CN101149375B

CN101149375B - 对隐色孔雀绿和孔雀石绿进行免疫测定的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN101149375B
Application number: CN200610064048.4A
Authority: CN
Inventors: 埃尔奥亚特·本奇克; 罗伯特·I·麦康奈尔; 斯蒂芬·P·菲茨杰拉德; 安德鲁·P·劳里
Original assignee: Randox Laboratories Ltd
Current assignee: Randox Laboratories Ltd
Priority date: 2005-09-22
Filing date: 2006-09-22
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2026-09-22
Also published as: DE602006003391D1; HK1113199A1; EP1767947A1; CN101149375A; US20070072242A1; ATE412911T1; EP1767947B1; ES2318639T3

Abstract

本发明提供半抗原、包含与赋予抗原性的载体材料偶联的所述半抗原的免疫原、包含与标记物结合的所述半抗原的偶联物、以及对抗这样的免疫原并能与隐色孔雀绿和孔雀石绿结合的抗体。

Description

对隐色孔雀绿和孔雀石绿进行免疫测定的方法和试剂盒

发明领域

本发明涉及新的免疫原、抗体和偶联物，它们用于检测和/或测定隐色孔雀绿(leucomalachite Green)和孔雀石绿(Malachite Green)的免疫测定。本发明也涉及用于检测或测定隐色孔雀绿和孔雀石绿的免疫测定方法和试剂盒。“检测(detecting)”是指定性分析隐色孔雀绿和/或孔雀石绿在样品中的存在或不存在。“测定(determining)”是指定量分析隐色孔雀绿和/或孔雀石绿在样品中的量。

发明背景

孔雀石绿是养鱼中使用的外用驱虫剂、杀真菌剂和杀菌剂。然而，它却是潜在的致癌剂、致突变剂和致畸变剂。自从1933年以来，已经认识到在可食用鱼类(例如鲑鱼(trout)和鳗鱼(eel))中的非法和威胁公众安全的使用。吸收后，孔雀石绿迅速地被还原为其无发色团的代谢物隐色孔雀绿，其是在受处理的水生动物的药物残留分析中检测到的普遍的残留物。孔雀石绿和隐色孔雀绿具有下列结构式：

孔雀石绿隐色孔雀绿。

最近孔雀石绿和隐色孔雀绿受到残留物分析者的高度观注，因为在养殖的大西洋鲑鱼和鳕(hake)鱼中发现了它们(参见，对食物和饲料的每周欧盟快速预警报告2003/2004(Weekly EC Rapid Alert Reports for Food and Feed2003/2004))。

用于孔雀石绿和隐色孔雀绿测定的方法相当有限。孔雀石绿具有光谱可见光区域(580-620nm)的发色团，这种发色团在孔雀石绿的分析中相当有帮助。然而，隐色孔雀绿在260-270nm具有λmax，使得其在相同的条件下难于分析。已经采用了很多方法来避免该问题。一种方法使用过柱后氧化的步骤，在HPLC分离后和检测前，将隐色孔雀绿氧化为孔雀石绿，以允许在更高的波长进行检测。通常，将分散于Celite(商品名)的铅氧化物或其本身包装放入短柱中使用。在另一变通方法中，Klein等人(E.Klein，M.Edelhaeuser和R.Lippold，Dtsch.Lebensm.-Rundsch.，1991，87，350)使用二氧化铅进行过柱前的氧化，测定的孔雀石绿为母体和隐色孔雀绿的总和。已使用电化学氧化作为二氧化铅的替代物。检测孔雀石绿和隐色孔雀绿的可选择的方法是使用LC-MS。粒子束LC-MS已经用于在鲶鱼(catfish)中确认孔雀石绿。

欧洲最低要求的执行极限(European minimum requried performane limit，MRPL)，残留物实验室的定性参数，设定孔雀石绿和隐色孔雀绿的总量为2μg/kg。最近，气相色谱质谱(GC-MS)和其它液相色谱串连质谱(LC-MS/MS)方法已经出现于第五届欧洲残留物会议(Euro Residue Conference)中。GC-MS和LC-MS方法都具有良好的表现，能以远低于设定MRPL的浓度可靠地检测和鉴定这些残留物。

特异性结合反应，例如抗体-抗原相互作用，已经在免疫测定中广泛使用，用来检测组织提取物中存在的多种物质。因此，例如放射性免疫测定(RIA)可用于孔雀石绿和隐色孔雀绿的测定。放射性免疫测定非常敏感，但却需要放射性核素示踪物，例如¹²⁵I和³H。目前还没有已知用于孔雀石绿和隐色孔雀绿的RIA。酶联免疫吸附测定(ELISA)是非放射性的方法，可选用该方法对孔雀石绿和隐色孔雀绿进行定性和定量测定。最近，用于孔雀石绿的测试试剂盒已经可以商业性获得。Bioo Scientific生产孔雀石绿ELISA测试试剂盒，其设计为仅检测孔雀石绿。这表明Bioo试剂盒包含抗基于孔雀石绿的免疫原的抗体，不像本发明使用基于隐色孔雀绿的免疫原。这得到Bioo Scientific提供的信息的进一步支持，该信息给出对隐色孔雀绿的交叉反应性为1％。由于孔雀石绿快速和广泛地代谢为隐色孔雀绿，BiooScientific免疫测定要求在抗原-抗体结合之前引入样品预处理步骤，使隐色孔雀绿转化为孔雀石绿。这使所述免疫测定因使用额外的步骤而比本发明更费时以及更易产生试验误差。

发明概述

在第一方面，本发明提供包含隐色孔雀绿的免疫原，其中隐色孔雀绿通过交联剂与赋予抗原性的载体材料偶联、且该交联剂从隐色孔雀绿的未取代苯环的对位、邻位或间位伸出。本发明也提供对抗这样的免疫原的抗体。此外，本发明涉及包含隐色孔雀绿的偶联物，其中隐色孔雀绿通过交联剂与可检测的标记物共价结合、且该交联剂从隐色孔雀绿的未取代苯环的对位、邻位或间位伸出。

本发明的免疫原和偶联物均可得自于下式I的半抗原，其中交联剂(该交联剂包含-X-Y-Z)从隐色孔雀绿的未取代苯环的对位、邻位或间位伸出：

“式I”

其中X是第一个二价连接，Y是第二个二价连接，Z是可与赋予抗原性的载体材料偶联(产生免疫原)或可与可检测的标记物偶联(产生偶联物)的反应基团。优选，交联剂从隐色孔雀绿的未取代苯环的对位伸出。

优选，X是选自O、S和N的杂原子，最优选在免疫原的情况中X是O原子，最优选在偶联物的情况中X是N原子。

优选，Y是C_1-10，更优选C_2-6，最优选C₃，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分(alkylene moiety)，或亚芳基部分(arylene moiety)。一个合适的取代基是羰基(C＝O)。

有利的是，Z(与赋予抗原性的载体材料偶联(产生免疫原)或与可检测的标记物偶联(产生偶联物)之前)选自羧酸、二硫代吡啶基(dithiopyridyl)、顺丁烯二酰亚胺、氨基、羟基、巯基(thiol)、硫酯或醛部分。与赋予抗原性的载体材料偶联之前，Z是羧酸(COOH)时，羟基的氧原子首先与DCC结合，然后与NHS结合，形成带有强效离去基团的酯。通过赋予抗原性的载体材料上的游离氨基，对上述酯的羰基(C＝O)进行亲核攻击，导致酰胺键和形成所期望的免疫原。当Z在与可检测的标记物偶联前是巯基(在硫酯的情形下，该巯基通过在碱性条件下水解而形成)时，有该巯基和BrCH₂C(O)NH-HRP参与的亲核取代反应导致溴被巯基取代，并形成所期望的偶联物。本领域读者可参考Bioconjugate Techniques G.Hermanson，ed.，Academic Press，1996，785pp.(其内容以其全部在此引入)中关于Z反应基团和赋予抗原性的载体材料或可检测的标记物之间相互作用的详细描述，其中Z是选自羧酸、二硫代吡啶基、顺丁烯二酰亚胺、氨基、羟基、巯基、硫酯或醛部分所组成的组中的剩余者(remainder)。最有利的是，Z(与赋予抗原性的载体材料偶联(产生免疫原)之前)是羧酸(COOH)部分。最有利的是，Z(与可检测的标记物偶联(产生偶联物)之前)是巯基或硫酯部分。

最有利的是，半抗原是对-(3-羧基丙氧基)隐色孔雀绿(半抗原A)。半抗原A的结构式显示于图1。

优选，免疫原是与赋予抗原性的材料偶联的对-(3-羧基丙氧基)隐色孔雀绿，其中所述材料可以是选自牛血清白蛋白(BSA)和牛甲状腺球蛋白(BTG)。

孔雀石绿的半抗原衍生物(以及相应的免疫原、抗体和偶联物)可通过用交联剂在孔雀石绿未取代苯环的对位、邻位或间位(优选对位)以相似的方式衍生而制得。孔雀石绿的半抗原衍生物之一是对-(3-羧基丙氧基)孔雀石绿(半抗原B)，结构式也显示于图1。

将半抗原(如上所述)与修饰或未修饰的赋予抗原性的载体材料偶联，可制备免疫原。优选，所述载体材料是蛋白质、蛋白片段、合成多肽或半合成多肽。所获得的免疫原然后施用于哺乳动物宿主以激发产生特异性抗体，可以是多克隆抗体，其然后用于研发对隐色孔雀绿和孔雀石绿的免疫测定方法，使用与标记物偶联的半抗原作为检测试剂。

在其它方面，本发明涉及抗本发明免疫原的抗体，所述抗体能够与隐色孔雀绿和孔雀石绿的至少一种结构性表位结合。

在其它方面，本发明涉及对隐色孔雀绿具有特异性的抗体，其特征在于对孔雀石绿具有交叉反应性。可选，所述抗体(以及包括这些抗体的方法和试剂盒)对孔雀石绿具有超过10％的交叉反应性。进一步可选，所述抗体(以及包括这些抗体的方法和试剂盒)对孔雀石绿具有超过20％的交叉反应性。进一步可选，所述抗体(以及包括这些抗体的方法和试剂盒)对孔雀石绿具有超过25％的交叉反应性。在每个这样的情形中，所提到的可选对隐色孔雀绿的最小交叉反应性是以对隐色孔雀石绿的交叉反应性为100％而言的。

本发明进一步提供制备这些抗体的方法，该方法包括通过重复施用本发明免疫原免疫动物(优选脊椎动物，最优选哺乳动物)的步骤以及从所述被免疫的动物收集所产生的血清的步骤。优选，本方法进一步包含将所述的血清抗体固定于背板底物(backing substrate)，优选固体支撑物，最优选聚苯乙烯(polystyrene)固体支撑物。优选，所述抗体是多克隆抗体。作为备选，所述抗体是单克隆抗体。

在另一方面，本发明包含偶联物，该偶联物包含与可检测的标记物共价结合的此处所公开的半抗原。优选，标记物选自酶、发光物、放射活性物或它们的混合物。更优选，标记物是酶，优选过氧化物酶，最优选，辣根过氧化物酶(HRP)。作为备选，或另外的，发光物可以是生物发光物、化学发光物或荧光物。

优选，偶联物是与可检测的标记物共价结合的对-(3-乙酰硫代丙酰氨基)隐色孔雀绿(p-(3-acetylthiopropanamido)leucomalachite)。一种这样的合适的标记物是辣根过氧化物酶。

在另一方面，本发明包括检测或测定样品中隐色孔雀绿和孔雀石绿的方法，该方法包括将样品与至少一种本发明的偶联物接触，并与至少一种本发明抗体接触；检测或测定结合的偶联物；从标准曲线推导出样品中隐色孔雀绿和孔雀石绿的存在或其量。这是半定量的方法，而下面的方法是定量的方法。该半定量的方法可选检测或测定样品中分析物，该分析物选自隐色孔雀绿、孔雀石绿或隐色孔雀绿和孔雀石绿的混合物。作为备选，该方法包括将一份样品与至少一种本发明的偶联物以及至少一种本发明的抗体接触，并且将其它样品与至少一种本发明的抗体接触；测定第一份样品中结合的偶联物(从而测定隐色孔雀绿和孔雀石绿的总量)，并测定第二份样品中结合的孔雀石绿(从而测定孔雀石绿的量)；从标准曲线中推导样品中隐色孔雀绿和孔雀石绿各自的量。可以理解的是，在第一份样品中测定的步骤是竞争性免疫测定，该测定被安排为测定隐色孔雀绿和孔雀石绿的总量。也可以理解的是，在第二份样品分中测定的步骤是免疫测定，该测定被安排为测定结合型孔雀石绿的量。后者的测定步骤可使用合适的分光镜方法(spectroscopic method)进行。本发明备选方法中的推导步骤如下进行：推导第二份样品中结合型孔雀石绿的量，以及推导第一份样品中隐色孔雀绿和孔雀石绿的量，随后从第二份样品的结合型孔雀石绿的量减去第一份样品的隐色孔雀绿和孔雀石绿的量，得到样品中隐色孔雀绿的量。

在另一方面，本发明包括检测或测定隐色孔雀绿和孔雀石绿的试剂盒，该试剂盒包括至少一种本发明的偶联物，以及至少一种本发明的抗体。试剂盒可选包括使用所述偶联物和所述抗体检测隐色孔雀绿和孔雀石绿的使用说明书。这是半定量试剂盒，其能可选的检测或测定样品中选自隐色孔雀绿、孔雀石绿以及隐色孔雀绿与孔雀石绿的混合物的分析物。作为备选，该试剂盒用于测定隐色孔雀绿和孔雀石绿中的每一个，该试剂盒包括至少一种本发明的偶联物，以及至少一种本发明的抗体。这样的试剂盒可选的包括使用所述偶联物和所述抗体测定样品中隐色孔雀绿和孔雀石绿各自的量的说明书。优选，样品是溶液，例如生物液体。更优选样品是血清或尿。

在本发明任意单独的方法和试剂盒中，用于制备偶联物的基本半抗原和用于制备免疫原(其刺激抗体生成)的基本半抗原，可以是相同或不同的。优选它们是不同的，这样增加测定的敏感性。不期望被如此限制，可以认为样品中的靶分析物更有能力与一种偶联物竞争抗体结合位点，该偶联物是与刺激生成抗体的免疫原在结构上有稍许不同。如此获得的更好的敏感性结果例证于下面的实施例12。在本发明任意单独的方法和试剂盒中，所述方法或试剂盒每个对隐色孔雀绿显示敏感性或IC₅₀(ng/ml)低于35ng/ml，可选低于30ng/ml。如果用于制备偶联物的基本半抗原和用于制备免疫原(其刺激抗体生成)的基本半抗原是不同的，所述方法或试剂盒每个对隐色孔雀绿显示敏感性或IC₅₀(ng/ml)低于10ng/ml，可选低于7.5ng/ml，进一步可选低于5.0ng/ml。在本发明任意单独的方法和试剂盒中，所述方法或试剂盒每个对孔雀石绿显示敏感性或IC₅₀(ng/ml)低于150ng/ml，可选低于125ng/ml，进一步可选低于105ng/ml。如果用于制备偶联物的基本半抗原和用于制备免疫原(其刺激抗体生成)的基本半抗原是不同的，所述方法或试剂盒每个对孔雀石绿显示敏感性或IC₅₀(ng/ml)低于35ng/ml，可选低于25ng/ml，进一步可选低于15ng/ml。

在另一方面，本发明涉及至少一种根据本发明的偶联物，以及至少一种根据本发明的抗体，在检测或测定样品(例如生物体液)中隐色孔雀绿和孔雀石绿的用途。

发明附图

现通过实施例和参考相应附图来描述本发明的实施方案，其中：

图1显示对-(3-羧基丙氧基)隐色孔雀绿(半抗原A)、对-(3-羧基丙氧基)孔雀石绿(半抗原B)、对-(3-乙酰硫代丙酰氨基)隐色孔雀绿(半抗原C)的结构式。

图2显示图1的对-(3-羧基丙氧基)隐色孔雀绿(半抗原A)的制备步骤。

图3显示图1的对-(3-羧基丙氧基)孔雀石绿(半抗原B)的制备步骤。

图4显示图1的对-(3-乙酰硫代丙酰氨基)隐色孔雀绿(半抗原C)的制备步骤。

图5显示图1的对-(3-羧基丙氧基)隐色孔雀绿(半抗原A)的NMR结果。

图6显示对BSA的MALDI结果。

图7显示对免疫原I(结合BSA的图1所示对-(3-羧基丙氧基)隐色孔雀绿(半抗原A))的MALDI结果。

图8显示用于开发隐色孔雀绿和孔雀石绿的竞争性ELISA的竞争性ELISA微滴定板测定。

发明内容

制备半抗原

按图2的三个步骤制备对-(3-羧基丙氧基)隐色孔雀绿(半抗原A)。首先，4-羟基苯甲醛，1，与4-溴丁酸乙酯在有碳酸钾存在的条件下在乙腈中回流得到对[3-(乙基羧基)丙氧基]苯甲醛，2。所获得的酯，2，与N，N-二甲苯胺在有硫酸存在的条件下于120℃反应48小时得到中等收率的对[3-(乙基羧基)丙氧基]隐色孔雀绿，3。将隐色孔雀绿酯，3，与氢氧化钠在四氢呋喃(THF)和甲醇中皂化后得到半抗原A。

通过用铅氧化物(PbO₂)或2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)氧化半抗原A得到对(3-羧基丙氧基)孔雀石绿，半抗原B(图3)。

在三步中制备半抗原C，对-(3-乙酰硫代丙酰氨基)隐色孔雀绿(图4)。首先，在酸性条件下4-硝基苯甲醛，4，与N，N-二甲苯胺加热得到对硝基隐色孔雀绿，5。其在甲酸铵存在下在MeOH/THF中用Pd/C还原得到对氨基隐色孔雀绿，6。最后，在N，N-二异丙基乙胺存在下在1，4-二噁烷(dioxane)中，使对氨基隐色孔雀绿与N-琥珀酰亚氨基3-(乙酰硫代)丙酸酯反应，并在室温搅拌过夜得到半抗原C。

制备免疫原和偶联物

尽管此处公开的半抗原提供指定的结构性表位，它们本身没有免疫原性，因此需要与载体材料结合，当施用给宿主动物时，其将引起免疫反应。合适的载体材料通常包含聚(氨基酸)片段，包括多肽、蛋白质和糖蛋白。有用的载体材料的实例有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(egg ovalbumin)、牛γ球蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、匙孔血蓝蛋白(KLH)等。作为备选，可使用具有足够数量的、可以利用的氨基基团(例如赖氨酸)的合成性聚(氨基酸)，也可以利用携有反应性官能团的其它合成或天然的聚合物。特别是，碳水化合物、酵母或多糖可与所述半抗原结合产生免疫原。

此处公开的半抗原也可与可检测的标记物结合，用于制备在免疫测定中使用的偶联物(或检测试剂)，所述标记物例如酶(如辣根过氧化物酶)、具有荧光性质的底物或放射性标记。荧光底物可以是例如，荧光素的单价残留物或其衍生物。

免疫原形成(实施例7和8)涉及常规的偶联化学，其中半抗原A羟基的氧首先与DCC结合，然后与NHS结合，形成带有强效离去基团的酯。通过蛋白质(BSA或BTG)上的游离氨基，对上述酯的羰基进行亲核攻击，导致酰胺键和形成靶免疫原。半抗原A-HRP偶联物的形成遵循相似的机理，并使用EDC和硫代NHS(实施例9)。水解半抗原C来形成硫代衍生物，随后由水解的半抗原C对修饰型HRP进行亲核取代，导致形成偶联物(实施例10)。

为了确认半抗原已与载体材料充分偶联，在免疫之前，使用基质支持UV激光解吸附/离子化飞行时间质谱(matrix-assisted UV laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectroscopy，MALDI-TOF MS)评估每一种免疫原。为了产生用于检测隐色孔雀绿和孔雀石绿的抗体，本发明的免疫原适合用于免疫接种。

对免疫原进行MALDI-TOF分析的一般过程

使用Voyager STR生物光谱研究站(Biospectrometry Research Station)激光解吸附质谱以及延时萃取进行MALDI-TOF质谱。每个待分析样品的等份试样在0.1％的三氟乙酸(TFA)水溶液中稀释得到1mg/ml的样品溶液。使用芥子(Sinapinic)酸的基质分析等份试样(1μl)，牛血清白蛋白用作外标(external calibrant)。图6显示了对BSA载体材料的分析。如图所示，存在主要的信号，其表示此样品的平均质子化质量为m/z 66,400。在m/z 33,203的信号与双电极形式(doubly-charged form)的主要成分一致。观察到其他信号，包括m/z 13,495。

制备抗血清

为了得到多克隆抗血清，本发明的免疫原与弗氏佐剂(Freund’s Adjuvant)混合，并将混合物注射于宿主动物，例如兔、羊、小鼠、豚鼠或马。进行进一步的注射(加强注射)，并对血清取样以评估抗体滴度。当获得最佳滴度时，将宿主动物放血得到合适容积的特异性抗血清。抗体纯化所需的纯度取决于预期的应用。对于很多目的而言，没有对纯度的要求，然而，在其他情况下，例如当抗体固定于固体支撑物时，可进行纯化步骤去除不期望的物质和消除非特异性结合。

本发明制备的特异性抗体用作检测或测定生物液体中隐色孔雀绿和孔雀石绿的免疫测定中的试剂。本发明的抗体能够与代谢的隐色孔雀绿以及与母体孔雀石绿结合。

实施例

实施例1：制备对[3-(乙基羧基)丙氧基]苯甲醛(2)

向4-羟基苯甲醛，1，(20g，164mMol)和碳酸钾(68g，492mMol)的乙腈(300ml)的混悬液中加入4-溴丁酸乙酯(35.2ml，246mMol)。然后将混合物加热回流过夜。冷却至室温后，过滤掉固体，真空除去溶剂。然后向残留物中加入水(200ml)，并用乙酸乙酯萃取(3x200ml)。合并有机相用盐水(brine)洗(1x200ml)，硫酸钠干燥，过滤、蒸发至干燥。所得残留物使用30％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗液(eluent)在硅胶(silica gel)上经过急骤层析(flashchromatography)，纯化得到无色油状2(27g，69.8％)。

IR光谱(film)：1733.7，1692.5，1601.2，1577.9，1509.8，1257.7，1161.1cm^-1。

实施例2：制备对[3-(乙基羧基)丙氧基]隐色孔雀绿(3)

向对[3-(乙基羧基)丙氧基]苯甲醛2(10g，42.4mMol)和N，N-二甲基苯胺(12.38g，106mMol)的混合物中加入浓硫酸(2ml)，并且混合物在120℃加热48小时。然后冷却溶液至室温，加入水(200ml)，用固体碳酸钠中和混合物，再用乙酸乙酯萃取(3x100ml)，用盐水洗(1x100ml)，硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩至干燥。所得粗品使用25％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗液在硅胶上经过急骤层析，纯化得到橘色油状酯3(6.9g，35％)。IR光谱(film)：1735.3，1612.2，1518.3，1242.6cm^-1。

实施例3：制备对-(3-羧基丙氧基)隐色孔雀绿(半抗原A)

向酯，3，(8.4g，18.75mMol)溶于甲醇和THF(2∶1，240ml)混合物所得的溶液中加入氢氧化钠(2N，40ml)。将混合物在室温搅拌16小时。真空去除溶剂并加入水(100ml)。该溶液通过加入HCl(2N)中和至pH7，所获得的沉淀通过过滤收集，在干燥器中经五氧化二磷干燥。得到蓝/绿色固体的半抗原A(3.2g，40％)。

NMR¹³C，溶剂δ-MeOH(图5)：178.8，156.9，148.9，137.7，133.6，130.6，129.9，114.1，112.9，66.6，54.2，40.9，30.9，24.6。

实施例4：制备对硝基隐色孔雀绿

向对硝基苯甲醛，4，(12.81g，84.77mMol)和N，N-二甲基苯胺(24.76g，204.3mMol)中加入硫酸(5ml)。加热48小时后，加入水(200ml)，该溶液通过加入饱和碳酸钠溶液中和。所得溶液用二氯甲烷(3×200ml)和乙酸乙酯(3×200ml)萃取，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干燥。粗品通过柱层析纯化(使用硅胶；20％乙酸乙酯的乙烷溶液)得到黄色固体对硝基隐色孔雀绿，5，(3.5g，11％)。

NMR¹³C，溶剂CDCl₃：153.5，149.5，146.2，131.0，129.4，123.4，113.9，54.9，40.9。

实施例5：制备对氨基隐色孔雀绿

向甲醇和四氢呋喃(1∶1，160ml)混合物中的对硝基隐色孔雀绿(2.1g，5.6mMol)中加入甲酸铵(1.91g，30.29mMol)和Pd/C(300mg，2.83mMol)，并且将混合物在室温搅拌3小时。真空去除溶剂，加入水(200ml)，用乙酸乙酯(3×200ml)萃取所得溶液，硫酸钠干燥，并蒸发至干燥。粗品通过柱层析纯化(使用硅胶；10％己烷的乙酸乙酯溶液)得到蜡状紫/红色固体对氨基隐色孔雀绿，6，(2.43g，75％)。

实施例6：制备对-(3-乙酰硫代丙酰氨基)隐色孔雀绿(半抗原C)

对氨基隐色孔雀绿(470mg，1.36mMol)、N，N-二异丙基乙胺(350μl，2.04mMol)和N-琥珀酰3-(乙酰硫代)丙酸酯(367mg，1.5mMol)在1，4-二噁烷(25ml)中室温搅拌过夜。真空去除溶剂。粗品通过柱层析纯化(硅胶；乙酸乙酯∶己烷，1∶5)得到紫色油状对-(3-乙酰硫代丙酰氨基)隐色孔雀绿，半抗原C，(560mg，87％)。

IR光谱(film)：1741，1692，1611，1518，1353，1204cm^-1

实施例7：半抗原A与BSA偶联(制备免疫原I)

向半抗原A(60mg，0.14mMol)的DMF(2ml)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(17.7mg，0.154mMol)和N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)(31.8mg，0.154mMol)，将混合物在室温搅拌过夜。通过过滤去除所形成的二环己脲，将滤出液滴加至BSA(200mg)的0.1M碳酸氢钠溶液(pH8.5，9ml)中。混合物在室温搅拌过夜。该溶液在4℃用50mM磷酸缓冲液pH7.2透析24小时(换3次透析液)，然后冻干。

MALDI结果显示47.9摩尔半抗原A已经与1摩尔BSA偶联(图7)。

实施例8：半抗原A与BTG偶联(制备免疫原II)

用：半抗原A(80mg)、N-羟基琥珀酰亚胺(24mg)、DCC(36mg)和BTG(150mg)，按实施例7的方法，使半抗原A与BTG偶联。

实施例9：半抗原A与HRP(辣根过氧化物酶)偶联

将EDC.HCl(10mg)溶于水(0.5ml)，并立即加至半抗原A(2mg)的DMF溶液(0.2ml)中。混合后，将该溶液滴加至HRP(20mg)的水溶液(1ml)中。加入硫代NHS(sulfo-NHS，5mg)，将反应混合物于室温避光保温过夜。在已用pH7.2 PBS(磷酸盐缓冲液)预平衡的PD-10柱(Pharmacia)上连续脱盐，去除过量半抗原。然后将半抗原-HRP偶联物用10L PBS/pH7.2在4℃透析过夜。

实施例10：对-(3-乙酰硫代丙酰氨基)隐色孔雀绿与HRP(辣根过氧化物酶)偶联

将1M的氢氧化钾溶液(100ml)加至对-(3-乙酰硫代丙酰氨基)隐色孔雀绿(2mg)的DMF溶液(0.2ml)中。保温10分钟后，加入0.1M的磷酸缓冲液，随后加入1M HCl。混合后，将该溶液滴加于修饰型HRP(20mg)的溶液中。在已用pH7.2 PBS(磷酸盐缓冲液)预平衡的PD-10柱(Pharmacia)上连续脱盐，去除过量半抗原。然后将半抗原-HRP偶联物用10L PBS/pH7.2在4℃透析过夜。

实施例11：制备抗实施例8所得免疫原II的抗体

将免疫原II的水溶液与弗氏完全佐剂(FCA)配制成2mg/ml免疫原的在50％(v/v)FCA中的乳液。三只羊用该乳液免疫(1⁰免疫)，在每只羊臀部取四个位点，每一位点肌肉内注射0.25ml该乳液。随后的免疫(加强免疫)包含1mg/ml免疫原。所有加强免疫物在50％(v/v)弗氏完全佐剂(FCA)中乳化，并且以与1⁰免疫相同的方式以月为间隔持续1年施用。在每次加强免疫后7-14天取血样。处理每个样本以产生抗血清，通过辛酸和硫酸铵沉淀进一步纯化得到免疫球蛋白(Ig)级分(fraction)。Ig级分通过竞争性ELISA微滴板测试来评估，如下面实施例12所描述。

实施例12：ELISA测定隐色孔雀绿和孔雀石绿

抗免疫原II(半抗原A-BTG)(实施例8)的抗血清的Ig级分用10mM TrispH8.5稀释，用它对增强结合型96孔聚苯乙烯微滴板的孔进行包被(125μl/孔)。适当的抗体包被稀释度用标准ELISA棋盘技术(checkerboard technique)测定。该板在37℃保温2小时，用含有吐温20的Tris缓冲盐水(Tris bufferedsaline)(TBST)洗4次，拍干。在TBST中制备0、5、10、50、100、250、500和1000ng/ml的标准隐色孔雀绿和孔雀石绿溶液，每种浓度各取50μl添加至相应孔中(图8)。

75μl偶联物I(半抗原A-HRP)(实施例9)，用包含EDTA、D-甘露醇、蔗糖、硫柳汞和BSA的Tris缓冲液(pH7.2)稀释后，加至每个孔，如图8所显示。适当的偶联物稀释度也用标准ELISA棋盘技术测定。该板在37℃保温2小时。过量的未结合的偶联物通过在10分钟内用TBST洗6次而除去。将125μl的四甲基联苯氨(TMB)底物溶液加于板上每孔，然后将板室温避光保温15-20分钟。通过向每孔加入125μl 0.2M H₂SO₄终止反应。然后使用微滴板读数器在450nm处测量吸收值。测试中所得数据列于表1。

表1：用抗免疫原II(半抗原A-BTG)(实施例8)的抗血清和偶联物I(实施例9)进行隐色孔雀绿和孔雀石绿的竞争性微滴板测定得到的数据。

IC₅₀(ng/ml)	27.33	103.39
			％CR	100	26.43

A_450＝在450nm的吸收值

B＝在xng/ml标准浓度、在450nm的吸收值

B₀＝在0ng/ml标准浓度、在450nm的吸收值

IC₅₀＝产生50％B/B₀的标准浓度

％CR＝基于隐色孔雀绿特异性的交叉反应百分数-这是本说明书中术语“交叉反应性”的含意。

75μl偶联物C(半抗原C-HRP)(实施例10)，用包含EDTA、D-甘露醇、蔗糖、硫柳汞和BSA的Tris缓冲液(pH7.2)稀释后，加于每个孔，如图8所显示。适当的偶联物稀释度也用标准ELISA棋盘技术测定。该板在25℃保温1小时。过量的未结合的偶联物通过在10-15分钟内用TBST洗6次而除去。

将125μl的四甲基联苯氨(TMB)底物溶液加于板上每孔，然后将板室温避光保温20分钟。通过向每孔加入100μl 0.2M H₂SO₄终止反应。然后使用微滴板读数器在450nm处测量吸收值。测试中所得数据列于表2。

表2：用抗免疫原II(半抗原A-BTG)(实施例8)的抗血清和偶联物II(实施例10)进行隐色孔雀绿和孔雀石绿的竞争性微滴板测定得到的数据。

IC₅₀(ng/ml)	3.74	13.962
			％CR	100	26.8

A_450＝在450nm的吸收值

B＝在xng/ml标准浓度下、450nm的吸收值

B₀＝在0ng/ml标准浓度下、450nm的吸收值

IC₅₀＝产生50％B/B₀的标准浓度

％CR＝基于隐色孔雀绿特异性的交叉反应百分数

隐色孔雀绿的敏感度或IC₅₀(ng/ml)在表2显示为3.74，表1显示为27.33。孔雀石绿的敏感度或IC₅₀(ng/ml)在表2显示为13.962，表1显示为103.39。可以认为，这些敏感度差异是由于使用偶联物而该偶联物带有与免疫原的交联基结构不同的交联基造成的。不期望受限于理论，可以认为测试中的受分析物更能与所述偶联物竞争抗体结合位点，因此增加测试敏感度但保留其特异性。

本发明将不限于此处描述的实施方案，其可在不偏离本发明范围下进行修改或修饰。

Claims

1.免疫原，其包含隐色孔雀绿且该隐色孔雀绿利用交联剂与赋予抗原性的载体材料偶联，其中所述交联剂从隐色孔雀绿的未取代苯环的对位、邻位或间位伸出，其中所述交联剂包含-X-Y-Z：

式I

其中X是选自O、S和N的杂原子，Y是C_1-10，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分，与赋予抗原性的载体材料偶联之前的Z选自羧基、二硫代吡啶基、顺丁烯二酰亚胺、氨基、羟基、巯基、硫酯或醛部分。

2.权利要求1所述的免疫原，其中所述交联剂从隐色孔雀绿的未取代苯环的对位伸出。

3.权利要求1所述的免疫原，其中X是O原子。

4.权利要求2的免疫原，其中X是O原子。

5.权利要求1的免疫原，其中Y是C_2-6，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

6.权利要求2的免疫原，其中Y是C_2-6，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

7.权利要求3的免疫原，其中Y是C_2-6，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

8.权利要求4的免疫原，其中Y是C_2-6，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

9.权利要求1的免疫原，其中Y是C₃，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

10.权利要求2的免疫原，其中Y是C₃，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

11.权利要求3的免疫原，其中Y是C₃，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

12.权利要求4的免疫原，其中Y是C₃，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

13.权利要求1的免疫原，其中与赋予抗原性的载体材料偶联之前的Z是羧基部分。

14.权利要求2的免疫原，其中与赋予抗原性的载体材料偶联之前的Z是羧基部分。

15.权利要求3的免疫原，其中与赋予抗原性的载体材料偶联之前的Z是羧基部分。

16.权利要求4的免疫原，其中与赋予抗原性的载体材料偶联之前的Z是羧基部分。

17.权利要求5的免疫原，其中与赋予抗原性的载体材料偶联之前的Z是羧基部分。

18.权利要求9的免疫原，其中与赋予抗原性的载体材料偶联之前的Z是羧基部分。

19.免疫原，包含与赋予抗原性的载体材料偶联的对-(3-羧基丙氧基)隐色孔雀绿。

20.权利要求1的免疫原，其中所述载体材料选自蛋白质、蛋白片段、合成多肽或半合成多肽。

21.权利要求2的免疫原，其中所述载体材料选自蛋白质、蛋白片段、合成多肽或半合成多肽。

22.权利要求3的免疫原，其中所述载体材料选自蛋白质、蛋白片段、合成多肽或半合成多肽。

23.权利要求4的免疫原，其中所述载体材料选自蛋白质、蛋白片段、合成多肽或半合成多肽。

24.权利要求5的免疫原，其中所述载体材料选自蛋白质、蛋白片段、合成多肽或半合成多肽。

25.权利要求9的免疫原，其中所述载体材料选自蛋白质、蛋白片段、合成多肽或半合成多肽。

26.权利要求13的免疫原，其中所述载体材料选自蛋白质、蛋白片段、合成多肽或半合成多肽。

27.权利要求19的免疫原，其中所述载体材料选自蛋白质、蛋白片段、合成多肽或半合成多肽。

28.抗权利要求1-27之一的免疫原的抗体，其中所述抗体能与隐色孔雀绿和孔雀石绿的至少一种结构性表位结合。

29.抗权利要求1-27之一的免疫原的抗体，所述抗体具有对隐色孔雀绿的特异性，其特征在于对孔雀石绿具有交叉反应性。

30.抗权利要求1-27之一的免疫原的抗体，所述抗体具有对隐色孔雀绿的特异性，其特征在于对孔雀石绿具有交叉反应性，其中所述抗体对孔雀石绿有大于10％的交叉反应性。

31.偶联物，包含通过交联剂与可检测的标记物共价结合的隐色孔雀绿，其中所述交联剂从隐色孔雀绿的未取代苯环的对位、邻位或间位伸出，其中所述交联剂包含-X-Y-Z：

式I

其中X是选自O、S和N的杂原子，Y是C_1-10，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分，与可检测的标记物偶联之前的Z选自羧基、二硫代吡啶基、顺丁烯二酰亚胺、氨基、羟基、巯基、硫酯或醛部分。

32.权利要求31所述的偶联物，其中所述交联剂从隐色孔雀绿的未取代苯环的对位伸出。

33.权利要求31所述的偶联物，其中X是N原子。

34.权利要求32的偶联物，其中X是N原子。

35.权利要求31的偶联物，其中Y是C_2-6，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

36.权利要求31的偶联物，其中Y是C₃，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

37.权利要求32的偶联物，其中Y是C_2-6，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

38.权利要求32的偶联物，其中Y是C₃，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

39.权利要求33的偶联物，其中Y是C_2-6，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

40.权利要求33的偶联物，其中Y是C₃，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

41.权利要求34的偶联物，其中Y是C_2-6，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

42.权利要求34的偶联物，其中Y是C₃，取代或未取代的直链，饱和亚烷基部分，或亚芳基部分。

43.权利要求31的偶联物，其中与可检测的标记物偶联之前的Z是巯基或硫酯。

44.权利要求32的偶联物，其中与可检测的标记物偶联之前的Z是巯基或硫酯。

45.权利要求33的偶联物，其中与可检测的标记物偶联之前的Z是巯基或硫酯。

46.权利要求34的偶联物，其中与可检测的标记物偶联之前的Z是巯基或硫酯。

47.权利要求35的偶联物，其中与可检测的标记物偶联之前的Z是巯基或硫酯。

48.权利要求36的偶联物，其中与可检测的标记物偶联之前的Z是巯基或硫酯。

49.偶联物，包含与可检测的标记物偶联的对-(3-硫代丙酰氨基)隐色孔雀绿。

50.权利要求31的偶联物，其中可检测的标记物选自酶、发光物质和放射活性物质。

51.权利要求32的偶联物，其中可检测的标记物选自酶、发光物质和放射活性物质。

52.权利要求33的偶联物，其中可检测的标记物选自酶、发光物质和放射活性物质。

53.权利要求34的偶联物，其中可检测的标记物选自酶、发光物质和放射活性物质。

54.权利要求35的偶联物，其中可检测的标记物选自酶、发光物质和放射活性物质。

55.权利要求36的偶联物，其中可检测的标记物选自酶、发光物质和放射活性物质。

56.权利要求49的偶联物，其中可检测的标记物选自酶、发光物质和放射活性物质。

57.检测或测定样品中隐色孔雀绿和孔雀石绿的方法，该方法包括将该样品与至少一种权利要求31-56之一所述偶联物和至少一种权利要求28或29或30所述抗体接触；检测结合的偶联物；从标准曲线推导出样品中隐色孔雀绿和孔雀石绿的存在或其量。

58.测定样品中包含隐色孔雀绿和孔雀石绿的每种分析物的量的方法，该方法包括将该样品与至少一种权利要求31-56之一所述偶联物和至少一种权利要求28或29或30所述抗体接触并测定结合的偶联物；将该样品与至少一种权利要求28或29或30所述抗体接触并测定结合的孔雀石绿；从标准曲线推导出样品中隐色孔雀绿和孔雀石绿各自的量。

59.用于检测或测定隐色孔雀绿和孔雀石绿的试剂盒，该试剂盒包括至少一种权利要求31-56之一所述偶联物和至少一种权利要求28或29或30所述抗体。

60.至少一种权利要求31-56之一所述偶联物和至少一种权利要求28或29或30所述抗体用于检测或测定隐色孔雀绿和孔雀石绿的用途。