I0为入射光强，I为透射光强；以及
根据I0/I值与加入伏马毒素含量FB1呈线性关系公式I0/I＝1.03+0.08[FB1]，对伏马毒素进行定量分析。
CN202010524171.XA 2020-06-10 2020-06-10 荧光探针传感器、其制作方法及检测伏马毒素的方法 Active CN112375020B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010524171.XA CN112375020B (zh) 2020-06-10 2020-06-10 荧光探针传感器、其制作方法及检测伏马毒素的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010524171.XA CN112375020B (zh) 2020-06-10 2020-06-10 荧光探针传感器、其制作方法及检测伏马毒素的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112375020A CN112375020A (zh) 2021-02-19
CN112375020B true CN112375020B (zh) 2022-08-05

Family

ID=74586375

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010524171.XA Active CN112375020B (zh) 2020-06-10 2020-06-10 荧光探针传感器、其制作方法及检测伏马毒素的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112375020B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115181085A (zh) * 2022-06-13 2022-10-14 河南省科学院化学研究所有限公司 一种荧光探针及其制备方法和应用、伏马毒素含量的检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6482601B1 (en) * 2000-09-11 2002-11-19 Diachemix Llc Fluorescence polarization-based homogeneous assay for fumonisin determination in grains
CN105543231A (zh) * 2016-01-11 2016-05-04 河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 伏马毒素b1核酸适配体链置换探针的筛选及应用
CN109884306A (zh) * 2019-03-14 2019-06-14 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种小分子检测试纸条、试剂盒及其检测方法
CN110850091A (zh) * 2019-11-13 2020-02-28 中国科学院生态环境研究中心 用于检测赭曲霉毒素a的荧光探针与成套试剂

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6482601B1 (en) * 2000-09-11 2002-11-19 Diachemix Llc Fluorescence polarization-based homogeneous assay for fumonisin determination in grains
CN105543231A (zh) * 2016-01-11 2016-05-04 河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 伏马毒素b1核酸适配体链置换探针的筛选及应用
CN109884306A (zh) * 2019-03-14 2019-06-14 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种小分子检测试纸条、试剂盒及其检测方法
CN110850091A (zh) * 2019-11-13 2020-02-28 中国科学院生态环境研究中心 用于检测赭曲霉毒素a的荧光探针与成套试剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
伏马毒素B_1核酸适配体链置换探针的筛选及应用;王红旗等;《农产品质量与安全》;20170210(第01期);全文 *
基于荧光生物传感器的真菌毒素检测方法研究进展;董燕婕等;《中国食物与营养》;20200228(第02期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112375020A (zh) 2021-02-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107033101B (zh) 一种检测甲醛的荧光探针制备方法及应用
CN101149375B (zh) 对隐色孔雀绿和孔雀石绿进行免疫测定的方法和试剂盒
Kramer et al. Development of a selective enzyme-linked immunosorbent assay for 1-naphthol-the major metabolite of carbaryl (1-naphthyl N-methylcarbamate)
CN112375020B (zh) 荧光探针传感器、其制作方法及检测伏马毒素的方法
CN103170309B (zh) 一种莱克多巴胺抗体免疫亲和层析柱及其应用
CN113150575B (zh) 一种近红外的萘酰亚胺染料及其制备方法与应用
CN110964042B (zh) 一种n，n-二(2-吡啶甲基)胺基bodipy类镍离子荧光探针的制备方法及其应用
Gao et al. A novel fluorescent labeling reagent, 2-(9-acridone)-ethyl chloroformate, and its application to the analysis of free amino acids in honey samples by HPLC with fluorescence detection and identification with online ESI-MS
CN103130712A (zh) 百草枯半抗原、百草枯完全抗原及其制备方法
CN105445241B (zh) 高选择性检测肼浓度的方法
CN108774240A (zh) 一种能应用于细胞溶酶体内HOCl检测的罗丹明B类荧光探针
CN105418559B (zh) 高灵敏性检测肼的试剂盒及其应用
CN107973836A (zh) 醛固酮衍生物及其制备方法、醛固酮均相酶免疫检测试剂
CN111362958A (zh) 一种特异性识别还原型gsh的罗丹明类荧光探针及其制备方法与应用
CN114835698B (zh) 一种用于检测半胱氨酸的(二苯氨基)苯基黄酮类荧光探针及其制备方法
CN105418560B (zh) 长波长肼比色荧光探针及其制备方法
CN110407755B (zh) 一种用于检测肼的2，3-蒎二酮基咪唑型荧光探针及其制备方法和应用
CN110156858B (zh) 一种水溶性硫化氢荧光探针及其制备方法和其在水质硫化物及细胞硫化氢检测中的应用
CN108896523B (zh) 一种荧光增强型检测次氯酸根的方法和应用
CN103254128B (zh) 一种水溶性裸眼和光增强检测汞离子的荧光探针及其合成与应用
CN109096203B (zh) 一种基于蒽醌衍生物的汞离子荧光探针及其制备方法和应用
CN110563609A (zh) 一种检测亚硒酸根的近红外荧光探针的制备方法及应用
CN111171073A (zh) 一种对硫磷半抗原、完全抗原的制备方法与应用
CN112110913A (zh) 一种可用于水合肼检测的新型荧光探针及试纸的制备和应用
CN110498795A (zh) 咪唑并[1,2-a]吡啶衍生物类半胱氨酸荧光探针及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant